Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI Christophe Junot CEA/Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments CEA-Saclay (iBiTec-S) [email protected]La spectrométrie de masse pour la détection, la caractérisation et la quantification des biomolécules dans les fluides biologiques
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Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Christophe Junot
CEA/Laboratoire d’Etude du Métabolisme des MédicamentsCEA-Saclay (iBiTec-S)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Sample preparation
Sophisticated sample preparation improves detection sensitivityat the expense of biomolecules coverage
Solid phase extraction
Liquid-liquidextractionSolvent/acid
precipitation
To clean-up samples and/or to concentrate metabolites
Sample preparation depends on the kind of biological medium investigated and on the kind of biomolecules of interest. Cell extracts, tissue extracts, biofluidsQuenching issue
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
La validation des méthodes LC/MS pour laquantification de médicaments dans les milieuxbiologiques
- Rendement d’extraction
- Rendement d’ionisation
- Effet mémoire
- Linéarité
- Limite de détection, limite de quantification approximative
- Précision et exactitude (intra- et inter-série)
- Stabilité (dans les conditions d’analyse et dans les conditions de
conservation)
- Effet des anticoagulants (pour les dosages plasmatiques)
Bien décrit (Shah et al., 1992, 2000 ; FDA, 2001…)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Metabolite-profiling for studying the regulation of the glutathione biosynthesis pathway in S. Cerevisiae
Cystathionine Cysteine
S-Adenosyl-Homocysteine
Oxidized glutathione
Homocysteine
-Glutamyl-Cysteine
Reduced glutathione
Methionine
S-Adenosyl-
Methionine
Cys4
Cys3
Str2
Gsh1
Gsh2
Sam1
Sam2
Met6
Str3
Sulfate assimilation
Glr1
Sah1
METHYLCYCLE
Previous proteomic results
showed that Cadmium stongly
increases GSH synthesis, which is
used for the detoxication process.
(Vido et al., 2001)
How is it regulated ?Are there any limiting enzymes ?
To develop an analytical method for the simultaneous quantification of the metabolites involved in the biosynthesis of GSH
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
(Lafaye et al.,Anal Chem 2005)
LC-ESI-MS/MS combined with 15N metabolic labelingof S.cerevisiae
14 N culture to be analyzed
15 N culture
14 N extract
15 N referenceextract
METABOLITE EXTRACTION
MIXING OF ALIQUOTS
LC- MS /MS ANALYSIS OF THE MIXTURE
14N/15N isotope ratio
QUANTITATIVERESULTS
N signals
14 metabolite
14 N referencecompounds
CONSTRUCTION OFCALIBRATION CURVES
0 25 50 75 100 1250
1
2
3
4
Concentration (µg/mL)
14N
/15N
rat
io
MS2collision cell
MRM: MULTIPLE REACTION MONITORING
MS1
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Cys 4
Cys 3
Gsh 1
Gsh 2
Met 6
Sulfate Cysteine
0 2 4 60.00
0.25
0.50
0.75
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(m
M)
Homocysteine
0 2 4 60
50
100
150
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(µ
M)
Methionine
0 2 4 60.00
0.25
0.50
0.75
1.00
16 20 24
Time (h)
Conc
entr
atio
n(m
M)
Cystathionine
0 2 4 60.0
0.5
1.0
1.5
2.0
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(m
M)
-Glutamyl-Cysteine
0 2 4 60.0
2.5
5.0
7.5
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(m
M)
S-Adenosyl-Homocysteine
0 2 4 60
100
200
300
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(µ
M)
Total Glutathione
0 2 4 60
5
10
15
20
16 20 24
Time (h)
Con
cent
ratio
n(m
M)Sam1
Sam2
Sah1
(Lafaye et al., J.Biol.Chem. 2005)
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Basic principle of quantitative mass spectrometry for proteins
Mass filtering approach with standard technologies
Triple quadrupole OrbitrapMaldi-Tof
8+
7+
6+
5+
4+8+
7+
6+
5+
4+8+
7+
6+
5+
4+8+
7+
6+
5+
4+
1. Whole protein
2. Digested protein (peptides)
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Internalstandard
Trypsination and analysisof peptides by LCMS/MS
F: \ 0101 2 8\ 080 40 8 \0 8040 8 007 0 8/0 4/ 2008 2 0: 55: 5 1 A pel in 12 1 0ng/ m L SI 10 ng /m L
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Détection automatique des signaux
1. Alignement des variables en temps de rétention et en mesures de masses2. Suppression du bruit de fond3. Détection et mesure des pics4. Présentation des données sous forme matricielle
Echantillons
Varia
bles
(Rt-m
asse
)
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
Few thousands of variables…
…Few hundreds of metabolites ??
Annotation of peak lists is requiredto help for metabolite identification
0 20 40 60 80 100 120 140Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
Samples
Varia
bles
(Rt-m
ass)
?????????0 20 40 60 80 100 120 140
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
0 20 40 60 80 100 120 140Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
Chemical and biochemical databases: KEGG (www.genome.jp/kegg), Metlin (www.metlin.scripps.edu), HMDB (www.hmdb.ca)
spectral databases
Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI
207.1051 5.28 C9[13C]2H13N2O2 Tryptophan [(M+H)]+ (13C2)Gly Trp Phe (and isomers)Lys Met Met (and isomers)Tyr Leu Asp (and isomers)Ile Tyr Asp (and isomers) Val Tyr Glu (and isomers)