Kromatografi Cair Tekanan Tinggi

8/19/2019 Kromatografi Cair Tekanan Tinggi

1/23

MAKALAH KIMIA ANALISIS

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI / HPLC

Oleh: MUTHI’AH RABBANIYAH

NIM: 35.2!".#.!.$%%

PROGRAM STU&I FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNI'ERSITAS &ARUSSALA GONTOR

NGA(I


2/23

2!%

KROMATOGRAFI CAIR TEKANAN TINGGI )HPLC*

PEN&AHULUAN

Latar Belakang

Kromatograf adalah suatu istilah umum yang

digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan

yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa

gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam

yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan.

Penemu kromatograf adalah Tswett yang pada tahun

1!"# mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun

dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur

$%a&'(). lstilah kromatograf diciptakan oleh Tswett untuk

melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak

ke bawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan#*.T. *ay juga menggunakan kromatograf untuk

memisahkan +raksi-+raksi petroleum# namun Tswett lah

yang pertama diakui sebagai penemu dan yang

menjelaskan tentang proses kromatograf.

Penyelidikan tentang kromatograf kendor untuk

beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalambentuk kromatograf padatan cair $L&%). Kemudian pada

akhir tahun 1"! an dan permulaan tahun 1(! an#

kromatograf mulai berkembang. *asar kromatograf

lapisan tipis $TL%) diletakkan pada tahun 1", oleh

mailo/ dan &chreiber# dan kemudian diperhalus oleh


3/23

&tahl pada tahun 10,. asil karya yang baik sekali dari

2artin dan &ynge pada tahun 1(1 $untuk ini mereka

memenangkan 3obel) tidak hanya mengubah dengan

cepat kroinatograf cair tetapi seperangkat umumlangkah untuk pengembangan kromatograf gas dan

kromatograf kertas. Pada tahun 104 2artin dan 5ames

mempublikasikan makalah pertama mengenai

kromatograf gas. *iantara tahun 104 dan akhir tahun

16! an kromatograf gas dikembangkan menjadi suatu

teknik analisis yang canggih.

&ejarah kromatograf cair# dalam praktek ditampilkandalam kolom gelas berdiameter besar# pada dasamya

dibawah kondisi atmos+er. 7aktu analisis lama dan segala

prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir

tahun 16! an# semakin banyak usaha dilakukan untuk

pengembangan kromatograf cair sebagai suatu teknik

mengimbangi kromatograf gas. igh Per+ormance Li8uid

%hromatography $PL%) atau Kromatograf %airPenampilan Tinggi atau igh Pre+ormance 9 Tekanan atau

Kinerja Tinggi# igh &peed 9 Kecepatan Tinggi dan

2odern 9 moderen) telah berhasil dikembangkan dari

usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan

pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga

sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian

membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalamkeadaan tertentu. Tentu saja# saat ini dengan teknik yang

sudah matang dan dengan cepat K%KT mencapai suatu

keadaan yang sederajat dengan kromatograf gas.


4/23

K%KT adalah teknik yang paling banyak digunakan

untuk mengukur kuantitas obat-obat dalam +ormulasi.

Penentuan kadar dalam +armakope masih banyak

didasarkan pada spektroskopi :; langsung# tetapi diindustri# deteksi dengan spektroskopi :; biasanya

dikombinasikan dengan pemisahan pendahuluan dengan

K%KT.

4. =pa saja jenis-jenis K%KT>". =pa saja instrumen dari K%KT>(. =pa saja kelebihan dan kekurangn K%KT>0. Bagaimana +ase diam dan +ase gerak yang

digunakan>6. =pa saja kolom yang digunakan>?. =pa saja macam detektor yang digunakan>,. Bagaimana penerapan K%KT>

Tujuan

Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah untuk

mengetahui prinsip dasar dan prinsip kerja K%KT#

mengetahui jenis-jenis K%KT# mengetahui instrumen dari

K%KT# mengetahui kelebihan dan kekurangan K%KT#

mengetahui +ase diam dan +ase gerak yang digunakan#

mengetahui kolom apa yang digunakan dalam K%KT#

mengetahui macam detektor yang digunakan# dan

mengetahui penerapan K%KT.


5/23

PEMBAHASAN

!.P+,-, &00+ 10- P+,-, Ke+0

Prinsip *asar

Prinsip dasar dari K%KT# dan semua metode

kromatograf adalah memisahkan setiap komponen

dalam sample untuk selanjutnya diidentifkasi $kualitati+)

dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing

komponen tersebut $kuantitati+). :ntuk K%KT sendiri

pemisahan didasarkan atas perbedaan si+at

kepolarannya. &ebetulnya hanya ada dua hal utama yang

menjadi krusial point dalam metode K%KT. @ang pertama

adalah proses separasiApemisahan dan yang kedua


6/23

adalah proses identifkasi. *ua hal ini mejadi +aktor yang

sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Prinsip Kerja

&uatu +ase gerak cair dipompa dibawah tekanan

melalui kolom baja yang mengandung partikel-partikel

+ase diam dengan diameter "-1! um. =nalit tersebut

dimasukkan ke dalam bagian atas kolom melalui katup

lengkung dan pemisahan suatu campuran berlangsung

sesuai dengan lamanya waktu relati+ yang dibutuhkan

oleh komponennya di dalam +ase diam. Perlu diperhatikanbahwa semua komponen di dalam cammpuran

membutuhkan waktu yang kurang lebih sama dengan

+ase gerak agar dapat keluar dari kolom. Pemantauan

eluen kolom dapat dilakukan dengan berbagai detektor.

2.Je-,e-, KCKT

-Kromatograf padat-cair

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya at padat

pada adsorben yang polar seperti silika gel atau alumina.

Kromatograf lapisan tipis $TL%) adalah salah satu bentuk

dari L&%. *alam K%KT kolom dipadati atau dipak dengan

partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular

$berkulit tipis "? -(( ).&ebagian besar dari K%KT

sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel

microparticulate lebih kecil dari 4! . Teknik ini biasanya

digunakan untuk at padat yang mudah larut dalam

pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama

sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.- Kromatograf partisi


7/23

Teknik ini tergantung pada partisi at padat diantara

dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu

diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang

lainnya sebagai +asa gerak. Pada keadaan awal darikromatograf cair $L&%)# rasa diamnya dibuat dengan cara

yang sama seperti pendukung pada kromatograf gas

$C%). Dasa diam $polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu

pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom.

Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk

kromatograf partisi ini disebut kromatograf cair cair

$LL%):ntuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang

dapat lebih tahan lama# telah dikembangkan pengepakan

+ase diam yang berikatan secara kimia dengan

pendukung inert. Bentuk kromatograf partisi ini disebut

kromatograf +ase terikat $BP% 9 Bonded Phase

%hromatography). BP% dengan cepat menjadi salah satu

bentuk yang paling populer dari K%KT. Kromatograf

partisi $LL% dan BP%)# disebut E+ase normalE bila +ase

diam lebih polar dari +ase gerak dan E+ase terbalikE bila

+ase gerak lebih polar dari pada +ase diam.- Kromatograf penukar ion

Teknik ini tergantung pada penukaran $adsorpsi) ion-

ion di antara +ase gerak dan tempat-tempat berion dari

pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari

kopolimer di/inilbenen stiren dimana gugus-gugus+ungsinya telah ditambah. =sam sul+onat dan amin

kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik

untuk digunakan Keduanya# +ase terikat dan resin telah

digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam li+e


8/23

sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam

amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation

dan anion.- Kromatograf eksklusi

Pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari at

padat. Pengepaknya merupakan suatu gel dengan

permukaan berlubang-lubang sangat kecil yang inert.

2olekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan

ditahan dalam +ase gerak yang menggenang. 2olekul

yang lebih besar# tidak dapat masuk kedalam jaringan

dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.

Kromatograf eksklusi disebut permeasi gel $CP%)dan fltrasi gel. *alam bidang biologi# &ephadeF# suatu

%ross-linked deFtran gel# telah digunakan secara luas#

hanya pengepak keras dan semi keras $polistiren# silika#

glass) yang digunakan dalam K%KT. *eFtran gel lunak

tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 4 atmos+er.

Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer

dan bahan-bahan biologi# terutama digunakan untukrnolekul-molekul kecil.

3.I-4+6e-,

&istem instrumen standar untuk elusi isokratik terdiri

atasG

1.


9/23

".&uatu injektor lengkung# yang pas dengan lengkung

ber/olume tetap antara 1 dan 4!! ul $4! ul sering

digunakan sebagai baku).(.&uatu kolom yang biasanya berupa tabung baja

kemas# biasanya# dengan gel silika tersalut-

oktadesilsilan $salut-'*&) dengan diameter partikel

rata-rata $"#0-1! um).0.&uatu detektor# yang biasanya berupa detektor

:;A/isibel# meskipun untuk penerapan khusus

tersedia berbagai macam detektor.6.&item penangkap data# yang dapat berupa suatu

integrator komputasi atau sebuah komputer denganpiranti lunak yang sesuai untuk memproses data

kromatograf.?.Kolom dihubungkan pada injektor dan detektor

dengan tabung berdiameter dalam yang sempit#

lebih kurang !#4 mm# untuk meminimalkan H/olume

matuI# yaitu ruang kosong di dalam sistem ketika

kromatograf tidak terjadi dan pelebaran pita dapatterjadi melalui di+usi longitudinal.

,. nstrumen-instrumen yang lebih canggih memiliki

injeksi sampel otomatis dan o/en kolom serta

mampu mencampur dua pelarut atau lebih dalam

berbagai perbandingan terhadap waktu untuk

menghasilkan gradien +ase gerak.


10/23

".Kele7,h0- 10- Ke8+0-90-

Kelebihan

- Pemasukan sampel yang tepat dan mudah

dikendalikan menjamin presisi kuantitati+.

- K%KT merupakan teknik kromatograf yang

perkembangannya tampak paling intensi+ beberapa

tahun belakangan# memberikan perbaikan pada

pengendalian kolom# detektor# dan piranti lunak.

- Keragaman kolom dan detektor berarti bahwa

selekti/itas metode tersebut dapat disesuaikan

dengan mudah.

- *ibandingkan dengan KC# terdapat risiko penguraian

sampel yang lebih kecil karena pemanasan bukan

meruupakan syarat dalam proses kromatograf.

- 2udah diotomatisasi.

Kekurangan


11/23

- 2asih dibutuhkan detektor yang terandalkan dan

tidak mahal yang dapat memantau senyawa-

senyawa yang tidak memiliki kromo+or.

- 'bat-obat harus diekstraksi dari +ormulasi sebelum

dianalisis.

- Terbentuknya buangan pelarut organik dalam jumlah

besar# yang mahal jika dibuang.

5.F0e 1,06 10- 0e 9e+08

Terdapat dua mekanisme penting yangmenyebabkan penahanan suatu senyawa melewati

kolom. Kedua mekanisme untuk gel silika yang

merupakan pengemas +ase lurus# dengan mekanisme

penahanan melalui adsorpsi gugus polar suatu molekul

pada gugus polar +ase diam. Cel silika '*& juga yang

merupakan pengemas +ase balik dengan mekanisme

penahanan akibat partisis bagian lipoflik suatu molekulke dalam +ase diam.

*ua diantara pengemas yang paling umum

digunakan adalah gel silika untuk penerapan

kromatograf +ase-lurus dan silika '*& untuk penerapan

kromatograf +ase-balik# tetapi tersedia berbagai

pengemas +ase-lurus dan +ase-balik# yang sebagian besar

berdasarkan pada modifkasi kimia permukaan gel silika#meskipun saat ini +ase diam berbasis polimer organik

telah tersedia. &ebagian besar senyawa akan ditahan

terutama tergantung pada polaritasnya# dalam hal gel

silika# dan terutama pada lipoflisitasnya dalam hal


12/23

pengemas +ase-balik seperti gel silika '*&. Kebanyakan

molekul obat ini memiliki gugus polar dan lipoflik. Daktor

lain yang perlu dipertimbangkan berkaitan dengan tinkat

retensi senyawa tertentu# selain dari +ase diam# adalahsi+at +ase gerak. &emakin polar suatu +ase gerak# semakin

cepat +ase tersebut akan mengelusi senyawa dari kolom

silika gel# dan semakin lipoflik suatu +ase gerak# semakin

cepat +ase tersebut akan mengelusi senyawa dari kolom

+ase-balik.

Daktor-+aktor struktural yang mengatur laju elusi senyawa

dari kolom K%KT

- Jlusi senyawa netral

Daktor penentu waktu yang dibutuhkannya untuk terelusi

dari kolom K%KT adalah kesetimbangan antara polaritas

dan lipoflisitas# sedang p +ase gerak tidak berperan.

*alam hal kolom +ase balik# semakin lipofl suatu

senyawa# semakin banyak senyawa tersebut ditahan.:ntuk kolom polar seperti gel silika# semakin polar suatu

senyawa semakin banyak senyawa tersebut akan

ditahan. Polaritas sering dikaitkan dengan jumlah dan

kekuatan ikatan hidrogen gugus hidroksil yang ada di

dalam molekul.

- Pengendalian laju elusi senyawa-senyawa yang dapat

terionisasi melalui penyesuaian p +ase gerak

&alah satu +aktor lain yang dapat digunakan untuk

mengendalikan kekuatan pelarut pada +ase gerak adalah

p. Pengendalian p terutama dilakukan pada


13/23

kromatograf +ase balik. 3amun# kondisi +ase gerak dapat

dipilih pada kromatograf +ase lurus ketika ionisasi analit-

analit tersebut ditekan# dan senyawa basa digerakkan

dalam +ase gerak yang bersi+at basa# sedangkan senyawaasam digerakkan dalam +ase gerak yang bersi+at asam.

Pengendalian laju elusi dengan p +ase gerak# tentu saja

hanya dapat diterapkan pada senyawa-senyawa yang

derajat ionisasinya tergantung pada p# tetapi hal ini

mmencangkup sebagian besar obat yang laim

digunakan. p +ase gerak hanya dapat diatur di dalam

rentang lebih kurang 4 ,#0 unit p karena

kecenderungan ekstrem-ekstrem p melarutkan gel silika

dan memutuskan ikatan antara bahan penyalut-silana

dan penyangga gel silika.


14/23

bahwa penurunan 1! +ase organik menyebabkan

peningkatan +aktor kapasitas tiga kali lipat.


15/23

- &elekti/itas hidro+obik N%4 9 kPBAkBB

- &elekti/itas bentuk N TA' 9 k TAk'

- Kapasitas ikatan hidrogen N%AP 9 kcAkP

- Kapasitas penukar ion total NBAP9 kBA kP $p ?#6)

- Kapasitas penukar ion asam NBAP9 kBA kP $p 4#?)

%.K;l;6 Terdapat 4 jenis kolom dalam K%KT# yaituG

- Kolom kon/ensionalG kolom dengan kinerja#

e+esiensinya meningkat dengan berkurangnyaukuran partikel +ase diam# akan tetapi umur kolom

dengan ukuran partikel " m lebih pendek.- Kolom mikroborG kinerjanya sangat e+esien dan

sensiti+# akan tetapi lambat. Konsumsi +ase gerak

hanya O dari kolom kon/ensionalKolom mikroba memiliki keuntungan utama

dibandingkan dengan kolom kon/ensional# yakniGa. Konsumsi +ase gerak kolom mikrobor hanya

,! atau lebih kecil dibandingkan dengan

kolom kon/ensional karena pada kolom

mikrobor kecepatan alir +ase gerak lebih

lambat $1!-1!! mAmenit).b.=danya aliran +ase gerak yang lebih lambat

membuat kolom mikrobor lebih ideal jika

digabung dengan spektrometer massa.c. &ensiti/itas kolom mikrobor ditinggalkan

karena solut lebih pekat# karenanya jenis

kolom ini sangat berman+aat jika jumlah

sampel terbatas misal sampel klinis.


16/23

#.M0


17/23

partikel-partikel senyawa yang tetap ada setelaah

e/aporasi +ase gerak.

- *etektor elektrokimia G deteksi didasarkan pada

produksi elektron-elektron saat analit tersebut

dioksidasi# yang merupakan mode operasi yang

paling umum# atau konsumsi elektron-elektron dalam

mode redukti+.

- *etektor amperometik berpulsa G detektor ini hampir

tidak memiliki perbedaan dengan detektor

elektrokimia kecuali bahwa detektor ini sebagianbesar timbul sebagai bagian dari kromatograf ion

dan ccenderung digunakan dalam mode

amperometrik# yang mengukur kondisi arus antara

kedua elektroda oleh suatu analit ionik dan bukan

perubahan arus yang dihasilkan dari oksidasi atau

reduksi analit tersebut.

- *etektor indeks bias G deteksi didasarkan padaperubahan indeks bias ketika analit tersebut

melewati sel sampel di dalam detektor# sel baku diisi

dengan +ase gerak.

- *etektor uoresensi G deteksi didasarkan pada emisi

beruoresensi setelah eksitasi senyawa

beruoresensi pada panjang gelombang yang tepat.

=.Pe-e+00-

Penerapan secara umum adalahG


18/23

- Kombinasi kromatograf cair tekanan tinggi $K%KT)

dengan pemantauan melalui deteksi :;A/isibel

memberikan suatu metode yangg akurat# tepat# dan

terandalakan untuk analisi kuantitati+ produk-produk+armasi dan merupakan metode standar di industri

untuk tujuan ini.

- Pemantauan stabilitas at-at obat murni dan obat-

obat dalam +ormulasi# dengan penukuran kuantitas

semua hasil urai.

- Pengukuran obat-obat dan metabolitnya di dalamcairan biologis.

- Penentuan koefsien partisi dan nilai-nilai pKa obat

dan penentuan ikatan protein obat.

Penerapan K%KT untuk analisis kuantitati+ obat-obatan

dalam +ormulasi

- =nalisis berdasarkan kalibrasi dengan baku eksternal- =nalisis tablet parasetamol dengan menggunakan

kur/a kalibrasi- Penetapan kadar parasetamol dan aspirin dalam

tablet dengan menggunakan kur/a kalibrasi rentang-

sempit.- Penetapan kadar krim hidrokortison dengan kalibrasi

satu-titik terhadap baku internal.Penerapan kadar yang melibatkan teknik-teknik K%KT

yang lebih khusus


19/23

- Penetapan kadar injeksi adrenalin secara

kromatograf dengan senyawa pasangan ion anionik- Penetapan kadar asam askorbat secara kromatograf

dengan senyawa pasangan ion kationik dan deteksi

elektrokimia- Penetapan kadar protein dengan kemasan K%KT

berpori lebar

PENUTUP


20/23

*emikian dapat diketahui bahwaG

- Prinsip *asarG Prinsip dasar dari K%KT# dan semua

metode kromatograf adalah memisahkan setiap

komponen dalam sample untuk selanjutnya

diidentifkasi $kualitati+) dan dihitung berapa

konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut

$kuantitati+). :ntuk K%KT sendiri pemisahan

didasarkan atas perbedaan si+at kepolarannya.

&ebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi

krusial point dalam metode K%KT. @ang pertama

adalah proses separasiApemisahan dan yang keduaadalah proses identifkasi. *ua hal ini mejadi +aktor

yang sangat penting dalam keberhasilan proses

analisa.Prinsip KerjaG &uatu +ase gerak cair dipompa

dibawah tekanan melalui kolom baja yang

mengandung partikel-partikel +ase diam dengan

diameter "-1! um. =nalit tersebut dimasukkan kedalam bagian atas kolom melalui katup lengkung dan

pemisahan suatu campuran berlangsung sesuai

dengan lamanya waktu relati+ yang dibutuhkan oleh

komponennya di dalam +ase diam. Perlu diperhatikan

bahwa semua komponen di dalam cammpuran

membutuhkan waktu yang kurang lebih sama

dengan +ase gerak agar dapat keluar dari kolom.Pemantauan eluen kolom dapat dilakukan dengan

berbagai detektor. 5enis-jenis K%KT: Kromatograf padat-cair#

Kromatograf partisi# Kromatograf penukar ion# dan

Kromatograf eksklusi.


21/23

nstrumensiG


22/23

- Terdapat 4 jenis kolom dalam K%KT# yaitu kolom

kon/ensional dan kolom mikrobor.- 2acam *etektor yang digunakan adalah detektor :;

panjang gelombang yang ber/ariasi# detektor dioda

array $*=*)# detektor hamburan-cahaya e/aporati+#

detektor elektrokimia# detektor amperometik

berpulsa# detektor indeks bias# dan detektor

uoresensi.- Penerapannya antara lainG Pengukuran obat-obat dan

metabolitnya di dalam cairan biologis# penentuan

koefsien partisi dan nilai-nilai pKa obat dan

penentuan ikatan protein obat# analisis berdasarkan

kalibrasi dengan baku eksternal# analisis tablet

parasetamol dengan menggunakan kur/a kalibrasi#

dan penetapan kadar protein dengan kemasan K%KT

berpori lebar


23/23

&AFTAR PUSTAKA

7atson. *a/id.# 4!!# Analisis Farmasi# Jdisi 4.# JC%# 5akarta.

Cholib# bnu dan

Kromatografi Cair Tekanan Tinggi

Documents