Kotimaisten lajihunajien karakterisointi NMR-metabolomiikalla. Maaria Kortesniemi

Kotimaisen lajihunajan karakterisointi NMR-metabolomiikalla

Talvipäivät 24.–25.1.2015, Jyväskylä

Maaria KortesniemiElintarvikekemia ja elintarvikekehitys

Biokemian laitosTurun yliopisto

Tutkimusasetelma

• Lähtökohta• Lajihunajien tunnistus työlästä, aikaa vievää ja osittain epävarmaa• Lisätietoa kotimaisista lajihunajista

• Tavoitteet• Yksiselitteinen ja tehokas menetelmä lajihunajien (kasvi)alkuperän

tunnistukseen ja yhdisteiden kvantitointiin

NMR-metabolomiikka

• NMR • engl. Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy• Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia• 1H NMR mittaa protoneita eli vety-ytimiä• Yhdisteiden rakennetutkimus

• Metabolomiikka• Tutkii aineenvaihduntatuotteita erilaisissa biologisissa kokonaisuuksissa• ”Tilannekuva”

Aiempia NMR-tutkimuksia hunajasta• Hunajan aminohappojen NMR-metabolomiikka ja kvantitointi

(Sandusky et al., 2005)

• Maantieteellisen alkuperän toteaminen NMR:llä (Consonni et al., 2008; Donarski et al., 2008)

• Kasvialkuperän määritys kloroformiuutteista 1H NMR:n ja kemometrian avulla (Schievano et al., 2010 & 2012)

• Sokerisiirapilla väärennettyjen hunajien tunnistus NMR-menetelmillä (Bertelli et al., 2010)

• Kasvialkuperän määritys vesiliukoisten yhdisteiden perusteella (Ohmenhauser et al., 2013; Zíelinski et al., 2014)

• Nopea NMR-profilointimenetelmä hunajan aitouden varmistamiseksi (Spiteri et al., 2015)

Menetelmä

• Näytteenkäsittely• 100 mg hunajaa + 800 µl vettä• Suodatus • Lisäys 10% D2O (sis. sisäinen standardi

DSS-d6 ja 2% NaN3)• pH:n mittaus ja säätö 6.55 ± 0.05• mitattava näyte 180 µl (3 mm NMR-putki)

• 1H NMR -mittaus• 600 MHz Bruker Avance• TCI cryoprobe• 298 K (25 ºC)

• Tulosten käsittely• Chenomx NMR Suite: prosessointi, profilointi, kvantitointi• SIMCA-P+: monimuuttujamallit

Kustannukset ja ajankäyttö

• Näytteenkäsittely per näyte• 20 min (aktiivinen) + 20 min (passiivinen)• Tarvikkeet ja reagenssit n. 5 €

• Mittaus per näyte• 12 min• Laiteaika 40–100 €/h (Laitekeskus, TY)

• Tulosten käsittely• Kvalitatiivinen n. 5–15 min• Kvantitatiivinen n. 1h

NMR-spektrit

lehmus

voikukka

mesikaste

tattari

kanerva

NMR-spektrit (0.7–3.1 ppm)

Ile, Leu, Val

fenyylimaito-happo

Pro

EtOH

maito-happo,

Thr

AlaTyr


glukoosi

fruktoosi

maltoosi

NMR-spekrit (4.1–4.7 ppm)

lehmus

mesikaste

α-glukoosi


β-glukoosi

mesikastemeletsitoosi

lehmus

maltoosi, sakkaroosi, …

kanervatattari

lehmus

fenyylimaitohappo, fenyylietikkahappo

muurahais-happo

HMF

bentsoe-happo

Phe


Tyr

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

-0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

t[2]

t[1]

BinningResults_002total_final_150115.M2 (PCA-X), Pareto scaledt[Comp. 1]/t[Comp. 2]

R2X[1] = 0,500051 R2X[2] = 0,327408 Ellipse: Hotelling T2 (0,95)

11C11B

12A12C

19A19C19B

12B12A

10B10C10A

11D

02B02A02C

01B01A

20A

20B20C

01C

08C

08A

08B

09C09A09B

06C13B13C

06B06A13A13A

07B07A

07D

14C14A14B

15A15B15C

03C03A

04A

05A

04C

04B

05C05B

03B

17A17B

17C

16A16B

16C18C18B

18A

SIMCA-P+ 12.0.1 - 2015-01-16 12:17:35 (UTC+2)

Pääkomponenttianalyysi (PCA)tiivistää aineiston ja kuvaa näytteiden välisiä suhteita

kanerva

tattari

apila

mesikaste

voikukka

lehmus

-0,25

-0,20

-0,15

-0,10

-0,05

-0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

-0,28 -0,26 -0,24 -0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28

p[2

]

p[1]

BinningResults_002total_final_150115.M2 (PCA-X), Pareto scaledp[Comp. 1]/p[Comp. 2]

R2X[1] = 0,500051 R2X[2] = 0,327408

9,999,979,959,939,919,899,879,859,839,819,799,779,759,739,719,699,679,659,639,619,599,579,559,539,519,499,479,459,439,419,399,379,359,339,319,299,279,259,239,219,199,179,159,139,119,099,079,059,039,018,998,978,958,938,918,898,878,858,838,818,798,778,758,738,718,698,678,658,638,618,598,578,558,538,518,498,478,458,438,418,398,378,358,338,318,298,278,258,238,218,198,178,158,138,118,098,078,058,038,017,997,977,957,937,917,89

7,877,857,837,817,797,777,757,737,717,697,677,657,637,617,597,577,557,537,517,497,477,457,437,417,39

7,377,357,33

7,317,29

7,277,257,237,217,197,177,157,137,117,097,077,057,037,016,996,976,956,936,916,896,876,856,836,816,796,776,756,736,716,696,676,656,636,616,596,576,556,536,516,496,476,456,43 6,416,396,376,356,336,316,296,276,256,236,216,196,176,156,136,116,096,076,056,036,015,995,975,955,935,915,895,875,855,835,815,795,775,755,735,715,695,675,655,635,615,595,575,555,535,515,495,47

5,455,43 5,415,39

5,37 5,35 5,335,315,29

5,275,25

5,23

5,215,195,17

5,155,135,115,09 5,07

5,055,035,014,99

4,974,95

4,934,67

4,654,63

4,614,594,57

4,55

4,534,51

4,494,474,454,434,414,39 4,374,354,334,31

4,29

4,274,254,23

4,214,19

4,17 4,154,13

4,114,09

4,07

4,05

4,034,01

3,99

3,97

3,95

3,93

3,91

3,89

3,87

3,85

3,83

3,81

3,79

3,77

3,75

3,73

3,71

3,69

3,673,65

3,633,61

3,59

3,57 3,55

3,53

3,51 3,49

3,473,45

3,43

3,41

3,39

3,37

3,353,33 3,313,293,27

3,25

3,23

3,21

3,193,173,153,133,113,093,073,053,033,012,992,972,952,932,91

2,892,872,852,832,812,792,772,752,732,712,692,672,652,632,612,59

2,572,552,532,512,492,472,452,432,41 2,39

2,372,352,332,312,292,272,252,232,212,192,172,152,132,112,092,072,052,032,011,99

1,971,95

1,931,91

1,891,871,851,831,811,791,771,751,731,711,691,671,651,631,611,591,571,551,531,511,491,471,451,431,411,391,371,351,331,311,291,271,251,231,21

1,191,17

1,151,13

1,111,091,071,051,031,010,990,970,950,930,910,890,870,850,830,810,790,770,750,730,710,690,670,650,630,61

SIMCA-P+ 12.0.1 - 2015-01-16 12:28:18 (UTC+2)

Pääkomponenttianalyysi (PCA)lataukset

fruktoosi

glukoosi

meletsitoosi

Potentiaaliset markkerit, esim.

• Kanerva• Fenyylietikkahappo, fenyylimaitohappo, …

• Lehmus• Terpeenihapon sokeriesteri (6-O-(β-D-glukopyranosyyli)-β-D-glukopyranosyyli-

4-(1-hydroksi-1-metyylietyyli)sykloheksa-1,3-dieeni-1-karboksylaatti)

• Mesikaste• Meletsitoosi

• Tattari• Isoleusiini, leusiini, valiini• Tyrosiini

Yhteenveto

• Kemiallinen sormenjälki• Hunajatyypeille spesifiset markkerit• Yhdellä mittauksella paljon tietoa näytteestä• Kvantitatiivinen • Pieni näytemäärä • Helppo näytteenkäsittely• Ei orgaanisia liuottimia

Kirjallisuutta• Bertelli et al. (2010), Detection of Honey Adulteration by Sugar Syrups Using One-Dimensional and

Two-Dimensional High-Resolution Nuclear Magnetic Resonance, J. Agric. Food Chem.• Consonni et al. (2008), Geographical Characterization of Polyfloral and Acacia Honeys by Nuclear

Magnetic Resonance and Chemometrics, J. Agric. Food Chem.• Donarski et al. (2008), Application of Cryoprobe 1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy and

Multivariate Analysis for the Verification of Corsican Honey, J. Agric. Food Chem.• Donarski et al. (2010), Identification of botanical biomarkers found in Corsican honey, Food Chem.• Sandusky et al. (2005), Use of Selective TOCSY NMR Experiments for Quantifying Minor Components

in Complex Mixtures: Application to the Metabonomics of Amino Acids in Honey, Anal. Chem.• Schievano et al. (2010), 1H Nuclear Magnetic Resonance Spectra of Chloroform Extracts of Honey for

Chemometric Determination of Its Botanical Origin, J. Agric. Food Chem. • Schievano et al. (2012), An NMR-based metabolomic approach to identify the botanical origin of

honey, Metabolomics• Schievano et al. (2013), Characterization of Markers of Botanical Origin and Other Compounds

Extracted from Unifloral Honeys, J. Agric. Food Chem.• Spiteri et al. (2015), Fast and global authenticity screening of honey using 1H-NMR profiling, Food

Chem.

Kiitos

• Lassi Kauko ja Olli Sjövall• Heikki Vartiainen ja Tarja Ollikka (SML)

• Heikki Kallio ja Baoru Yang (UTU)• Carolyn Slupsky (UC Davis)

• Suomen Kulttuurirahasto• Magnus Ehrnroothin säätiö