UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL TRUJILLO-PERÚ 2012 “DETERMINACIÓN DE BIOMASA” LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES PROFESOR: ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER ALUMNA: MARTÍNEZ SALDAÑA, YURICO ELIZABETH CICLO: IX HORARIO: JUEVES 11-1PM
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
TRUJILLO-PERÚ
2012
“DETERMINACIÓN DE BIOMASA” LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE LOS
PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES
YURICO
PROFESOR: ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER
ALUMNA: MARTÍNEZ SALDAÑA, YURICO ELIZABETH
CICLO: IX
HORARIO: JUEVES 11-1PM
LABORATORIO N° 03.
DETERMINACIÓN DE BIOMASA
“PESO HÚMEDO, PESO SECO, TURBIDIMETRÍA”
I. OBJETIVOS
Determinar la concentración en Peso húmedo (g mH/mL) y Peso Seco (g mS/mL) de una solución
celular y ver que método es más efectivo.
Calcular el coeficiente de variabilidad de las tres repeticiones en Peso Húmedo y Peso Seco de la
levadura de pan.
Determinar la biomasa de una solución celular desconocida mediante el método de turbidimetría
Determinar la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicación de diferentes
métodos.
Hallar el factor de conversión para cada caso, mediante la Curva de Calibración.
Determinar el Porcentaje de Error de los factores de Conversión, relacionando los datos.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez
también se puede referir como la cantidad de células, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la
biomasa es la reproducción de células.
La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso ya que su
determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para
establecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances de masa de
cualquier proceso biológico. Los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que
se basan en el número de células o en el peso celular. Para determinar la biomasa es necesario calcular el
número de células en una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo,
para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los microorganismos en
esos productos. Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la cantidad de
células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles
principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o
actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en
los que es difícil cuantificar las células individuales.
A. Medida de biomasa
La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada frecuentemente como base
para la medida de una actividad metabólica, o de un constituyente metabólico o químico. Algunos de los
métodos para cuantificar la biomas son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se
busca exactitud.
1. Peso húmedo
Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por
filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja
es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La
cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy
empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformación celular.
Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio
intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el
Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
2. Peso seco
La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por
unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles
(SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Se expresan en
g.m.s/mL.
La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo microorganismos activos
sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida.
Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los métodos gravimétricos
son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. A la vez este método este método
los componentes volátiles de las células pueden perderse en el secado y puede existir alguna degradación.
También la muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene
humedad relativa alta.
3. Absorción
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada,
parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por
una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz
transmitida a través de la solución. Con relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden
existir tres tipos de dispersión.
Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los
cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente,
dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Turbidimetría
La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y
cuantifica la luz residual transmitida.Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones
diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma
absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la
absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del
microorganismo.
Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de
Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el
número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión
bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma
es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con
UFC.
Figura 1.Absorbancia en función del Peso Seco
K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del
microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).
Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml).
La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de
bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores
producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas
puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
A. Materiales e instrumentos
Materiales
Levadura de panificación “Fleishmann”
Agua destilada
Tubos de ensayo
Láminas cubreobjetos
Vaso de precipitación
Pipeta
Jeringa
Equipos
Centrifugadora
Microscopio
Estufa (105°ºC por 3 horas)
Balanza electrónica
Cámara de Neubauer
Espectrofotómetro
Figura 2.Absorbancia en función del Peso Seco Figura 3.Absorbancia en función del
Número de Microorganismos Totales
B. Metodología
a) Para determinación de Peso Húmedo
Se tomaron muestras de 5 mL de la solución inicial y se colocaron en tres tubos de
ensayos previamente pesados.
Luego los tubos son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un
tiempo de 10 minutos.
Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analítica, anotamos los
pesos y luego promediamos.
b) Para determinación de Peso Seco
Se tomaron muestras de 5 mL de la solución inicial y se colocaron en tres tubos de
ensayos previamente pesados.
Los tubos de ensayo son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por
un tiempo de 10 minutos.
Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analítica y anotamos los
pesos.
Posteriormente, se llevan los tubos a estufa, a una temperatura de 105 ºC por un tiempo
promedio de 3 horas.
Pasado el tiempo anotaremos, los pesos y luego pasamos a sacaremos un promedio.
Figura 4. Metodología de Peso Húmedo y Peso Seco.
En Seco la solución no tiene que estar muy
diluida, con este método se mide la levadura
“Fleischmann”
Las ecuaciones que se determinarán son:
Hallaremos el coeficiente de Variabilidad de las 3 repeticiones.
c) Para determinación de turbidimetría
Se preparó una solución acuosa con levadura, a partir de la cual se procedió a preparar