Kromatografi Cair Tingkat TinggiI. Tujuan Percobaan Menganalisis
secara kuantitatif kafein dalam berbagai jenis minuman ringan
(sampel) dengan teknik HPLC
II. Teori DasarKafein adalah senyawa polar yang larut dalam
metanol. Apabila kadar kafein ingin ditentukan dengan kromatografi,
kafein harus diekstrak ke pelarut lain yang lebih non polar. Tapi
apabila fasa dalam kromatografinya diubah dimana fasa diamnya non
polar dan fasa geraknya polar (HPLC fasa terbalik), ekstraksi
tersebut tidak perlu dilakukan. Eluen dari kolom monitor dalam
bentuk absoban yang sebanding dengan konsentrasi kafein, sehingga
konsentrasi kafein dapat ditentukan.HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) menggunakan fasa terbalik dimana sample dialirkan
pada fasa diamnya dan dielusi, kemudian dibawa ke detector oleh
fasa geraknya. Fasa diam HPLC berupa partikel silica yang ditutup
silena. Eluennya bersifat polar seperti methanol dan air. Fasa
geraknya tidak diperlukan dalam jumlah yang besar, sehingga
komposisi suatu sample dapat diketahui tanpa harus mengekstraknya
terlebih dahulu. Pada HPLC, waktu retensi akan meningkat dengan
meningkatnya sifat non polar dari suatu senyawa.
III. Cara Kerja Mula-mula, kita membuat fasa geraknya (eluen)
terlebih dahulu, yaitu 140 ml aquabidest, 1.4 ml H3PO4 5%, dan 60
ml methanol dicampurkan gelas ukur. Lalu dimasukkan ke dalam
penangas ultrasonic (ultrasonic bath) untuk dihilangkan gas
terlarutnya. Setelah itu, larutan standar 500 ppm kafein diambil
sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam 5 buah labu takar 10 ml kemudian
diencerkan dengan eluen yang telah dibuat dengan konsentrasi
masing-masing 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Selanjutnya larutan
dengan konsentrasi masing-masing tersebut diinjeksikan ke dalam
HPLC untuk dihasilkan kromatogramnya. Untuk larutan sampel, teh
yang telah disaring dengan penyaringan biasa, diencerkan sebanyak
2x dan 5x sebagai acuan.
IV. Data Pengamatan 20 ppm
40 ppm
60 ppm
80 ppm
100 ppm
Sampel kopi
Sampel Teh
Sampel Kratingdaeng
V. Pengolahan Data A. Penentuan Konsentrasi Kafein Pada Sampel
dengan Perbandingan Grafik StandarKafein [ppm]Area [mAU*s]Height
[mAU]Waktu Retensi (min)
20881,68179,611,353
401891,52375,151,381
602662,44546,361,355
803059,67637,971,356
1004398,91930,781,358
Grafik
Dari grafik bisa ditentukan konsentrasi sampel :Luas puncak = y
= 41,013 x + 118,06Konsentrasi ( C ) = x a. Konsentrasi Sampel
Kopiy = 41,013 x + 118,068544,0752 = 41,013 x + 118,068544,0752
118,06 = 41,013 xX = 205,44 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali,
maka :Konsentrasi (C) = 205,44 ppm x 5 = 1027,23 ppm Konsentrasi
kafein dalam sampel = 1027,23 ppm = 1027,23 mg/LJadi, berat kafein
dalam kopi (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L = 1027,23 mg/L x 1 L
= 1027,23 mg = 1,027 gramb. Konsentrasi sampel Tehy = 41,013 x +
118,061529,492 = 41,013 x + 118,061529,492 118,06 = 41,013 xX =
34,41 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) =
34,41 ppm x 5 = 172,05 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 172,05
ppm = 172,05 mg/LJadi, berat kafein dalam teh (diambil 1 L
larutan)mg = ppm x 1L= 172,05 x 1 = 172,05 mg = 0,172 gramc.
Konsentrasi sampel Kratingdaengy = 41,013 x + 118,063418,0603 =
41,013 x + 118,063418,0603 118,06 = 41,013 xX = 80,462 ppmkarena
sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) = 80,462 ppm x 5 =
402,311 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 402,311 ppm = 402,311
mg/LJadi, berat kafein dalam Kratingdaeng (diambil 1 L larutan)mg =
ppm x 1L= 402,311 x 1 = 402,311 mg = 0,402 gram
B. Berdasarkan grafik konsentrasi dengan tinggi
Dari grafik bisa ditentukan konsentrasi sampel :Tinggi puncak =
y = 8,8258 x + 4,426Konsentrasi ( C ) = x a. Konsentrasi Sampel
Kopiy = 8,8258 x + 4,4261592,66 = 8,8258 x + 4,4261592,66 4,426 =
8,8258 xX = 179,953 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka
:Konsentrasi (C) = 179,953 ppm x 5 = 899,767 ppm Konsentrasi kafein
dalam sampel = 899,767 ppm = 899,767 mg/LJadi, berat kafein dalam
kopi (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L = 899,767 mg/L x 1 L =
899,767 mg = 0,899 gramb. Konsentrasi sampel Tehy = 8,8258 x +
4,426295,602 = 8,8258 x + 4,426295,602 4,426 = 8,8258 xX = 32,99
ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) = 32,99
ppm x 5 = 164,96 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 164,96 ppm =
164,96 mg/LJadi, berat kafein dalam teh (diambil 1 L larutan)mg =
ppm x 1L= 164,96 x 1 = 164,96 mg = 0,165 gramc. Konsentrasi sampel
Kratingdaengy = 8,8258 x + 4,426602,953 = 8,8258 x + 4,426602,953
4,426 = 8,8258 xX = 67,81 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka
:Konsentrasi (C) = 67,81 ppm x 5 = 339,078 ppm Konsentrasi kafein
dalam sampel = 339,078 ppm = 339,078 mg/LJadi, berat kafein dalam
Kratingdaeng (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L= 339,078 x 1 =
339,078 mg = 0,339 gram
VI. PembahasanHigh-performance liquid chromatography (HPLC)
mengacu pada proses pemurnian dan pengasingan campuran. Pada HPLC
RP, senyawa-senyawa dipisahkan berdasarkan karakter hidrofobiknya.
Pelarut-pelarut harus dihawa gaskan (dihilangkan komponen gasnya)
untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung.Prinsip kerja
HPLC adalah dengan bantuan pompa fasa gerak cair yang dialirkan
melalui kolom ke detector. Sampel yang digunakan pada percobaan
ialah kafein pada kopi, teh, dan kratingdaeng yang mempunyai
struktur molekul
Sampel dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut
terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya
dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya,
solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka
solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas.
Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan
mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran
HPLC.Instrumentasi HPLC yaitu: Fasa gerakFasa gerak dalam HPLC
adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. HPLC
mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak. Fasa gerak selain
berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa
gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu, fasa
gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan
proses pemisahan. Dalam percobaan ini yang berfungsi sebagai fasa
gerak ialah metanol. Fasa gerak Persyaratan fasa gerak dalam HPLC
ialah:1. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk
cuplikan yang akan di analisis.2. zat cair harus murni sekali untuk
menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi
kromatogram3. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan
penyumbatan pada kolom4. zat cair harus mudah diperoleh, murah,
tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.5. zat cair tidak kental6.
sesuai dengan detectorJenis fasa gerak untuk kromatografi partisi,
adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak
berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu
retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa
gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh
karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung
pada komposisi fasa gerak. PompaPompa memberikan tekanan tinggi
yang tetap tanpa berpulsasi, dan bisa diprogramkan untuk
memvariasikan komposisi pelarut selama berlangsungnya pemisahan.
Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair
melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan
dalam HPLC harus memenuhi persyaratan, yaitu:1. Menghasilkan
tekanan sampai 600 psi (pons/in2)2. Keluaran bebas pulsa3.
Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit4. Bahan tahan korosi
Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian SampelKadang kala,
faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan
pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan
memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band
broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil
mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan
tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran
fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam
sistem HPLC :1. Injeksi SyringeAlat yang paling dulu dan paling
mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan
melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang
tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi
syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek2.
Injeksi stop-flowInjeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe
kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan
pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam
ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut
dialirkan kembali3. Kran CuplikanJenis pemasukan cuplikan ini
disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan
cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah
volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load,
cuplikan masih berada dalam loop, (b) kran diputar untuk mengubah
posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan
ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai
ukuran volume dari 5 hingga 500L. Dengan sistem pemasukan cuplikan
ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan
ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5
hingga 5 L. KolomKolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel
walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom
utama berisi fas diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi
komponen-komponennya.
DetectorDetektor-detektor bergantung pada perubahan indeks
refraktif, serapan UV-tampak, atau fluoresensi setelah eksitasi
dengan panjang gelombang yang sesuai.Berbagai detector untuk HPLC
telah tersedia, walaupun demikian detector harus memenuhi
persyaratan berikut: 1. cukup sensitive; 2. stabilitas dan
keterulangan tinggi;3. respon linear terhadap solute; 4. waktu
respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir ;5.
realibilitas tinggi dan mudah digunakan; 6. tidak merusak cuplikan.
Detector HPLC dikelompokan ke dalam tiga jenis, yaitu: detector
umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan
adanaya solute. Sebaliknya, detector sepesifik memberi respon
terhadap beberapa sifat solute yang tidak dimiliki oleh fasa gerak.
Terakhir, detectoe yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa
gerak dihilangkan dengan penguapan. Detector berdasarkan absorpsi
UV merupakan detector HPLC yang paling banyak di pakai. Detector
elektrokimia paling banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar
ion.Cara Kerja HPLC, mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven
ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang dipasang
tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel
dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan
solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh
detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat =
recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur
tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan
kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa
milliliter per menit. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat
yang dipisahkan dari suatu sampelKelebihan HPLC Dibandingkan dengan
kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC
= High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa
kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah:1. Percobaan
dapat dilaksanakan dalam suhu kamar2. cepat dan mudah
melaksanakannya3. peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik.4.
pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan
kolomnya.5. ideal untuk molekul besar dan ion.6. mudah memperoleh
cuplikan.7. daya pisahnya baik.8. dapat dihindari terjadinya
dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis.9. HPLC juga dapat
menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.
Dari percobaan terlihat bahwa kopi memiliki kadar kadein yang
tinggi yaitu 1,027 gram, disusul oleh Kratingdaeeng yaitu 0,402
gram, dan yang terakhir teh sebanyak 0,172 gram (semua dalam
larutan 1 L)VII. KesimpulanKadar kafein dalam Kopi: Dengan kurva
kalibrasi luas kromatogram : 1,027 gram Dengan kurva kalibrasi
tinggi kromatogram: 0,899 gramKadar kafein dalam Teh: Dengan kurva
kalibrasi luas kromatogram : 0,172 gram Dengan kurva kalibrasi
tinggi kromatogram: 0,165 gramKadar kafein dalam Kratingdaeng:
Dengan kurva kalibrasi luas kromatogram : 0,402 gram Dengan kurva
kalibrasi tinggi kromatogram: 0,339 gram
VIII. Daftar Pustaka Harvey, David. Modern Analytical Chemistry.
International edition. Mc Graw Hill Publisher. Sydney. 2000. pg
578-588. Braithwaite, A. and Smith, F. J. Chromatographic Methods.
5th ed. Kluwer Academic Publisher. London. 1999. pg 23-26, 258-266,
379-383. Drs. Soebagio dkk, 2002, KIMIA ANALITIK II, Malang: JICA
FMIPA UNM Sumar Hendrayana, 2006, KIMIA PEMISAHAN, Bandung :
Rosdakarya Hostettmann, K dkk, 1995, Cara Kromatografi Preparatif,
Bandung: ITB