Kromatografi Cair 4

BAB IV. KROMATOGRAFI CAIR

A. INTERAKSI SOLUT-FASE GERAK-FASE DIAM

Sistem paling sedrhana dari kromatografi cair adalah kromatografi kolom

terbuka. Sistem ini tergolong non-instrumental method. Hampir semua sampel

dapat dianalisis dengan metode ini dan tidak perlu pre treatment seperti

penguapan pada kromatografi gas. Hal yang menjadi kekurangan dari sistem ini

adalah keterbatasannya dalam menjaga laju alir fase gerak dan membuat fase

diam terpacking secara merata. Oleh karena itu dalam banyak kasus sering

terjadi pelebaran pita kromatogram.

Ada banyak macam interaksi solut-fase diam-fase gerak yang mendasari

terjadinya proses pemisahan dalam kromatografi ini, yaitu : Adsorpsi permukaan

(didasarkan pada mekanisme adsorpsi-desorpsi solut dalam fase diam)

1. Partisi (didasarkan pada partisis solut dalam fase diam dan fase gerak)

2. Ion exchange atau pertukaran ion (didasarkan pada pertukaran ion solut

dan fase diam)

3. Eksklusi (didasarkan pada perbedaan ukuran partikel solut)

Kromatografi adsorpsi

Dalam kromatografi adsorpsi fase diam yang digunakan merupakan

padatan biasanya silika dan alumina. Solut dan fase gerak dapat berinteraksi

dengan sisi polar dari fase diam. Pemisahan terjadi oleh karena perbedaan

kekuatan adsorpsi solut terhadap fase diam.

Fase diam alumina dapat digunakan untuk analisis amina dan derivatnya.

Fase gerak yang dapat dipakai adalah heksana, kloroform atau 2-propanol.

Sedangkan fase diam silika dapat digunakan untuk analisis eter, ester, porphirin

dan vitamin larut lemak. Fase gerak yang dapat dipakai adalah heksana,

kloroform dan 2-propanol.

Kromatografi Partisi

Pemisahan dalm kromatografi partisi terjadi oleh karena adanya partisis

solut dalam dua fase cair yang berbeda. Perjalanan solut dalam kolom hampir

sama dengan perjalanan solut dalam ekstraksi berkelanjutan. Solut yang lebih

larut dalam fase diam akan tertahan lebih lama dalam kolom daripada solut yang

kelarutannya dalam fase diam kecil. Ada dua tipe dalam kromatografi partisi yaitu

:

1. Normal phase chromatography atau kromatografi fase normal, bila fase

diamnya bersifat polar dan fase geraknya bersifat non polar. Fase diam

yang dapat digunakan adalah amino (-NH2), Cyano (-CN) dan Diol

(glycidoxy-ethilmethokxysilane)

2. Reverse phase chromatography atau kromatografi fase terbalik, bila fase

diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar. Fase diam

yang dapat digunakan adalah RP-2 ( Si-CH2-CH3 ), RP-8 (Si-(CH2)7-

CH3), RP-18 (Si-(CH2)17-CH3.

Ion Exchange Chromatography atau Kromatografi Penukar Ion

Fase diam yang digunakan adalah molekul yang memiliki muatan ionik di

permukaannya dan muatannya berlawanan dengan muatan ionik solut. Kadang

molekul fase diam ini diikatkan pada bahan penyangga. Kromatografi tipe ini

cocok digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa ionik.

Pada gambar di atas fase diam mempunyai muatan positif. Bila ada solut

yang bermuatan positif lebih kuat maka dapat mendesak dan menggantikan

muatan positif fase diam dan terjadilah proses retensi solut dalam fase diam.

Adanya perbedaan kekuatan interaksi antara solut dan fase diam menyebabkan

terjadinya pemisahan. Ada dua macam kromatografi penukar ion yaitu :

1. Penukar kation (cationic exchange}, bila muatan yang dipertukarkan

adalah positif

X+ + R-K+ X+R- + K+

Penukar kation kuat dapat menggunakan golongan asam sulfonat,

sedangkan penukar kation lemah dapat menggunakan golongan

karboksilat (-COOH)

2. Penukar anion (anionic exchange), bila muatan yang dipertukarkan

adalah negatif

x- + R+Cl- X-R+ + Cl-

Penukar anion kuat dapat menggunakan golongan amino quarterner,

sedangkan penukar anion lemah dapat menggunakan golongan amin

primer.

Di samping pemilihan fase diam, perlu mendapat perhatian adalah

pemilihan buffer. Derajat keasaman (pH) buffer harus dipilih pada pH di mana

komponen sampel yang akan dianalisis berada dalam bentuk ion. Untuk

pemisahan anion disarankan pH>6 atau pH>pKa, sedangkan untuk pemisahan

kation disarankan pH<6 atau pH<pKa. Konsentrasi buffer juga harus seminimal

mungkin untuk menghindari terjadinya kompetisi dengan solut.

Size Exclusion Chromatographyatoau Kromatografi Eksklusi

Kromatografi eksklusi juga disebut kromatogarfi permeasi gel. Proses

pemisahan didasarkan pada ukuran partikel solut. Sebagai fase diam adalah

material yang terkontrol ukuran partikelnya, bisa silika atau gelas yang ukuran

partikelnya terkontrol atau gel organik seperti agarosa dan poliakrilamid. Sistem

kromatografi ini biasa dipakai untuk menentukan ukuran partikel dari senyawa

polimer seperti protein. Partikel solut denan ukuran partikel besar akan terelusi

lebih cepat karena mereka melewati ruang antar partikel fase diam. Sebaliknya,

partikel solut dengan ukuran partikel kecil akan terelusi lebih lama karena

mereka harus melewati pori-pori fase diam.

Ion Pair Chromatography atau Kromatografi Pasangan Ion

Prinsip pemisahan tidak berbeda jauh dengan kromatografi penukar ion

yaitu adanya pergantian ion solut dengan ion fase diam seperti pada gambar

III.6. Hanya saja fase diam yang dipakai adalah fase diam reverse phase Q atau

C18. Lapisan muatan fase diam dibuat dengan jalan melewatkan fase gerak yang

berisi pasangan ion. Pasangan ion selanjutnya akan mengimpregnasi C8 atau

C18 sehingga fase diam menjadi bermuatan. Pasangan ion fase gerak tertata

melapisi C8 atau C18 dengan muatan positif berada bebas dan muatan negatif

terikat pada C8 atau Q8. Bila terdapat ion positif lebih kuat daripada muatan

positif fase gerak, maka ion solut ini akan mengganti kedudukannya dan menjadi

tertahan dalam kolom. Untuk mengeluarkan solut maka dilakukan pendesakan

dengan fase gerak yang memiliki kekuatan muatan positif jauh lebih kuat

daripada muatan ion positif ion solut.

B. Pemilihan Fase Gerak

Untuk menentukan jenis fase gerak maka perlu mengetahui terlebih

dahulu sistem kromatografi apa

kromatografi didasarkan pada jenis dan sifat dari solut yang akan dianalisis.

Berikut ini garis besar menentukan sistem kromatografi yang sesuai.

Dalam memilih fase gerak, perlu memperhatikan dua hal penting yaitu :

1. Solvent strength,

Sebagai fase diam acuan adalah silika atau alumina.

2. Polarity index, yaitu kepolaran dari fase gerak, terutama dalam kromatografi

fase terbalik.

Harga solvent strength

mencampur lebih dari satu macam pelarut.

Pemilihan fase gerak untuk kromatografi fase terbalik didasarkan pada

hukum Snyder. Menurut Snyder solven atau pelarut dapat diklasifikasikan

menjadi tujuh golongan berdasarkan keasaman,

sifat kimianya, seperti gambar IV. 1 dan tabel IV. 1 berikut ini.

Gambar IV. 1. Skema pemilihan sistem kromatografi

Pemilihan Fase Gerak


dahulu sistem kromatografi apa yang akan dikerjakan. Pemilihan sistem




Solvent strength, yaitu kemampuan membawa solut melintasi fase diam.

Sebagai fase diam acuan adalah silika atau alumina.

yaitu kepolaran dari fase gerak, terutama dalam kromatografi

solvent strength dan plarity yang optimum dapat dicari dengan

mencampur lebih dari satu macam pelarut.


Menurut Snyder solven atau pelarut dapat diklasifikasikan

menjadi tujuh golongan berdasarkan keasaman, kebasaan, momen dipol dan

sifat kimianya, seperti gambar IV. 1 dan tabel IV. 1 berikut ini.



yang akan dikerjakan. Pemilihan sistem




yaitu kemampuan membawa solut melintasi fase diam.

yaitu kepolaran dari fase gerak, terutama dalam kromatografi

optimum dapat dicari dengan


Menurut Snyder solven atau pelarut dapat diklasifikasikan

kebasaan, momen dipol dan


Tabel IV. 1. Klasifikasi solven menurut Snyder

GOLONGAN

I ETER ALIFATIK, ALKIL

II ALKOHOL ALIFATIK

III TETRA HIDRO FURAN, PIRIDIN, DIMETIL SULFOKSIDA,

AMIDA

IV FORNAMIDA, ASAM ASETAT, GLIKOL

V DIKLORMETAN, 1,2

VI ALKIL HALIDA, ESTER, KETON, NITRIL

VII BENZENA DAN DERIVATNYA

VIII KLOROFORM, M

Gambar IV.2. Pembagian solven berdasarkan Snyder

Dalam praktek tidak semua solven tersebut dapat dipakai karena

beberapa alasan, antara lain :

� Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan

� Menimbulkan interaksi kimia

� Mengganggu sinyal de

� Viskositas sangat tinggi

� Toksik dan mudah terbakar

Tabel IV. 1. Klasifikasi solven menurut Snyder

CONTOH SOLVEN

ETER ALIFATIK, ALKIL AMINA

ALKOHOL ALIFATIK

TETRA HIDRO FURAN, PIRIDIN, DIMETIL SULFOKSIDA,

AMIDA

FORNAMIDA, ASAM ASETAT, GLIKOL

DIKLORMETAN, 1,2-DIKLOROETIL

ALKIL HALIDA, ESTER, KETON, NITRIL

BENZENA DAN DERIVATNYA

KLOROFORM, M-KRESOL, AIR



beberapa alasan, antara lain :

Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan

Menimbulkan interaksi kimia

Mengganggu sinyal detektor, seperti dapat menyerap sinar ultra violet

Viskositas sangat tinggi

Toksik dan mudah terbakar

TETRA HIDRO FURAN, PIRIDIN, DIMETIL SULFOKSIDA,



Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan

tektor, seperti dapat menyerap sinar ultra violet

� Tekanan uapnya terlalu tinggi

� Terlalu mahal

Dari sekian jenis solven yang paling sering digunakan adalah :

� Metanol, mewakili golongan asam

� Asetonitril, mewakili golongan basa

� Terra hidro furan, mewakili golongan yang mempunyai momen dipol

besar

� Air, untuk mengatur polaritas

Syarat fase gerak yang baik untuk kromatografi cair adalah :

� Viskositas rendah

� Tersedia dalam kemurnian yang tinggi

� Tidak menginterferensi sinyal detektor

� Dapat bercampur dengan fase gerak yang lain

Untuk meningkatkan resolusi pemisahan dan efektifitas elusi, maka teknik

elusi dapat dikembangkan, yaitu dengan teknik elusi gradien. Elusi gradien

adalah elusi menggunakan komposisi fase gerak yang diubah-ubah secara

terprogram, sedangkan bila elusi dikerjakan dengan satu macam komposisi fase

gerak mulai dari start hingga finish disebut elusi isokratik. Perubahan komposisi

fase gerak dapat dikerjakan secara linear atau non linear (curved program).

Dengan teknik elusi gradien maka resolusi dapat diatur sedemikian rupa

sehingga waktu analisis dapat dipersingkat. Teknik elusi gradien ini terutama

ditujukan untuk :

� Sampel yang terdiri dari campuran senyawa yang meiliki kisaran harga

factor kapasitas 0.5<k'<20

� Sampel yang terdiri dari molekul-molekul dengan berat molekul cukup

besar (BM>1000)

� Sampel yang mengandung senyawa pengganggu dengan waktu retensi

sangat besar

� Sampel dengan konsentrasi sangat encer sehingga volume yang

dianalisis sangat banyak. Dengan teknik ini diharapkan dapat

meminimalkan pelebaran pita kromatogram karena overload volume.

C. Instrumentasi Kromatografi Kolom Terbuka

Instrumentasi dalam kromatografi cair kolom terbuka hanya terdiri dari

kolom tempat fase diam yang terbuat dari kaca, tempat fase gerak dan

tampungan hasil elusi yang dapat menggunakan erlenmeyer atau beker glass.

Hasil elusi selanjutnya dapat dianalisis menggunakan detektor yang sesuai.

Gambar IV.3. Instrumentasi kromatografi kolom

Kromatografi kolom terbuka biasanya dimanfaatkan untuk clean up atau

pembersihan suatu larutan atau ekstrak sampel sebelum akhirnya dianalisis

secara instrumentasi. Seperti misalnya pada penghilangan klorofil dari ekstrak

tanaman menggunakan kolom berisi fase diam florisil atau penghilangan lemak

dari ekstrak makanan dengan menggunakan kolom berisi fase diam alumina.

D. Solid Phase Extraction SPE (Ekstraksi Padat Cair)

Bila dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair seperti yang umum dipakai,

SPE memiliki banyak keuntungan, yaitu :

� Ekstraksi analit lebih komplit atau sempurna

� Pemisahan bahan pengganggu dari analit lebih efisien

� Mengurangi kebutuhan pelarut

� Fraksinasi terhadap larutan sampel lebih mudah dikerjakan

� Dapat menghilangkan partikulat

� Mudah dilakukan otomatisasi

Namun demikian teknik SPE memiliki kekurangan yaitu variabilita isi dari tiap

cartridge cukup besar dan sering terjadi adsorbs! irreversibel

komponen dalam cartridge.

Teknik SPE ini dapat diaplikasikan untuk keperluan antara lain :

� Menghilangkan material pengganngu dan perusak kolom HPLC

� Pemekatan sampel

� Desalting atau menghilangkan garam

� Penggantian pelarut

� Derivatisasi in situ

� Penyimpanan sampel terutama dalam masa transportasi sampel

E. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi

HPLC merupakan pengembangan dari kromatografi kolom terbuka. HPLC

digunakan untuk analisis senyawa yang non vol

dalam HPLC merupakan material yang dipacking dalam kolom dan memiliki

ukuran partikel berdiameter 3

melewati fase diam hanya dengan mengandalkan gaya gravitasi seperti pada

kromatografi kolom terbuka. Diperlukan suatu pompa yang mendorong fase

gerak agar dapat melewati fase diam dengan kecepatan tertentu yang dapat

memberikan jumlah lempeng teoritik maksimum, sehingga mendapatkan

pemisahan yang maksimal.

Pilihan detektor untuk HPLC

kromatografi gas. Detektor yang paling banyak dipergunakan adalah

spektrofotometer dengan keterbatasan hanya molekul yang dapat mengabsorpsi

sinar saj'a yang dapat dianalisis.

cartridge cukup besar dan sering terjadi adsorbs! irreversibel

komponen dalam cartridge.


Menghilangkan material pengganngu dan perusak kolom HPLC

Pemekatan sampel

Desalting atau menghilangkan garam-garam

Penggantian pelarut

Derivatisasi in situ

Penyimpanan sampel terutama dalam masa transportasi sampel

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi


digunakan untuk analisis senyawa yang non volatil dan termolabil. Fase diam


ukuran partikel berdiameter 3-10µm. Oleh karena itu fase gerak tidak dapat


grafi kolom terbuka. Diperlukan suatu pompa yang mendorong fase



pemisahan yang maksimal.

Pilihan detektor untuk HPLC lebih terbatas bila dibandingkan dengan



sinar saj'a yang dapat dianalisis.

Gambar IV.4. Bagan alat HPLC

cartridge cukup besar dan sering terjadi adsorbs! irreversibel beberapa


Menghilangkan material pengganngu dan perusak kolom HPLC

Penyimpanan sampel terutama dalam masa transportasi sampel

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi


atil dan termolabil. Fase diam


m. Oleh karena itu fase gerak tidak dapat


grafi kolom terbuka. Diperlukan suatu pompa yang mendorong fase



lebih terbatas bila dibandingkan dengan



Solven atau fase gerak untuk HPLC hendaknya memenuhi kriteria :

� Mempunyai kemurnian tinggi

� Sebelum digunakan disaring terlebih dahulu dengan kertas saring dengan

ukuran pori 0.2 µm

� Bebas dari gas yang dapat mengganggu detektor atau menyumbat

kolom.Dapat dilakukan dengan memanaskan solven sebelum digunakan

atau mengaplikasikan motor vaccum.

Keterangan Bagan Alat HPLC

Gradient controller atau pengatur gradien, adalah alat untuk mengatur komposisi

fase gerak apabila elusi dikerjakan secara gradien

Pump/dampning system, adalah pompa yuntuk menyedot fase gerak yang

dilengkapi dengan peredam getaran, sehingga aliran fase gerak stabil tidak

dipengaruhi oleh getaran pompa selama bekerja.

Sample introduction, adalah alat untuk memasukkan sampel biasanya berupa

rotary loop. Ketika injektor berada dalam posisi load sampel dimasukkan dengan

bantuan syringe, sehingga sampel akan memenuhi tempat penampungan

sampel. Bila volume sampel terlalu besar, maka kelebihan sampel akan terbuang

secara otomatis ke saluran pembuangan (vent). Ketika injektor ini diposisikan

inject, maka aliran fase gerak akan berubah, fase gerak akan mengalir dengan

membawa sampel ke arah kolom.

Column/Pre column, adalah bagian jantung pemisahan dalam HPLC. Kolom

biasanya terbuat dari bahan stainless steel dan ukuran diameter dalam terukur

dengan presisi tinggi. Guard column adalah kolom berukuran kecil yang

diletakkan di antara injektor dan kolom analitik. Fungsinya adalah untuk

menahan senyawa yang kemungkinan dapat menyumbat kolom analitik. Fase

diam dibuat dari jenis bahan yang sesuai dengan fase diam pada kolom analitik.

Kolom analitik biasanya berukuran panjang 15 cm, diameter dalam 4.6 mm

dengan ukuran partikel fase diam 10 µm (memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar

5000), 5 µm (memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar 9000), 3 µm (memiliki

jumlah lempeng teoritik sekitar 15000). Agar diperoleh hasil pemisahan yang

baik, maka perlu dilakukan evaluasi kolom secara berkala. Evaluasi terhadap

kelayakan kolom dapat dipantau dengan mengevaluasi harga beberapa

parameter di bawah ini secara berkala :

� Faktor kapasitas berkisar 2-10

� Jumlah lempeng teoritik tidak mengalami perubahan yang signifikan

� Faktor resolusi (Rs) harus > 1.5

� Peak asimetri < 1.2

� Tekanan kolom dalam kisaran normal (dapat dikerjakan oleh pompa

dengan ringan)

Ada banyak faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom sehingga harus

dioptimasi agar diperoleh pemisahan yang baik, yaitu :

� Kecepatan alir fase gerak, kecepatan alir yang sangat lambat akan

menyebabkan terjadinya difusi longitudinal, sedangkan bila terlalu cepat

akan menyebabkan terjadinya transfer masa non ekuilibrium, sehingga

terjadi pelebaran pita kromatogram

� Ukuran partikel fase diam, semakin kecil ukuran partikel maka efisiensi

semakin baik Tetapi menyebabkan tekanan dalam kolom semakin besar

sehingga dibutuhkan kekuatan pompa yang semakin besar.

� Panjang kolom, semakin panjang akan semakin besar harga efisiensi

kolom, tetapi dapat menyebabkan terjadinya pelebaran pita.

� Viskositas fase gerak, semakin kecil harga viskositas fase gerak maka

efisiensi kolom semakin besar.

� Temperatur, semakin tinggi temperatur maka viskositas semakin rendah

dan efisiensi kolom menjadi lebih besar.

� Volume ekstra kolom, semakin besar volume ekstra kolom

maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita semakin besar, sehingga

efisiensi semakin berkurang.

� Jumlah sampel dan volume sampel, bila jumlah maupun volume sampel

sangat besar (overload) maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita

semakin besar, sehingga efisiensi semakin berkurang.

Detector, merupakan alat untuk melihat adanya sinyal dari analit atau solut yang

sedang dianalisis. Hendaknya memiliki kriteria : sensitivitasnya tinggi, batas

deteksi rendah, linearitas respon tinggi dan reprodusibilitasnya tinggi. Ada

banyak detektor yang dapat diaplikasikan, yaitu :

� Detektor spektrofotometer UV/Vis, merupakan detektor universal dan

dapat diaplikasikan pada semua analit yang dapat menyerap sinar uv/vis.

Fase gerak yang dipakai tidak boleh menyerap sinar uv/vis pada panjang

gelombang yang dipilih.

� Detektor spektrofluorometer, merupakan detektor yang lebih selektif dan

lebih sensitif daripada detektor spektrofotometer. Tidak semua senyawa

bersifat fluoresens dan tidak semua senyawa yang berfluorsens memiliki

panjang gelombang eksitasi dan emisi yang sama dengan senyawa lain.

� Detektor indeks bias, merupakan detektor yang sinyalnya tergantung

pada perubahan harga indeks bias fase gerak oleh karena adanya analit

atau solut.

� Detektor elektrokimia, ada banyak jenisnya antara lain : detektor

konstanta dielektrika (didasarkan pada perubahan polaritas fase gerak

oleh karena adanya solut), detektor konduktometer (didasarkan pada

perubahan sifat penghantaran listrik dari fase gerak oleh karena adanya

solut), detector amperometer (didasarkan adanya perubahan kekuatan

medan listrik dari fase gerak karena adanya solut).

Contoh Aplikasi Pemisahan Peptida Dan Protein Dengan Rp-HPLC

Kondisi Awal Yang Bisa Dipakai:

VARIABEL PEPTIDA PROTEIN Kolom Bonded phase

Dimensi Partikel

C18 atau C8

0.46 X 15 atau 25 cm

3.5-10 µm (diameter)

80-300 A° (pori)

C4, C3, CN

0.46 x 5-15 cm

3.5-10 µm (diameter)

300 A° (pori)

Fase gerak Solven A

Solven B Gradien

0.12% TFA/air

0.10%TFA/air

0-60% B/60 menit

0.12% TFA/air

0.10%TFA/air

0-60% B/60 menit

Temperatur 40 - 80 °C 40 - 80 °C

Kecepatan alir 0.5 - 2 ml/menit 0.5 - 2 ml/menit

Ukuran sampel Volume

Berat

10-50 µL

1-100 µg

10-50 µL

1-100 µg

Problem yang mungkin muncul:

� Bentuk pita yang jelek : melebar, tailing

� Recovery rendah

� Timbul pita yang misterius

� Pita ganda untuk satu jenis analit

� Performance kolom berubah, tr tidak reprodusibel

Faktor penyebab :

� Kolom rusak, terlalu asam, terlalu hidrofob, terlalu kecil ukuran pori-

porinya

� Denaturesi sampel

� Isomerisasi (cis ke trans)

Pengatasannya :

� Pemisahan pada ph rendah (fase gerak 0.1 % Tetra fluoro Acid)

� Gunakan asetonitril sebagai solven organik. Untuk sampel yang hidrofob

gunakan propanol

� Analisis dikerjakan pada temperatur kolom 50 - 80°c

� Gunakan zwitterionic detergent

Contoh aplikasi pemisahan peptida dan protein dengan ion exchange HPLC

Kondisi yang bisa dipakai :

VARIABEL

PROTEIN ASAM

(ANION EXCHANGE)

PROTEIN BASA

(KATION EXCHANGE)

Kolom

Bonded phase

Ukuran

DEAE, SAX, PEI

5-25 x 0.46cm

CM, SP

5-25 x 0.46 cm

Fase gerak

Solven A

Solven B

Gradien

10mm tris atau phosphat (pH 8)

Solvent A + 0.5m NaCI atau Na-

asetat

0-100% B dalam 30 menit

10mm bis-tris atau phosphat (pH

6) Solvent A + 0.5m NaCI atau

Na-asetat

0-100% B dalam 30 menit

Temperatur 35 °c 35 °c Kecepatan alir 1.0ml/ menit l.0ml/menit

Ukuran sampel

Volume Berat

10-50 µl

1-100 µg

10-50 µl

1-100 µg

Keuntungan :

� Konformasi protein tetap terjaga,

� Kemungkinan denaturasi kecil,

� Dapat digunakan untuk isolasi dan purifikasi protein dengan tetap

berbentuk bioaktif

� Protein basa biasa memakai kation exchange, dengan ph 3

Problem yang sering muncul:

� Recovery rendah dan dapat diatasi dengan menggunakan gradien elusi

dengan fase gerak mengandung garam.

Contoh analisis campuran aspartam, benzoat dan kafein dengan RP-HPLC

Variabel Kondisi

Fase diam C18, panjang 15 cm

Fase gerak A : asam asetat 0.02 M dalam air pH 4.0; B :

asetonitril

Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir 1 ml/menit

Temperatur Temperatur kamar

Detektor Spektrofotometer UV 254 nm

Volume injeksi 20 µl

Perhitungan Standard eksternal

Contoh analisis campuran asam salisilat, kafein dan parasetamol dengan

RP-HPLC

Variabel Kondisi

Fase diam C18, panjang 15 cm

Fase gerak A : buffer TBA, dibuat dengan melarutkan 4.0

gram KH2P04 dan 1.5 gram Tetra butilamonium

bromida dalam 350 ml aquadest (larutan 1).

Melarutkan NaaHP04 dalam aquadest hingga

diperoleh konsentrasi lg/100 ml (larutan 2).

Campur larutan 1 dan 2 hingga diperoleh pH 6.

Encerkan dengan aquadest hingga 1 L.

B : Asetonitril

Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir l ml/menit

Temperatur Temperatur kamar

Detektor Spektrofotometer UV 254 nm atau �,

maksimumnya

Volume injeksi 20 µl

Perhitungan Standard eksternal

Kromatografi Cair 4

Documents