Korrelation von Replikationskapazität und Pathogenität zum Resistenzmuster von HIV-1 Varianten Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Monika Tschochner aus Erlangen
140
Embed
Korrelation von Replikationskapazität und Pathogenität zum ... · Korrelation von Replikationskapazität und Pathogenität zum Resistenzmuster von HIV-1 Varianten Den Naturwissenschaftlichen
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Korrelation von Replikationskapazität und Pathogenität
zum Resistenzmuster von HIV-1 Varianten
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Monika Tschochner
aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissen-
schaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2007
Vorsitzender der Promotionskomission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. B. Fleckenstein
Zweitberichterstatter: PD Dr. R. Slany
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................................... 1 2 EINLEITUNG........................................................................................................................ 5 3 ZIEL DER ARBEIT ............................................................................................................. 15 4 MATERIAL UND METHODEN ........................................................................................ 16
5.6 Vorhersage der Replikationskapazität anhand des Genotyps ....................................... 67 5.7 Analyse der Auswirkungen des wechselnden Selektionsdrucks in der CAT-Studie .... 70 5.8 Untersuchung von Viruslastveränderungen in der CAT-Studie ................................... 72 5.9 Die klinische Relevanz der RC ..................................................................................... 84
Angriffspunkte antiretroviraler Therapie im viralen Replikationszyklus
Die Angriffspunkte antiretroviraler Therapie sind in Abb. 1 dargestellt. Bereits 1985 wurde das
Thymidinanalogon AZT (3’-Azido-3’-Deoxythymidin) erstmals zur Behandlung eingesetzt
(Mitsuya et al., 1985). Das Medikament wird der Gruppe der nukleosidischen reverse
Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) zugeordnet und inhibiert durch Kettenabbruch das
Umschreiben des viralen RNS-Genoms in zunächst einzelsträngige DNS (Baltimore, 1992).
Seit 1995 stehen zwei weitere Stoffgruppen zur Verfügung: die nicht-nukleosidischen RT-
Inhibitoren (NNRTI) und die Protease-Inhibitoren (PI) (De Clercq und Balzarini, 1995;
Kageyama et al., 1994). NNRTI hemmen die reverse Transkriptase (RT) allosterisch. PI
verhindern die Reifung der viralen Partikel durch Verminderung der Spaltung der Gag / Pol-
Vorläufer-Proteine. Als neueste Stoffgruppe wurden in Deutschland im Jahr 2003 die Fusions-
Inhibitoren (FI) zugelassen. Sie wirken nach der Bindung des viralen Glykoproteins (gp)-120
an den zellulären CD4-Rezeptor und verhindern die Fusion von Virusmembran mit der
Zellmembran (Lawless et al., 1996; Wild et al., 1994). Zudem befinden sich zwei weitere
Stoffgruppen in klinischen Phase-II und -III-Studien: Die Korezeptor-Antagonisten, welche die
EINLEITUNG
6
Bindung von HIV an einen der beiden Korezeptoren CCR5 oder CXCR4 verhindern (Alkhatib
et al., 1996; Berson et al., 1996; Feng et al., 1996). CXCR4-Inhibitoren haben sich jedoch in
frühen klinischen Testungen als toxisch erwiesen. Eine weitere Stoffgruppe umfasst die
Integrase-Inhibitoren. Unter den Integrase-Inhibitoren scheinen die beiden Strangtransfer-
Inhibitoren MK-0518 und GS-9137 sehr vielversprechend zu sein. Die Hemmung des Einbaus
der viralen DNS des Präintegrationskomplexes in das Wirtsgenom führte in klinischen Studien
zu starken Viruslastsenkungen (Dayam et al., 2007; O'Neal, 2006).
Abb. 1: Schematische Darstellung der Angriffspunkte antiretroviraler Therapie im viralen Replikationszyklus nach Oette et al., 2003. Als Bestandteile antiretroviraler Therapie befinden sich nukleosidische und nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren, Protease-Inhibitoren und Fusions-Inhibitoren im klinischen Einsatz. Korezeptor-Antagonisten und Integrase-Inhibitoren werden derzeit in klinischen Studien geprüft.
Einfluss verschiedener Faktoren auf den Krankheitsverlauf
Virale und patienteneigene Faktoren nehmen erheblichen Einfluss auf den Krankheitsverlauf.
Bereits die Art der Transmission und damit auch die Höhe der individuellen Infektionsdosis
besitzen Einfluss auf den Krankheitsverlauf (Little et al., 2007). Nach erfolgter Infektion kann
durch den Einsatz der hoch aktiven antiretroviralen Therapie (HAART), bei der eine
Kombination von mindestens drei Medikamenten aus mindestens zwei verschiedenen
Medikamentenklassen eingesetzt wird, die Viruslast (VL), d.h. die Menge der HIV-1-RNS / ml
Wirtszelle
reverse TranskriptionzelluläreDNA
CD4-Rezeptor
nukleosidische und nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren
Integration
KnospungTranskription
viraleProteine
Spleißung
mRNS
genomischevirale RNS
Translation
Zusammen-bau
Reifung
zelluläres Protein
Fusions-Inhibitoren
Integrase-Inhibitoren
Protease-Inhibitoren
Korezeptor-Antagonisten
Zellkern
CXCR4/CCR5-Korezeptor
Wirtszelle
reverse TranskriptionzelluläreDNA
CD4-Rezeptor
nukleosidische und nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren
Integration
KnospungTranskription
viraleProteine
Spleißung
mRNS
genomischevirale RNS
Translation
Zusammen-bau
Reifung
zelluläres Protein
Fusions-Inhibitoren
Integrase-Inhibitoren
Protease-Inhibitoren
Korezeptor-Antagonisten
Zellkern
CXCR4/CCR5-Korezeptor
EINLEITUNG
7
Plasma, anhaltend auf labortechnisch nicht nachweisbare Mengen (< 50 Kopien / ml) gesenkt
und dadurch die durch HIV ausgelöste Morbidität und Mortalität stark vermindert werden
(Palella, Jr. et al., 1998; Van Vaerenbergh, 2001). Unter subinhibitorischer Therapie entstehen
jedoch innerhalb kurzer Zeit medikamentenresistente Virusvarianten, die zu einem
Wiederanstieg der VL mit Krankheitsprogression führen (Masuhr et al., 2002; Quinones-Mateu
et al., 2000). Diese resistenten Varianten entstehen aus einer Population genetisch eng
verwandter viraler Varianten, der so genannten Quasispezies (Coffin, 1995; Goodenow et al.,
1989; Najera et al., 1995). Die Quasispezies entsteht durch die hohe Mutationsrate des Virus,
welche durch die hohen Fehlerraten der viralen RT und der zellulären DNS-abhängigen RNS-
Polymerase, der hohen viralen Replikationsrate und der kurzen Generationszeit bedingt wird
(Laakso und Sutton, 2006; Perelson et al., 1996). Auch die Wirts-Cytidin-Deaminase
APOBEC3G (engl.: apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G), ein
zellulärer antiretroviraler Abwehrmechanismus, der während der reversen Transkription im neu
gebildeten DNS-Strang G zu A-Austausche verursacht, trägt zur viralen Sequenzdiversität bei
(Barbour und Grant, 2005; Harris et al., 2003; Zhang et al., 2003).
Hinsichtlich der Resistenzentstehung unterscheidet man primäre Mutationen und sekundäre
Mutationen (Devereux et al., 1999). Primäre Mutationen vermitteln Resistenz und erlauben
dem Virus, trotz Therapie auf niedrigem Niveau zu replizieren (Mammano et al., 1998).
Sekundäre Mutationen können auch zur Resistenz beitragen, kompensieren aber vor allem die
mit der primären Resistenz einhergehenden Fitnessverluste, wodurch die Viruslast wieder
ansteigt. Daher werden sie oft auch als kompensatorische Mutationen bezeichnet. Ihr
Auftauchen geht deshalb normaler Weise mit einer hohen VL einher (Zhang et al., 1997).
Andererseits ist auch dikutiert worden, dass primäre Mutationen zwar Resistenz vermitteln,
aber ohne Kompensation keine hohe VL verursachen, da sie die virale Fitness zu stark
beeinträchtigen (Nijhuis et al., 1999). Insgesamt definieren verschiedene Autoren den Begriff
der viralen Fitness sehr unterschiedlich. So wird darunter die virale Pathogenität, die
Infektiosität oder ganz allgemein die Anpassung von HIV an seine Umgebung verstanden
(Barbour und Grant, 2004; Ometto et al., 2002; Quinones-Mateu und Arts, 2002; Shadan und
Villarreal, 1995). In Zusammenhang mit Resistenz wird aber zumeist von der viralen
Replikationskapazität (engl.: replication capacity) in einem medikamentenfreien in-vitro-
System gesprochen (Baliga und Sutton, 2004; Deeks, 2001). Das Phänomen des Fitnessverlusts
durch Resistenzentwicklung ist bereits vielfach beschrieben worden und primäre und sekundäre
EINLEITUNG
8
Mutationen sind im Hinblick auf ihren Einfluss auf Fitness untersucht worden (Martinez-
Picado et al., 2000; Nijhuis et al., 2001).
Goudsmit und Kollegen beschrieben bereits 1997, dass der Austausch der Aminosäure T zu Y
an Position 215 und M zu L an Position 41 der RT (RT:T215Y, RT:M41L) zu einer reduzierten
Fitness führte (Goudsmit et al., 1997). Resistenz-Mutationen in der RT können einerseits mit
einer verringerten reversen Transkription einhergehen, aber auch mit anderen Veränderungen
der enzymatischen Aktivität. So führt die Mutation RT:M184V, die Resistenz gegen
Lamivudine (3TC) vermittelt, nicht nur zu einer verminderten Bindungsaffinität und einer
geringeren Einbaurate von NRTI, sondern auch zu einer höheren Lesegenauigkeit der RT
(Hamburgh et al., 1998; Wainberg et al., 1996). Für den Mutationskomplex Q151M konnte
erstmals gezeigt werden, dass eine Anhäufung multipler NRTI-Medikamentenresistenz nicht
immer zu einer verminderten Replikationskapazität (RC) führt, sondern dass resistente
Varianten sogar schneller als der Wildtyp replizieren können (Kosalaraksa et al., 1999).
Auch für die PI-Resistenz wurde bereits 1996 beschrieben, dass stark resistente Viren kaum
noch replikationsfähig waren. Als Grund wurde eine verminderte Prozessierung des
Vorläuferproteins beschrieben, welche mit einer Reifungsstörungen des Virus sowie geringerer
Infektiosität der Partikel assoziiert werden konnte (Robinson et al., 2000; Shehu-Xhilaga et al.,
2001; Zennou et al., 1998). Veränderung der Fitness und Resistenz trat insbesondere bei
Mutationen auf, die im oder nahe des aktiven Zentrums der Protease (PR) lokalisiert waren
(Croteau et al., 1997). Diese Effekte auf die RC können Viren durch Veränderungen des Gag-
Pol-Vorläuferproteins, dem natürlichen Substrat der viralen PR teilweise kompensieren. Dabei
treten zusätzliche Mutationen in den Spaltstellen zumeist zwischen den gag-C-terminalen
Schnittstellen p1 / p6 und p7 / p1 auf (Doyon et al., 1996).
Bislang wird vor allem die Resistenz als Schlüsselfaktor für ein Therapie-Versagen angesehen
(Van Vaerenbergh, 2001). Dennoch ist die Resistenz nicht der einzige Faktor, der das
Therapie-Ansprechen beeinflusst. Weitere Faktoren sind die Erfahrung des behandelnden
Arztes, die Höhe der Medikamentenkonzentration in Plasma und Zellen, die wiederum
beeinflusst wird durch die Therapie-Treue (Adhärenz) des Patienten und die Pharmakokinetik
(Cingolani et al., 2002; Durant et al., 2000; Hirsch et al., 1998).
EINLEITUNG
9
Darüber hinaus nehmen genetische und immunologische Faktoren Einfluss auf den
Krankheitsverlauf. Beispielsweise kann eine Deletion von 32 Basenpaaren im CCR5-Gen, die
in 1 % der kaukasischen Bevölkerung homozygot und in 15 - 30 % heterozygot vorliegt, zu
einem verzögerten Krankheitsverlauf führen. Auch eine veränderte Chemokin-Expression der
natürlichen CCR5-Liganden (z.B. RANTES, MIP1a, MIP1ß) kann Einfluss nehmen (Berger et
al., 1999). Eine Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass eine geringe RC stark mit hoher Sensitivität
gegenüber der Inhibition durch das Chemokin RANTES korrelieren kann (Trkola et al., 2003).
Zudem wurde eine Korrelation zwischen verschiedenen HLA-assoziierten
und dem Krankheitsverlauf gezeigt. Moore und Kollegen waren die ersten, die einen
Zusammenhang von Mutationen unter Selektionsdruck von HLA zeigen konnten (Moore et al.,
2002). In Patienten mit HLA-B*5101-Allel, auf dem ein Epitop über die Aminosäuren 128 -
135 der RT präsentiert wird, mutierte die Aminosäure Isoleucin des WT an Position 135
gehäuft. Zudem wurde eine Mutation an AS 135 mit geringer RC assoziiert (Barbour und
Grant, 2004). Auch treten die HLA-Gene B25, B35, DR1, DR3, DQ1 vermehrt bei
beschleunigter Krankheits-Progression, die HLA-Klasse-I-Gene A1, A2, B14, B17, B27 und
HLA-Klasse-II-Gene DR5, DR6 dagegen gehäuft bei stark verminderter Krankheits-
Progression auf (Karlsson et al., 2007; Müller et al., 2007; Walker und Korber, 2001).
In einer Studie konnte in Folge einer Umstellung des Therapie-Regimes ein geringfügiger
Abfall der CD4-Zellen beobachtet werden, wobei die CD4- und CD8-spezifische
Immunantwort jedoch stark erhöht war (Legrand et al., 2005). Die Rolle der Aktivierung des
Immunsystems auf den Krankheitsverlauf wird unvermindert kontrovers diskutiert. Eine
immunologische Verbesserung des Patienten ist natürlich wünschenswert, jedoch besteht bei
erhöhter CD4-Zellzahl auch vermehrt die Möglichkeit der Adaption von Seiten des Virus
(Deeks und Walker, 2004). Deeks und Kollegen zeigten bereits in 2002, dass eine geringe RC
einerseits mit geringerer CD4-T-Zell-Aktivierung assoziiert sein kann, andererseits aber eine
Folge von starken Immunantworten sein kann, die das Virus zwingen, sich zu adaptieren,
(Deeks et al., 2002b).
Auch ist bekannt, dass der Zelltropismus des Virus eine entscheidende Rolle spielt. CXCR4-
trope HIV-Isolate treten häufiger in späten Phasen des Krankheitsverlaufes auf, wohingegen
R5-Isolate in der asymptomatischen Phase überwiegen (Tersmette et al., 1988). Als weitere
Ursache verminderter Pathogenese wurde in Einzelfällen eine nef-Deletion beobachtet, die zu
EINLEITUNG
10
verstärkter CTL-Antwort führte (Pantaleo et al., 1995). Alle genannten Faktoren beeinflussen
gemeinsam und möglicherweise in Abhängigkeit voneinander den Krankheitsverlauf HIV-
infizierter Patienten.
Abb. 2: Modell über den Zusammenhang von VL, CD4, CD8, RC und RF im Therapie-Verlauf, verändert nach Coffin, 1996. A) primäre Infektion. B) Ersttherapie. C) Entstehung von Resistenz unter antiretroviraler Therapie. D) verschiedene Szenarien zum langfristigen Therapie-Versagen unter Zugewinn von Resistenz-assoziierten Mutationen mit oder ohne Kompensation der RC. Hier wird deutlich, dass die Zusammenhänge der verschiedenen Parameter in A, B und C einfacher zu prädizieren sind, als in D. RC: Replikationskapazität; RF: Resistenzfaktor; VL: Viruslast; ART: antiretrovirale Therapie; CD4: CD4-Zellzahl; CD8: CD8-Zellzahl. RC-verändernde Mutationen mit Therapieansprechen oder -Versagen koppeln könnten.
Abb. 2 soll die aktuelle Vorstellung der Zusammenhänge der klinisch eingesetzten
Surrogatmarker von VL und CD4-Zellzahl insbesondere im Kontext der RC während des
Infektionsverlaufes illustrieren.
(A) Bei der primären Infektion mit nicht-resistentem Virus geht eine Aktivierung des
Immunsystems (vermehrte CD8-Aktivität) mit einer CD4-Depletion und einem Anstieg von
RC und VL einher (Koup et al., 1994). Mellors und Kollegen zeigten in therapienaiven
Patienten bereits 1997, dass höhere Plasma-RNS-Level (VL) mit schnellerem CD4-Abfall
assoziiert sind und dass sowohl die VL als auch die CD4-Zellzahl prädiktiv für den weiteren
Krankeitsverlauf sind, wobei eine Kombination aus beiden Parametern aussagekräftiger war als
jeder Parameter für sich (Mellors et al., 1997).
VLRF
RC
CD8
CD4
VL
Zeit
RC
CD8
CD4
VL
RF
RC
CD8
CD4
VL
RF
RC
CD8
CD4
RF
DA CB
VLRF
RC
CD8
CD4
VL
Zeit
RC
CD8
CD4
VL
RF
RC
CD8
CD4
VL
RF
RC
CD8
CD4
RF
DA CB
EINLEITUNG
11
(B) Unter antiretroviraler Therapie kann die VL zunächst erfolgreich gesenkt werden,
einhergehend mit einer immunologischen Verbesserung durch einen Anstieg der
CD4-Zellzahlen und einer reduzierten Immunaktivierung (Hammer et al., 1997).
(C) Unter subinhibitorischer Therapie entstehen im Verlauf primäre Resistenzen, welche es
dem Virus erlauben, trotz Therapie zu replizieren, was seinerseits eine oft nur geringe
Depletion der CD4-Zellzahl und eine Aktivierung des Immunsystems mit sich bringt. Ohne
Kompensation ist die RC jedoch stark vermindert. Erfolgt kein Therapie-Wechsel sind
verschiedene Szenarien denkbar.
(D) Grundsätzlich scheinen jedoch die VL und die CD4-Zellzahl als Verlaufsparameter
geeignet zu sein, um die Zusammenhänge im weiteren Krankheitsverlauf zu beschreiben.
Zahlreiche Publikationen belegen den Zusammenhang zwischen VL, CD4-Zellzahl und
Therapie. Eine der ersten Korrelationen, die in diesem Zusammenhang publiziert wurden, ist
die inverse Korrelation von VL und CD4-Zellzahl (Daar et al., 2005; Hughes et al., 1997).
Bald nach der ersten Beschreibung der Zusammenhänge zwischen Resistenz und RC wurde
versucht, den Einfluss der RC des HI-Virus zusätzlich als maßgeblichen Parame ter im
Krankheitsverlauf in Modelle zu integrieren. Dies erwies sich jedoch als ungewöhnlich
schwierig. Eine Studie an 15 Patienten zeigte eine lineare Korrelation zwischen RC und VL
(Campbell et al., 2003). Dagegen konnte in einer anderen Studie keine Korrelation zwischen
den Veränderungen der VL und der RC gefunden werden. Obwohl die PI-Resistenz zunahm,
veränderte sich die RC nicht (Barbour et al., 2002). Übereinstimmend dazu konnte vielfach
belegt werden, dass primäre Mutationen mit verminderter RC einhergehen, die durch
Akkumulation sekundärer PR-Mutationen partiell kompensiert werden kann (Barbour und
Grant, 2004; Mammano et al., 1998; Nijhuis et al., 1999; Sarmati et al., 2004). In 2002
publizierten Deeks und Kollegen, dass Veränderungen der VL zu einem beliebigen Zeitpunkt
nach einer Therapie-Umstellung besser zum Verlauf der CD4-Zellzahl korrelieren, als die
absolute VL (Deeks et al., 2002a). Von einer anderen Arbeitsgruppe konnten signifikante
Zusammenhänge zwischen hohen CD4-Zellzahlen und geringer RC nachgewiesen werden,
bzw. dass geringe RC-Werte mit einer relativen Erhöhung der CD4-Zellzahlen einhergehen
(Barbour et al., 2004). Die Verläufe der Infektion während lang anhaltendem Therapie-
Versagens sind sehr unterschiedlich. Trotz hoher Resistenz liegt eine anhaltende antiretrovirale
Aktivität vor, die auf partiell resistente Quasispezies Einfluss nimmt und die VL senken kann.
Bislang konnte die RC in der Praxis nicht als prognostischer Marker einbezogen werden, da
EINLEITUNG
12
keine ausreichenden Studien vorliegen, die RC-verändernde Mutationen mit
Therapieansprechen oder -Versagen koppeln könnten.
Verfahren zur Bestimmung der Replikationskapazität
Normalerweise werden zur Bestimmung der Replikationskapazität in-vitro-Systeme und
rekombinante Viren verwendet. Sie erleichtern die Standardisierung, da sie auf
immortalisierten Zelllinien getestet werden können. Allerdings werden unter Verwendung
rekombinanter Viren möglicherweise entscheidende virale Gene nicht berücksichtigt (Simon et
al., 2003).
Basierend auf rekombinanten Viren werden derzeit drei Systeme am häufigsten zur
Bestimmung der RC verwendet (Bogner E. und Holzenburg A., 2006). Als „Goldstandard“
gelten die so genannten Koinfektions-Versuche (Kompetitions-Versuche) (Kosalaraksa et al.,
1999; Nijhuis et al., 1999). Sie basieren auf der Infektion zumeist primärer Zellen in fest
definierten Mischungen aus einem nicht resistenten Referenzvirus und einem Patienten-
abgeleiteten Virus. Anschließend wird die Verdrängung der einen Virusvariante durch das
replikationskompetentere Virus im zeitlichen Verlauf bestimmt (Quinones-Mateu et al., 2000;
Weber et al., 2003). Diese Verfahren können aber nur mit genetisch markierten Viren
durchgeführt werden, um eine Differenzierung der Replikation der koinfizierten Viren zu
ermöglichen. Daher ist die Bestimmung von primären Isolaten mit diesen Verfahren derzeit
nicht möglich. Als zweite Methode, RC zu messen, finden virale Replikationskinetiken
Verwendung (Connor und Ho, 1994; Maeda et al., 1998; Quinones-Mateu und Arts, 2002). Sie
zeichnen sich durch eine relativ einfache Versuchsdurchführung aus und besitzen die
Möglichkeit, auch Primärisolate testen zu können. Ihr wesentlicher Nachteil ist die geringe
Reproduzierbarkeit. Die dritte Methode ist eine Modifikation der zweiten und wurde
entwickelt, um möglichst effizient RC-Bestimmungen durchführen zu können. Es handelt sich
um Versuchsansätze die nur eine Replikationsrunde messen (engl.: one replication assays). Die
virale Replikation wird dabei über die Expression von Indikatorgenen gemessen, die z.B.
anstelle des nef-Gens ins virale Genom integriert wurden. Durch die Verwendung
pseudotypisierter Viren ist es möglich, gezielt nur eine virale Replikationsrunde zu messen,
was eine schnelle Versuchsdurchführung gewährleistet (Deeks et al., 2001; Mammano et al.,
1998; Petropoulos et al., 2000; Zennou et al., 1998). Ein wesentlicher Nachteil dieses
Verfahrens besteht darin, dass nicht der gesamte Replikationszyklus des Virus integriert ist.
EINLEITUNG
13
Dennoch ist dies bislang das einzige kommerziell erhältliche Testverfahren (PhenoSense
Assay, Virologic, San Francisco, USA).
Angesichts der weltweit zunehmenden Bedeutung von non-B-Subytpen, sowie dem zu
erwartenden Einsatz von Inhibitoren außerhalb der bisherigen Zielgene erscheint der Einsatz
von Methoden, die primäre Isolate testen können, unerlässlich (Bannister et al., 2006;
Buonaguro et al., 2004). Dennoch wirft die Verwendung von Primärisolaten zwei wesentliche
Probleme auf. Zur Gewinnung von Primärisolaten müssen diese normalerweise auf primären
Zellen (engl.: peripheral blood mononuclear cells: PBMC) passagiert werden. Bei der meist
langwierigen Passagierung ohne Medikamentendruck besteht die Möglichkeit, dass weniger
resistente HI-Viren wegen ihrer höheren RC präferenziell angezüchtet werden.
Trotz vereinzelter Ansätze konnte bislang kein geeignetes System für die Bestimmung der RC
in-vivo gefunden werden (Bonhoeffer et al., 2002; Goudsmit et al., 1996; Goudsmit et al.,
1997). Auch geeignete Tiermodelle würden Studien erheblich erleichtern, da sie Transmission,
Pathogenese, Immunantwort und antiretrovirale Strategien erfassen (Goffinet et al., 2007;
Keppler et al., 2001; Namikawa et al., 1988). Derartige Bestimmungsverfahren hätten zudem
den Vorteil, Volllänge-Viren in Gegenwart des Immunsystems testen zu könnten, was derzeit
als die beste RC-Testmöglichkeit diskutiert wird (Nicastri et al., 2004). So konnte in einem
Mausmodell festgestellt werden, dass die Mutationen PR:V82A und RT:M184V herabgesetzte
RC im Vergleich zum Wildtyp-HIV besitzen (Picchio et al., 2000). Durch hohe Virus-
Wirtsspezifität und hohen Zeit- und Kostenaufwand sind Tiermodelle aber bisher nur
eingeschränkt einsetzbar.
Ein großes Problem besteht bislang in der unzureichenden Vergleichbarkeit der RC-
Ergebnisse. So wurden nicht nur durch verschiedene Methoden unterschiedliche Ergebnisse
erzeugt, sondern auch bei sonst gleicher Methode durch Verwendung unterschiedlicher
Wildtyp-Stämme als Referenzviren (z.B. HXB2 oder NL4-3), verschieden großer
rekombinanter Anteile sowie verschiedener Zelltypen (PBMCs oder Zelllinien) und
Indikatorsysteme. Zudem erfolgt die Bestimmung der initialen Infektionsdosis nicht über eine
einheitliche Methode. Am geläufigsten sind die Bestimmung von p24-Antigen-Gehalt (p24-ag)
oder von infektiösen Einheiten (engl.: tissue culture infectious dose 50 %: TCID50) (Marozsan
et al., 2004). Sicher ist, dass mit jedem dieser Verfahren unterschiedliche virale Eigenschaften
mitbestimmt werden, die direkten von der viralen RC beeinflusst werden können. So ist
gezeigt, dass durch Punktmutationen Infektiosität, RT-Aktivität, PR-Aktivität, Virusreifung
EINLEITUNG
14
und daraus resultierende virale Replikation und Pathogenität verändert sein können (Bleiber et
al., 2001; Kaufmann et al., 2000; Martinez-Picado et al., 1999; Shehu-Xhilaga et al., 2001). Da
nicht bekannt ist, welche der Faktoren die veränderte Pathogenität verursachen, kann je nach
verwendeter Methode der Wert, der eigentlich bestimmt werden soll, unwissentlich in das
virale Quantifikationsverfahren mit eingehen und daher anschließend nicht mehr korrekt
bestimmt werden (Tschochner et al., 2007).
Am deutlichsten werden die Unterschiede der eingesetzten Verfahren, wenn man Publikationen
über den Einfluss einzelner Resistenzmutationen auf die RC vergleicht (Quinones-Mateu und
Arts, 2002). So wird beispielsweise das Replikationsverhalten von Viren, welche die RT-
Mutation Q151M tragen, einerseits als vermindert, verstärkt oder vergleichbar zum Wildtyp
beschrieben (Garcia-Lerma et al., 2000; Kosalaraksa et al., 1999; Maeda et al., 1998). In
einigen Studien wurde bereits auf dieses Problem hingewiesen und versucht, durch die
parallele Verwendung verschiedener Methoden zur Bestimmung der RC eine Vergleichbarkeit
zu erreichen (Martinez-Picado et al., 1999). Dennoch ist durch die Vielzahl an Publikationen
ohne hinlängliche Vergleichbarkeit eine Datenbank für RC-assoziierte Mutationen essenziell.
Erste Bestrebungen wurden dazu von der Firma Virologic durchgeführt, deren Arbeiten aber
überwiegend nicht publiziert und deren Daten nur in sehr begrenzten Mengen zugänglich sind.
ZIEL DER ARBEIT
15
3 ZIEL DER ARBEIT
Unter subinhibitorischer Therapie können Resistenzen in viralen Genen entstehen, die es dem
HI-Virus ermöglichen, in Gegenwart von Medikamenten zu replizieren. Dennoch schränkt das
Auftreten von Resistenz zumeist die Fähigkeit der viralen Replikation ein. Daher liegt die
Vermutung nahe, dass die virale Replikationskapazität, insbesondere beim Vorliegen
multiresistenter Stämme, für die klinische Relevanz eine entscheidende Rolle spielen kann.
In der hier vorgestellten Arbeit sollte eine Methode zur Bestimmung der Replikationskapazität
mittels viraler Replikationskinetiken entwickelt und die klinische Relevanz der
Replikationskapazität untersucht werden. Es sollte eine Möglichkeit gefunden werden, die
bereits durch die initiale Virusquantifizierung verursachte hohe Variabilität zu senken und
damit die Variabilität im Bestimmungsverfahren der Replikationskapazität zu minimieren.
Zudem sollte das Verfahren geeignet sein, Volllänge-Viren testen zu können. Des Weiteren
sollte anhand von Datenpaaren aus Replikationskapazität und viraler Sequenz mit Hilfe von
bioinformatischen Methoden ein Modell für die Vorhersage der Replikationskapazität von der
viralen Sequenz entwickelt werden, wie es von der Arbeitsgruppe bereits zuvor für die
Resistenz etabliert wurde. Dies sollte einerseits die Möglichkeit bieten, Mutationen zu
identifizieren, die einen maßgeblichen Einfluss auf die Replikationskapazität besitzen und
andererseits die Bestimmung der Replikationskapazität einfach und kostengünstig in den
klinischen Alltag zu integrieren. Mit Hilfe dieser Methoden sollte dann die bislang nur
unzureichend untersuchte klinische Relevanz der Replikationskapazität anhand diagnostischer
Proben im Zusammenhang von genotypischer und phänotypischer Resistenz, VL, CD4- und
CD8-Zellzahlverlauf und dem verwendeten Therapie-Regime untersucht werden.
MATERIAL UND METHODEN 16
4 MATERIAL UND METHODEN
4.1 Material
4.1.1 Eukaryotische Zelllinien
293T-Zellen:
Humane, embryonale, epitheliale Nierenzelllinie, die mit Adenovirus Typ 5 transformiert
wurde und zusätzlich ein temperatursensitives Gen, das große T-Antigen des SV40-Virus
(engl.: simian virus 40) exprimiert (Graham et al., 1977)
CEMx-174-Zellen:
Zellhybrid, welches aus einer humanen T-Zelllinie und einer B-Zelllinie hergestellt wurde.
Die Zahlenbeschriftung der Oligonukleotide bezieht sich auf die Position innerhalb der pNL4-3-Sequenz (GenBank accession number: U26942); Restriktionsendonukleasen-Erkennungssequenzen sind fett markiert; * Dieses Oligonukleotid wurde auch für die Generierung von cDNS verwendet; (s): Sinnstrang (engl.: sense); (a): Gegenstrang (engl.: antisense).
Tab. 2: Zur Sequenzierung verwendete Oligonukleotide
Name Sequenz
H2720a: 5’- TATTGTATGGATTTTCAGGCC -3’
H15564s: 5’- TCAGGTCACTCTTTGGCAAC -3’
H2589s: 5’- GCCAGGAATGGATGGCCC -3’
H3032a: 5’- TTTGGAATATTGCTGGTGATC C -3’
H2835s: 5’- GTTCAATTAGGAATACCACATCC -3’
H3330a:* 5’- ACTAAYTTCTGTATRTCATTGACAGTCCA -3’
* im Oligonukleotid enthaltene Wobble-Basen: Y = C / T, R = A / G; (s): Sinnstrang (engl.: sense); (a): Gegenstrang (engl.: antisense).
MATERIAL UND METHODEN
20
Tab. 3: Für die selektive, quantitative real-time-PCR verwendete Oligonukleotide
Name Sequenz
Int 4452 5’- GTAGCAGTTCATGTAGCCAGTG -3’
Int 4575a 5’- CTGGTGAAATTGCTGCCATTGTC -3’
M184 EP1 5’- AATCCAGACATAGTTATCTATC -3’
M184 EP2 5’- TTTTTTGTCTGGTGTGGTAAATC -3’
L90 EP1 5’- GAAGCTCTATTAGATACAGG -3’
L90 EP2 5’- TTTAAAGTGCAACAAATCTGAG -3’
K103 EP1 5’- CCCGCAGGGTTAAAAAAG -3’
K103 EP2 5’- CCTGTGGAAGCACATTG -3’
Pol 2981_unspezif 5’- CAGTACAATGTGCTTCCACAGG -3’
Pol IN 3002 für 103 5’- CTGTGGAAGCACATTGTACTG -3’
IN M184 5’- CCAGACATAGTTATCTATCAATAIA -3’
IN M184V 5’- CCAGACATAGTTATCTATCAATAIG -3’
Pol IN 3206_für 184 5’- TTTGTCTGGTGTGGTAAATCCCCAC -3’
Quellenangaben zu den verwendeten Expressionsvektoren in Nijhuis* et al., 1999; Tschochner° et al., 2007; NL4-3: nicht resistentes Referenzvirus; PR: Protease; RT: reverse Transkriptase; Resistenz-assoziierte Mutationen sind fett gedruckt (Johnson et al., 2006)
MATERIAL UND METHODEN
21
4.1.5 Enzyme
Restriktionsendonukleasen und deren Puffer
Die Restriktionsendonukleasen ApaI, BclI, EciI, MscI, NheI, XbaI und SbfI wurden von den
Firmen New England Biolabs (Schwalbach, Traunstein) oder Gibco BRL (Eggenstein)
bezogen. Die zugehörigen Puffer wurden nach Angaben der Hersteller verwendet und
gegebenenfalls mit BSA versetzt.
sonstige Enzyme
Enzym Hersteller / Zusammensetzung
T4-DNS-Ligase: New England Biolabs (Schwalbach, Traunstein)
Trypsin: aus Rinderpankreas Gibco / BRL, 0.15 % (Eggenstein)
Trypsin / EDTA:
0,25 % Lösung in 140 mM NaCl; 5 mM KCl; 0,65 mM Na2HPO4;
5 mM D(+) Glukose; 25 mM Tris / HCl; 0,01 % EDTA; Trypsin; 0,1 %ige Phenolrotlösung; pH-Wert mit 25 % HCl auf 7,5 - 7,6 einstellen und anschließend steril filtrieren.
Reaktionsgefäße Eppendorf (Hamburg) Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) (C H NO )
Roth (Karlsruhe)
Triton-X100 Sigma (München)
Wasser (H2O) Sigma (München) SYBR green Molecular Probes, Invitrogen (Karlsruhe)
Deutschland DNS-Längenstandard: Gene RulerTM MBI, Fermentas (St. Leon-Roth)
4.1.6 Datensätze
GenoRC-Datenbank
Die Datenbank enthält insgesamt 279 Datensätze aus 254 klinischen Isolaten und 25 Klonen.
Diese wurden zum einen von klinischen Proben abgeleitet, zum anderen durch Mutagenese
konstruiert. Bei den klinischen Isolaten handelt es sich um Proben aus der Routine-Testung für
HIV-1 geno- und phänotypische Analysen aus dem Virologischen Institut, Klinische und
Molekulare Virologie des Universitätsklinikums Erlangen. Die Daten wurden über einen
Zeitraum von 2003 - 2006 erhoben. Alter und Geschlecht der Patienten sowie der Status der
Therapie sind zufällig und nicht vorselektioniert. Einschlusskriterium war das Vorhandensein
MATERIAL UND METHODEN
23
eines replikationsfähigen rekombinanten Virusisolats. Die Klone wurden generiert, um den
Einfluss von ausgewählten Kombinationen von Mutationen auf die RC analysieren zu können.
Verwendete Volllängeviren Bei den verwendeten Volllängeviren handelte es sich um folgende Isolate: aus der Gruppe M
die Subtypen B (92TH026), C (92BR025), G (ARP173 / RU570), CRF01_AE (92TH022) und
aus der Gruppe O der Subtyp O2 (HIV-1 CA-9) sowie ein HIV-2 Isolat (Die Angaben in
Klammern entsprechen den GenBank Nummern). Um Volllänge-Isolate mit hohen Virustitern
zu erhalten, wurden Plasmaproben von HIV-positiven Patienten auf PBMCs oder PM1-Zellen
kultiviert. Diese Virusüberstände wurden aus dem Subtypen-Panel der Abteilung Diagnostik
des Universitätsklinikums in Erlangen zur Verfügung gestellt. (Quellenangabe: http://virologie-
uni-erlangen.de).
Die CAT-Datenbank
Diese Datenbank enthält klinische Proben von Patienten aus der CAT-Studie (engl.:
continuously alternating therapy). Bei der CAT-Studie (Phase IV) handelt es sich um eine
offene, prospektive, multizentrische Studie zur Überprüfung der Wirksamkeit und
Verträglichkeit sowie der virologischen, immunologischen und pharmakologischen
Auswirkungen von regelmäßigen Therapie-Umstellungen in Patienten mit multiresistenten HI-
Viren gegen mindestens drei Klassen (NRTI / NNRTI / PI). Von 22 Teilnehmern wiesen nach
initialer Genotypisierung 21 Teilnehmer weniger als drei virologisch wirksame Medikamente
für eine mögliche Therapie auf (in T20-therapienaiven Patienten galt T20 als wirksames
Medikament) und besaßen keine Therapie-Optionen mit Aussicht auf erfolgreiche
Virussuppression. Die aktuelle VL unter Therapie lag bei allen Patienten ≥ 1000 Kopien/ml
Plasma. Bei den internierenden Therapie-Regimes bestand das eine Regime ausschließlich aus
Substanzen, die die RT inhibieren, das andere Regime ausschließlich aus Substanzen, die die
PR inhibieren. Zwischen den Therapie-Regimes sollte immer dann gewechselt werden, wenn
die VL um mehr als Faktor drei anstieg. Ziel der Therapie war eine Selektion von suszeptiblen
Viren durch partielle Reversion multipel resistenter Viren zum Wildtyp. Verlaufsproben
wurden im zwei- bis vierwöchigen Abstand entnommen und folgende Parameter
bestimmt: CD4-Zellzahl, CD8-Zellzahl, VL, genotypische und phänotypische Resistenz, RC,
Triglyceride und Medikamenten-Plasmaspiegel. Für die klonalen Analysen wurden 28
Plasmaproben ausgewählt und von insgesamt 22 Proben Klone isoliert.
MATERIAL UND METHODEN
24
Tab. 5: Plasmaproben der CAT-Studie, die für klonale Analysen verwendet wurden.
Patient Plasmaprobe Datum ART VL CD4
1 KV64* 26.08.2002 APV+SQV+RTV 1040 140
1 KV66 09.09.2002 APV+SQV+RTV 6810 200
1 KV67 19.09.2002 APV+SQV+RTV 79000 160
1 KV83 15.08.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 39700 120
1 KV84 12.09.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 137600 100
1 KV85 26.09.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 72500 90
4 KV12 24.03.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 4750 260
4 KV13 09.04.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 7460 190
4 KV14 23.04.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 6060 220
5 KL18 23.01.2004 LPV/r +SQV 388000 10
5 KL19 10.02.2004 LPV/r +SQV 690200 10
5 KL20 24.02.2004 LPV/r +SQV 361000 10
5 KL21 09.03.2004 T-20+3TC+EFV+DDI+TDV 376800 15
5 KL22 23.03.2004 T-20+3TC+EFV+DDI+TDV 282150 10
5 KL23 06.04.2004 T-20+3TC+EFV+DDI+TDV 179900 20
5 KL24 20.04.2004 T-20+3TC+EFV+DDI+TDV 750000 10
8 KL63 05.01.2004 AZT+3TC+ABC+TDV 378000 54
8 KL64 02.02.2004 LPV/r+IDV 261000 60
8 KL65 27.02.2004 LPV/r+IDV 56754 80
8 KL66 09.03.2004 LPV/r+IDV 21200 80
8 KL67 23.03.2004 LPV/r+IDV 262900 140
8 KL68 06.04.2004 LPV/r+IDV 94700 120
8 KL69 20.04.2004 LPV/r+IDV 133000 100
11 KL88 10.02.2004 AZT+3TC+ABC+TDV 11100 190
11 KL89 25.02.2004 AZT+3TC+ABC+TDV 1270 220
11 KL90 09.03.2004 LPV/r +SQV 4210 270
11 KL91 23.03.2004 LPV/r +SQV 12100 220
11 KL92 06.04.2004 LPV/r +SQV 3040 230 VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; ART: antiretrovirale Therapie; Abkürzungen der Medikamente und Angaben zu CD-Zellzahl, CD8-Zellzahl, VL, RC und phänotypischer Resistenz der Patientenproben s. Anhang; * Die Bezeichnung der Plasmaproben folgte einem laborinternen Code.
EUResist Datensatz
Um die klinische Relevanz von RC und Resistenz als prognostischen Marker für Therapie-
Ansprechen zu prüfen, wurde ein Datensatz aus insgesamt 2044 Proben mit zugehörigen
Angaben von Genotyp, VL und Therapie untersucht. Dieser Datensatz wurde von Dr. Rolf
MATERIAL UND METHODEN
25
Kaiser aus der EUResist-Studiengruppe in Köln zur Verfügung gestellt. 1022 Patienten wiesen
in einem Zeitfenster von drei Monaten ein Therapie-Ansprechen auf, weitere 1022 Daten
dagegen ein Therapie-Versagen. Als Kennzeichen eines klinischen Ansprechens diente ein VL-
Abfall von > 2 log, oder ein Abfall der VL < 400 Kopien/ml (http://www.euresist.org). Es
wurde darauf geachtet, dass für jedes Therapie-Regime die gleiche Anzahl an erfolgreichen
und nicht erfolgreichen Therapien mit einbezogen wurde. Für jede Probe wurden anschließend
anhand der genotypischen Sequenz die Resistenfaktoren (RF) und RC-Werte vorhergesagt. Um
die gesamte Aktivität des Therapie-Regimes einzuschätzen, wurden die Einzel-RF-Werte eines
Therapie-Regimes (nur verabreichte Medikamente) multipliziert Für die Analyse zur Relevanz
des RC-Werts wurde der RC-Wert in dieses Produkt eingerechnet.
Kontrollgruppe für klonale Analysen
Als Kontrollen für die klonalen Analysen aus der CAT-Datenbank wurden Daten von sechs
Patienten mit insgesamt 14 Proben ausgewählt, bei denen die VL sowie bis auf vier
Ausnahmen die CD4-Zellzahlen bekannt waren (Tab. 6). Zudem war von fünf Patienten der
Therapie-Status bekannt.
Tab. 6: Plasmaproben der Kontrollgruppe, die für klonale Analysen verwendet wurden.
Patient Plasmaprobe Datum ART VL CD4
23 NZ7* 28.04.2005 ohne 34000 -
23 NZ8 14.07.2005 ohne 22000 363
23 NZ9 06.10.2005 ohne 82000 181
24 NZ12 08.03.2005 SQV+LPV/r 810 137
24 NZ13 16.06.2005 SQV+LPV/r 2200000 42
25 NZ14 10.11.2005 TDV+FTC+SQV/r 41000 24
25 NZ15 24.11.2005 ohne 640 73
26 AB24 15.11.2005 ohne 3700 n.d.
26 NZ16 22.11.2005 ohne 4300 375
26 NZ17 15.12.2005 ohne 3700 437
27 NZ18 06.10.2005 ohne 54000 361
27 NZ19 22.11.2005 ohne 32000 275
28 PK8 16.12.2004 nicht bekannt 30000 n.d.
28 PK9 04.02.2005 nicht bekannt 8900 n.d.
VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; ART: antiretrovirale Therapie; n.d.: nicht durchgeführt; Abkürzungen der Medikamente s. Anhang; * Die Bezeichnung der Plasmaproben folgte einem laborinternen Code.
MATERIAL UND METHODEN
26
4.2 Methoden
4.2.1 Nukleinsäuremethoden
DNS-Standardmethoden
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR: engl.: polymerase chain reaction) zur Amplifikation
von DNS-Fragmenten (Saiki et al., 1988)
• Agarose Gelelektrophorese
• DNS-Isolierung aus Agarosegelen mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma
Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers
• Aufreinigung von PCR-Amplifikaten vor der Ligation mit dem
QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen (Hilden)
• Aufreinigung von PCR-Amplifikaten speziell für anschließende Sequenzierung mit
Microcon-Säulen der Firma Millipore (Eschborn)
• Plasmidpräparation mit dem Plasmid Mini Kit der Firma Qiagen (Hilden) nach
Angaben des Herstellers
• Photometrische Bestimmung von DNS-Konzentrationen in einem Spektralphotometer
der Firma Perkin Elmer (Cetus)
• Restriktionsanalysen nach Angaben der Hersteller: New England Biolabs (Schwalbach,
Traunstein) und Gibco BRL (Eggenstein)
• Aufreinigung von Vektoren über Geneclean II der Firma Qbio-gene (Mannheim)
Durchführung quantitativer und allelspezifischer real-time-PCR
Die quantitative, selektive real-time-PCR erlaubt die allelspezifische Amplifikation von
Sequenzvarianten, die sich in einem Nukleotid unterscheiden. Sie wurde im real-time-PCR-
Gerät ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) nach publizierter Methode
durchgeführt (Metzner et al., 2005). Getestet wurden die Positionen L90M in der PR
(Kodons: 90L: TTG, 90M: ATG), K103N in der RT (Kodons: 103K: AAA, 103N: AAC) und
M184V in der RT (Kodons: 184M: ATG, 184V: GTG). Die Nachweisgrenze für die
Erkennung der Wildtyp-Variante in Anwesenheit der Mutante RT:M184V-DNS beträgt 0,1 %,
sowie für PR:L90M-DNS oder RR:K103N-DNS jeweils 0,01 % (Metzner et al., 2005). Für
eine real-time-PCR wurden 10 µl einer Probe zu einem Ansatz aus 0,2 µM Puffer Rox-K,
MATERIAL UND METHODEN
27
0,4 x PCR-Puffer II, 3,5 mM MgCl2, 0,5 mM dNTPs, 0,2 x SYBR-Green I, je 0,4 µM der
entsprechenden Oligonukleotide und Taq DNS-Polymerase mit einem Endvolumen von 50 µl
gegeben. Die Kopienzahl wurde über eine Regressionskurve eines Standards über den Bereich
der Integrase berechnet (Metzner et al., 2007).
Konstruktion rekombinanter viraler DNS
Die Herstellung der rekombinanten Viren erfolgte nach (Walter et al., 1999) in der
Modifikation von (Schmidt et al., 2000) (Abb. 3).
Abb. 3.: Generierung rekombinanter Viren nach Schmidt et al., 2000 und Walter et al., 1999. Nach Extraktion der viralen RNS und reverser Transkription erfolgt die Teilamplifikation der viralen Gene gag, PR, RT. Diese werden anschließend in einen entsprechend deletierten viralen Vektor ligiert. Nach Transformation in E.coli wird die Gesamt-DNS isoliert und in 293T-Zellen transformiert. Nach Passagierung des viralen Überstandes auf CEMx-174-Zellen erfolgt eine drei - bis sechstägige Kultivierung mit anschließender Gewinnung des zellfreien viralen Überstandes. gag: engl.: group specific antigen; PR: Protease; RT: reverse Transkriptase; RNS: Ribonukleinsäure; DNS: Desoxyribonukleinsäure.
LTR
LTR
RNS-Extraktion+ RT-PCR
Patienten Plasma
3´env LTRgag pol
PCR
5´ LTR
gag PR RT Deletionsmutante? gag/PR/RT
LTR
LTR
gag PR RT Ligation
Transformation (E.coli)und Präparation der Gesamt-DNS
Transfektion: 293T-ZellenInfektion von CEMx-174-Zellen;Gewinnung des rekombinanten
Virusüberstandes
Amplifikation des N-terminalen Teils des gag-Gens, derkompletten viralen Protease und der ersten 300 Aminosäuren der reversen Transkriptase mittels PCR
cDNS
LTR
LTR
RNS-Extraktion+ RT-PCR
Patienten Plasma
3´env LTRgag pol
PCR
5´ LTR
gag PR RT Deletionsmutante? gag/PR/RT
LTR
LTR
gag PR RT Ligation
Transformation (E.coli)und Präparation der Gesamt-DNS
Transfektion: 293T-ZellenInfektion von CEMx-174-Zellen;Gewinnung des rekombinanten
Virusüberstandes
Amplifikation des N-terminalen Teils des gag-Gens, derkompletten viralen Protease und der ersten 300 Aminosäuren der reversen Transkriptase mittels PCR
cDNS
MATERIAL UND METHODEN
28
Nach der Extraktion von HIV aus Plasma erfolgte die reverse Transkription unter Verwendung
des Oligonukleotids H3532a. In zwei anschließenden PCRs wurden mit den Oligonukleotiden
H1980s und H3532a (Amplifikat-Bandengröße: 1.552 bp) und den Oligonukleotiden H2001s
und H3454a (Amplifikat-Bandengröße: 1.453 bp) der C-terminale Teil des gag-Gens (AS 428 -
500), die gesamte PR (AS 1 - 99) und den Beginn der RT (AS 1 - 300) amplifiziert.
Anschließend wurden die 1.453 bp PCR-Fragmente mit den Restriktionsendonukleasen ApaI,
NheI verdaut und in das über ApaI, XbaI linearisierte NL4-3 Plasmid ligiert. 10 - 20 ng der
rekombinanten HIV-1-Plasmide wurden anschließend in ultrakompetente Escherichia coli
(Stamm XL2-Blue) transformiert. 150 µl der transformierten Bakterien wurden jeweils in
5 ml LB-Medium überimpft, für weitere 14 h inkubiert mit anschließender Plasmidpräparation
nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden). Zur Gewinnung von Klonen wurden jeweils
150 µl der transformierten Bakterien auf LB-Agar-Platten, die Ampicillin enthielten,
ausgestrichen und für ca. 14 h im Brutschrank bebrütet. Nach Abschluss der Inkubationszeit
wurden die Bakterienkolonien gezählt und im Schnitt 10 - 30 Klone isoliert. Einige der so
generierten Klone wurden zusätzlich mittels positionsgerichteter Mutagenese an einigen
Positionen gezielt verändert (Wolf et al., 2003). Bei dieser Methode wurden je zwei PCRs mit
Oligonukleotiden durchgeführt, welche die zu mutierende Base enthielten. Dadurch konnten
Amplifikate gewonnen werden, welche jeweils im Sinn- und Gegenstrang die durch die
Oligonukleotide eingefügte Mutation enthielten. Die so gewonnenen Amplifikate überlappten
nur im Bereich der Mutations-tragenden Oligonukleotide. Um die so gewonnenen Amplifikate
in einen Vektor einfügen zu können, wurden bei geeigneter Lage von
Restriktionsendonuklease-Schnittstellen, Amplifikat und Vektor entsprechend gespalten und
ligiert. Lagen keine geeigneten Schnittstellen vor wurden diese entweder durch Mutagenese
zusätzlich eingefügt oder es wurde eine Elongations-PCR durchgeführt, um den Abstand bis
zur nächsten Schnittstelle zu überbrücken. Dabei dienten die überlappenden DNS-Fragmente
mit der enthaltenden Mutation als Oligonukleotide in der Elongations-PCR.
Die Klone N2D und N3L wurden von Monique Nijhuis (Eijkman-Winkler Institut, Utrecht,
Niederlande) in TA-Klonierungs-Vektoren zur Verfügung gestellt. Beide Proben wurden aus
demselben Patienten isoliert. N2D wurde am ersten Tag, N3L am 115. Tag unter Ritonavir-
Monotherapie isoliert. Die Klone enthielten die PR flankiert von zusätzlichen 115 bp des gag-
Gens und 100 bp des RT-Gens. Um daraus rekombinante virale Klone herzustellen, ohne auf
homologe Rekombination zurückgreifen zu müssen, wurden die einzelnen Fragmente mit
Oligonukleotiden amplifiziert, die gleichzeitig die Erkennungssequenz für die
Restriktionsendonuklease EciI einführen (Tschochner et al., 2007). Bei einer Spaltung mit dem
MATERIAL UND METHODEN
29
Restriktionsenzym EciI spaltet EciI seine eigene Erkennungssequenz aus dem Amplifikat. Alle
Amplifikate wurden mittels Expand High Fidelity PCR System (Boehringer, Mannheim,
Deutschland) mit einer um 5 °C steigenden Hybridisierungs-Temperatur der Oligonukleotide
nach den ersten 10 Zyklen generiert. Zuerst wurde das PR-enthaltende Amplikon 2 des TA-
Klonierungs-Vektors mit Hilfe der Oligonukleotide Eci-TA-H2135s und Eci-TA-H2649a
amplifiziert. In zwei anschließenden PCRs wurden die angrenzenden 5’- und 3‘-Regionen mit
Eci-H2146a und H2001s (Amplikon 1) sowie Eci-H2639s und H2852a (Amplikon 3)
amplifiziert. Nach der Spaltung der Fragmente mit EciI wurden die Amplikons 1 und 2 sowie
die Amplikons 2 und 3 ligiert und mit den Oligonukleotiden H2001s und Eci-No-TA-H2649a,
sowie Eci-No-TA-H2135s und H2852a amplifiziert. Beide PCR-Produkte wurden anschließend
mit BclI an der internen Restriktionsstelle gespalten. Nach der Aufreinigung der Fragmente
erfolgte die Ligation mit anschließender Amplifikation über die Oligonukleotide H2001s und
H2852a. Das resultierende PCR-Fragment wurde in das ApaI und SbfI gespaltene pNL4-3
ligiert. Die Klone wurden N2D und N3L benannt (Nijhuis et al., 1999; Tschochner et al.,
2007).
4.2.2 Generierung rekombinanter Viren
Zur Herstellung rekombinanter Virusüberstände wurden 5 µg präparierte Gesamt-Plasmid-
DNS in 2,5 x 106 293T-Zellen transfiziert (Abb. 3). Nach zwei Tagen wurde der Virus
enthaltende Überstand bei 1200 RPM 10 min zentrifugiert. Zur Gewinnung von hochtitrigen
Überständen erfolgte anschließend Passagierung von 1 ml Überstand auf 500.000 CEMx-174-
Zellen mit drei- bis sechstägiger Kultivierung. Alle gewonnenen Überstände wurden
abschließend bei – 80 °C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
4.2.3 Resistenz-Analysen
Genotypische Resistenz -Analysen
Die Sequenzierung wurde teils mit dem kommerziellen HIV-1 Viroseq Kit ABI PRISM 3100
(ABI, Weiterstadt), teils mit dem kommerziellen Sequenziersystem von HIV-1 TrueGene™ Kit
(Visible Genetics) nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Die resultierenden Sequenzen
wurden anschließend in der zugehörigen ABI-Software ViroSeqTM zusammengefügt. Da dieses
Programm die gag-Sequenzen nicht mit erfasst, wurden diese anschließend manuell angefügt
MATERIAL UND METHODEN
30
und die zusätzlichen Aminosäureaustausche im gag-Gen dokumentiert. Insgesamt wurden zur
Qualitätskontrolle 28 der mit TrueGeneTM bestimmten Proben parallel mit dem ViroSeq Kit
bestimmt. Die Aminosäuren-Austausche im Vergleich zum Referenzvirus HXB2, sowie die
Subtypen wurden mit Hilfe des frei zugänglichen Algorithmus geno2pheno 3.0. Drug
Resistance Database (http://www.genafor.org/) analysiert. Aus der Summe aller
Aminosäureaustausche wurden die Resistenz-assoziierten Aminosäurenaustausche nach
(Johnson et al., 2006) identifiziert.
Phänotypische Resistenz-Analysen
Die Quantifizierung der rekombinanten Virusüberstände, sowie die anschließenden
Phänotypisierung und deren Auswertung erfolgten nach Walter et al. 1999 im jeweils
dreifachen Ansatz (Walter et al., 1999). Als Maß der viralen Replikation in Gegenwart
ansteigender Medikamentenkonzentration, wurde die Induktion des zelleigenen tat-induzierten
Indikatorgens SEAP bestimmt. Anschließend wurde die Medikamentenkonzentration
errechnet, bei der das jeweilige Virus um 50 % inhibiert wird (engl. inhibitory concentration
IC50) (Garcia-Lerma et al., 2001; Garcia-Lerma und Heneine, 2001). Der jeweilige
Resistenzfaktor (RF) wurde durch Division der IC50 des Testvirus durch die IC50 des
Referenzvirus NL4-3 errechnet. Er beschreibt den Faktor, um den ein Patientenvirus mehr oder
weniger Medikament benötigt, um in der Replikation im gleichen Maß wie der Wildtyp
gehemmt zu werden (Abb. 4).
Abb. 4: Messung der abnehmenden HIV-Replikation eines suszeptiblen Referenzvirus und eines resistenten klinischen Isolates durch ansteigende Medikamenten-Konzentration, modifiziert nach Oette et al., 2003: RF: Resistenzfaktor; Ref.: Referenzvirus; klin.: klinisches Isolat; IC50: engl.: inhibitory concentration IC50.
0
25
50
75
100
125
0,01 0,1 1 10 100
Medikamentenkonzentration (log, µM)
Akt
ivit
ät (%
)
Referenzvirus
klinisches Isolat
RF
IC50 klin.IC50 Ref.0
25
50
75
100
125
0,01 0,1 1 10 100
Medikamentenkonzentration (log, µM)
Akt
ivit
ät (%
)
Referenzvirus
klinisches Isolat
RF
IC50 klin.IC50 Ref.
MATERIAL UND METHODEN
31
Benötigt das Patientenvirus weniger Medikament für die Inhibition als das Wildtyp-Virus,
spricht man von Hypersuszeptibilität. Des Weiteren wurde mit Hilfe des frei zugänglichen
Algorithmus geno2pheno 3.0. Drug Resistance Database (http://www.genafor.org/) die
phänotypische Resistenz von der Sequenz vorhergesagt.
4.2.4 Virale Quantifizierungsverfahren
SEAP-Reportergen-Analysen
Zur Bestimmung der SEAP-Aktivität in Zellkulturüberständen wurde der Phospha-LightTM
(Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Gene Assay System)-Kit (ABI, Weiterstadt) mit
geringfügiger Modifikationen des Herstellerprotokolls verwendet. Nach Inaktivierung des
virushaltigen Zellkulturüberstandes und der zellulären alkalischen Phosphatasen bei 65 °C für
40 min erfolgte eine zehnminütige Abkühlung. Anschließend wurde zu den inaktivierten
Virusüberständen 22 µl Assay Buffer gegeben und nach mindestens fünfminütiger Inkubation
22 µl Reaction Buffer zugegeben. Abschließend wurde nach exakt zwölf Minuten die Aktivität
in einem Luminometer als RLU (engl.: relative light units) gemessen.
Quantifizierung der RNS-Kopienzahl
Die Viruslast-Bestimmung für Proben aus der Geno2RC-Datenbank wurde mit dem
RNS 3.0 Assay (bDNS) der Firma Bayer (Leverkusen) nach Angaben des Herstellers
durchgeführt. Bei Ergebnissen oberhalb des linearen Messbereichs (50 - 500000 Kopien/ml)
wurden die Proben in HIV-negativem Plasma verdünnt und die Messung wiederholt. Die VL-
Bestimmungen für alle Proben aus der CAT-Studie wurden im Rahmen einer Kooperation mit
dem Vivantes-Auguste-Viktoria-Klinikum Berlin durchgeführt. Dort wurde zur quantitativen
Bestimmung der HIV-1 RNS-Kopien im Plasma der Cobas Amplicor HIV-1 Monitor Test,
Version 1.5 (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers verwendet. Der
lineare Messbereich liegt nach Angaben des Herstellers bei 50 – 750000 Kopien/ml. Proben,
die einen höheren Wert als 750.000 Kopien/ml besitzen, eigens austitriert und
nachquantifiziert. Proben, die mit 750000 Kopien/ml angegeben wurden, liegen an der
Obergrenze des Messbereiches und es besteht daher die Möglichkeit, dass die reale VL in
diesen Proben höher ist als angegeben.
MATERIAL UND METHODEN
32
Quantifizierung des p24-Antigen (p24-ag)-Gehalts
Die p24-ag Reportergen-Analysen wurden mit dem Murex HIV Antigen Mab Kit der Firma
Abbott (Wiesbaden) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Proben einer Messung,
die oberhalb der Extinktion der Standardkurve lagen (Wellenlänge: 450 nm
/ Referenzwellenlänge: 630 nm), wurden verdünnt und erneut bestimmt.
Quantifizierung viraler Infektiosität
Virale Infektiosität wurde nach geringfügig modifizierter Methode von Johnson und Byington
über die Messung der TCID50 (engl.: tissue culture infectious dose 50 %) bestimmt (Johnson,
1990). Bei der Durchführung dieser Methode wurde im sechsfachen Ansatz 50 µl zellfreier
viraler Überstand vierfach seriell verdünnt und anschließend dazu verwendet, je 3 x 105 CEMx-
174-Zellen in einer 96-Vertiefungsplatte zu infizieren. Zwei Mal wöchentlich wurden die
Kulturen resuspendiert, 20 µl in frisches Medium enthaltende 96-Vertiefungsplatten überführt
und lichtmikroskopisch auf das Auftreten von zytopatischem Effekt hin überprüft. Die Menge
an Viren, die notwendig war, um 50 % der Zellkulturen zu infizieren, wurde über die Formel
von Reed und Münch berechnet und als IU (engl.: infectious units) angegeben (Reed und
Münch, 2007).
Quantifizierung der CD4- und CD8-Zellzahl
Der Nachweis von CD4- und CD8-Zellen erfolgte im Rahmen einer Kooperation mit der
Medizinischen Klinik III der Universität Erlangen-Nürnberg und dem Vivantes-Auguste-
Viktoria-Klinikum in Berlin. Zellen aus dem Blut HIV-positiver Patienten wurden mit
Antikörpern (Beckman, Coulter) gegen die Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 gefärbt
und anhand von Durchflusszytometrie (Beckman, Coulter) quantifiziert (Carcelain et al., 2001).
Bestimmung der Medikamentenspiegel in Zellen und Plasma
Für 39 Proben aus der CAT-Studie wurden rückwirkend die Plasmaspiegel für die
Medikamente 3TC, ABC, TDV und FTC sowie IDV, SQV, RTV, APV und LPV im Labor des
Auguste-Victoria-Klinikums, Berlin bestimmt. Die Untersuchungen wurden nach einem
validierten Verfahren durchgeführt, welches auf der Flüssigkeitschromatographie und Tandem-
Massenspektroskopie beruht (Kurowski et al., 1999; Stocker et al., 2004). Da für keinen der
MATERIAL UND METHODEN
33
Spiegel der zeitliche Abstand zur Medikamenteneinnahme durch den Patienten bekannt war,
konnte es sich bei den gemessenen Spiegeln sowohl um Spitzen- als auch Talspiegel handeln.
Vergleich der Produktion von p24-ag und Infektiosität in Zellkultur
1 x 106 CEMx-174-SEAP-Zellen wurden mit 800 µl der rekombinanten viralen Zellkultur-
überstände NL4-3, 1G25 oder 4lig7 in einem Gesamtvolumen von 10 ml über neun Tage
kultiviert. Täglich wurde der Gehalt an viralem p24-ag und viraler Infektiosität (gemessen als
TCID50) in 500 µl zellfreiem Überstand bestimmt (Abb. 6).
4.2.5 Zellkulturverfahren
Kultivierung von Zelllinien
Eukaryotische Zellen wurden in Lux-, Nunc- bzw. Roux-Zellkulturflaschen der Firma
NucleonTM (Dänemark) bei 37 °C, 7 % CO2 und 80 % Luftfeuchtigkeit im Inkubator bebrütet.
Neu aufgetaute Zellen wurden zwei Wochen passagiert, bevor sie in Experimente eingesetzt
wurden.
293T-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10 % FKS und 1 % SPG in Roux-
Zellkulturflaschen kultiviert und zur Passage zweimal pro Woche 1:10 vereinzelt: Zur
Ablösung der adhärent wachsenden Zellen wurde Trypsin verwendet. Für die Vorbereitung der
Zellen für transiente Transfektionen wurden 5 Mio Zellen in Nunc-Flaschen überführt, mit
7 ml DMEM-Medium aufgefüllt und 24 h bebrütet.
CEMx-174-Zellen, CEMx-174-SEAP-Zellen und PM1-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium
mit 10 % FKS und 1 % SPG in Roux- Zellkulturflaschen kultiviert. Zweimal pro Woche
wurden die Zellen zur Passage 1:10 verdünnt. Zudem wurden die Zellen alle 14 Tage in neue
Zellkulturflaschen überführt, um den Anteil von adhärent wachsenden Zellen möglichst gering
zu halten.
Identifikation von optimalen Zellkulturbedingungen bei der viralen Replikation
Eines der Ziele bei der Entwicklung eines Zellkultursystems ist die Gewährleistung optimaler
Zellkulturbedingungen. So wurden zunächst Versuche durchgeführt, um den Bereich der
MATERIAL UND METHODEN
34
Sättigung unseres Zellkultursystems herauszufinden. Dabei muss zwischen zwei Arten der
Sättigung unterschieden werden: (i) Die Limitierung der Zellzahl durch Virusreplikation, d.h.
es muss gewährleistet werden, dass auch bei schnell replizierenden Viren bis zum
Versuchsende ausreichend viele uninfizierte Zellen in der Kultur vorhanden sind, da
andernfalls die Virusproduktion gegen Versuchsende rückläufig werden würde. (ii) Die andere
Art der Sättigung der Zellkultur entsteht, wenn die Replikation durch eine zu hohe Zellzahl in
der Kultur limitiert wird, da proportional zur Anzahl der Zellen Medium verbraucht wird und
Stoffwechselprodukte in die Zellkultur abgeben werden. Es muss gewährleistet werden, dass
bis zum Versuchsende ausreichend frisches Medium zur Verfügung steht, andernfalls käme es
zu verminderter Zellteilung und damit auch indirekt zu verminderter Virusreplikation. Um
gesättigte Kulturen identifizieren zu können, wurde ein hochtitriger Virusüberstand des
resistenten Referenzvirus 4lig7 zehnfach verdünnt und die SEAP-Aktivität im Überstand,
angegeben in RLU, an den Tagen eins, zwei und drei nach Infektion bestimmt. Der
Verdünnungsfaktor zwischen den einzelnen Kulturen betrug 1,427. Die so verdünnten Kulturen
reichten über einen Bereich von 23-facher bis 582-facher Verdünnung des Originalüberstandes.
Je niedriger der Verdünnungsfaktor gewählt wurde, desto höher war gleichzeitig die
Infektionsdosis und desto höher war die SEAP-Produktion in dieser Kultur. Sättigung einer
Zellkultur trat ein, wenn die SEAP-Produktion trotz höherer Infektionsdosis gleich oder
niedriger war, als die nächst niedriger infizierte Kultur.
Test zur Bestimmung der relativen Replikationskapazität
Der Versuch wurde im 96-Vertiefungsplatten-Format durchgeführt. Die Infektion erfolgte am
Tag 0. Die Vorverdünnung der viralen Überstände erfolgte im sechsfachen Ansatz, wobei nur
die inneren 60 Vertiefungen der Platten verwendet wurden, um den Anteil an der Verdunstung
in den verwendeten Vertiefungen zu minimieren. Dazu wurden je Virusüberstand zunächst
70 µl 1640-Medium in drei 96-Vertiefungsplatten vorgelegt. Der virale Überstand wurde
anschließend über drei 96-Vertiefungsplatten mit einem Faktor von 1,39 verdünnt, indem
jeweils 180 µl in die Nachbarvertiefungen überführt wurden. Das Resultat waren 30
verschiedene Verdünnungen eines jeden viralen Überstandes, mit einem Verdünnungsfaktor
von 1,39 bis 19056–fach. Für die anschließende Infektion wurden drei 96-Vertiefungsplatten
mit 100 µl Zellsuspension aus CEMx-174-SEAP-Zellen in einer Konzentration von
1 x 105 Zellen/ml vorbereitet. Es folgte die Infektion dieser Zellen im sechsfachen Ansatz mit
MATERIAL UND METHODEN
35
allen 30 Virusverdünnungen (Abb. 5). Die Virusüberstände NL4-3 und 4lig7 wurden jeweils
als Referenz in jedem Versuch einzeln oder doppelt mitgeführt. Um der Zeitspanne des
Versuchs Rechnung zu tragen, wurden die Referenzviren jeweils zu Beginn und am Ende eines
Experimentes pipettiert. Nach der Infektion erfolgte die erste Inkubation im Brutschrank. An
Tag drei wurden aus jeder infizierten Vertiefung 15 µl Überstand entnommen und die SEAP-
Aktivität in den verschiedenen Verdünnungen bestimmt.
An Versuchstag drei erfolgte eine Passagierung von 1:25 verdünntem zellfreien Überstand auf
frische CEMx-174-SEAP-Zellen in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/ml im sechsfachen
Ansatz in drei 96-Vertiefungsplatten je Virus. Es folgte eine erneute Inkubation im
Brutschrank. An Tag sechs (Tag drei nach Überinfektion) wurde abschließend die SEAP-
Aktivität in den verschiedenen Verdünnungen aus zellfreiem Überstand bestimmt.
Abb. 5: Vorgehensweise bei Durchführung einer viralen Verdünnungsreihe mit dem Verdünnungsfaktor 1,39 zur anschließenden Infektion von CEMx-174-LTR-SEAP-Zellen.
Die Auswertung der Versuchsergebnisse erfolgte mit Hilfe des Microsoft-Excel Programms.
Aus jeder SEAP-Sechsfach-Bestimmung an Tag drei und sechs wurden zunächst Mittelwert
und Standardabweichung gebildet. Die Ergebnisse der Mittelwerte wurden den jeweiligen
Verdünnungsfaktoren der entsprechenden Zellkultur zugeordnet und grafisch dargestellt.
Kulturen, die trotz hoher Infektionsdosis (geringe Verdünnung) weniger SEAP produzierten als
die nächst niedriger infizierte Kultur, wurden als gesättigt definiert.
Alle als gesättigt identifizierten Kulturen wurden aus der weiteren Berechnung ausgeschlossen
mit Ausnahme der Kultur, welche um Faktor 1,39 höher infiziert war als die erste ungesättigte
Kultur. Dadurch konnte über alle Mittelwerte der Sechsfachmessungen anschließend mit Hilfe
des Microsoft-Excel Solvers eine idealisierte Kurve extrapoliert werden (s. 4.2.7). Um die
137209878
512136872655
1376
19056
991
1911
7113
51437026619213899 72 37713
52 19 14 10 7,25,23,72,71,9
27
1,39
50µl
Verdünnung des viralen Überstandes mit dem Verdünnungsfaktor 1,39
137209878
512136872655
1376
19056
991
1911
7113
51437026619213899 72 37713
52 19 14 10 7,25,23,72,71,9
27
1,39
50µl
Verdünnung des viralen Überstandes mit dem Verdünnungsfaktor 1,39
MATERIAL UND METHODEN
36
Kultur mit optimaler Virusreplikation zu identifizieren, wurde der maximale SEAP-Wert der
extrapolierten Kurve durch zwei dividiert (VA50%: virale Aktivität 50%). Dadurch erhält man
einen Wert, der in der exponentiellen Phase der Kurvenfunktion liegt. Anhand der
extrapolierten Kurvenfunktion konnte anschließend die zugehörige Verdünnung bestimmt
werden, die notwendig war, um diese optimale Replikation zu gewährleisten. Nachdem für jede
Probe zwei zugehörige Verdünnungen bestimmt worden waren (Tag 3 und Tag 6), wurde der
Verdünnungsfaktor, der optimale virale Replikation für Tag drei gewährleistet hat, durch den
Wert der Verdünnung, der optimale virale Replikation für Tag sechs gewährleistet hat,
dividiert. Der resultierende Faktor gab den Anstieg der Produktion infektiöser Viren an.
Um von diesem Faktor auf die zugehörige RC eines Virusüberstandes schließen zu können,
wurde der resultierende Wert des Wildtyp-Virus (NL4-3) als 100 % definiert und anschließend
der Quotient aus dem Faktor der jeweiligen zu bestimmenden Probe mit dem Faktor für das
Wildtyp-Virus gebildet und in Prozent angegeben. Ein resultierender Wert größer 100 % weist
auf eine schneller replizierende Variante als NL4-3 hin, ein Wert kleiner als 100 % auf ein
replikationsinhibiertes Virus.
RC-Bestimmung von Volllänge-Viren verschiedener Subtypen auf PM1-Zellen
Fünf Subtypen und ein HIV-2-Isolat wurden verwendet und mit einer modifizierten Version
des RC-Protokolls getestet. Da bei der Verwendung von Volllänge-Viren der Tropismus der
Viren CXCR4 oder CCR5 zumeist unbekannt ist, die CEMx-174-SEAP-Zellen aber nur von
CXCR4-tropen Viren infiziert werden können, musste auf andere Zellen und einen anderen
Indikator viraler Aktivität zurückgegriffen werden. In vielen T-Zelllinien können nur
bestimmte HIV-1-Laborstämme und in der Regel keine HIV-1-Primärisolate replizieren (Lusso
et al., 1995). Daher wurde für die Infektion ein klonales Derivat der Hut78-Zellen verwendet,
das Suszeptibilität für ein außergewöhnlich breites Spektrum von Laborstämmen und
Primärisolaten aufweist. Da diese im Vergleich zu den CEMx-174-SEAP-Zellen langsamer
wachsen, wurde die virale Aktivität über das sehr stabile virale p24-ag in zellfreiem Überstand
an den Versuchstagen vier und acht bestimmt (s. 4.2.4). In jedem Versuch wurde 4lig7 als
resistentes Kontrollvirus mitbestimmt. Zudem wurde in jedem Versuch das rekombinante Virus
N2D, für das bereits RC-Ergebnisse vorlagen, bestimmt.
MATERIAL UND METHODEN
37
4.2.6 Klonale Analysen
Für die Analyse wurden 28 Proben von fünf Patienten (Pat.: 1, 4, 5, 8, 11) aus der CAT-Studie,
die einen auffälligen VL-Verlauf ohne offensichtliche genotypische Veränderungen aufwiesen,
und 14 diagnostische Kontrollproben von sieben verschiedenen Patienten, welche entweder
therapienaiv waren oder eine Ersttherapie erhielten (Pa.: 23-28), ausgewählt (Kontrollgruppe).
Anschließend wurden von 22 CAT-Proben und acht Kontrollproben molekulare Klone
generiert (s. 4.2.1.). Je Probe wurden bis zu zehn Klone isoliert und mittels oben genannter
PCR amplifiziert (s. 4.2.1.). Der untersuchte Genanteil betrug dabei 1035 bp und reichte von
PR: 1 bis RT: 246. Klone mit richtiger Bandengröße wurden sequenziert und auf
Aminosäureaustausche im Vergleich zum Wildtyp HXB2 untersucht. Anschließend wurden
lineare Regressionsanalysen zwischen der Anzahl an Mutationen, die nicht bei der
Sequenzierung der Plasmapopulation aufgefunden wurden, und der Veränderung in der VL
durchgeführt. Zudem wurden auch stumme Mutationen in den klonalen Sequenzen im
Vergleich zur Plasmapopulation untersucht. Diese sind gekennzeichnet durch Basenaustausche,
welche die resultierende Aminosäure nicht verändern.
Art der Basenaustausche in klonalen Sequenzen
Untersucht wurde, welche der vier Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin innerhalb eines
Genabschnitts von 1035 Basen im rekombinanten viralen Anteil aller Klone, beginnend bei der
AS 1 der PR bis zur AS 246 des RT-Gens, am häufigsten verändert war, in der zugehörigen
Plasmasequenz aber unverändert war. Da bekanntermaßen die Verteilung der vier Basen in
Retroviren nicht gleichmäßig ist, sondern mehr Adenin und Thymin im Vergleich zu Guanin
und Cytosin vorhanden sind, wurde zunächst der Anteil der vier Basen der Plasmasequenzen
unter Ausschluss von Mischungen bestimmt. Der resultierende Wert wurde anschließend mit
der Anzahl der isolierten Klone multipliziert und über Vier-Felder-Tafel-Analysen mit der
Anzahl der vorgefundenen absoluten Anzahl an Basenaustauschen in den Klonen verglichen.
Phylogenetische Analysen
Phylogenetische Analysen werden dazu verwendet, das Maß der Verwandtschaft mehrerer
Proben zueinander zu bestimmen. Die Analysen wurden für Proben der CAT-Datenbank und
diagnostische Kontrollproben durchgeführt. Die Verwandtschaft der Proben steigt dabei mit
MATERIAL UND METHODEN
38
der Anzahl an gleichen Basen und damit in der gleichen Verzweigung des phlogenetischen
Baumes. Sie wurde graphisch als Baum mit Hilfe des Programms Vektor NTI Version 5.5
dargestellt.
4.2.7 Statistik und computergestützte Analysen
Statistische Analysen
Statistische Analysen wurden mit der SPSS Statistik Software, Version 12.0 durchgeführt. Die
klinischen Korrelationen wurden mit Hilfe linearer Regressionsanalysen ausgewertet. Für
binomiale Variablen wurden Vier-Felder-Tafel-Analysen (Chi-Quadrat-Test) mit Hilfe der frei
zugänglichen Internetseite http://www.georgetown.edu/ durchgeführt, um signifikante
Unterschiede zwischen Basenaustauschen in CAT- und Kontrollklonen fest zu stellen. P-
Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen, p-Werte < 0,001 wurden als
statistisch hoch signifikant angesehen. Zur Korrektur von multiplen Analysen wurde die
Bonferroni-Korrektur angewandt.
Der Kolmogorov-Smirnov-Test wurde angewandt, um Proben auf Normalverteilung zu prüfen.
Dieser Test erreicht Signifikanz, wenn die untersuchten Werte nicht normalverteilt sind.
Computergestützte Auswertungen
Validierungskriterien der RC-Bestimmung
Die Bestimmung der RC erfolgte mit Hilfe der Solver-Funktion in Microsoft-Excel und wurde
anhand folgender Kriterien validiert:
• Kann die Funktion des Microsoft-Excel Solvers eine Kurve nicht extrapolieren, muss
der Virusüberstand als nicht validiert angesehen und erneut bestimmt werden.
• Der maximal gemessene SEAP-Mittelwert der Kurve muss an Tag drei mindestens
90 % des extrapolierten Maximalwerts betragen, an Tag sechs mindestens 80 %.
• Mindestens sechs SEAP-Mittelwerte müssen in die Kurve miteingehen, welche nicht im
Sättigungsbereich der Kuvenfunktion liegen.
• Mindestens drei SEAP-Mittelwerte müssen unter 50 % des Kurven-Maximums liegen.
• Die Infektion der Zellkulturen mit unverdünntem Überstand muss an Tag drei
mindestens 2.500 RLU und an Tag sechs mindestens 4.000 RLU im Mittel des
MATERIAL UND METHODEN
39
Sechsfachansatzes erzeugen, ansonsten muss der Versuch mit einem höhertitrigen
Überstand wiederholt werden.
Analysen zur klinischen Relevanz der RC
Um die klinische Relevanz der RC zu ermitteln, wurden zunächst die Veränderung (delta: d)
der CD4- und CD8-Zellzahlen sowie der VL zwischen Folgeproben ermittelt. Dazu wurde der
Wert der Folgeprobe, durch den Wert der Vorprobe dividiert. In anderen Analysen wurde von
allen Proben eines Patienten die Mittelwerte aller Einzelwerte eines Parameters errechnet. Um
Korrelationen zwischen verschiedenen Parametern festzustellen, wurden über diese Mittelwerte
aller Patienten lineare Regressionsanalysen durchgeführt. Dies gewährleistete die
Unabhängigkeit der Daten, die in die linearen Regressionsanalysen einbezogen wurden.
Bioinformatische Verfahren zur Prädiktion der RC
Univariate Analyse:
Die univariate Analyse wurde angewendet, um die Relevanz einzelner Mutationen in Bezug
auf die RC herauszufinden. Jeder Aminosäure-Austausch der zu untersuchenden Sequenz
wurde dazu mit HXB2 verglichen. Bei der Analyse wurden nur Mutationen berücksichtigt, die
mindestens fünfmal im Datenset vertreten waren, um Sequenzartefakte ausschließen zu
können. Anschließend wurden die Proben folgendermaßen verglichen: Alle Sequenzen, die
eine spezifische Mutation trugen, wurden einer Gruppe, alle Sequenzen, welche die
Referenzaminosäure trugen, einer zweiten Gruppe zugeteilt. Anschließend wurde für die
Gruppen 1 und 2 der Median aller RC-Werte der Sequenzen berechnet. Insgesamt wurden drei
Analysen durchgeführt: Positionen, die gemischte Aminosäure-Informationen aus Gruppe 1
und 2 tragen, wurden in die Analyse A) vollständig mit einbezogen, B) teilweise mit
einbezogen und C) von der Analyse ausgeschlossen.
Mit Hilfe des nicht parametrischen Wilcoxon Rangsummentest, konnten nach abgeschlossener
Analyse für jede Sequenzposition p-Werte berechnet und eine Rangliste der Mutationen erstellt
werden. Die ermittelten p-Werte wurden anschließend mit Hilfe der Benjamini-Hochberg-
Methode korrigiert, um falsch positive Ergebnisse zu identifizieren (Benjamini Y. und
MATERIAL UND METHODEN
40
Hochberg Y., 2005). Sehr niedrige p-Werte wiesen auf Mutationen hin, die mit entsprechend
hoher Wahrscheinlichkeit eine veränderte RC gegenüber dem Wildtyp-Virus NL4-3 aufweisen.
Multivariate Analyse:
Untersucht wurden 261 Proben aus der Geno2RC-Datenbank ohne Berücksichtigung von
Sequenzinformationen aus dem gag-Gen. Zudem wurde eine Subanalyse von 92 Daten
durchgeführt, für welche zusätzlich gag-Sequenzinformationen vorhanden waren (92mG),
welche mit den Sequenzinformationen desselben 92er Datensets ohne gag-Sequenzinformation
verglichen wurden (92oG). Bei der multivariaten Analyse wurde der Einfluss aller Mutationen
einer Probe im Kontext berücksichtigt. Es wurden nur Mutationen mit einbezogen, die
mindestens fünf Mal in der Datenbank enthalten waren. Die Mutationen wurden nach ihrem
mittleren Gewicht sortiert, so dass man eine Rangliste von Mutationen graduiert nach ihrem
Einfuß auf die RC erhielt. Mutationen mit großem Einfluss auf die RC stehen in der Rangliste
oben. Die multivariate Analyse wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden durchgeführt, den
Entscheidungswäldern und den Support Vector Machines.
Die Methode der Rekursiven Partitionierung (Entscheidungsbäume) wurde erstmals von
Leo Breiman 1984 entwickelt (Breiman L., 2001). Mit Hilfe der Entscheidungsbäume konnte
bereits gezeigt werden, dass man für den Genotyp einer Probe die voraussichtliche Resistenz
gegen ein Medikament vorhersagen kann (Beerenwinkel et al., 2002; Quigg et al., 2002; Segal
et al., 2004). Dabei wurden die Sequenzen rekursiv in Teilmengen unterteilt, sodass Sequenzen
der gleichen Partition sich phänotypisch zunehmend ähnlicher waren als solche aus anderen
Partitionen. Jede zu prüfende Sequenzposition erhielt dabei eine Zuordnung, resistent oder
sensitiv gegenüber einem Medikament, und führte zur nächsten Sequenzposition weiter. So
konnte ein Pfad erstellt werden, der die Interpretation einer Probe erleichtert.
In dieser Arbeit wurde das Modell zur Vorhersage von RF auf die Vorhersage der RC adaptiert,
wobei hauptsächlich auf den Veröffentlichungen von Beerenwinkel und Kollegen aufgebaut
wurde (Beerenwinkel et al., 2003a; Beerenwinkel et al., 2005). Um eine noch genauere
Vorhersage erstellen zu können, wurden mehr als 1000 Entscheidungsbäume zu
Entscheidungswäldern (EW: engl.: random forests) zusammengefasst (Segal, 1995). Die
Vorhersagequalität wurde beurteilt, indem die Vorhersage aller Proben bis auf eine
berücksichtigt und anschließend die fehlende Probe klassifiziert wurde. Man erhält so einen
MATERIAL UND METHODEN
41
prozentualen Wert an falsch klassifizierten Proben, den so genannten Vorhersagefehler
(engl.: mean squared error: MSE).
Auch bei der Methode der Vorhersage der RC mittels Support Vector Machines (SVM)
handelt es sich um ein maschinelles Lernverfahren, welches mit Algorithmen arbeitet und sich
zu Klassifikation und nicht linearen Regressionsanalysen eignet (Chalimourda et al., 2004).
Dadurch ist das Lernen in hochdimensionalen Sequenzräumen möglich. Auch dieses Verfahren
wurde bereits erfolgreich zur Vorhersage von Resistenzfaktoren verwendet (Beerenwinkel et
al., 2003a). Im Unterschied zur rekursiven Partitionierung werden in die quantitative
Vorhersage mittels SVM alle Sequenzpositionen im Kontext berücksichtigt und mit
unterschiedlichen Gewichten versehen. Dadurch konnte der Einfluss des gesamten
Sequenzhintergrundes bei der Vorhersage mit einbezogen werden. Mutationen, die nur im
Kontext anderer Mutationen zu veränderter Replikationskapazität führten, konnten über
Transformation der Sequenzen in den Euclideanischen Vektorraum X identifiziert werden. Für
die Implementierung wurde das R-package „e1071“ verwendet (Dimitriadou E. et al., 2006).
Um eine Aussage über die Vorhersagegüte dieses Modells machen zu können, wurde die
zehnfache Kreuzvalidierung angewandt, wodurch ein Korrelationskoeffizient errechnet werden
konnte. Man erhält diesen, indem man den vorhandenen Datensatz in zehn Teile gliedert und
mit Hilfe von neun Teilen den zehnten Teil voraussagt. Dieses Prozedere wurde für alle
anderen Teile jeweils wiederholt. Der resultierende Korrelationskoeffizient ist ein Maß dafür,
wie nahe eine unbekannte Sequenz nach der Vorhersage am tatsächlichen Wert liegt.
ERGEBNISSE 42
5 ERGEBNISSE
5.1 Vergleich der Produktion von p24-Antigen und Infektiosität in
Zellkultur
Ein Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Testsystems zur Bestimmung der RC, wobei
insbesondere die Variabilität der Virusquantifizierung reduziert werden sollte. Bei der
parallelen Bestimmung von p24-Antigen (p24-ag) und TCID50 in infizierten Kulturen konnte
bei allen Viren ein Anstieg von p24-ag und Infektiosität innerhalb der ersten drei bis vier Tage
nach Infektion festgestellt werden (Abb. 6), gefolgt von einem Abfall der Infektiosität.
Dagegen wurde ein weiterer Anstieg von p24-ag bis Tag sieben in allen Kulturen beobachtet.
Anschließend ging die nachweisbare Menge an p24-ag in ein Plateau über. Das Verhältnis
zwischen Infektiosität und p24-ag verringerte sich daher in allen Kulturen nach vier Tagen
Kultivierung stetig (Tab. 7). Für das nicht resistente Virus NL4-3 betrug das Verhältnis nach
drei Tagen 17:1 und verringerte sich bis zum letzten Versuchstag auf 0,1:1. Die resistenten
Virusüberstände von 1G25 und 4lig7 erzielten niedrigere Verhältnisse zwischen Infektiosität
und p24-ag und der Abfall der Infektiosität erfolgte verzögert im Vergleich zu NL4-3
(Tschochner et al., 2007).
Tab. 7: Verhältnis von Infektiosität (TCID50) und p24-Antigen. Die virale Aktivität von NL4-3 erreicht an Tag 2 ihr Maximum und fällt dann stetig ab.
TCID50 / p24-ag
Tag nach Infektion NL4-3-2 4lig7-2 1G25-2
Tag 0 0,4 0,0 0,1
Tag 1 1,4 0,1 0,2
Tag 2 17,5 n.d. n.d.
Tag 3 15,9 n.d. n.d.
Tag 4 10,4 6,3 3,5
Tag 5 2,1 3,3 1,1
Tag 6 2,0 1,0 0,3
Tag 7 1,4 1,9 0,1
Tag 8 n.d. n.d. n.d.
Tag 9 0,1 0,3 0,0
n.d.: nicht durchgeführt; p24-ag: p24-Antigen; TCID50: engl.: tissue culture infectious dose 50 %; IU: engl.: infectious units; NL4-3: nicht resistentes Referenzvirus; n.d.: nicht durchgeführt.
ERGEBNISSE
43
Abb. 6: Vergleich der viralen Produktion von p24-Antigen und Infektiosität in Zellkultur im zeitlichen Verlauf (Tschochner et al., 2007). A) Nach initialem Anstieg ist ein Abfall der Infektiosität ab Tag fünf zu beobachten. B) Anreicherung des viralen p24-ag bis Tag sieben und Übergang in ein Plateau. Die Abbildung ist repräsentativ für vier unabhängig voneinander durchgeführte Experimente mit geringfügiger Modifikation der Infektionsdosis. p24-ag: p24-Antigen; TCID50: engl.: tissue culture infectious dose 50 %; IU: engl.: infectious units; NL4-3: nicht resistentes Referenzvirus; 4lig7 und 1G25: resistente virale Klone.
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
TC
ID50
(IU
)
B
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tage
p24-
ag (n
g/m
l)
NL4-3
4lig7
1G25A
Tage
NL4-3
4lig7
1G25
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
TC
ID50
(IU
)
B
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tage
p24-
ag (n
g/m
l)
NL4-3
4lig7
1G25A
Tage
NL4-3
4lig7
1G25
ERGEBNISSE
44
5.2 Replikationskapazität rekombinanter Viren
Identifikation von optimalen Zellkulturbedingungen bei der viralen Replikation
Virale Replikation in Zellkultur ist abhängig von den Bedingungen für den Zellstoffwechsel
und darum in der Folge der lytischen Replikation auch von der HIV-Infektionsdosis. Um
gesättigte Kulturen identifizieren zu können, wurden CEMx-174-SEAP-Zellen mit
verschiedenen Verdünnungen eines hochtitrigen Virusüberstands des Kontrollklons 4lig7
infiziert. Der Verdünnungsfaktor von Kultur zu Kultur betrug dabei 1,427. Die am höchsten
infizierte Kultur wurde mit 24-fach verdünntem Virusüberstand infiziert, die am niedrigsten
infizierte Kultur 582-fach verdünntem Virusüberstand. Im angegebenen Beispiel Abb. 7 wird
deutlich, dass gesättigte Zellkulturen keine optimale Virusreplikation aufweisen. Die LTR-
induzierte SEAP-Indikator-Aktivität, angegeben in RLU, an den Tagen eins bis drei nach
Infektion in den Kulturen der Verdünnungen 24, 34, 48 und 69 zeigte keine erhöhte SEAP-
Aktivität im Vergleich zur jeweils nächst höher verdünnten Kultur. Auch in der Zellkultur,
welche 99-fach verdünnt infiziert wurde traten Sättigungseffekte auf, da in dieser Kultur die
SEAP-Produktion nicht weiter exponentiell über die Zeit anstieg.
Wie in Abb. 7 bereits ersichtlich, können solche gesättigten Kulturen aber auch über die
Bestimmung der viralen Aktivität ausschließlich zu einem Zeitpunkt, etwa an Versuchstag drei
oder vier, identifiziert werden, wenn dies im Vergleich mit anderen Infektionsdosen geschieht.
Dies wird anhand eines Beispiels noch deutlicher Abb. 8. Im angegebenen Versuch wurden
Zellkulturen mit 30 verschiedenen Infektionsdosen eines Virusüberstandes von NL4-3 infiziert
und die SEAP-Produktion drei Tage nach Infektion bestimmt. Der Verdünnungsfaktor betrug
dabei jeweils 1,39-fach. Die Kultur, die mit ca. zehnfacher Verdünnung des Virusüberstandes
infiziert war, konnte innerhalb von drei Tagen 14482 RLU produzieren, die nächst höher
infizierte Kultur (Verdünnungsfaktor 7,19) konnte dagegen nur 14078 RLU produzieren und ist
damit die erste Kultur, die gesättigt war. Demnach waren auch alle höher infizierten Kulturen
gesättigt (verdünnt über einen Bereich von 1,39 bis 7,19).
ERGEBNISSE
45
Abb. 7: Infektion von zehn Zellkulturen mit geringfügig unterschiedlicher Infektionsdosis des Referenzvirus 4lig7. Die Verdünnung des viralen Überstandes zur Infektion umfasste einen Verdünnungsbereich von 24- bis 582-fach. Je geringer der Verdünnungsfaktor gewählt wurde, desto höher war die Infektionsdosis und in der Folge auch die SEAP-Produktion. Sättigungseffekte einer Kultur wurden erkennbar, wenn die SEAP-Produktion nicht weiter exponentiell über die Zeit anstieg, aber auch wenn die SEAP-Aktivität trotz höherer Infektionsdosis nicht höher war als die der nächst geringer infizierten Zellkultur. In diesem Versuch sind die Kulturen, welche mit Verdünnungen von 24, 34, 48, 69 und 99 infiziert worden sind gesättigt. Die Grafik steht exemplarisch für 28 unabhängig voneinander durchgeführte Experimente für das resistente Referenzvirus 4lig7. RLU: engl.: relative light units; SEAP: sekretierte alkalische Phosphatase.
Abb. 8: Infektion von 30 Zellkulturen mit sukzessive ansteigender Infektionsdosis anhand eines Beispiels des Referenzvirus NL4-3. Angegeben sind die Mittelwerte der SEAP-Produktion drei Tage nach Infektion aus jeweils sechs unabhängig infizierten Zellkulturen und die zugehörigen Standardabweichungen (vertikale Linien an den Balken). Gesättigt sind in diesem Beispiel die Kulturen der Verdünnungen von 1 (1,39) bis 7 (7,19). Die Grafik steht exemplarisch für NL4-3 für 73 unabhängig voneinander durchgeführte Experimente. RLU: engl.: relative light units; SEAP: sekretierte alkalische Phosphatase.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
1 2 3 4 5 7 10 14 19 27 37 52 72 99 138
192
266
370
514
713
991
1376
1911
2655
3687
5121
7113
9878
1372
0
1905
6
Verdünnung
SE
AP
(R
LU)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
1 2 3 4 5 7 10 14 19 27 37 52 72 99 138
192
266
370
514
713
991
1376
1911
2655
3687
5121
7113
9878
1372
0
1905
6
Verdünnung
SE
AP
(R
LU)
Verdünnung
Tag 2 Tag 3
2434486999141200286408582
SE
AP
(R
LU
)
Tag 10
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
Verdünnung
Tag 2 Tag 3
2434486999141200286408582
SE
AP
(R
LU
)
Tag 10
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
ERGEBNISSE
46
Um die optimalen Bedingungen zur Virusreplikation für jedes Isolat bestimmen zu können,
wurde eine extrapolierte Solver-Kurve über die Rohwerte gelegt. Die Funktion näherte sich
dem Plateauwert asymptotisch an. Anhand dieser Kurvenfunktion konnte die Verdünnung
errechnet werden, die der Kultur mit idealer Replikation zugrunde lag. Voraussetzung dafür
war die Annahme, dass ideale Replikation vorlag, wenn die Hälfte des maximalen,
extrapolierten SEAP-Werts in der Plateauphase erreicht wurde (VA50%: virale Aktivität 50%).
Dadurch wurde gewährleistet, dass die Kultur einerseits nicht gesättigt war und andererseits die
SEAP-Aktivität nicht im Hintergrundbereich der SEAP-Messung lag. Im Beispiel (Abb. 9)
zeigte die Kultur mit optimaler Virusreplikation eine SEAP-Aktivität von 6518 RLU und eine
errechnete zugehörige Verdünnung von 26-fach. An Tag sechs (Tag drei nach Überinfektion)
zeigte die Kultur mit optimaler Virusreplikation eine SEAP-Aktivität von 11938 RLU und eine
zugehörige Verdünnung von 92-fach. Offenbar wurde durch die Virusproduktion innerhalb der
ersten drei Tage bei der Passage mit einer höheren Infektionsdosis als an Tag 0 infiziert.
Demgemäß war für eine ideale Virusreplikation in den Kulturen an Tag sechs meist eine initial
geringere Infektionsdosis als an Tag drei zugrunde liegend. Anders gesagt, wenn die gleiche
Infektionsdosis in den Zellkulturen am Tag 0 und am Tag 3 optimale Replikationsbedingungen
hervorrief, dann war in den Kulturen infiziert mit etwa 92-fach verdünntem Überstand nach
drei Tagen soviel Infektiosität entstanden, die der Infektionsdosis der mit etwa 26-fach
verdünntem Überstand infizierten Kultur am Tag 0 entsprach. In diesem System war eine
Passagierung viraler Überstände in Zellkultur notwendig, da bei der Infektion desselben Virus
mit identischer Infektionsdosis Unterschiede in der absolut erreichbaren Virusreplikation
erzeugt wurden (vgl. Standardabweichungen Abb. 8), welche maßgeblich auf Variabilität der
Zellzahl und den Zustand der infizierten Zellen zurückgeführt werden konnten.
Um zu prüfen, ob bei der Passagierung Verschiebungen in der Quasispezies auftraten, wurden
20 Proben zufällig ausgewählt und die Sequenz der Plasmapopulation mit der Sequenz der
rekombinanten Überstände am letzten Versuchstag der RC-Bestimmung verglichen. In dieser
Untersuchung wurden nur geringe Abweichungen festgestellt, die zumeist an ohnehin
gemischten Sequenzpositionen auftraten (Daten nicht gezeigt).
ERGEBNISSE
47
Abb. 9: Identifikation der Kultur mit optimaler Virusreplikation anhand einer extrapolierten Solver-Kurve. A) Originalwerte und extrapolierte Kurve des nicht resistenten Virus NL4-3 an Tag drei ohne gesättigte Werte. B) Originalwerte für das nicht resistente Virus NL4-3 an Tag sechs (Tag drei nach Überinfektion) ohne gesättigte Werte. Die Grafik steht exemplarisch für 73 unabhängig voneinander durchgeführte Experimente für NL4-3. RLU: engl.: relative light units; Originalwerte: Mittelwerte der Sechsfachmessung einer jeden Verdünnung; VA50%: virale Aktivität 50%; SEAP: sekretierte alkalische Phosphatase.
16000
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
2 4 7 14 27 52 99 192
370
713
1376
2655
5121
9878
1905
6
20000
25000
30000
192
370
713
1376
2655
5121
9878
1905
6
OriginalwerteSolver-Kurve
15000
7 14 27 52 99
0
5000
10000SE
AP
(R
LU)
Verdünnung
SE
AP
(RLU
)
Verdünnung
Tag 6
VA50%
B
A
Tag 3
VA50%
OriginalwerteSolver-Kurve
16000
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
2 4 7 14 27 52 99 192
370
713
1376
2655
5121
9878
1905
6
20000
25000
30000
192
370
713
1376
2655
5121
9878
1905
6
OriginalwerteSolver-Kurve
15000
7 14 27 52 99
0
5000
10000SE
AP
(R
LU)
Verdünnung
SE
AP
(RLU
)
Verdünnung
Tag 6
VA50%
B
A
Tag 3
VA50%
OriginalwerteSolver-Kurve
ERGEBNISSE
48
Variationsbreite des Tests zur Bestimmung der Replikationskapazität
Zunächst wurde der Test zur Bestimmung der RC für rekombinante Viren etabliert. Insgesamt
wurden 48 verschiedene Experimente zu Bestimmung der RC von rekombinanten Viren
erfolgreich durchgeführt. In diesen Versuchen wurde das Kontrollvirus 4lig7 insgesamt 68-mal
gemessen und ein Median für dieses Virus von 52 % ermittelt. Ein Versuch wurde als valide
gewertet, wenn mindestens ein Wert des Kontrollvirus 4lig7 in einem Interquartilenbereich
(IQR: engl.: interquarile range) von 0,131 – 0,869, entsprechend der asymmetrischen
Datenverteilung lag, was RC-Werten zwischen 35 % - 77 % entsprach. Diese Kriterien konnten
von 17 Virusüberständen von 4lig7 in elf Versuchen nicht eingehalten werden. Da nicht
auszuschließen war, dass die Messabweichugen des Kontrollvirus auf eine Abweichung des
Referenz-Wildtyp-Virus im entsprechenden Lauf zurückzuführen war, wurde von den 48
Versuchen der Median über den Faktor für das Wildtyp-Virus NL4-3 gebildet, der den Anstieg
der Wildtyp-Aktivität von Tag drei auf Tag sechs wiedergab. Demgemäß war für die optimale
Wildtyp-Virus-Replikation in den Kulturen an Tag sechs im Median eine 10,476-fach
niedrigere Infektionsdosis als an Tag drei notwendig. Mit diesem Wert wurden die tatsächlich
gemessenen Wildtyp-Faktoren über den Anstieg der Aktivität von Tag drei auf sechs aus den
elf Läufen, in denen 4lig7 nicht im IQR zwischen 0,131 – 0,869 lag, ersetzt. Lag der RC-Wert
von 4lig7 nach dieser Korrektur innerhalb des gültigen IQR, wurde für das Wildtyp-Virus der
korrigierte Wert angenommen und der Versuch für alle Isolate als valide gewertet. Insgesamt
wurden sieben Werte in fünf Versuchen (Doppelbestimmung) ersetzt, sechs Versuche wurden
aus der Wertung ausgeschlossen. Eine Probe wurde aufgrund eines singulären, ungewöhnlich
hohen RC-Wert trotz valider Wertung (RC: 3410 %) aus der Auswertung ausgeschlossen.
Insgesamt wurden Messungen von 411 Virusüberständen als valide gewertet, die sich
zusammensetzten aus 279 klinischen Proben, 59 Messungen des resistenten Referenzvirus
4lig7 und 73 Messungen des nicht resistenten Referenzvirus NL4-3.
Um zu prüfen, ob alle validierten RC-Werte für 4lig7 normalverteilt waren, wurden sie
logarithmiert und anschließend der Kolmogorov-Smirnov-Test angewandt. D.h. Werte p < 0.05
stammen sehr unwahrscheinlich aus einer Normalverteilung. Da der Test statistisch nicht
signifikant war (p = 0,2), wies er darauf hin, dass die Daten mit sehr großer Wahrscheinlich
normal verteilt waren.
Der Mittelwert für das Kontrollvirus 4lig7 betrug nach abgeschlossener Validierung in 59
Wertungen 52 % (Min.: 35; Max.: 76). Die Standardabweichung schwankte um den
Faktor 1,27 (Abb. 10).
ERGEBNISSE
49
Abb. 10: Box-Plot über die Verteilung von 59 Replikationskapazitäts-Werten des resistenten Referenzvirus 4lig7. Die Angabe der Y-Achse entspricht Prozentangaben in Abhängigkeit zum Wildtyp-Virus NL4-3. n: Anzahl; die Balkenlänge entspricht dem Interquartilenbereich (25 % Quartile, Median, 75 % Quartile), die vertikale Linie am Balken entspricht dem Interquartilenbereich (5 % Quartile, 95 % Quartile). Um die Variabilität des Testverfahrens anhand von unabhängigen Proben zu beurteilen, wurde
die RC von 15 rekombinanten Virusüberständen in je zwei unterschiedlichen Messungen
bestimmt und eine niedrige Abweichung gefunden (Tab. 8).
Die Virusüberstände von N2D und N3L wurden jeweils in drei unabhängigen Experimenten
bestimmt und mit RC-Ergebnissen, die mit Hilfe eines Koinfektionsverfahrens bestimmt
worden waren, verglichen (Nijhuis et al., 1999) (Tab. 9). Von einem weiteren Klon der im
Koinfektionsversuch stark reduzierte RC aufwies, konnten keine rekombinanten Viren
Tab. 8: Doppelbestimmung von 15 rekombinanten Viren.
Probe KL20 KL37 KL64 KL86 FL3 KV13 KV30 KV31
RC 1 33 % 18 % 12 % 13 % 38 % 18 % 8 % 5 %
RC 2 40 % 41 % 32 % 19 % 74 % 27 % 9 % 3 %
Probe KV47 KV62 KK1 KK2 KK3 KK4 KK7
RC 1 17 % 6 % 5 % 8 % 29 % 33 % 48 %
RC 2 24 % 12 % 9 % 14 % 53 % 49 % 81 %
RC: Replikationskapazität.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1004lig7n = 59
Rep
likat
ions
kapa
zitä
t (%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1004lig7n = 59
Rep
likat
ions
kapa
zitä
t (%
)
ERGEBNISSE
50
generiert werden, weshalb keine parallelen RC-Werte zu diesem Klon vorliegen. Die beiden
Virusüberstände N2D und N3L wurden jeweils in drei unabhängigen Experimenten bestimmt.
RC: Replikationskapazität; Stabwn: Standardabweichung; PR: Protease; Die Ergebnisse des Koinfektionsversuches wurden durchgeführt und beschrieben von Nijhuis et al., 1999.
5.3 Replikationskapazität von Volllänge-Viren
Das Testsystem zur Bestimmung der RC konnte zudem auf die Verwendung von Volllänge-
Viren und non-B-Subtypen hin adaptiert werden. Es wurden drei unabhängige Experimente zur
Bestimmung der RC von Volllänge-Viren durchgeführt. Da die Identifizierung der idealen
Replikationsbedingungen auf der Identifikation der maximal erreichbaren viralen Aktivität
beruht, die PM1-Zellen aber eine geringere Zellteilung als CEMx-174-SEAP-Zellen aufwiesen,
musste der Messzeitpunkt der viralen Replikation auf einen späteren Zeitpunkt verschoben
werden. Zur Validierung wurde in diesen Experimenten neben 4lig7 zusätzlich das
rekombinante Virus N2D bestimmt. Beide Kontrollviren lagen in den Versuchen im validen
Messbereich (Tab. 10). Für die Isolate G und HIV-2 war es möglich, dass innerhalb von vier
Tagen die maximale Aktivität des Indikatorgens erreicht wurde. Dagegen erreichten einige der
Volllänge-Isolate (B, CRF01_AE, O und C) nicht die gewünschte maximale Replikation
innerhalb von vier Kultivierungstagen. Dies lag maßgeblich an sehr niedrigen Virustitern in
den verwendeten Virusüberständen. Auch wenn damit die strengen Validierungsauflagen nicht
erfüllt wurden, konnte für die Kulturen von Subtyp B, CRF01_AE und C anhand der
Kurvenfunktion ein Maximum der Virusreplikation extrapoliert werden. Die errechneten RC-
Werte von Subtyp B (112 %) und Subtyp C (60 %) entsprachen dabei unlängst vergleichbar
publizierten Werten für Isolate dieser Subtypen (Ball et al., 2003; Marozsan et al., 2005; Rubio
et al., 2006).
ERGEBNISSE
51
Tab. 10: Replikationskapazitäts-Werte der getesteten Volllänge-Isolate und rekombinanten resistenten Referenzviren.
Abb. 11: Box Plot über die Verteilung von 279 Replikationskapazitäts-Werten für Proben der Geno2RC-Datenbank. Die Angabe der Y-Achse entspricht RC-Prozentangaben in Abhängigkeit zum Wildtyp-Virus NL4-3. n: Anzahl. * Extremfälle die mehr als Faktor drei vom Interquartilenbereich abweichen; U Ausreißer zwischen Faktor 1,5 und drei vom Interquartilenbereich abweichen; die Balkenlänge entspricht dem Interquartilenbereich (25 % Quartile, Median, 75 % Quartile), die vertikale Linie am Balken entspricht dem Interquartilenbereich (5 % Quartile, 95 % Quartile).
Abb. 12: Eine lineare Regressionsanalyse ergab eine direkte Korrelation zwischen der Anzahl an primären Resistenz-assoziierten Mutationen und der RC. RC: Replikationskapazität;
Alle anderen 220 Proben wiesen mindestens eine primäre Resistenz-assoziierte Mutation auf
(Min.: 2 %; Max.: 292 %; Median: 34 %; IQR (25 - 75): 15 % - 68 %). Mit Hilfe einer linearen
Regressionsanalyse konnte eine hoch signifikante Korrelation zwischen der Anzahl an
primären Resistenz-assoziierten Mutationen und der RC festgestellt werden (p < 0,001;
p < 0,001R2: 0,071
0
50
100
150
200
250
300
350
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Anzahl primärer Resistenz-assoziierter Mutationen
RC
(%)
p < 0,001R2: 0,071
0
50
100
150
200
250
300
350
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Anzahl primärer Resistenz-assoziierter Mutationen
RC
(%)
0
50
100
150
200
250
300
350
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Anzahl primärer Resistenz-assoziierter Mutationen
RC
(%)
0
100
150
200
300
I
II
I
I
I
I
I
S
SS
250
allen = 279allen = 279
Rep
likat
ions
kapa
zitä
t(%
)
50
0
100
150
200
300
I
II
I
I
I
I
I
S
SS
250
allen = 279allen = 279
Rep
likat
ions
kapa
zitä
t(%
)
50
ERGEBNISSE
53
R2: 0,071. Dabei war die RC umso niedriger, je höher die Anzahl an primären Resistenz-
assoziierten Mutationen war (Abb. 12).
Außerdem wurde anhand der genotypischen Sequenzinformation der Subtyp der Proben
vorhergesagt (Geno2Pheno.org). Im gesamten Datensatz waren 53 non-B-Subtypen vorhanden.
Diese ließen sich folgenden Subtypen zuordnen: 2 x A1, 1 x A2, 14 x C, 9 x D, 1 x F1, 1 x F2,
2 x G, 1 x H, 1 x 05_DF, 1 x 14_BG, 3 x 01_AE, 4 x 02_AG, 2 x 06_CPX, 3 x 09_CPX,
2 x 11_CPX, 2 x 13_CPX, 4 x CRF10_CD. Zusätzlich wurden für insgesamt 18 Medikamente
Abb. 13: Ausgangs-Verteilung von VL, CD4- und CD8-Zellzahl je Patient zu Studienbeginn. Von den Patienten 1, 2, 3 und 18 wurde zu Studienbeginn keine CD8-Zellzahl bestimmt. VL: Viruslast; CAT: engl.: continuously alternating therapy. Häufigkeitsverteilungen der ermittelten Resistenzfaktoren (RF) aus dem CAT- und Geno2RC-Datensatz
Eine Häufigkeitsverteilung der gemessenen Resistenzfaktoren aus den phänotypischen
Analysen ergab je Medikament ein spezifisches Muster, wobei RF-Werte die um 1 verteilt
liegen, als suszeptibel eingestuft werden und RF-Werte, die weit über 1 verteilt liegen, auf
Resistenz hinweisen. Dazwischen treten selten Werte auf. FTC und DDC wurden aus dieser
Analyse für die Geno2RC-Datenbank ausgeschlossen, da eine Verteilung bei 17 bzw. 19
Werten nicht aussagekräftig war. Für die Medikamente IDV, SQV, RTV NLV, APV, LPV,
ATV, AZT, ABC, DLV, NVP, EFV, 3TC wurde eine zweigipflige Verteilung ermittelt
(Abb. 14, im Anhang Abb. 29), wohingegen sich für die Medikamente DDI, D4T und TDV
nur eine eingipflige Verteilung ergab (Abb. 15, im Anhang Abb. 28). Dennoch kann man
selbst innerhalb der eingipfligen Verteilungen erkennen, dass die RF für die Proben aus der
CAT-Studie im Vergleich zu Proben aus der Geno2RC-Datenbank deutlich höher waren.
Proben aus der CAT-Studie wiesen erwartungsgemäß nahezu ausschließlich hohe RF auf, was
auf die Einschlusskriterien der Studie zurückzuführen ist.
ERGEBNISSE
56
IDV
02468
101214161820
0,16
0,25 0,
4
0,6
1,0
1,6
2,5
4,0
6,3 10 16 25 40 63 100
158
251
398
631
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
Abb. 14 Zweigipflige Verteilung der Resistenzfaktoren von Proben aus der CAT- und Geno2RC-Datenbank am Beispiel von Indinavir (IDV). Resistenzfaktor: RF; CAT: engl.: continuously alternating therapy; Häufigkeitsverteilung der Resistenzfaktoren für die Medikamente SQV, RTV NLV, APV, LPV, ATV, AZT, ABC, DLV, NVP, EFV, 3TC und deren Abkürzungen s. Anhang.
ddI
05
1015202530354045
0,25
0,32 0,
40,
50,
60,
81,
01,
31,
62,
02,
53,
24,
05,
06,
37,
9 10 13 16 20 25
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
Abb. 15: Eingipflige Verteilung der Resistenzfaktoren von Proben der CAT- und Geno2RC-Datenbank am Beispiel von Didanosine (DDI). Resistenzfaktor: RF; CAT: engl.: continuously alternating therapy; Häufigkeitsverteilung der Resistenzfaktoren für die Medikamente D4T und TDV s. Anhang.
Einfluss von Mischungen an Sequenzpositionen auf die Ergebnisse aus der univariaten Analyse
Die univariate Analyse wurde für 261 Daten aus der Geno2RC-Datenbank durchgeführt. Die
wichtigsten Mutationen dieser Liste dienten als Marker für veränderte RC einer Probe im
Vergleich zum Wildtyp NL4-3.
Um den Einfluss der Mischpopulationen herauszufinden, wurden die Ergebnisse der drei
univariaten Analysen A) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen B)
unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, die keinen Wildtyp-Anteil
besitzen C) unter Ausschluss von allen Mischungen an Sequenzpositionen für die ersten 25
gelisteten Mutationen verglichen. Mutationen, die sehr geringen Einfluss auf die RC besitzen
sollten, wurden weiter unten in der Rangfolge gelistet und sollten nur einen geringen Einfluss
auf die Veränderung der RC haben. Mutationen, deren Vorhandensein in der bioinformatischen
Analyse auf einen höheren RC-Wert der Probe im Vergleich zu der nicht mutierten Sequenz
von HXB2 schließen lässt, sind fett markiert. In den Spalten des Positionsvergleiches ist
angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der
zweiten Analyse positioniert ist. So wurde beispielsweise die Mutation RT:T39E in Analyse A
auf Platz zwei gefunden und in Analyse C auf Platz neun. In der Spalte des
Positionsvergleiches A - C ist deshalb die Zahl neun eingetragen. Wurde eine Mutation im
Vergleich mit einer anderen Analyse nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden, ist dies mit
„fehlt“ gekennzeichnet.
Die drei Einzelanalysen waren sehr gut miteinander vergleichbar. Innerhalb der ersten
25 Ränge aus allen drei Analysen fanden sich jeweils mindestens 21 übereinstimmende
Mutationen. Die Unterschiede im jeweiligen Rang sind in Tab. 14 dargestellt. Dabei
unterschieden sich die Ränge in Analyse A zu B im Median um 1,5 die Ränge in Analyse A zu
C im Median um 2,0 und die Ränge in Analyse B zu C im Median um 1,0 Rangplätze. Die
maximale Verschiebung betrug 11 Rangplätze und trat bei der Mutation PR:E65D zwischen
Analyse A und B auf.
ERGEBNISSE
58
Tab. 14: Analyse des Einflusses von Mischungen an Sequenzpositionen anhand der Verschiebung der Ränge. Untersucht wurden die Top-25-Mutationen aus der univariaten Analyse anhand von 261 Proben des Geno2RC-Datensatzes.
Geno2RC (261) A B C Positionsvergleich
Rang Gen Mutation Gen Mutation Gen Mutation A – B A – C B – C
Mutationen, die in der bioinformatischen Analyse auf Viren mit höherer RC als Wildtyp hinweisen sind fett gedruckt. In den Spalten des Positionsvergleiches ist angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der zweiten Analyse positioniert ist. Mutationen, die in der Listung der ersten 25 Positionen in der Vergleichs-Listung nicht vorkommen wurden mit „fehlt“ markiert. A) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, B) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, die keinen Wildtyp-Anteil besitzen, und C) unter Ausschluss von allen Mischungen an Sequenzpositionen; fehlt: diese Mutation wurde im Vergleich mit einer anderen Analyse nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
In allen drei Einzelanalysen wurde die Mutation PR:L90M an erster Position identifiziert.
Diese Mutation konnte dabei als wichtigste Indikatormutation für verringerte RC, die PR-
Mutation 65D als wichtigste Indikatormutation für erhöhte RC einer Probe bestimmt werden.
ERGEBNISSE
59
Unter den ersten 25 Positionen in allen drei Analysen wurden insgesamt vier Mutationen
identifiziert, deren singuläres Vorhandensein auf einen höheren RC-Wert der Probe im
Vergleich zum Wildtyp schließen ließ. Es handelte sich dabei um die Mutationen PR:K20I,
PR:E65D und RT:Q207E, RT:E122K, wobei die Mutation PR:E65D allen drei Analysen
gemeinsam war.
Einfluss von gag-Mutationen auf die Ergebnisse aus der univariaten Analyse
Alle drei univariaten Einzelanalysen (A, B und C) wurden anhand von 92 Proben des
Geno2RC-Datensatzes, der zudem einen gag-Sequenzanteil besaß, wiederholt. Es sollte
untersucht werden, inwiefern sich gag-Mutationen unter den ersten Rängen einordnen.
Innerhalb der ersten 25 Positionen aus allen drei Analysen fanden sich jeweils mindestens 21
übereinstimmende Mutationen. Die Unterschiede in der Positionierung sind in Tab. 15
dargestellt. Dabei unterschieden sich die Rangplätze in Analyse A und B im Median um 4,0
Positionen, die Rangplätze in Analyse A und C im Median um 4,0 Positionen und die
Rangplätze in Analyse B und C im Median um 1,0 Positionen. Die maximale Verschiebung
betrug elf Positionen und trat bei der Mutation RT:R172K zwischen Analyse A und B auf. Die
zuvor auf dem ersten Rang gelistete Mutation PR:L90M wurde unter Einbezug der gag-
Sequenzen von Rang 1 auf die Ränge 14 (A) und 10 (B, C) verdrängt. Stattdessen wurden die
Mutationen RT:T39E (A) und PR:I72L (B, C) auf Rang eins gelistet. Es wurden insgesamt
innerhalb der ersten 25 Ränge folgende fünf gag-Mutationen unter den wichtigsten
identifiziert: Gag:A431V, Gag:F463V, Gag:E468K, Gag:E477G und Gag:I479V. Allen drei
Analysen gemeinsam waren dabei die Mutationen Gag:E477G, Gag:I479V. Keine der
wichtigsten gag-Mutationen aus den Top-25 Mutationen dieser Analyse wies auf erhöhte RC
im Vergleich zum Wildtyp HXB2 hin.
ERGEBNISSE
60
Tab. 15: Analyse des Einflusses von Gag-Mutationen anhand der Verschiebung der Ränge. Untersucht wurden die Top-25-Mutationen aus der univariaten Analyse von 92 Proben anhand des Geno2RC- Datensatzes.
Geno2RC (92) A B C Positionsvergleich
Position Gen Mutation Gen Mutation Gen Mutation A – B A – C B – C
1 RT T39E PR I72L PR I72L 2 5 1
2 PR G73T RT T39E PR G73T 3 2 5
3 PR I72L PR G73T GAG E477G 1 1 2
4 GAG E477G GAG E477G RT A98G 4 3 3
5 RT A98G RT A98G RT T39E 5 4 4
6 RT Y181C GAG I479V GAG I479V 13 11 6
7 GAG I479V RT D67N RT D67N 6 6 7
8 RT E79D PR I62V PR I62V fehlt fehlt 8
9 RT I178M PR I93L PR I93L 15 16 9
10 RT D67N PR L90M PR L90M 7 7 10
11 RT K219R RT T39A RT Y181C 16 20 fehlt
12 PR I93L RT T215Y RT M41L 9 9 18
13 RT R172K RT Y181C PR L10I 23 24 11
14 PR L90M RT M41L GAG F463V 10 10 12
15 PR I62V RT I178M RT L210W 8 8 16
16 RT T39A RT K219R RT I178M 11 fehlt 20
17 RT T215Y GAG F463V GAG A431V a 12 18 14
18 RT V75I RT L210W RT T215Y fehlt fehlt 15
19 PR L24F GAG A431V a PR I64V fehlt fehlt 17
20 RT M41L PR I64V RT K219R 14 12 19
21 GAG F463V RT V179I RT V179I 17 14 21
22 PR I64V RT Y188L RT Y188L 20 19 22
23 RT L210W RT R172K RT E122K 18 15 24
24 GAG A431V a PR G48M RT R172K 19 17 fehlt
25 RT Y188L GAG E468K GAG E468K 22 22 25
Mutationen, die in der bioinformatischen Analyse auf Viren mit höherer RC als diejenige des Wildtyp-Referenzvirus hinweisen, sind fett gedruckt. In den Spalten des Positionsvergleiches ist angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der zweiten Analyse positioniert ist. Mutationen, die in der Listung der ersten 25 Positionen in der Vergleichs-Listung nicht vorkommen, wurden mit „fehlt“ markiert. A) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, B) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, die keinen Wildtyp-Anteil besitzen, und C) unter Ausschluss von allen Mischungen an Sequenzpositionen; a Position liegt in der Spaltstelle p7 / p1; fehlt: diese Mutation wurde im Vergleich mit einer anderen Analyse nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
ERGEBNISSE
61
5.5.2 Multivariate Analyse
Support Vector Machines
In Tab. 16 wurden exemplarisch die Mutationen der ersten 25 Positionen aus den drei
Analysen, 261 Proben ohne gag-Mutationen, 92 Proben ohne gag (92_oG) Mutationen, sowie
das 92er Datenset unter Einbezug der gag-Informationen (92_mG) unter Berücksichtigung aller
Mischungen und mit allen Mutationen im Kontext verglichen und deren Einfluss auf Resistenz
hin begutachtet. Innerhalb der ersten 25 Positionen aus den drei verschiedenen Analysen
wurden in der PR drei und in der RT neun mit primärer Resistenz-assoziierte Mutationen
festgestellt (Johnson et al., 2006). Allen drei Analysen gemeinsam war die mit primärer
Resistenz-assoziierte Mutationen RT:Y181C, die in der Analyse mit SVM mit einem positiven
Einfluss auf RC gekoppelt war. Außerdem wurde festgestellt, dass die Mutationen Gag:I437V
und Gag:S451N in den Gag-Spaltstellen p7 / p1 bzw. p1 / p6 liegen. Berücksichtigte man
zusätzlich zu den primären Resistenz-assoziierten Mutationen die sekundären Mutationen, so
konnte man zusätzlich 12 Mutationen in der PR identifizieren. In allen drei Analysen wurden
die sekundären Mutationen die Mutationen PR:L10I und PR:G73T als relevant erkannt.
Entscheidungswälder
Ein alternatives Verfahren zur Bestimmung der Wertigkeit von AS-Positionen aus
Sequenzinformation für Funktionen stellen die Entscheidungswälder dar. In Analogie zu den
SVM, wurden dieselben drei Datensätze aus der Geno2RC-Datenbank verwendet. Auch hier
wurden exemplarisch die Mutationen der ersten 25 Positionen aus allen drei Analysen
verglichen (Tab. 17). Mit maßgeblichem Einfluss auf die RC konnten sowohl in der PR, als
auch in der RT sieben gemeinsame Aminosäure-Positionen unter den ersten 25 Rängen
Tab. 16: Multivariate Analyse des Einflusses von Mutationen auf die Replikationskapazität mittels Support Vector Machines mit und ohne Berücksichtigung der gag-Sequenzinformationen.
Positionsvergleich
SVM 261 92_oG 92_mG 261 261 92_oG
Rang Gen Mut. Gen Mut. Gen Mut. 92_oG 92_mG 92_mG
1 RT Y181C* RT D67N* RT Y181C* 11 1 fehlt
2 RT Q207E PR I62V* RT I178M fehlt 14 fehlt
3 RT T215Y* PR L90M* RT E122K 8 fehlt fehlt
4 PR V82A* RT M41L* PR L10I* fehlt 11 fehlt
5 RT K70R* RT D177E Gag R490K fehlt fehlt 18
6 PR K20I* PR I93L* RT L74V* fehlt fehlt 15
7 PR L10I* PR L63P* Gag I479V 20 4 fehlt
8 RT T39E RT T215Y* PR I64V* 23 fehlt fehlt
9 PR L63P* PR G73T* RT K20R 7 fehlt 21
10 PR L90M* PR A71V* RT G190A* 3 fehlt fehlt
11 RT Y188L* RT Y181C* PR V82A* 21 fehlt 1
12 PR E65D RT V179I RT T139K fehlt fehlt fehlt
13 RT A98G RT L210W* Gag P473S 16 fehlt fehlt
14 PR I15V* PR I72L RT Q207E fehlt fehlt fehlt
15 RT L74V* RT V118I PR I93L* fehlt 6 fehlt
16 PR I54V* RT A98G Gag E477G fehlt fehlt fehlt
17 PR L10F* RT D123E RT D123E fehlt 25 17
18 RT E122K RT K219R RT D177E 24 3 24
19 RT V35M PR I64V* Gag I437V a fehlt fehlt 8
20 PR I13V* PR L10I* Gag K475R fehlt fehlt 4
21 PR L19I RT Y188L* PR G73T* fehlt fehlt fehlt
22 PR L10V PR M46I* Gag S451N°a fehlt fehlt fehlt
23 PR G73T* RT T39E RT D123N 9 21 fehlt
24 RT T139K RT E122K RT K219R fehlt 12 3
25 PR L24F RT V60I PR L10F* fehlt fehlt fehlt * Mutationen, die als Resistenz-assoziiert beschrieben sind nach Johnson et al., 2006 (Johnson et al., 2006: 16946457); Mutationen (Mut.), die auf Viren mit höherer RC als Wildtyp hinweisen, sind fett gedruckt In den Spalten des Positionsvergleiches ist angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der Zweitgenannten Analyse positioniert ist. 92_oG : 92 Proben ohne gag, 92_mG : 92 Proben mit gag. SVM: Support Vector Machines, a Position liegt in der Spaltstelle p7 / p1, ° Position liegt in der Spaltstelle p1 / p6; gag: engl.: group specific antigen; fehlt: diese Mutation wurde im Vergleich mit einem anderen Datensatz nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
ERGEBNISSE
63
Tab. 17: Analyse des Einflusses von Mutationen auf die Replikationskapazität über Entscheidungswälder Machines mit und ohne Berücksichtigung der gag-Sequenzinformationen.
EW 261 92_oG 92_mG Positionsvergleich
Rang Gen AS-
Position Gen AS-
Position Gen AS-
Position 261-
92_oG 261-
92_mG 92_oG-92_mG
1 PR 82 PR 82 PR 72 1 13 13
2 RT 215 RT 215 Gag 479 2 11 11
3 RT 39 RT 39 PR 73 3 4 4
4 PR 63 RT 245 RT 39 6 fehlt fehlt
5 RT 245 PR 72 RT 67 4 fehlt 1
6 RT 67 PR 63 RT 98 7 5 fehlt
7 PR 90 RT 67 Gag 477 8 12 5
8 PR 72 PR 90 RT 219 5 1 12
9 RT 210 PR 54 RT 41 13 18 19
10 RT 98 RT 207 PR 93 11 6 fehlt
11 RT 139 RT 98 RT 215 15 fehlt 6
12 RT 207 PR 65 PR 90 10 fehlt fehlt
13 PR 54 RT 210 PR 82 9 19 18
14 PR 20 PR 20 RT 188 14 fehlt fehlt
15 PR 65 RT 139 RT 181 12 fehlt fehlt
16 RT 219 RT 35 PR 10 fehlt 8 fehlt
17 RT 188 PR 93 PR 62 fehlt 14 10
18 PR 24 PR 24 RT 210 18 fehlt fehlt
19 PR 93 RT 122 PR 54 17 10 23
20 PR 71 PR 10 RT 179 21 24 16
21 RT 35 PR 71 RT 162 16 fehlt 24
22 RT 162 RT 184 RT 123 25 21 fehlt
23 PR 73 PR 73 RT 122 23 3 3
24 PR 37 RT 181 PR 71 fehlt fehlt 15
25 RT 122 RT 162 PR 77 19 23 21 In den Spalten des Positionsvergleiches ist angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der Zweitgenannten Analyse positioniert ist. 92_oG : 92 Proben ohne Einbezug der gag-Informationen, 92_mG : 92 Proben mit gag-Informationen. EW: Entscheidungswälder; gag: engl.: group specific antigen; fehlt: diese Mutation wurde im Vergleich mit einem anderen Datensatz nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
ERGEBNISSE
64
Gegenüberstellung von Replikations-beeinflussenden gag-Mutationen, identifiziert mittels Support Vector Machines und Entscheidungswäldern
In Tab. 18 sind die Top-20 gag-Mutationen in der Übersicht dargestellt, die in den SVM und
den EW den größten Einfluss auf die RC besitzen (92 Daten).
Tab. 18: Vergleich der Top-20-Gag-Positionen. Analysiert wurden dazu 92 Proben, die mit Hilfe von Entscheidungswäldern und Support Vector Machines analysiert wurden.
92 EW_mG SVM 92_mG
Rang gag-AS Position Rang Mutation Positionsvergleich
2 479 5 R490K 2
7 477 7 I479V 4
27 463 13 P473S fehlt
30 468 16 E477G fehlt
35 460 19 I437V a fehlt
36 441 20 K475R 9
39 431? 22 S451N b 10
40 469 34 I479T fehlt
44 487 36 Y441N fehlt
46 451? 40 A431V a 7
49 473 51 L449F b 3
57 436? 54 P478L 19
62 ins 56 S451T b fehlt
63 428? 61 V467E 18
64 471 73 R464K fehlt
65 478 86 K481E 12
74 490 87 P473L 1
82 470 88 E428A a fehlt
85 464 91 K436R a 15
88 449? 94 N495S 11 Fett gedruckt sind Mutationen in den SVM, die auf Viren mit erhöhter RC im Vergleich zu Wildtyp hinweisen. In den Entscheidungswäldern ist keine Angabe von AS möglich. Daher werden einige Mutationen in den SVM öfter unter den ersten 20 Mutationen gelistet. Mutationen, die auf erhöhte RC im Vergleich zum Referenzvirus HXB2 hinweisen sind fett gedruckt. EW; Entscheidungswälder; VM: Support Vector Machines; a Position liegt in der Spaltstelle p7 / p1; b Position liegt in der Spaltstelle p1 / p6; gag: engl.: group specific antigen; fehlt: diese Gag-Position wurde nur unter den Top-20Gag-Positionen einer der Analysen mittels SVM oder EW gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
ERGEBNISSE
65
Über den Rang ist angegeben, an welcher Position in der Liste die Mutation vorkam. Für die
Entscheidungswälder ist dabei die jeweilige Position der veränderten Aminosäure gelistet, für
die SVM der entsprechende Aminosäure-Austausch. Es konnten 12 übereinstimmende
Aminosäure-Positionen in den Top-20 gag-Mutationen beider Listen gefunden werden. Es
handelt sich dabei um die Positionen: Gag:428, Gag:431, Gag:436, Gag:441, Gag:449,
Gag:451, Gag:464, Gag:473, Gag:477, Gag:478, Gag:479 und Gag:490. In dieser Analyse
wurden verschiedene Aminosäure-Positionen identifiziert, die in den gag-Spaltstellen liegen.
Zu den Positionen in der p1 / p6 Spaltstelle (443 - 453) gehören: Gag:449 und Gag: 451. Zu
den Positionen in der p7 / p1 Spaltstelle (428 - 437) gehören: Gag:428, Gag:431, Gag:436
sowie Gag:437. Mutationen in den Spaltstellen sind als kompensatorische RC-Mutationen
beschrieben worden (Zhang et al., 1997). Außerhalb dieser beiden Schnittstellen wurde die
Mutation Gag:I479V als Therapie-assoziiert beschrieben (Peters et al., 2001).
Identische Replikationskapazitäts-assoziierte Mutationen aus univariater- und multivariater-Analyse
Um abschätzen zu können, welche der RC-assoziierten Mutationen aus der univariaten
Analyse, den SVM und EW mit dem niedrigsten Fehler RC-assoziierte Mutationen darstellen,
wurden die ersten 25 Mutationen aus der univariaten Analyse unter Einbezug aller Mischungen
mit den ersten 25 Mutationen der SVM und EW verglichen. Dabei wurde einerseits der große
Datensatz mit 261 Datenpaaren ohne gag-Mutationen und andererseits der kleine Datensatz mit
92 Datenpaaren inklusive gag-Mutationen verglichen. Die Mutationen, die in der univariaten
Analyse als wichtigste eingestuft wurden, stimmten zu einem erheblichen Anteil mit der Liste
der Mutationspositionen aus den EW überein. Weniger Übereinstimmungen konnten dagegen
beim Vergleich der wichtigsten Mutationen aus der univariaten Analyse mit den SVM
gefunden werden. Da hier nur die wichtigsten 25 Positionen untersucht wurden, ist
anzumerken, dass RC-assoziierte Mutationen in den verschiedenen Analysen auch in den
Positionen unterhalb der ersten 25 Listenplätze durchaus hoch identisch waren, wobei der
Abstand der Rangplätze in verschiedenen Analysen aber etwas größer war, was unter anderem
an der verschiedenen Anzahl an Rangplätzen in den unterschiedlichen Analysen lag. So
enthielt der Datensatz 261 ohne Gag in der Analyse mittels SVM 1435 Rangplätze und in der
Analyse mittels EW 404 Rangplätze, der Datensatz 92 mit Gag in der Analyse mittels SVM
717 Rangplätze und in der Analyse mittels EW 349 Rangplätze.
ERGEBNISSE
66
Im kleinen Datensatz mit gag (92) stimmten folgende sechs Mutationen im Vergleich der Top-
25 Mutationen aus univariater Analyse, SVM und EW überein: GAG:E477G, GAG:I479V,
PR:G73T, PR:I93L, RT:Y181C, RT:K219R. Im großen Datensatz (261) stimmten im
Vergleich die 12 Mutationen PR:L24F, PR:I54V, PR:E65D, PR:G73T, PR:V82A, PR:L90M,
RT:T39E, RT:A98G, RT:T139K, RT:Y188L, RT:Q207E, RT:T215Y überein. Einzig die
Mutation PR:G73T konnte im Vergleich der univariaten Analyse mit SVM und EW sowohl im
großen, als auch im keinen Datensatz unter den Top-25-Mutationen identifiziert werden.
Mutationen, die sowohl in der univariaten Analyse als auch in über SVM und EW unter den
Top-25-Mutationen im kleinen, oder im großen Datensatz identifiziert wurden, sind in Tab. 19
dargestellt. Zusätzlich ist in dieser Tabelle angegeben, wie viele Proben im großen Datensatz
die jeweilige Mutation aufwiesen und in wie vielen Proben an dieser AS-Position die Wildtyp-
AS vorlag. In den übereinstimmenden RC-assoziierten Mutationen aus der univariaten
Analyse, SVM und EW wurden interessanterweise bereits zuvor viele der identifizierten
Mutationen als Resistenz-assoziiert, RC-assoziiert oder als Polymorphismen beschrieben
(Tab. 19). Bei einer Mutation handelt es sich um einen Polymorphismus, wenn eine Mutation
auch in therapienaiven Patienten auftritt.
Da die Stanford HIV Drug Resistance Database einen sehr großen Datensatz verfügt
(8426 Proben von 5867 Patienten), konnten mit Hilfe der über das Internet frei zugänglichen
Datenbank die von uns identifizierten Mutationen PR:L24F, PR:E65D, RT:T39E, RT:T139K
und RT:Q207E als Polymorphismen identifiziert werden (http://www.hivdb.stanford.edu/). Des
Weiteren wurde für die Mutation Gag:I479V beschrieben, dass sie innerhalb eines Gag-Epitops
liegt, welches Hinweise auf die Rolle dieser Mutation im Kontext der Immunabwehr liefert
(Geldmacher et al., 2007).
Zu den mit primärer Resistenz-assoziierten Mutationen gehören die PR-Mutationen: PR:V82A,
PR:L90M, und die RT-Mutationen: RT:Y181C, RT:Y188L, RT:T215Y, zu den mit sekundärer
Resistenz-assoziierten Mutationen die PR-Mutationen: PR:I54V, PR:G73T und PR:I93L
(Stanford Drug Resistance Database); (Berkhout et al., 2006; Cabana et al., 1999; Gallego et
al., 2001; Johnson et al., 2006; Peters et al., 2001). In Zusammenhang mit verminderter RC
wurden die Mutationen PR:I54V, PR:V82A, PR:L90M, PR:I93L, Y188L und RT:T215Y
beschrieben, in Zusammenhang mit erhöhter RC die Mutation RT:Y181C (Andreoni, 2004;
Barbour et al., 2002; Charpentier et al., 2004; Goudsmit et al., 1997; Harrigan et al., 1998; Iga
et al., 2002; Iglesias-Ussel et al., 2002; Isaguliants et al., 2004; Kosalaraksa et al., 1999;
ERGEBNISSE
67
Martinez-Picado et al., 1999; Menzo et al., 2003; Nicastri et al., 2003; Picchio et al., 2000;
Prado et al., 2004; Weber et al., 2003).
Tab. 19: Übersicht der wichtigsten Replikationskapazitäts-assoziierten Mutationen, identifiziert über univariate Analyse, SVM und EW mit zusätzlicher Charakterisierung dieser Mutationen aus der Literatur.
Gen Mutation Proben mit
WT AS Proben mit
mut AS RC Resistenz Poly-
morphismus
Gag E477G 76 14 - ja -
Gag I479V 49 16 - ja -
PR L24F 237 9 - - ja
PR I54V° 155 87 ja ja -
PR E65D 254 9 - - ja
PR G73T° 219 20 - ja -
PR V82A* 153 63 ja ja -
PR L90M* 159 107 ja ja -
PR I93L° 149 114 ja ja -
RT T39E 181 20 - - ja
RT A98G 208 33 - ja -
RT T139K 250 7 - - ja
RT Y181C* 224 36 ja ja -
RT Y188L* 231 25 ja ja -
RT Q207E 172 68 - ja ja
RT T215Y* 100 136 ja ja -
RT K219R 172 28 - ja - * primäre Resistenz-assoziierte Mutationen und ° sekundäre Resistenz-assoziierte Mutationen nach Johnson et al., 2006; Polymorphismen wurden mit Hilfe der Stanford HIV Drug Resistance Database identifiziert; Mutationen mit höherer Replikationskapazität als NL4-3 sind fett gedruckt; Proben mit WT AS: Anzahl der Proben, die im großen Datensatz an dieser Position die Wildtyp (NL4-3) Aminosäure aufwiesen; Proben mit mut AS: Anzahl der Proben, die im großen Datensatz an dieser Position eine abweichende Aminosäure von NL4-3 aufwiesen; AS: Aminosäure, WT: Wildtyp, mut: mutiert; SVM: Support Vector Machines; EW: Entscheidungswälder; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
5.6 Vorhersage der Replikationskapazität anhand des Genotyps
Der gesamte Datensatz der für die bioinformatischen Analysen basiert auf 261 Genotyp-RC-
Proben. Um für eine unbekannte Probe die RC mittels SVM oder EW vorherzusagen, wurden
ERGEBNISSE
68
für diese Probe alle Gewichte der Einzelmutationen verrechnet, so dass man abschließend
einen Wert über die voraussichtliche RC dieser Probe erhält. Eine gute Vorhersage von RC-
Werten zeichnet sich durch niedrige MSE-Werte (engl.: mean squared error) und hohe R2-
Werte aus. In der Korrelationsgrafik zwischen gemessener und vorhergesagter RC würde die
ideale Vorhersage eine Winkelhalbierende ergeben (Abb. 16). Der Vergleich zwischen
gemessener und vorhergesagter RC ergab aber nur für Proben mit geringer RC eine gute
Korrelation. Werte mit hoher RC wurden dagegen generell zu niedrig vorhergesagt. Dies traf
sowohl für die Vorhersage über SVM, als auch über EW zu. Der niedrigste gemessene RC-
Wert betrug 2 %, der höchste 300 %. Der niedrigste vorhergesagte RC Wert betrug 7 %, der
höchste 89 %.
Abb. 16: Korrelation zwischen gemessener und vorhergesagter RC anhand von 242 Proben aus der Geno2RC-Datenbank. Die Vorhersage der Replikationskapazität anhand des Genotyps erfolgte mittels Support Vector Machines (SVM) und Entscheidungswäldern (EW). Der Pfeil in der Diagonale stellt die idealisierte, optimale Korrelation dar. Die Linie, mit den benachbarten zwei gestrichelten Linien stellt die Hyperebene mit den Abständen zu den dichtest benachbarten Vektoren dar. Die Vorhersagequalität für niedrige RC-Werte (kleines Quadrat) war besser, als für RC-Werte oberhalb von 65%. RC: Replikationskapazität. Der Vorhersagefehler für die PR- und RT-Sequenzen betrug für 261 Daten für SVM 15,2 %
und für die EW 14,4 % und ist damit für beide Verfahren vergleichbar (Tab. 20). Der Fehler
wurde in dem kleineren Datensatz von 92 Proben etwas geringer, unabhängig davon, ob die
gag-Sequenzen in die Analyse mit einbezogen wurden (SVM 13.9 %, EW 14.2 %) oder nicht
(SVM 14.0 %, EW 13.9 %). Diese Unterschiede waren aber sehr wahrscheinlich nicht relevant.
SVM
vorh
erg
esag
te R
C (%
)
gemessene RC (%)
RFvo
rher
ges
agte
RC
(%)
gemessene RC (%)
50 100 1500
5010
015
00
50 100 1500
5010
015
00 HyperebeneHyperebene
SVM
vorh
erg
esag
te R
C (%
)
gemessene RC (%)
RFvo
rher
ges
agte
RC
(%)
gemessene RC (%)
50 100 1500
5010
015
00
50 100 1500
5010
015
00 HyperebeneHyperebene
ERGEBNISSE
69
Tab. 20: Vorhersagefehler der Kreuzvalidierung für Entscheidungswälder und Support Vector Machines mit und ohne Einbezug der gag-Sequenzen.
(261) PR, RT (92) PR, RT (92) PR, RT, Gag
SVM MSE R2 MSE R2 MSE R2
MW 0,152 0,241 0,140 0,298 0,139 0,325
Stabwn 0,001 0,015 0,004 0,040 0,003 0,029
EW MSE R2 MSE R2 MSE R2
MW 0,144 0,297 0,139 0,320 0,1419 0,319
Stabwn 0,003 0,019 0,004 0,029 0,005 0,024
MSE: engl.: mean squared error; Stabwn: Standardabweichung; EW: Entscheidungswälder; SVM: Support Vector Machines.
Eine Subtypen-spezifische Analyse der RC-Vorhersage auf Basis der Geno2RC-Datenbank
ergab, dass sowohl in B- als auch in non-B-Subtypen Proben mit geringer RC und mit primären
Resistenz-assoziierten Mutationen besser vorhergesagt werden konnten als Proben mit hoher
RC ohne Resistenz-assoziierte Mutationen.
Für B-Subtypen mit primären Rsistenz-assoziierten Mutationen wurden folgende RC-
Verteilungen ermittelt: Die gemessene RC lag im Median bei 30 % (IQR (25 - 75): 13 % -
56 %) und die vorhergesagte RC im Median bei 34 % (IQR (25 - 75): 23 % - 45 %). Für non-
B-Subtypen mit primären Resistenz-assoziierten Mutationen wurden folgende RC-
Verteilungen ermittelt: gemessene RC im Median 47 % (IQR (25 - 75): 28 % - 85 %) und
vorhergesagte RC im Median 49 % (IQR (25 - 75): 33 % - 55 %). Für B-Subtypen ohne
primäre Resistenz-assoziierte Mutationen wurden folgende RC-Verteilungen ermittelt:
gemessene RC im Median 61% (IQR (25 - 75): 41 % - 100 %) und vorhergesagte RC im
Median 53 % (IQR (25 - 75): 50 % - 59 %). Für non-B-Subtypen ohne primäre Resistenz-
assoziierte Mutationen lagen diese Werte dagegen höher mit einem Median von 77% der
gemessenen RC (IQR (25 - 75): 34 % - 116 %) und einer vorhergesagten RC von 63%
(IQR (25 - 75): 50 % - 75 %).
Die beiden nicht resistenten Wildtyp-Viren erreichten bei dieser Vorhersage RC-Werte von
NL4-3: 53,34 % und HXB2: 47,42 %. Um abschätzen zu können, ob dieser geringfügige
ERGEBNISSE
70
Unterschied der nicht resistenten Wildtyp-Viren auf verschiedene AS im rekombinanten Anteil
zurückzuführen war, wurden deren rekombinante Sequenzabschnitte verglichen und dabei 14
abweichende AS identifiziert (Tab. 21).
Tab. 21: Aminosäure-Unterschiede zwischen den beiden nicht resistenten Wildtyp-Viren HXB2 und NL4-3 im rekombinanten Genanteil.
Gen AS Position AS HXB2 AS NL4-3 Gen AS Position AS HXB2 AS NL4-3
Gag 441 Y H PR 57 R G
Gag 467 V E RT 102 K Q
Gag 473 P S RT 122 E K
Gag 487 T A RT 163 S C
Gag 495 N S RT 214 L F
PR 3 V I RT 272 P A
PR 37 S N RT 293 I V
AS: Aminosäure; PR: Protease; RT: reverse Transkriptase; HXB2, NL4-3: Vektoren die keine Resistenz-assoziierten Aminosäuren tragen; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
5.7 Analyse der Auswirkungen des wechselnden Selektionsdrucks
in der CAT-Studie
Der wechselnde Selektionsdruck in der CAT-Studie wirkt sich auf die verschiedenen Varianten
in der Plasmapopulation unterschiedlich aus. In drei Patienten konnte ein stetiger Wechsel von
zwei Hauptpopulationen festgestellt werden (Patienten: 4, 5, 8). Eine Population trug dabei
vornehmlich Mutationen, die PI-Resistenz hervorrufen, die andere hingegen Mutationen, die
vornehmlich RTI-Resistenz hervorrufen. In der Folge des kontinuierlichen Therapie-Wechsels,
erschien abwechselnd eine der beiden Populationen als vorherrschend. Exemplarisch sollen
hier die beiden alternierenden Populationen von Patient 4 charakterisiert werden. Die unter RTI
selektionierte Population besaß im Mittel eine RC von 16 % (Einzelwerte: Woche 12: 19 %,
Woche 26: 13 %, Woche 30: 17 %, Woche 40: 23 %, Woche 46: 8 %). Sie war charakterisiert
durch das Erscheinen der Resistenz-assoziierten Mutationen: RT:70R, RT:184V. Die unter PI
selektionierte Population besaß im Mittel eine RC von 4 % (Einzelwerte: Woche 14: 3 %,
Woche 52: 5 %) und war charakterisiert durch das Auftauchen der Resistenz-assoziierten
ERGEBNISSE
71
Mutationen: PR:33F, PR:54V, PR:71V, PR:82A. In Tab. 22 ist ein Beispiel von zwei
wechselnden Populationen unter RTI- und PI-Therapie für die Protease dargestellt.
Tab. 22: Darstellung des Wechsels von zwei Hauptpopulationen anhand der Protease-Mutationen in Patient 4 der CAT-Studie. Unter RTI-Therapie verschwinden die Protease-Inhibitor-Mutationen und erscheinen wieder beim Wechsel zum Protease-Inhibitor-haltigem-Therapieregime.
RTI: AZT 3TC ABC TDV PI: LPV/r SQV
Wo 0 Wo 4 Wo 6 Wo 8 Wo 10 Wo 12 Wo 14
n.d. V3I V3I V3I V3I V3I V3I
L10I L10I L10I L10I L10I L10I L10I
I13V I13V I13V I13V I13V I13V I13V
L24F L24F/L L24F/L - - L24F L24F
L33F L33F/L L33F/L - - L33F L33F
S37N S37N S37N S37N S37N S37N S37N
R41K R41K R41K R41K R41K R41K R41K
M46I M46I M46I M46I M46I M46I M46I
I54V I54I/V I54I/V - - I54V I54V
- K55K/R - K55K/R K55K/R - -
D60E D60E D60E D60E D60E D60E D60E
I62V I62V I62V I62V I62V I62V I62V
L63P L63P L63P L63P L63P L63P L63P
A71A/V A71A/V - - - A71V A71A/V
I72L I72L I72L I72L I72L I72L I72L
G73T G73T G73T G73T G73T G73T G73T
V77I V77I V77I V77I V77I V77I V77I
V82A V82A/V V82A/V - - V82A V82A
N83N/Y - - - - - -
L90M L90M L90M L90M L90M L90M L90M
I93L I93L I93L I93L I93L I93L I93L
Fett gedruckt sind die Resistenz-assoziierten Mutationen, die unter PI-Therapie selektioniert wurden (Johnson et al., 2006). Die unter PI selektionierten Resistenz-assoziierten Mutationen verschwinden unter RTI-Therapie und tauchen beim Wechsel zur PI-Therapie in Woche 12 wieder auf. PR: Protease; RTI: reverse Transkriptase-Inhibitoren; Wo: Woche; - : keine Mutation detektiert Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
Prinzipiell war eine partielle Resensitivierung multipel resistenter Virusstämme durch
alternierende Therapie-Regimes möglich. Reversionen erfolgten jedoch nur in einem geringen
Prozentsatz der Patienten, da in den anderen 18 Patienten kein Wechsel von zwei
Hauptpopulationen nachgewiesen werden konnte.
ERGEBNISSE
72
5.8 Untersuchung von Viruslastveränderungen in der CAT-Studie
Gemäß den Kriterien der CAT-Studie erfolgten Therapie-Umstellungen, wenn die VL um mehr
als den Faktor drei anstieg. In einigen Fällen aber wurde der VL-Wiederanstieg erst bekannt,
wenn der Patient bereits wieder vorstellig geworden war, so dass zum nächsten Termin Werte
aus einer erneuten VL-Bestimmung vorlagen. In wenigen Fällen zeigte sich dabei, dass die VL
unter unveränderter Therapie wieder abgesunken war. Dies ging zumeist einher mit einer
phänotypischen Veränderung, aber kaum Änderungen in den Sequenzen. Insbesondere an den
zu erwartenden Änderungen an Resistenz-assoziierten Positionen, welche mittels
konventioneller Sequenzierung untersucht wurden, konnten keine maßgeblichen
Verschiebungen gefunden werden.
Abb. 17: Verlauf von VL und CD4-Zellzahl in Patient 8 der CAT-Studie. Nach Therapie-Umstellung von reverse Transkriptase-Inhibitoren (RTI) zu Protease-Inhibitoren (PI) in Woche 10 folgte ein initialer Viruslast-Abfall bis zur 18. Woche ohne Veränderung der CD4-Zellzahl. Diesem folgte ein transienter Viruslast-Anstieg größer Faktor drei von Woche 18 auf 20, einhergehend mit einem parallelen Anstieg der CD4-Zellzahl und einem Abfall der Phänotypischen Resistenz; VL: Viruslast; RTI: reverse Transkriptase-Inhibitoren; PI: Protease-Inhibitoren. Auffällig war außerdem, dass in einigen Patienten nach Therapie-Umstellung trotz initialem
VL-Abfall die CD4-Zellzahlen weitestgehend stabil blieben und auch in diesen Proben keine
maßgeblichen genotypischen Veränderungen festgestellt werden konnten. Das angegebene
Beispiel Abb. 17 und Tab. 23 (Patient 8) soll diese beiden Phänomene exemplarisch
illustrieren.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 26 28
CD
4-Ze
llzah
l
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
Viru
slas
tCD4Viruslast
RTI PI
Woche
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 26 28
CD
4-Ze
llzah
l
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
Viru
slas
tCD4Viruslast
RTI PI
Woche
ERGEBNISSE
73
Tab. 23: Exemplarisch werden hier die Proben aus Woche 18 und 20 charakterisiert. Parallel zum Viruslast- und CD4-Zellzahlanstieg in Woche 20 stieg die Replikationskapazität ohne relevante genotypische Veränderungen an und die phänotypische Resistenz fiel ab. A) Genotypische Veränderungen, B) CD4-Zellzahl, Viruslast RC und Resistenzfaktoren der Protease und C) Resistenzfaktoren der reversen Transkriptase;
A
Woche PR PR PR RT RT
18 A71A/V T74K/P/Q/T L89M D218D/E/K K219K/Q
20 A71A/V/L/P T74P/T L89M/V D218D/E K219Q
B RF der PI Woche CD4 VL RC IDV SQV RTV NFV APV LPV ATV
C RF der RTI Woche ZDV DDI D4T 3TC FTC ABC TDV NVP EFV DLV
18 137 2,2 2,3 >15* n.d. 6,7 3,5 37 9,1 24
20 >59* 0,9 2,8 n.d. >146* 13 1,2 13 0,6 7
* diese RF lagen an der Obergrenze des Messbereiches und könnten real höher liegen; grau hinterlegt sind die Medikamente aus der verabreichten Therapie; VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; RF: Resistenzfaktor; RC: Replikationskapazität; PI: Protease-Inhibitoren; RTI: reverse Transkriptase-Inhibitoren; n.d.: nicht durchgeführt; Abkürzungen der Medikamente s. Anhang; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
Klonale Analysen
Da bekannter Maßen über konventionelle Sequenzierung Virus-Minoritäten nur zu einem
geringen Anteil erfasst werden können (Nachweisgrenze bei etwa 25 % - 30 %) sollte überprüft
werden, ob durch klonale Analysen zusätzliche Resistenz-assoziierte Mutationen detektiert
werden können (Beerenwinkel et al., 2003b; Korn et al., 2003; Schuurman et al., 1999;
Schuurman et al., 2002).
Von fünf Patienten und 22 Proben aus der CAT-Studie konnten erfolgreich 110 molekulare
Klone generiert und sequenziert werden. Als Kontrollgruppe dienten sieben Patienten mit acht
Proben, von denen 48 Klone erfolgreich generiert und sequenziert wurden. Alle untersuchten
ERGEBNISSE
74
Klone wurden über einen identischen Genanteil mit einheitlicher Größe von 1035 bp untersucht
(PR: AS 1 - 99, RT: AS 1 - 246), für die eine parallele VL vorlag.
Tab. 24: Korrelationen der Viruslast-Veränderung mit Aminosäueaustauschen und Basenaustauschen der Klone aus der CAT-Gruppe.
CAT
Patient Plasma-
probe dVL Klone neue Mut bp-Tausche neue Mut /
1000bp neue bp / 1000bp
1 KV66 6,5 7 10 24 1,38 3,31
1 KV67 11,6 3 13 23 4,19 7,41
1 KV84 3,5 7 4 17 0,55 2,35
1 KV85 0,5 10 13 25 1,26 2,42
4 KV13 1,6 4 8 14 1,93 3,38
4 KV14 0,8 3 0 15 0,00 4,83
5 KL19 1,8 1 0 6 0,00 5,80
5 KL20 0,5 3 1 9 0,32 2,90
5 KL21 1,0 6 1 11 0,16 1,77
5 KL22 0,7 6 12 21 1,93 3,38
5 KL23 0,6 4 3 11 0,72 2,66
5 KL24* 4,2 4 7 22 1,69 5,31
8 KL64 0,7 4 11 33 2,66 7,97
8 KL65 0,2 3 5 14 1,61 4,51
8 KL66 0,4 4 5 10 1,21 2,42
8 KL67 12,4 8 22 52 2,66 6,28
8 KL68 0,4 1 2 13 1,93 12,56
8 KL69 1,4 2 5 12 2,42 5,80
11 KL89 0,1 7 6 12 0,83 1,66
11 KL90 3,3 6 9 28 1,45 4,51
11 KL91 2,9 10 31 44 3,00 4,25
11 KL92 0,3 7 6 20 0,83 2,76 *Die Probe KL24 wurde aus der Analyse ausgeschlossen, weil die zugehörige VL an der Obergrenze des Messbereiches lag, und die reale VL möglicherweise höher war. VL: Viruslast; d: delta; bp: Basenpaar; bp-Tausche: Basenaustausche.
ERGEBNISSE
75
Tab. 25 Korrelationen der Veränderung der Viruslast mit Aminosäure-Austauschen und Basenaustauschen der Klone aus der Kontrollgruppe
Kontrollgruppe
Patient Plasma-
probe dVL Klone neue Mut bp-Tausche neue Mut /
1000bp neue bp / 1000bp
23 NZ8 0,6 3 7 10 2,25 3,2
23 NZ9 3,7 8 17 29 2,05 3,5
24 NZ12 n.d. 3 n.d. n.d. n.d. n.d.
24 NZ13 2716 6 10 36 1,61 5,8
25 NZ14 n.d. 2 n.d. n.d. n.d. n.d.
25 NZ15 0,0 10 19 21 1,84 2,0
26 NZ16 1,2 3 3 10 0,97 3,2
26 NZ17 0,9 6 10 20 1,61 3,2
27 NZ19 0,6 6 8 25 1,29 4,0
28 PK9 0,3 6 14 40 2,25 6,4 *Die Probe KL24 wurde aus der Analyse ausgeschlossen, weil die zugehörige VL an der Obergrenze des Messbereiches lag und die reelle VL möglicherweise höher ist. VL: Viruslast; d: delta; bp: Basenpaar; bp-Tausche: Basenaustausche; n.d.: nicht durchgeführt.
Korrelation von der Viruslastveränderung mit Aminosäure-Austauschen, die nur in den Klonen, jedoch nicht in der Plasmasequenz gefunden wurden
Bei den klonalen Analysen wurden zunächst die Sequenzen der Klone auf Aminosäure-
Abweichungen zum Wildtyp HXB2 hin untersucht. Diejenigen Mutationen, die zusätzlich zu
Mutationen auftraten, die bereits mit konventioneller Sequenzierung nachgewiesen worden
waren, wurden als neu gefundene Minoritäten-Mutationen erfasst. Betrachtete man den
mittleren Anteil an AS-Austauschen pro 1000 bp, so konnte man feststellen, dass die absolute
Anzahl an AS-Austauschen im Mittel in der Kontrollgruppe (1,7) vergleichbar war zu denen
der CAT-Klone (1,5).
In der Kontrollgruppe konnte aber keine signifikante Korrelation zwischen der Veränderung
der VL (dVL) und der Anzahl an Minoritäten-Mutationen festgestellt werden (p: 0,796,
R2: 0,012). Dagegen konnte bei den CAT-Klonen eine signifikante Korrelation zwischen dVL
und der Anzahl an Minoritäten-Mutationen festgestellt werden (p: 0,006, R2: 0,316) (Abb. 18).
ERGEBNISSE
76
Abb. 18: Lineare Regressionsanalysen der dVL und Minoritäten-Mutationen (Aminosäure-Austausche) in CAT- und Kontroll-Klonen. A) Signifikante Korrelation zwischen der Anzahl an Minoritäten-Mutationen und der Veränderung der Viruslast über die Zeit in den CAT-Klonen; B) Keine Korrelation zwischen der Anzahl an Minoritäten-Mutationen und der Veränderung der Viruslast über die Zeit in den Kontroll-Klonen; CAT: engl.: continuously alternating therapy; VL: Viruslast; d: delta.
Korrelation der Basenaustausche in den Minoritäten-Mutationen
In dieser Analyse wurden im Unterschied zu der vorangegangenen auch Basenaustausche
berücksichtigt, die keine Veränderung in der AS-Sequenz verursachten. Nun konnten weder für
die CAT-Klone (p: 0,260, R2: 0,061) noch für die Kontroll-Klone (p: 0,187, R2: 0,269)
Korrelationen zwischen der dVL und den Basenaustauschen je 1000 bp festgestellt werden
(Abb. 19). Interessanterweise war der mittlere Anteil an Basenaustauschen pro 1000 bp in der
p: 0,796R2: 0,012
B)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 1 2 3 4 5
dVL
Min
oritä
ten-
M
utat
ione
n/10
00 b
p
p: 0,006R2: 0,316
A)
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14
dVL
Min
oritä
ten-
M
utat
ione
n/10
00 b
p
ERGEBNISSE
77
Gruppe der Kontroll-Klone (3,9) niedriger als in der CAT-Gruppe (4,5). Je höher die Änderung
in der VL war, desto höher war auch die Anzahl an Basenaustauschen in der CAT-Gruppe.
Dieser Trend war in der Kontrollgruppe nicht zu beobachten.
Abb. 19: Lineare Regressionsanalysen der delta Viruslast (dVL) und Basenaustauschen in CAT- und Kontroll-Klonen. A) Trend einer Verknüpfung von erhöhter Anzahl an Basenaustauschen mit einer vermehrten Veränderung der Viruslast in CAT. B) Keine Korrelation zwischen Basenaustauschen und einer Veränderung der Viruslast in der Kontrollgruppe; CAT: engl.: continuously alternating therapy; VL: Viruslast; d: delta.
Analyse der Minoritäten-Mutationen Insgesamt wurden in den CAT-Klonen 174 Minoritäten-Mutationen (Mutationen die nicht
durch konventionelle Sequenzierung gefunden wurden) gefunden, davon 41 in der PR an 22
p: 0,269R2: 0,187
B)
01234567
0 1 2 3 4 5
dVL
Bas
enau
stau
sche
/1
000
bp
p: 0,260R2: 0,061
A)
02468
101214
0 2 4 6 8 10 12 14
dVL
Bas
enau
stau
sche
/1
000
bp
ERGEBNISSE
78
verschiedenen AS-Positionen und 133 in der RT an 82 AS-Positionen. Dagegen wurden in den
Kontrollklonen 88 Minoritäten-Mutationen gefunden, davon 33 in der PR an 23 verschiedenen
AS-Positionen und 55 in der RT an 48 AS-Positionen.
Es konnten 17 Positionen in der RT und sechs Positionen in der PR identifiziert werden, an
denen sowohl in den CAT- als auch in den Kontroll-Klonen Aminosäure-Austausche vorlagen.
Dabei handelte es sich um die PR-Positionen 23, 35, 41, 43, 48, 65 und die RT-Positionen 7,
16, 64, 75, 102, 104, 218, 128, 177, 198, 199, 201, 202, 218, 230, 232 und 242. Bei genauerer
Betrachtung stimmten in beiden Gruppen die Mutationen PR:23P, PR:35G, PR:41K, PR:42R,
PR:48E, RT:64E, RT:102R, RT:198R, RT:199G, RT:201R, RT:232C und RT:242R überein.
In einer weiteren Analyse beider Gruppen wurden die Minoritäten-Mutationen auf Resistenz-
assoziierte Mutationen hin untersucht (Johnson et al., 2006). In der Liste der
übereinstimmenden Mutationen aus beiden Gruppen konnte nur die Mutation PR:E35G als
Resistenz-assoziierte Mutation identifiziert werden. Betrachtet man die beiden Gruppen jedoch
einzeln, ließen sich zudem weitere Resistenz-assoziierte Mutationen identifizieren. In der CAT-
Gruppe konnten die zehn Mutationen PR:I13V, PR:E35G, PR:I62V, PR:I64M, RT:A62V,
RT:F77L, RT:F116Y, RT:Y181C, RT:G190A und RT:K219E identifiziert werden. In der
Kontrollgruppe konnten die fünf Mutationen PR:E35G, PR:V82A, RT:D67N und RT:L100I
identifiziert werden. Die einzigen Mutationen aus dieser Liste, die häufiger als einmal
detektiert wurden (jeweils fünf Mal detektiert) und die mit hoher Resistenz assoziiert sind,
waren die Mutationen Y181C und G190A. Diese Mutationen traten jedoch immer in
Kombination mit einer der Mutationen RT:K103N oder RT:Y188L auf, welche an sich jeweils
hohe NNRTI-Kreuzresistenz verursachen.
Vergleich der Minoritäten-Detektion mittels allelspezifischer selektiver real-time-PCR, konventioneller Sequenzierung und klonalen Analysen
Als zweite Methode zur Untersuchung der Plasmapopulationen aus den Proben mit transienten
VL-Anstiegen wurden sehr sensitive quantitative allelspezifische real-time-PCRs nach Metzner
und Kollegen durchgeführt (Metzner et al., 2003; Metzner et al., 2005). Es sollte untersucht
werden, ob möglicherweise Mutationen an Positionen, die mit starker Resistenz assoziiert sind,
durch sequenzielle Analyse der Plasmapopulation und klonale Analysen nicht erfasst wurden.
ERGEBNISSE
79
Tab. 26: Gegenüberstellung der Minoritäten-Detektion mit Hilfe von konventioneller Sequenzierung, klonalen Analysen und allelspezifischer real-time-PCR an den Aminosäure-Positionen A) 90 in der Protease (PR), sowie in der reversen Transkriptase (RT) B) 103 und C)184 A Probe Patient VL Anzahl Plasma Klone 90M in real-time-PCR
KL66 8 21200 9 90M, M/V > 99,48
KL67 8 262900 8 90M, M > 99,96
KL68 8 94700 3 90M, M/V > 99,88
KL90 11 4210 6 90L L < 2,64
KL91 11 12100 10 90L L 1,23 ± 0,38 %
KL92 11 3040 7 90L L < 3,65
KL20 5 361000 3 90L L < 0,03
KV13 4 7460 5 90M, M > 98,51
KV14 4 6060 6 90M, M > 98,17
KV84 1 137600 8 90M, M > 99,92
KV85 1 72500 10 90M, M > 99,85 B Probe Patient VL Anzahl Plasma Klone 103N in real-time-PCR
KL66 8 21200 9 103N, N 57,69 ± 8,67 %
KL67 8 262900 8 103N, N/T 92,04 ± 10,54 %
KL68 8 94700 3 103N, K/N 89,68 ± 15,82 %
KL90 11 4210 6 103K K 15,69 ± 5,18 %
KL91 11 12100 10 103K K 1,47 ± 0,80 %
KL92 11 3040 7 103K K 4,77 ± 0,52 %
KL20 5 361000 3 103K/N K 4,32 ± 1,21 %
KV13 4 7460 5 103N, N 90,62 ± 12,10 %
KV14 4 6060 6 103K/N K/N 3,69 ± 2,82 %
KV84 1 137600 8 103K/N K 5,66 ± 2,11 %
KV85 1 72500 10 103K K 4,48 ± 1,98 % C Probe Patient VL Anzahl Plasma Klone 184V in real-time-PCR
KL66 8 21200 9 184V, V 99,17 ± 0,03 %
KL67 8 262900 8 184V, V 95,83 ± 0,18 %
KL68 8 94700 3 184V, V 90,43 ± 0,62 %
KL90 11 4210 6 184V, V > 97,36
KL91 11 12100 10 184V, V/E > 99,08
KL92 11 3040 7 184V, V 89,46 ± 5,38 %
KL20 5 361000 3 184V, V 93,41 ± 0,65 %
KV13 4 7460 5 184M/V M/V 66,78 ± 0,82 %
KV14 4 6060 6 184M/V V 77,95 ± 0,17 %
KV84 1 137600 8 184V, V 99,61 ± 0,09 %
KV85 1 72500 10 184V, V 99,67 ± 0,03 %
VL: Viruslast; detektierte Minoritäten sind fett geruckt; Anzahl: Anzahl der Klone; PCR: Polymerase Kettenreaktion; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
ERGEBNISSE
80
Dazu wurden exemplarisch elf Proben von fünf Patienten aus der CAT-Studie untersucht, die
veränderte phänotypische Resistenz trotz kaum veränderter Genotypen besaßen. An den
untersuchten drei Kodons, die als mit hoher Resistenz assoziiert beschrieben wurden, konnten
über konventionelle Sequenzierung insgesamt fünf Minoritäten detektiert werden, über klonale
Analysen sieben Minoritäten und über selektive real-time-PCR 23 Minoritäten (Tab. 26).
Damit stellt die selektive real-time-PCR in dieser Analyse die sensitivste Methode dar, um
Minoritäten zu erkennen, gefolgt von der klonalen Analyse und der konventionellen
Sequenzierung. Die Sequenzierung von Klonen aus der Plasmasequenz detektierte Minoritäten
geringfügig besser als die Sequenzierung der Plasmapopulation und könnte wahrscheinlich
über Erhöhung der Klonanzahl noch gesteigert werden.
Betrachtete man aufeinander folgende Proben eines Patienten jeweils im Verlauf, konnten
keine Verschiebungen der Resistenz-assoziierten Mutationen festgestellt werden, die transiente
VL-Anstiege erklären könnten.
Art der Basenaustausche in klonalen Sequenzen
Die Analyse über Vier-Felder-Tafeln ergab, dass keine Base in der CAT-Gruppe häufiger als in
der Kontrollgruppe zu einer anderen Base mutiert war (Tab. 27). Adenin-
Betrachtete man die Art der gefundenen Basenaustausche, konnte in der Einzelanalyse
festgestellt werden, dass es sich in beiden Gruppen bei den Adenin-Austauschen vorwiegend
um Adenin- zu Guanin-Austausche handelte, bei den Cytosin-Austauschen vorwiegend um
Cytosin- zu Thymin-Austausche, bei den Guanin-Austauschen vorwiegend um Guanin- zu
Adenin-Austausche, sowie bei den bei den Thymin-Austauschen vorwiegend um Thymin- zu
Cytosin-Austausche handelte (Tab. 29). Interessanterweise traten in der CAT-Gruppe keine
Cytosin- zu Guanin-Austausche und in der Kontrollgruppe keine Guanin- zu Cytosin-
Austausche auf.
In einer abschließenden Untersuchung sollte festgestellt werden, ob eine residuelle
ABOBEC3G-Aktivität vorlag, welche vermehrte Guanin zu Adenin Austausche verursacht.
Eine Analyse über Vier-Felder-Tafeln ergab, dass in der Kontrollgruppe kein signifikanter
Unterschied in der Anzahl der Guanin- zu Adenin-Austausche im Vergleich zu den Adenin- zu
ERGEBNISSE
82
Guanin-Austauschen vorlag (Chi2: 1,09, p: 0,297). Dagegen konnte in der CAT-Gruppe eine
signifikante Häufung von Guanin- zu Adenin-Austauschen im Vergleich zu Adenin- zu
Guanin-Austauschen festgestellt werden (Chi2: 8,543, p: 0,003). Damit war zumindest in der
CAT-Gruppe der Anteil an Guanin- zu Adenin-Austauschen höher, aber die vorhandenen
Adenin- zu Guanin-Austausche könnten dennoch von ABOBEC3G verursacht worden sein.
Tab. 29: Anteile an Basenaustauschen in CAT- und Kontroll-Klonen anteilig an der absoluten Basenzahl / 1000 bp im Vergleich zur Plasmasequenz.
A C G T
Gruppe zu C zu G zu T zu A zu G zu T zu A zu C zu T zu A zu C zu G CAT-Gruppe 20 175 12 14 0 36 62 6 1 13 88 9
Kontroll-gruppe 8 72 7 3 1 21 30 0 3 4 38 4
fett markiert sind jeweils diejenigen Austausche, zu denen eine Base signifikant am häufigsten mutierte; A: Adenin; C: Cytosin; G: Guanin; T: Thymin; CAT: engl.: continuously alternating therapy.
Phylogenetische Untersuchungen
Phylogenetische Untersuchungen machen es möglich, das Maß der Verwandtschaft zwischen
Proben anhand deren Sequenz-Übereinstimmungen zu ermitteln. Interessanterweise
gruppierten sich in der CAT-Gruppe die Plasmapopulationen eines Patienten nicht mit den
zugehörigen Klonsequenzen, die aus der jeweiligen Plasmasequenz isoliert wurden, sondern
die Sequenzen der Plasmapopulationen untereinander, sowie die Sequenzen der Klone
untereinander (Abb. 20). Eine Ausnahme stellt dabei die Plasmaprobe KL89 dar, die sich nicht
mit den anderen Plasmaproben gruppierte. Dabei ist anzumerken, dass die Probe KL89 unter
AZT + 3TC + ABC + TDV-Therapie selektioniert wurde, wohingegen die Proben KL90 -KL92
jeweils unter LPV/r + SQV-Therapie selektioniert wurden.
Im Vergleich dazu gruppierten sich in der Kontrollgruppe nur in zwei Patienten die Sequenzen
der Plasmapopulation untereinander (NZ12-13, NZ18-19), sowie die Sequenzen der Klone
zueinander. Dagegen gruppierten sich die Plasmasequenzen drei anderer Patienten nicht so nah
nebeneinander wie in der CAT-Gruppe. Für die Plasmaprobe PK9 war keine zweite
Plasmaprobe verfügbar.
ERGEBNISSE
83
NZ8
Kontrollgruppe:
NZ8-61NZ8
NZ9 1NZ9
10NZ911NZ9
12NZ97NZ9
13NZ92NZ9
8NZ9
5NZ81NZ14
3NZ14NZ14 NZ15
2NZ1511NZ15
7NZ1510NZ15
15NZ1512NZ1514NZ15
4NZ158NZ15
Kontrollgruppe: Kontrollgruppe:
1NZ162NZ16
3NZ16NZ16
8NZ1710NZ17
5NZ173NZ1713NZ17
6NZ17NZ17
NZ18 NZ19
13NZ1915NZ19
8NZ191NZ19
2NZ197NZ19
Kontrollgruppe:
NZ12 NZ13
1NZ129NZ12
3NZ1211NZ13
12NZ137NZ136NZ13
9NZ138NZ13
Kontrollgruppe:
10PK911PK99PK9
13PK91PK9
7PK9PK9
Kontrollgruppe:
22KV135KV147KV1423KV1324KV13
2KV13KV13
KV14 17KV14
CAT :
10bp
Maßstab:
5bp 10bp
Maßstab:
5bp
10KV6618KV663KV66
4KV665KV66
6KV6612KV67
3KV67KV66
KV67 4KV67
8KV66
CAT :
10KV849KV85
15KV857KV858KV85
3KV8410KV8511KV8512KV85
5KV8514KV85
KV84 KV85
1KV844KV84
2KV845KV849KV84
2KV85
CAT :
ERGEBNISSE
84
Abb. 20: Darstellung des Verwandtschaftsgrads zwischen Plasmaproben und zugehörigen Klonen in phylogenetischen Untersuchungen. Im Vergleich der Proben aus den beiden Gruppen zeigt sich innerhalb der CAT-Gruppe im Gegensatz zur Kontrollgruppe eine höhere Verwandtschaft der Plasmaproben zueinander als zu den abgeleiteten Klonen. CAT: engl.: continuously alternating therapy.
5.9 Die klinische Relevanz der RC
Korrelation von Replikationskapazität, Viruslast, CD4- und CD8-Zellzahl, sowie Therapie-Ansprechen innerhalb der CAT-Studie
Bei den Untersuchungen der Mittelwerte über die Daten von RC, VL, CD4- und CD8-Zellzahl
aller Patienten der CAT-Studie, konnte eine signifikante inverse Korrelation zwischen der
CD4-Zellzahl und der VL festgestellt werden (n: 21, p: 0,035, R2: 0,214) (Abb. 21). Außerdem
konnte eine signifikante Korrelation zwischen der CD4- und CD8-Zellzahl festgestellt werden
(n: 21, p: 0,01, R2: 0,304) (Abb. 22). Dabei war die CD4-Zellzahl umso höher, je höher die
35KL1940KL21
44KL2035KL21
41KL2144KL2143KL21
42KL2143KL20
47KL2013KL2245KL22
KL19 KL20
KL21 KL22
KL23 KL24
45KL2437KL24
12KL2214KL22
51KL2343KL24
46KL2250KL23
47KL2241KL23
44KL2447KL23
CAT :
17KL644KL68
10KL6510KL66
19KL65KL64
KL65 KL66
KL67 KL68 KL69
16KL6542KL67
45KL6748KL67
35KL6644KL66
36KL6739KL6749KL67
44KL6949KL69
37KL6743KL67
28KL6429KL64
4KL6418KL66
CAT :
1KL892KL89
KL89 48KL90
51KL9010KL92
65KL9149KL9050KL90
10KL911KL91
KL90 KL91 KL92 54KL90
8KL919KL9111KL92
6KL893KL894KL89
5KL897KL8952KL90
3KL9158KL9166KL91
62KL9163KL91
12KL923KL92
2KL924KL928KL92
CAT :
10bp
Maßstab:
5bp 10bp
Maßstab:
5bp
ERGEBNISSE
85
CD8-Zellzahl war. Das Verhältnis der CD4- zur CD8-Zellzahl lag für jeden Patienten unter
dem Normalwert von 0,7 - 2,8 (n: 21; Min.: 0,02; Max.: 0,56) (http://www.laborlexikon.de)
Abb. 21 Regressionsanalyse über die Mittelwerte der CD4-Zellzahlen und der VL von allen 21 Patienten aus der CAT-Studie. Es konnte eine signifikante negative Korrelation zwischen der CD4-Zellzahl und der VL festgestellt werden. RC: Replikationskapazität; CAT: engl.: continuously alternating therapy.
Abb. 22 Regressionsanalyse über die Mittelwerte der CD4- und CD8-Zellzahlen von allen 21 Patienten aus der CAT-Studie. Es konnte eine signifikante Korrelation zwischen der CD4- und der CD8-Zellzahl festgestellt werden. RC: Replikationskapazität; CAT: engl.: continuously alternating therapy.
p: 0,035R2 :0,214
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
0 100 200 300 400 500 600
CD4
VL
p: 0,01R2 : 0,304
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 100 200 300 400 500 600
CD4
CD
8
ERGEBNISSE
86
Betrachtet man den Unterschied zwischen RTI- und PI-Behandlung bezüglich der
Behandlungsdauer unabhängig vom Patienten und Zyklus, ist ein hochsignifikanter
Unterschied zwischen den beiden Behandlungen feststellbar. Im Median dauerten RTI-
VL: Viruslast, CD4: CD4-Zellzahl, CD8: CD8-Zellzahl, RC: Replikationskapazität, d: delta = Veränderung eines Parameters, errechnet durch Division des Wertes der Folgeprobe durch den Wert der Vorprobe; Pat.: Patient; CAT: engl.: continuously alternating therapy.
Betrachtete man die Proben der einzelnen Patienten im longitudinalen Verlauf, so ließ sich
auch hier in 9 von 12 Patienten eine signifikante Korrelation zwischen der CD4- und der
CD8-Zellzahl feststellen (Daten nicht gezeigt). Dagegen wurde keine Korrelation zwischen der
RC und der VL festgestellt.
Abb. 24 Regressionsanalyse über die Mittelwerte der CD4-Zellzahlen und der RC von sechs Patienten aus der CAT-Studie. Es konnte eine signifikante Korrelation zwischen der CD4-Zellzahl und der RC festgestellt werden. RC: Replikationskapazität; CAT: engl.: continuously alternating therapy.
p: 0,008R2 : 0,858
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150 200 250 300
CD4
RC
ERGEBNISSE
88
Abb. 25 In einer Regressionsanalyse über die Veränderung der CD4- und CD8-Zellzahl von sechs Patienten aus der CAT-Studie, konnte eine signifikante Korrelation ermittelt werden. RC: Replikationskapazität; CAT: engl.: continuously alternating therapy.
Korrelation von Replikationskapazität, Viruslast und CD4-Zellzahl in klinischen Verlaufsproben
Um den prognostischen Wert der Replikationskapazität für die Klinik zu überprüfen, sollten
diagnostische Verlaufsproben hinzugezogen werden. Dabei wird ein echtes therapeutisches
Ansprechen erst bei einer VL-Veränderung von 2,5-fach und größer angenommen, da eine
singuläre Bestimmung der einzelnen Parameter Messschwankungen unterliegt (Hughes et al.,
1997). Es wurden für diese Analysen sechs Proben von drei Patienten aus der Geno2RC-
Datenbank näher untersucht, für die VL- und CD4-Zellzahl-Bestimmungen, genotypische und
phänotypische Analysen, sowie Replikationsanalysen erfolgreich durchgeführt wurden
(Tab. 31, Tab. 32, Abb. 26). Die genotypische Analyse ergab eine Vielzahl an Resistenz-
assoziierten Mutationen (Tab. 32). In einem Fall (Patient Wki) war unter Anstieg der Resistenz
ein Abfall der ohnehin sehr niedrigen RC zu beobachten. Der Patient war immunologisch und
klinisch im gesamten Beobachtungszeitraum unauffällig. Die VL fiel um den Faktor 2 ab. Ein
anderer Patient (Patient Dki) dagegen verschlechterte sich immunologisch im
Beobachtungszeitraum, was sich im Abfall der CD4-Zellzahl widerspiegelte. Die RC stieg
parallel dazu knapp auf das Doppelte an. Die Viren vom dritten Patienten (Patient Fki) zeigten
keine signifikante Veränderung über den Beobachtungszeitraum und waren mit ca. 82% der
Wildtyp-Aktivität auch nicht stark in der Replikation herabgesetzt. Der Patient war im
R2 = 0,728p = 0,031
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
dCD4
dCD
8
ERGEBNISSE
89
Beobachtungszeitraum klinisch und immunologisch stabil. In den Patienten Fki und Dki nahm
die phänotypische Resistenz zur Folgeprobe hin stark zu, wohingegen im Patienten Wki die
Resistenz für das Medikament 3TC stark zunahm, aber für die Medikamente Efavirenz, DDC
und D4T stark abnahm.
Tab. 31: Viruslast (VL), CD4-Zellzahl und Replikationskapazität von sechs Proben von drei Patienten im Verlauf. Alle Proben enthalten hoch resistente Viren und liegen jeweils 1,5 Jahre auseinander.
RT: reverse Transkriptase; PR: Protease; primäre Resistenz-assoziierte Mutationen sind fett markiert (Johnson: 16946457); Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.
ERGEBNISSE
90
Abb. 26: Ermittelte Resistenzfaktoren in phänotypischen Resistenzanalysen von Verlaufsproben dreier Patienten aus der Geno2RC-Datenbank. In den Patienten Fki und Dki nahm die Resistenz zur Folgeprobe für alle Medikamente stak zu. Im Patienten Wki nahm die Resistenz v.a. für das Medikament 3TC stark zu, dagegen für die Medikamente Efavirenz DDC und D4T stark ab. Min.: Liegt der Resistenzfaktor einer Probe innerhalb des grauen Kreises in der Mitte, so wird dieses Medikament als suszeptibel eingestuft; Max.: Die Äußerste Umrandung gibt die maximal messbare Resistenz des Medikamentes an; Abkürzungen der Medikamente, s. Anhang.
5
86
29
95
55
11 1
9
2
14
678
>148
1
10
100
1000
10000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Fki1Min.
20
75
53
85
59
2344 87
10
4
11
7
>463
>314
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Fki2Min.
21
139
68
>100
61
11 1
6
>100
1
3
3151
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Dki1Min.
4577
28
101
301
1728 103
9
4
4
>463
>314
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Dki2Min.
61
405
304
>100
>200
1014
32
9
31
10
3
>10>265
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Wki1Min.
19
76
220
111
139
3 10 21
6
1
9
6
>463
>314
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Wki2Min.
5
86
29
95
55
11 1
9
2
14
678
>148
1
10
100
1000
10000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Fki1Min.
Max.Fki1Min.
20
75
53
85
59
2344 87
10
4
11
7
>463
>314
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Fki2Min.
Max.Fki2Min.
21
139
68
>100
61
11 1
6
>100
1
3
3151
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Dki1Min.
Max.Dki1Min.
4577
28
101
301
1728 103
9
4
4
>463
>314
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Dki2Min.
Max.Dki2Min.
61
405
304
>100
>200
1014
32
9
31
10
3
>10>265
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Wki1Min.
Max.Wki1Min.
19
76
220
111
139
3 10 21
6
1
9
6
>463
>314
1
10
100
1000
AZTDDC
DDI
D4T
3TC
ABC
NVPDLV
EFV
IDV
SQV
RTV
NLV
APVMax.Wki2Min.
Max.Wki2Min.
ERGEBNISSE
91
RC und Resistenz als prognostische Parameter für Therapie-Ansprechen
Um die klinische Relevanz von RC und Resistenz als prognostischen Marker für Therapie-
Ansprechen zu prüfen, wurde der EUResist-Datensatz näher untersucht. Es wurde analysiert,
inwiefern die Parameter von RC und RF eine Vorhersage des Therapie-Ansprechens
verbessern. Im unten dargestellten Diagramm zeigt die Winkelhalbierende an, wie die Werte
bei einer zufälligen Verteilung angeordnet wären (Abb. 27). Es wird deutlich, dass unter
Einbezug der RC-Werte wertvolle Hinweise auf das künftige Therapie-Ansprechen angegeben
werden können. Dennoch scheint der Parameter der RF in Bezug auf VL-Veränderungen den
entscheidenderen Einfluss auszuüben. In einer Analyse, in die sowohl die RC als auch die RF
als Faktoren für die Prädiktion eines Therapie-Erfolges mit einbezogen wurden, ist nur noch
eine sehr geringfügige Verbesserung der Vorhersage des Therapie-Ansprechens im Vergleich
zum prädiktiven Parameter der RF alleine sichtbar.
Abb. 27: Analyse über den Einfluss von Replikationskapazität (RC) und Resistenzfaktoren (RF) als prognostische Parameter für Therapie-Ansprechen. Analysiert wurden 2044 Proben aus dem EUResist-Datensatz. Die Vorhersage der RC und RF erfolgte über Support Vector Machines anhand der Sequenz. Der Einfluss der RF auf das Therapie-Ansprechen war hier deutlich größer als der Einfluss der RC; gepunktete Linie: Winkelhalbierende.
durchschnittliche falsch negative Werte
du
rch
sch
nit
tlic
he
fals
ch p
osi
tive
Wer
te
RC
RF x RCRF
durchschnittliche falsch negative Werte
du
rch
sch
nit
tlic
he
fals
ch p
osi
tive
Wer
te
RC
RF x RCRF
DISKUSSION 92
6 DISKUSSION
Zu den Zielen dieser Arbeit zählte es, einen Test zur Bestimmung der RC aufzubauen, der die
Problematik der initialen Virusquantifizierung handhaben und zudem die meisten bekannten
Resistenz- und RC-assoziierten Mutationen erfassen konnte. Gängige Verfahren generieren für
funktionelle Untersuchungen rekombinante HI-Viren, weil es bei der Anzucht primärer Isolate
zu kompetitiver Virusreplikation kommen kann, bei der die oft weniger replikativen resistenten
Viren von replikationskompetenteren Varianten aus der Quasispezies verdrängt werden können
(Charpentier et al., 2004). Rekombinante Systeme basieren zumeist auf der Amplifikation des
pol-Gens aus der im Plasma vorherrschenden viralen Quasispezies. Ein kritischer Punkt der
rekombinanten Systeme in dieser Arbeit war die Auswahl des zu amplifizierenden Bereichs, da
die Sensitivität der PCR mit der Größe des Amplifikats abnimmt. Für die Amplifikation der
rekombinanten Anteile der Viren wurde eine sehr sensitive PCR verwendet, deren Amplifikat
den C-terminalen Teil des gag-Gens (AS 428 - 500) einschließlich der PR-Schnittstellen des
Gag-Pol-Vorläuferproteins p7 / p1 und p1 / p6, die gesamte PR (AS 1 - 99) und den
überwiegende Anteil der RT (AS 1 - 300) enthielt (Walter et al., 1999). In diesem Teil des
HIV-1-Genoms liegen die meisten bekannten Resistenz- und Replikations-assoziierten
Mutationen (Doyon et al., 1996; Johnson et al., 2006). Dennoch sind im Zusammenhang
veränderter RC viele Mutationen auch außerhalb des hier benutzten rekombinanten
Virussystems beschrieben, und ein Einfluss auf die RC solcher Mutationen in-vivo ist
prinzipiell nicht auszuschließen.
Ein weiteres großes Problem bei der Durchführung Infektions-gebundener Testverfahren zur
Bestimmung der RC ist die Ermittlung der initialen Infektionsdosis. Zum einen weisen die
Verfahren zur Virusquantifizierung nicht selten selbst eine höhere Variabilität auf als die zu
messenden RC-Unterschiede, zum anderen führt insbesondere PI-Resistenz auch zu
Veränderungen der Infektiosität (de la Carriere et al., 1999; Mammano et al., 1998). Letztere
werden im Wesentlichen auf Reifungsstörungen des Virus zurückgeführt, die der verminderten
Prozessierung der viralen Strukturproteine durch die resistente Protease direkt folgen (Bleiber
et al., 2001; Brenner et al., 2002; Zennou et al., 1998). Die Quantifizierung über das virale
Protein p24-ag erfasst auch unreifes p24-Protein, was zur Überquantifizierung der Infektiosität
für PI-resistente HI-Viren führen kann. Ergänzend zu diesen Daten ließ sich in dieser Arbeit
zeigen, dass durch die lange Haltbarkeit des p24-Proteins im Gegensatz zur funktionellen
Infektiosität unterschiedliche Verhältnisse für die Mengen an p24-ag und Infektiosität in
DISKUSSION
93
Zellkulturüberständen erzeugt werden (Tschochner et al., 2007). Demgemäß erreichte die
Infektiosität in Zellkultur nach wenigen Tagen ihren höchsten Wert und sank dann durch
virusbedingte Lyse und Saturationseffekte in der Zellkultur schnell wieder ab. Dagegen
reicherte sich das virale Kapsidprotein weiter an, so dass sich in HIV-Zellkulturüberständen
eines jeden Virus verschiedene Verhältnisse für p24-ag und Infektiosität ergaben, deren
absoluter Wert im Wesentlichen vom Entnahmezeitpunkt des virushaltigen Überstands abhing.
Da die Virusquantifizierung über RNS weitgehend ähnliche Ergebnisse wie die Bestimmung
von p24-ag ergab, erscheinen diese beiden Methoden nicht geeignet, die Infektionsdosis für
funktionelle Tests zu bestimmen (Tschochner et al., 2007).
Neben der Problematik um die Bestimmung der Infektionsdosis zeigte sich, dass ein Teil der
Variabilität auf den Zustand der infizierten Zellen zurückzuführen war, da auch nach Infektion
desselben Virus bei identischer Infektionsdosis Unterschiede in der absolut erreichbaren
Virusreplikation erzeugt wurden. Deshalb war ein Vergleich anhand der absoluten Werte der
erzeugten Virusaktivität nicht möglich. Im Gegensatz dazu konnten bei zeitgleich infizierten
Zellkulturen mit steigender Infektionsdosis je Virus solange höhere absolute Werte für die
virale Replikation erzeugt werden, bis das Virus in sehr hohen Infektionsdosen durch seine
lytische Replikation zu keinem weiteren Anstieg der Werte führte. Die Verwendung mehrer
Infektionsdosen je Virus zur RC-Bestimmung hatte also den Vorteil, dass Zellkultur-
Saturationseffekte unabhängig davon, ob sie durch das Virus oder durch die Zellen einer
Zellkultur erzeugt wurden erkennbar wurden. Zudem konnte dadurch in dem hier vorgestellten
Verfahren auf die initiale Virusquantifizierung verzichtet werden. In der Folge konnte
einerseits eine sehr geringe Testvariabilität erzielt werden und andererseits die Durchführung
maßgeblich beschleunigt werden, da eine Bestimmung der infektiösen Einheiten nach Reed
und Münch im günstigsten Fall zusätzliche 14 Tage dauern würde (Reed und Münch, 2007).
In dem hier vorgestellten Test zu Bestimmung der Replikationskapazität erreichte der Klon
4lig7, welcher als resistentes Kontrollvirus in jedem Experiment mitgeführt wurde, einen
vergleichbaren Wert wie für dessen Plasmaprobe in einer Publikation 2002 ermittelt wurde
(Walter et al., 2002). Dessen Variabilität über die Gesamtheit der Versuche war für Zellkultur-
basierte Verfahren erstaunlich gering (1,27-fach) und zu anderen hoch standardisierten
Methoden vergleichbar. Mit Hilfe des neuartigen Messverfahrens konnten für N2D und N3L
geringfügig höhere RC-Werte ermittelt werden, wie sie für die Testung der beiden
Referenzviren in Koinfektionsversuchen zuvor publiziert worden waren (Nijhuis et al., 1999).
DISKUSSION
94
Es wäre denkbar, dass dies in der unterschiedlichen Herstellungsstrategie der Viren begründet
liegt. In den Koinfektionsversuchen wurde zur Herstellung der rekombinanten Viren das
Verfahren der homologen Rekombination angewandt. Dabei ist eine Mischung geringfügig
unterschiedlicher Varianten im DNS-Überlappungsbereich nicht auszuschließen, welche aber
durchaus zu geringgradig verändertem Replikationsverhalten führen könnten. Zudem wurde im
hier beschriebenen Testsystem NL4-3 als Klonierungsvektor und nicht wie im
Koinfektionsversuch HXB2 verwendet, was zu einer unterschiedlichen Replikationskapazität
der resultierenden rekombinanten Viren führen kann (Quinones-Mateu und Arts, 2002). Nicht
zuletzt wurde in unserem Versuch eine Zelllinie verwendet, im Koinfektionsversuch dagegen
primäre Zellen. Retrovirale Replikation variiert aber stark in unterschiedlichen Zellen, was
unter anderem auf verschiedene Konzentrationen an Deoxynukleosid-Triphosphaten
zurückzuführen sein kann (Jamburuthugoda et al., 2006; Quinones-Mateu und Arts, 2002;
Tebit et al., 2004). Von einer Arbeitsgruppe konnte zudem gezeigt werden, dass die Zugabe des
Lektins PHA zu Zellkulturen, welches auch zur Stimulation von primären Zellen Verwendung
findet, durch Aktivierung verschiedener Signalkaskaden die Mengen an Transkriptionsfaktoren
im Zellkern verändert und dadurch die Replikation herabsetzt (Van Opijnen et al., 2004).
Da sowohl im neu etablierten, als auch im Koinfektionsversuch der Klon N2D eine höhere RC
als das nicht resistente Referenzvirus erzielte, stellt sich die Frage, wie Viren generell eine
höhere RC besitzen können als nicht resistente, hoch adaptierte Wildtyp-Viren (z.B. NL4-3
oder HXB2). Erneut ist anzumerken, dass bei der Verwendung von rekombinanten Viren große
Patienten-abgeleitete Genanteile nicht vorhanden sind. Dadurch könnten in-vitro RC-Werte
größer als 100 % gemessen werden, die in-vivo unter Einbezug aller viraler Gene dagegen
möglicher Weise durch Mutationen in anderen viralen Genanteilen kompensiert werden
könnten. Auch konnte bereits von Simon und Kollegen in 2003 gezeigt werden, dass in
rekombinanten Viren, die nur die PR- und RT-Gene enthielten RC-Werte größer 100%
gemessen wurden, welche nach zusätzlichen Einbezug von gag in den rekombinanten Anteil
RC-Werte unter 100% erzielten. Noch sind nicht sämtliche Aminosäuren identifiziert, die einen
Einfluss auf die RC haben (Simon et al., 2003). In 2001 konnten Wrin und Kollegen zeigen,
dass Viren therapienaiver Patienten im Median eine Replikationskapazität von 73 % im
Vergleich zu NL4-3 besaßen (IQR (25-75): 47 % - 89 %) (Wrin et al., 2001). Dabei zeigte sich,
dass die nicht resistenten Viren eine sehr große Bandbreite an RC-Werten aufwiesen. Auch bei
der Analyse unserer Proben ohne primäre Resistenz-assoziierte Mutationen im Geno2RC-
Datensatz, konnte ein breites Spektrum an RC gefunden werden (n: 56, Min.: 5 %,
DISKUSSION
95
Max.: 300 %, Median: 56 %, IQR (25 - 75): 31 % - 101 %). Streng genommen ist aber ein
Vergleich der beiden Datensätze nicht ohne weiteres möglich, da sowohl rekombinante
Virusanteile als auch die Einschluss-Kriterien verschieden waren. So können einerseits Viren
von therapienaiven Patienten durch Transmission sehr wohl starke Resistenz aufweisen, und
andererseits die Abwesenheit der als primär beschriebenen Resistenz-Mutationen nicht alle
Mutationen mit einschließen, die der RC des Virus abträglich sind. Wie erst kürzlich
beschrieben, sind aber auch in-vivo vereinzelt Viren aufzufinden, die zu beschleunigter
Krankheitsprogression führen, einige wenige sogar obwohl sie hoch resistent sind (Markowitz
et al., 2005).
Neben Viren ohne Resistenz-assoziierte Mutationen, wurden in dieser Arbeit auch
verschiedene Proben mit primären und oder sekundären Resistenz-assoziierten Mutationen auf
ihre Replikationskapazität untersucht. Dies wurde neben den genotypischen Veränderungen aus
der Verteilung der Resistenzfaktoren ersichtlich. Beim Vergleich der Häufigkeitsverteilung der
CAT-Datenbank und der Geno2Pheno-Datenbank konnten eingipflige und zweigipflige
Verteilungen der Resistenzfaktoren festgestellt werden. Bei der eingipfligen Verteilung liegen
im Gegensatz zur zweigipfligen Verteilung, die Gipfel der sensitiven und der resistenten
Population so nahe beieinander, dass das Tal dazwischen überdeckt wird (Beerenwinkel et al.,
2003a). Betroffen davon sind diejenigen Medikamente, bei denen der maximal messbare
Resistenzfaktor kaum höher liegt als der klinisch relevante. Eine eingipflige Verteilung kann
prinzipiell auch dadurch verursacht werden, dass die analysierten Daten ausschließlich
resistente oder sensitive Viren gegenüber dem zu untersuchenden Medikament enthalten.
Tatsächlich aber erscheint diese Erklärung angesichts der breiten Kreuzresistenzen innerhalb
der Stoffklassen für die meisten Medikamente als nicht sehr wahrscheinlich. So besteht eine
strenge Korrelation zwischen den Resistenzprofilen der beiden Thymidin-Analoga D4T und
AZT. Zutreffen könnte das Argument dagegen für die Medikamente DDI, D4T und TDV der
CAT-Datenbank, da hier die RF-Werte fast ausschließlich größer als 1 waren. Auch der
Vergleich der RC-Verteilung mit der Verteilung der Resistenzen ergab - in Übereinstimmung
mit der Literatur - , dass eine reduzierte RC in der Regel mit einer erhöhten Resistenz
einherging. Alle Proben aus der CAT-Datenbank waren multipel vorbehandelt und wiesen
mehrere primäre Resistenz-assoziierte Mutationen auf. Die 67 Proben der CAT-Datenbank
besaßen im Vergleich zu resistenten Proben der Geno2RC-Datenbank erheblich niedrigere RC-
h engl.: hour HAART engl.: highly active antiretroviral therapy
H2O Wasser
H3C2O2 Azetat
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
108
Abkürzung Ausformulierung
HCl Salzsäure HIV Humanes Immundefizienzvirus IC50 engl.: inhibitoriy conzentration 50 % ID Infektionsdosis IL Interleukin INT Integrase IQR engl.: interquartile range IU engl.: infectious units k Kilo kb Kilobasen KCl Kaliumchlorid KH2PO4 Kalium-Dihydrogenphosphat Konz. Konzentration l Liter LB Luria-Bertani LTR engl.: long terminal repeat M Molar (mol/l) m milli (10-3) MA Matrix Max. Maximum MDR engl.: multidrug resistance MgCl Magnesiumchlorid min Minute Min. Minimum MOI engl.: multiplicity of infection MW Mittelwert N Normale n Anzahl Na2 HPO4 Di-Natriumhydrogenphosphat NaAc Natriumacetat NaCl Natriumchlorid NC Engl.: nucleocapsid NEB engl.: New Englangd Biolabs n d. nicht durchgeführt NNRTI nicht- nukleosidaler reverse Transkriptase-Inhibitor NRTI nukleosidaler reverse Transkriptase-Inhibitor NtRTI nukleotidaler reverse Transkriptase-Inhibitor o. ohne OD Optische Dichte
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
109
Abkürzung Ausformulierung
p Piko (10-12) Pat. Patient p24-ag p24-Antigen PBMC engl.: peripheral blood mononuclear cells PCR engl.: polymerase chain reaction pH Negativer lokatischer Logarithmus der Protonenkonzentration PHA-P Phytohämagglutinin PI Protease-Inhibitor Pol Polymerase PR Protease RC engl.: replication capacity RLU engl.: relative light units RF Resistenfaktor RNS Ribonucleinsäure RT reverse Transkriptase RTI reverser Transkriptase-Inhibitor s Sekunde (s) engl.: sense s. siehe s.o. siehe oben s.u. siehe unten SEAP Sezernierte alkalische Phosphatase Stabwn Standardabweichung SIV engl.: simian immunodefiziency virus SV40-Virus simian virus 40 Tab. Tabelle TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer tat engl: transactivator of transcription TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TCID50 engl.: tissue culture infectious dose TM Transmembranprotein Tris Trishydroxymethylaminomethan U Units Upm Umdrehungen pro Minute VL Viruslast UNAIDS Koordinierungsprogramm der Vereinten Nationen zur HIV-Bekämpfung Wo Woche WHO engl.: world health organisation WT Wildtyp
LITERATURVERZEICHNIS
110
8 LITERATURVERZEICHNIS
Alkhatib, G., Broder, C.C., Berger, E.A., 1996. Cell type-specific fusion cofactors determine human immunodeficiency virus type 1 tropism for T-cell lines versus primary macrophages. J Virol. 70, 5487-5494.
Andreoni, M., 2004. Viral phenotype and fitness. New Microbiol. 27, 71-76.
Bagasra, O., 2006. A unified concept of HIV latency. Expert Opin Biol Ther. 6, 1135-1149.
Baliga, C.S., Sutton, R.E., 2004. The role of phenotyping and replication capacity in anti-HIV therapeutics. Curr Opin Mol Ther. 6, 308-317.
Ball, S.C., Abraha, A., Collins, K.R., Marozsan, A.J., Baird, H., Quinones-Mateu, M.E., Penn-Nicholson, A., Murray, M., Richard, N., Lobritz, M., Zimmerman, P.A., Kawamura, T., Blauvelt, A., Arts, E.J., 2003. Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes B and C. J Virol. 77, 1021-1038.
Baltimore, D., 1992. Viral RNA-dependent DNA polymerase. 1970. Biotechnology. 24, 3-5.
Bannister, W.P., Ruiz, L., Loveday, C., Vella, S., Zilmer, K., Kjaer, J., Knysz, B., Phillips, A.N., Mocroft, A., 2006. HIV-1 subtypes and response to combination antiretroviral therapy in Europe. Antivir Ther. 11, 707-715.
Barbour, J.D., Grant, R.M., 2004. The Clinical Implications of Reduced Viral Fitness. Curr Infect Dis Rep. 6, 151-158.
Barbour, J.D., Grant, R.M., 2005. The role of viral fitness in HIV pathogenesis. Curr HIV/AIDS Rep. 2, 29-34.
Barbour, J.D., Hecht, F.M., Wrin, T., Segal, M.R., Ramstead, C.A., Liegler, T.J., Busch, M.P., Petropoulos, C.J., Hellmann, N.S., Kahn, J.O., Grant, R.M., 2004. Higher CD4+ T cell counts associated with low viral pol replication capacity among treatment-naive adults in early HIV-1 infection. J Infect Dis. 190, 251-256.
Barbour, J.D., Wrin, T., Grant, R.M., Martin, J.N., Segal, M.R., Petropoulos, C.J., Deeks, S.G., 2002. Evolution of phenotypic drug susceptibility and viral replication capacity during long-term virologic failure of protease inhibitor therapy in human immunodeficiency virus-infected adults. J Virol. 76, 11104-11112.
Barre-Sinoussi, F., 1996. HIV as the cause of AIDS. Lancet. 348, 31-35.
Beerenwinkel, N., Daumer, M., Oette, M., Korn, K., Hoffmann, D., Kaiser, R., Lengauer, T., Selbig, J., Walter, H., 2003a. Geno2pheno: Estimating phenotypic drug resistance from HIV-1 genotypes. Nucleic Acids Res. 31, 3850-3855.
Beerenwinkel, N., Lengauer, T., Daumer, M., Kaiser, R., Walter, H., Korn, K., Hoffmann, D., Selbig, J., 2003b. Methods for optimizing antiviral combination therapies. Bioinformatics. 19 Suppl 1, i16-i25.
LITERATURVERZEICHNIS
111
Beerenwinkel, N., Schmidt, B., Walter, H., Kaiser, R., Lengauer, T., Hoffmann, D., Korn, K., Selbig, J., 2002. Diversity and complexity of HIV-1 drug resistance: a bioinformatics approach to predicting phenotype from genotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8271-8276.
Beerenwinkel, N., Sing, T., Lengauer, T., Rahnenfuhrer, J., Roomp, K., Savenkov, I., Fischer, R., Hoffmann, D., Selbig, J., Korn, K., Walter, H., Berg, T., Braun, P., Fatkenheuer, G., Oette, M., Rockstroh, J., Kupfer, B., Kaiser, R., Daumer, M., 2005. Computational methods for the design of effective therapies against drug resistant HIV strains. Bioinformatics. 21, 3943-3950.
Benjamini Y., Hochberg Y., 2005. Controlling the false discovery rate. Journal of the royal statistical society7. 5; 289-300.
Berger, E.A., Murphy, P.M., Farber, J.M., 1999. Chemokine receptors as HIV-1 coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease. Annu Rev Immunol. 17, 657-700.
Berkhout, B., Back, N.K., de Ronde, A., Jurriaans, S., Bakker, M., Parkin, N.T., Van der, H.L., 2006. Identification of alternative amino acid substitutions in drug-resistant variants of the HIV-1 reverse transcriptase. AIDS. 20, 1515-1520.
Berson, J.F., Long, D., Doranz, B.J., Rucker, J., Jirik, F.R., Doms, R.W., 1996. A seven-transmembrane domain receptor involved in fusion and entry of T-cell-tropic human immunodeficiency virus type 1 strains. J Virol. 70, 6288-6295.
Bleiber, G., Munoz, M., Ciuffi, A., Meylan, P., Telenti, A., 2001. Individual contributions of mutant protease and reverse transcriptase to viral infectivity, replication, and protein maturation of antiretroviral drug-resistant human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 75, 3291-3300.
Bogner E., Holzenburg A., 2006. New Concepts of Antiviral Therapies. 255-279. In New Concepts of Antiviral Therapies. Springer, New York and Dodrecht. ISBN 0-387-31046-0.
Bonhoeffer, S., Barbour, A.D., De Boer, R.J., 2002. Procedures for reliable estimation of viral
fitness from time-series data. Proc Biol Sci. 269, 1887-1893.
Breiman L., 2001. Random Forests. Machine Learning. 45, 5-32.
Brenner, B.G., Turner, D., Wainberg, M.A., 2002. HIV-1 drug resistance: can we overcome? Expert Opin Biol Ther. 2, 751-761.
Buonaguro, L., Tagliamonte, M., Tornesello, M.L., Pilotti, E., Casoli, C., Lazzarin, A., Tambussi, G., Ciccozzi, M., Rezza, G., Buonaguro, F.M., 2004. Screening of HIV-1 isolates by reverse heteroduplex mobility assay and identification of non-B subtypes in Italy. J Acquir. Immune Defic. Syndr. 37, 1295-1306.
Cabana, M., Clotet, B., Martinez, M.A., 1999. Emergence and genetic evolution of HIV-1 variants with mutations conferring resistance to multiple reverse transcriptase and protease inhibitors. J Med Virol. 59, 480-490.
LITERATURVERZEICHNIS
112
Campbell, T.B., Schneider, K., Wrin, T., Petropoulos, C.J., Connick, E., 2003. Relationship between in vitro human immunodeficiency virus type 1 replication rate and virus load in plasma. J Virol. 77, 12105-12112.
Carcelain, G., Tubiana, R., Samri, A., Calvez, V., Delaugerre, C., Agut, H., Katlama, C., Autran, B., 2001. Transient mobilization of human immunodeficiency virus (HIV)-specific CD4 T-helper cells fails to control virus rebounds during intermittent antiretroviral therapy in chronic HIV type 1 infection. J Virol. 75, 234-241.
Chalimourda, A., Scholkopf, B., Smola, A.J., 2004. Experimentally optimal nu in support vector regression for different noise models and parameter settings. Neural Netw. 17, 127-141.
Charneau, P., Borman, A.M., Quillent, C., Guetard, D., Chamaret, S., Cohen, J., Remy, G., Montagnier, L., Clavel, F., 1994. Isolation and envelope sequence of a highly divergent HIV-1 isolate: definition of a new HIV-1 group. Virology. 205, 247-253.
Charpentier, C., Dwyer, D.E., Mammano, F., Lecossier, D., Clavel, F., Hance, A.J., 2004. Role of minority populations of human immunodeficiency virus type 1 in the evolution of viral resistance to protease inhibitors. J Virol. 78, 4234-4247.
Cingolani, A., Antinori, A., Rizzo, M.G., Murri, R., Ammassari, A., Baldini, F., Di Giambenedetto, S., Cauda, R., De Luca, A., 2002. Usefulness of monitoring HIV drug resistance and adherence in individuals failing highly active antiretroviral therapy: a randomized study (ARGENTA). AIDS. 16, 369-379.
Clavel, F., Guetard, D., Brun-Vezinet, F., Chamaret, S., Rey, M.A., Santos-Ferreira, M.O., Laurent, A.G., Dauguet, C., Katlama, C., Rouzioux, C., ., 1986. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 233, 343-346.
Coffin, C.M., 1986. Current issues in transfusion therapy. 1. Risks of infection. Postgrad. Med. 80, 219-224.
Coffin, J.M., 1995. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science. 267, 483-489.
Connor, R.I., Ho, D.D., 1994. Human immunodeficiency virus type 1 variants with increased replicative capacity develop during the asymptomatic stage before disease progression. J Virol. 68, 4400-4408.
Croteau, G., Doyon, L., Thibeault, D., McKercher, G., Pilote, L., Lamarre, D., 1997. Impaired fitness of human immunodeficiency virus type 1 variants with high-level resistance to protease inhibitors. J Virol. 71, 1089-1096.
Daar, E.S., Kesler, K.L., Wrin, T., Petropoulo, C.J., Bates, M., Lail, A., Hellmann, N.S., Gomperts, E., Donfield, S., 2005. HIV-1 pol replication capacity predicts disease progression. AIDS. 19, 871-877.
Dayam, R., Al Mawsawi, L.Q., Neamati, N., 2007. HIV-1 Integrase Inhibitors : An Emerging Clinical Reality. Drugs R. D. 8, 155-168.
LITERATURVERZEICHNIS
113
De Clercq, E., Balzarini, J., 1995. Knocking out human immunodeficiency virus through non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors used as single agents or in combinations: a paradigm for the cure of AIDS? Farmaco. 50, 735-747.
de la Carriere, L.C., Paulous, S., Clavel, F., Mammano, F., 1999. Effects of human immunodeficiency virus type 1 resistance to protease inhibitors on reverse transcriptase processing, activity, and drug sensitivity. J Virol. 73, 3455-3459.
De Leys, R., Vanderborght, B., Vanden Haesevelde, M., Heyndrickx, L., Van Geel, A., Wauters, C., Bernaerts, R., Saman, E., Nijs, P., Willems, B., ., 1990. Isolation and partial characterization of an unusual human immunodeficiency retrovirus from two persons of west-central African origin. J Virol. 64, 1207-1216.
Deeks, S.G., Barbour, J.D., Grant, R.M., Martin, J.N., 2002a. Duration and predictors of CD4 T-cell gains in patients who continue combination therapy despite detectable plasma viremia. AIDS. 16, 201-207.
Deeks, S.G., Hoh, R., Grant, R.M., Wrin, T., Barbour, J.D., Narvaez, A., Cesar, D., Abe, K., Hanley, M.B., Hellmann, N.S., Petropoulos, C.J., McCune, J.M., Hellerstein, M.K., 2002b. CD4+ T cell kinetics and activation in human immunodeficiency virus-infected patients who remain viremic despite long-term treatment with protease inhibitor-based therapy. J Infect Dis. 185, 315-323.
Deeks, S.G., Hoh, R., Neilands, T.B., Liegler, T., Aweeka, F., Petropoulos, C.J., Grant, R.M., Martin, J.N., 2005. Interruption of treatment with individual therapeutic drug classes in adults with multidrug-resistant HIV-1 infection. J Infect Dis. 192, 1537-1544.
Deeks, S.G., Walker, B.D., 2004. The immune response to AIDS virus infection: good, bad, or both? J Clin Invest. 113, 808-810.
Deeks, S.G., Wrin, T., Liegler, T., Hoh, R., Hayden, M., Barbour, J.D., Hellmann, N.S., Petropoulos, C.J., McCune, J.M., Hellerstein, M.K., Grant, R.M., 2001. Virologic and immunologic consequences of discontinuing combination antiretroviral-drug therapy in HIV-infected patients with detectable viremia. N Engl J Med. 344, 472-480.
Devereux, H.L., Youle, M., Johnson, M.A., Loveday, C., 1999. Rapid decline in detectability of HIV-1 drug resistance mutations after stopping therapy. AIDS. 13, F123-F127.
Dimitriadou, E., Meyer D., Leisch, F., Meyer, D., Weingessel, A., 2006. e1071: Misc Functions of the Department of Statistics. TU Wien. R package version 1.5-13.
Doyon, L., Croteau, G., Thibeault, D., Poulin, F., Pilote, L., Lamarre, D., 1996. Second locus involved in human immunodeficiency virus type 1 resistance to protease inhibitors. J Virol. 70, 3763-3769.
Durant, J., Clevenbergh, P., Garraffo, R., Halfon, P., Icard, S., Del Giudice, P., Montagne, N., Schapiro, J.M., Dellamonica, P., 2000. Importance of protease inhibitor plasma levels in
LITERATURVERZEICHNIS
114
HIV-infected patients treated with genotypic-guided therapy: pharmacological data from the Viradapt Study. AIDS. 14, 1333-1339.
Dykes, C., Fox, K., Lloyd, A., Chiulli, M., Morse, E., Demeter, L.M., 2001. Impact of clinical reverse transcriptase sequences on the replication capacity of HIV-1 drug-resistant mutants. Virology. 285, 193-203.
Feng, Y., Broder, C.C., Kennedy, P.E., Berger, E.A., 1996. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. Science. 272, 872-877.
Gallego, M.D., Aguado, E., Kindelan, J.M., Pena, J., Santamaria, M., Molina, I.J., 2001. Altered expression of CD43-hexasaccharide isoform on peripheral T lymphocytes from HIV-infected individuals. AIDS. 15, 477-481.
Gallo, R.C., Sarin, P.S., Gelmann, E.P., Robert-Guroff, M., Richardson, E., Kalyanaraman, V.S., Mann, D., Sidhu, G.D., Stahl, R.E., Zolla-Pazner, S., Leibowitch, J., Popovic, M., 1983. Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science. 220, 865-867.
Garcia-Lerma, J.G., Gerrish, P.J., Wright, A.C., Qari, S.H., Heneine, W., 2000. Evidence of a role for the Q151L mutation and the viral background in development of multiple dideoxynucleoside-resistant human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 74, 9339-9346.
Garcia-Lerma, J.G., Heneine, W., 2001. Resistance of human immunodeficiency virus type 1 to reverse transcriptase and protease inhibitors: genotypic and phenotypic testing. J Clin Virol. 21, 197-212.
Garcia-Lerma, J.G., Nidtha, S., Heneine, W., 2001. Susceptibility of human T cell leukemia virus type 1 to reverse-transcriptase inhibitors: evidence for resistance to lamivudine. J Infect Dis. 184, 507-510.
Geldmacher, C., Currier, J.R., Herrmann, E., Haule, A., Kuta, E., McCutchan, F., Njovu, L., Geis, S., Hoffmann, O., Maboko, L., Williamson, C., Birx, D., Meyerhans, A., Cox, J., Hoelscher, M., 2007. CD8 T-cell recognition of multiple epitopes within specific Gag regions is associated with maintenance of a low steady-state viremia in human immunodeficiency virus type 1-seropositive patients. J Virol. 81, 2440-2448.
Goffinet, C., Allespach, I., Keppler, O.T., 2007. HIV-susceptible transgenic rats allow rapid preclinical testing of antiviral compounds targeting virus entry or reverse transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1015-1020.
Goodenow, M., Huet, T., Saurin, W., Kwok, S., Sninsky, J., Wain-Hobson, S., 1989. HIV-1 isolates are rapidly evolving quasispecies: evidence for viral mixtures and preferred nucleotide substitutions. J Acquir. Immune Defic. Syndr. 2, 344-352.
Gootenberg, J.E., Ruscetti, F.W., Mier, J.W., Gazdar, A., Gallo, R.C., 1981. Human cutaneous T cell lymphoma and leukemia cell lines produce and respond to T cell growth factor. J Exp Med. 154, 1403-1418.
LITERATURVERZEICHNIS
115
Goudsmit, J., de Ronde, A., de Rooij, E., de Boer, R., 1997. Broad spectrum of in vivo fitness of human immunodeficiency virus type 1 subpopulations differing at reverse transcriptase codons 41 and 215. J Virol. 71, 4479-4484.
Goudsmit, J., de Ronde, A., Ho, D.D., Perelson, A.S., 1996. Human immunodeficiency virus fitness in vivo: calculations based on a single zidovudine resistance mutation at codon 215 of reverse transcriptase. J Virol. 70, 5662-5664.
Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., Nairn, R., 1977. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol. 36, 59-74.
Greener, A., Callahan, M., Jerpseth, B., 1996. An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. Methods Mol Biol. 57, 375-385.
Hamburgh, M.E., Drosopoulos, W.C., Prasad, V.R., 1998. The influence of 3TC-resistance mutations E89G and M184V in the human immunodeficiency virus reverse transcriptase on mispair extension efficiency. Nucleic Acids Res. 26, 4389-4394.
Hammer, S.M., Squires, K.E., Hughes, M.D., Grimes, J.M., Demeter, L.M., Currier, J.S., Eron, J.J., Jr., Feinberg, J.E., Balfour, H.H., Jr., Deyton, L.R., Chodakewitz, J.A., Fischl, M.A., 1997. A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less. AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team. N Engl J Med. 337, 725-733.
Harrigan, P.R., Bloor, S., Larder, B.A., 1998. Relative replicative fitness of zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1 isolates in vitro. J Virol. 72, 3773-3778.
Hirsch, M.S., Conway, B., D'Aquila, R.T., Johnson, V.A., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., Demeter, L.M., Hammer, S.M., Jacobsen, D.M., Kuritzkes, D.R., Loveday, C., Mellors, J.W., Vella, S., Richman, D.D., 1998. Antiretroviral drug resistance testing in adults with HIV infection: implications for clinical management. International AIDS Society--USA Panel. JAMA. 279, 1984-1991.
Holguin, A., Alvarez, A., Soriano, V., 2005. Differences in the length of gag proteins among different HIV type 1 subtypes. AIDS Res Hum Retroviruses. 21, 886-893.
Hughes, M.D., Johnson, V.A., Hirsch, M.S., Bremer, J.W., Elbeik, T., Erice, A., Kuritzkes, D.R., Scott, W.A., Spector, S.A., Basgoz, N., Fischl, M.A., D'Aquila, R.T., 1997. Monitoring plasma HIV-1 RNA levels in addition to CD4+ lymphocyte count improves assessment of antiretroviral therapeutic response. ACTG 241 Protocol Virology Substudy Team. Ann Intern. Med. 126, 929-938.
Iga, M., Matsuda, Z., Okayama, A., Sugiura, W., Hashida, S., Morishita, K., Nagai, Y., Tsubouchi, H., 2002. Rapid phenotypic assay for human immunodeficiency virus type 1 protease using in vitro translation. J Virol Methods. 106, 25-37.
LITERATURVERZEICHNIS
116
Iglesias-Ussel, M.D., Casado, C., Yuste, E., Olivares, I., Lopez-Galindez, C., 2002. In vitro analysis of human immunodeficiency virus type 1 resistance to nevirapine and fitness determination of resistant variants. J Gen Virol. 83, 93-101.
Isaguliants, M.G., Belikov, S.V., Starodubova, E.S., Gizatullin, R.Z., Rollman, E., Zuber, B., Zuber, A.K., Grishchenko, O.I., Rytting, A.S., Kallander, C.F., Kochetkov, S.N., Karpov, V.L., Wahren, B., 2004. Mutations conferring drug resistance affect eukaryotic expression of HIV type 1 reverse transcriptase. AIDS Res Hum Retroviruses. 20, 191-201.
Jamburuthugoda, V.K., Chugh, P., Kim, B., 2006. Modification of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase to target cells with elevated cellular dNTP concentrations. J Biol Chem. 281, 13388-13395.
Johnson, V.A., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., Kuritzkes, D.R., Pillay, D., Schapiro, J.M., Richman, D.D., 2006. Update of the drug resistance mutations in HIV-1: Fall 2006. Top HIV Med. 14, 125-130.
Johnson, V., Byington, R.E., 1990. Quantitative assays for virus infectivity. 71-76. eds. A. Aldovini and B.D. Walker, in Techniques in HIV research. Stockton Press.
Kageyama, S., Hoekzema, D.T., Murakawa, Y., Kojima, E., Shirasaka, T., Kempf, D.J., Norbeck, D.W., Erickson, J., Mitsuya, H., 1994. A C2 symmetry-based HIV protease inhibitor, A77003, irreversibly inhibits infectivity of HIV-1 in vitro. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 735-743.
Karlsson, A.C., Iversen, A.K., Chapman, J.M., de Oliviera, T., Spotts, G., McMichael, A.J., Davenport, M.P., Hecht, F.M., Nixon, D.F., 2007. Sequential Broadening of CTL Responses in Early HIV-1 Infection Is Associated with Viral Escape. PLoS ONE. 2, e225.
Kaufmann, D., Munoz, M., Bleiber, G., Fleury, S., Lotti, B., Martinez, R., Pichler, W., Meylan, P., Telenti, A., 2000. Virological and immunological characteristics of HIV treatment failure. AIDS. 14, 1767-1774.
Kemp, S.D., Shi, C., Bloor, S., Harrigan, P.R., Mellors, J.W., Larder, B.A., 1998. A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine. J Virol. 72, 5093-5098.
Keppler, O.T., Yonemoto, W., Welte, F.J., Patton, K.S., Iacovides, D., Atchison, R.E., Ngo, T., Hirschberg, D.L., Speck, R.F., Goldsmith, M.A., 2001. Susceptibility of rat-derived cells to replication by human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 75, 8063-8073.
Korn, K., Reil, H., Walter, H., Schmidt, B., 2003. Quality control trial for human immunodeficiency virus type 1 drug resistance testing using clinical samples reveals problems with detecting minority species and interpretation of test results. J Clin Microbiol. 41, 3559-3565.
Kosalaraksa, P., Kavlick, M.F., Maroun, V., Le, R., Mitsuya, H., 1999. Comparative fitness of multi-dideoxynucleoside-resistant human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) in an In vitro competitive HIV-1 replication assay. J Virol. 73, 5356-5363.
LITERATURVERZEICHNIS
117
Koup, R.A., Safrit, J.T., Cao, Y., Andrews, C.A., McLeod, G., Borkowsky, W., Farthing, C., Ho, D.D., 1994. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655.
Kurowski, M., Muller, M., Donath, F., Mrozikiewicz, M., Mocklinghoff, C., 1999. Single daily doses of saquinavir achieve HIV-inhibitory concentrations when combined with baby-dose ritonavir. Eur J Med Res. 4, 101-104.
Laakso, M.M., Sutton, R.E., 2006. Replicative fidelity of lentiviral vectors produced by transient transfection. Virology. 348, 406-417.
Lawless, M.K., Barney, S., Guthrie, K.I., Bucy, T.B., Petteway, S.R., Jr., Merutka, G., 1996. HIV-1 membrane fusion mechanism: structural studies of the interactions between biologically-active peptides from gp41. Biochemistry. 35, 13697-13708.
Leitner, T., Korber, B., Daniels, M., Calef, C., Foley, B. 2005. HIV-1 Subtype and Circulating Recombinant Form (CRF) Reference Sequences, 2005. 41-48. in HIV Sequence Compendium 2005. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. LA-UR 06-0680
Little, K., Thorne, C., Luo, C., Bunders, M., Ngongo, N., McDermott, P., Newell, M.L., 2007. Disease progression in children with vertically-acquired HIV infection in sub-Saharan Africa: reviewing the need for HIV treatment. Curr HIV Res. 5, 139-153.
Lusso, P., Cocchi, F., Balotta, C., Markham, P.D., Louie, A., Farci, P., Pal, R., Gallo, R.C., Reitz, M.S., Jr., 1995. Growth of macrophage-tropic and primary human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) isolates in a unique CD4+ T-cell clone (PM1): failure to downregulate CD4 and to interfere with cell-line-tropic HIV-1. J Virol. 69, 3712-3720.
Maeda, Y., Venzon, D.J., Mitsuya, H., 1998. Altered drug sensitivity, fitness, and evolution of human immunodeficiency virus type 1 with pol gene mutations conferring multi-dideoxynucleoside resistance. J Infect Dis. 177, 1207-1213.
Mammano, F., Petit, C., Clavel, F., 1998. Resistance-associated loss of viral fitness in human immunodeficiency virus type 1: phenotypic analysis of protease and gag coevolution in protease inhibitor-treated patients. J Virol. 72, 7632-7637.
Markowitz, M., Mohri, H., Mehandru, S., Shet, A., Berry, L., Kalyanaraman, R., Kim, A., Chung, C., Jean-Pierre, P., Horowitz, A., La Mar, M., Wrin, T., Parkin, N., Poles, M., Petropoulos, C., Mullen, M., Boden, D., Ho, D.D., 2005. Infection with multidrug resistant, dual-tropic HIV-1 and rapid progression to AIDS: a case report. Lancet. 365, 1031-1038.
Marozsan, A.J., Fraundorf, E., Abraha, A., Baird, H., Moore, D., Troyer, R., Nankja, I., Arts, E.J., 2004. Relationships between infectious titer, capsid protein levels, and reverse
LITERATURVERZEICHNIS
118
transcriptase activities of diverse human immunodeficiency virus type 1 isolates. J Virol. 78, 11130-11141.
Marozsan, A.J., Moore, D.M., Lobritz, M.A., Fraundorf, E., Abraha, A., Reeves, J.D., Arts, E.J., 2005. Differences in the fitness of two diverse wild-type human immunodeficiency virus type 1 isolates are related to the efficiency of cell binding and entry. J Virol. 79, 7121-7134.
Martinez-Picado, J., Savara, A.V., Shi, L., Sutton, L., D'Aquila, R.T., 2000. Fitness of human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitor-selected single mutants. Virology. 275, 318-322.
Martinez-Picado, J., Savara, A.V., Sutton, L., D'Aquila, R.T., 1999. Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of huma n immunodeficiency virus type 1. J Virol. 73, 3744-3752.
Masuhr, A., Müller, M., Simon, V., Zwingers, T., Kurowski, M., Jessen, H., Lauenroth-Mai, E., Moll, A., Schranz, D., Moecklinghoff, C., Arasteh, K., 2002. Predictors of treatment failure during highly active antiretroviral therapy (racing trial). Eur J Med Res. 7, 341-346.
Mellors, J.W., Munoz, A., Giorgi, J.V., Margolick, J.B., Tassoni, C.J., Gupta, P., Kingsley, L.A., Todd, J.A., Saah, A.J., Detels, R., Phair, J.P., Rinaldo, C.R., Jr., 1997. Plasma viral load and CD4+ lymphocytes as prognostic markers of HIV-1 infection. Ann Intern. Med. 126, 946-954.
Menzo, S., Monachetti, A., Balotta, C., Corvasce, S., Rusconi, S., Paolucci, S., Baldanti, F., Bagnarelli, P., Clementi, M., 2003. Processivity and drug-dependence of HIV-1 protease: determinants of viral fitness in variants resistant to protease inhibitors. AIDS. 17, 663-671.
Metzner, K.J., Allers, K., Rauch, P., Harrer, T., 2007. Rapid selection of drug-resistant HIV-1 during the first months of suppressive ART in treatment-naive patients. AIDS. 21, 703-711.
Metzner, K.J., Bonhoeffer, S., Fischer, M., Karanicolas, R., Allers, K., Joos, B., Weber, R., Hirschel, B., Kostrikis, L.G., Gunthard, H.F., 2003. Emergence of minor populations of human immunodeficiency virus type 1 carrying the M184V and L90M mutations in subjects undergoing structured treatment interruptions. J Infect Dis. 188, 1433-1443.
Metzner, K.J., Rauch, P., Walter, H., Boesecke, C., Zollner, B., Jessen, H., Schewe, K., Fenske, S., Gellermann, H., Stellbrink, H.J., 2005. Detection of minor populations of drug-resistant HIV-1 in acute seroconverters. AIDS. 19, 1819-1825.
Mitsuya, H., Weinhold, K.J., Furman, P.A., St Clair, M.H., Lehrman, S.N., Gallo, R.C., Bolognesi, D., Barry, D.W., Broder, S., 1985. 3'-Azido-3'-deoxythymidine (BW A509U): an antiviral agent that inhibits the infectivity and cytopathic effect of human T-lymphotropic virus type III/lymphadenopathy-associated virus in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7096-7100.
LITERATURVERZEICHNIS
119
Moore, C.B., John, M., James, I.R., Christiansen, F.T., Witt, C.S., Mallal, S.A., 2002. Evidence of HIV-1 adaptation to HLA-restricted immune responses at a population level. Science. 296, 1439-1443.
Müller, S.M., Schaetz, B., Eismann, K., Bergmann, S., Baürle, M., Schmitt-Haendle, M., Walter, H., Schmidt, B., Korn, K., Sticht, H., Spriewald, B., Harrer, E.G., Harrer, T., 2007. Dual selection pressure by drugs and HLA class I-restricted immune responses on human immunodeficiency virus type 1 protease. J Virol. 81, 2887-2898.
Najera, I., Holguin, A., Quinones-Mateu, M.E., Munoz-Fernandez, M.A., Najera, R., Lopez-Galindez, C., Domingo, E., 1995. Pol gene quasispecies of human immunodeficiency virus: mutations associated with drug resistance in virus from patients undergoing no drug therapy. J Virol. 69, 23-31.
Namikawa, R., Kaneshima, H., Lieberman, M., Weissman, I.L., McCune, J.M., 1988. Infection of the SCID-hu mouse by HIV-1. Science. 242, 1684-1686.
Nicastri, E., Sarmati, L., d'Ettorre, G., Palmisano, L., Parisi, S.G., Uccella, I., Rianda, A., Concia, E., Vullo, V., Vella, S., Andreoni, M., 2003. Replication capacity, biological phenotype, and drug resistance of HIV strains isolated from patients failing antiretroviral therapy. J Med Virol. 69, 1-6.
Nicastri, E., Sarmati, L., Dori, L., Montano, M., d'Ettorre, G., Buonomini, A.R., Parisi, S.G., Concia, E., Vullo, V., Andreoni, M., 2004. Viral growth assay to evaluate the replicative capacity of HIV-1 isolates. J Virol Methods. 115, 199-205.
Nijhuis, M., Deeks, S., Boucher, C., 2001. Implications of antiretroviral resistance on viral fitness. Curr Opin Infect Dis. 14, 23-28.
Nijhuis, M., Schuurman, R., de Jong, D., Erickson, J., Gustchina, E., Albert, J., Schipper, P., Gulnik, S., Boucher, C.A., 1999. Increased fitness of drug resistant HIV-1 protease as a result of acquisition of compensatory mutations during suboptimal therapy. AIDS. 13, 2349-2359.
O'Neal, R., 2006. MK-0518 and GS-9137: two promising integrase inhibitors in the pipeline. BETA. 18, 13-16.
Oette, M., Kaiser, R., Häusinger, D. 2003. Resistenz in der HIV-Therapie-Diagnostik und Management. 1. Auflage. Breme n, UNI-MED, ISBN 3-89599-736-6.
Ometto, L., De Forni, D., Patiri, F., Trouplin, V., Mammano, F., Giacomet, V., Giaquinto, C., Douek, D., Koup, R., De Rossi, A., 2002. Immune reconstitution in HIV-1-infected children on antiretroviral therapy: role of thymic output and viral fitness. AIDS. 16, 839-849.
Palella, F.J., Jr., Delaney, K.M., Moorman, A.C., Loveless, M.O., Fuhrer, J., Satten, G.A., Aschman, D.J., Holmberg, S.D., 1998. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV Outpatient Study Investigators. N Engl J Med. 338, 853-860.
Pantaleo, G., Menzo, S., Vaccarezza, M., Graziosi, C., Cohen, O.J., Demarest, J.F., Montefiori, D., Orenstein, J.M., Fox, C., Schrager, L.K., ., 1995. Studies in subjects
LITERATURVERZEICHNIS
120
with long-term nonprogressive human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med. 332, 209-216.
Perelson, A.S., Neumann, A.U., Markowitz, M., Leonard, J.M., Ho, D.D., 1996. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science. 271, 1582-1586.
Peters, S., Munoz, M., Yerly, S., Sanchez-Merino, V., Lopez-Galindez, C., Perrin, L., Larder, B., Cmarko, D., Fakan, S., Meylan, P., Telenti, A., 2001. Resistance to nucleoside analog reverse transcriptase inhibitors mediated by human immunodeficiency virus type 1 p6 protein. J Virol. 75, 9644-9653.
Petropoulos, C.J., Parkin, N.T., Limoli, K.L., Lie, Y.S., Wrin, T., Huang, W., Tian, H., Smith, D., Winslow, G.A., Capon, D.J., Whitcomb, J.M., 2000. A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 920-928.
Picchio, G.R., Valdez, H., Sabbe, R., Landay, A.L., Kuritzkes, D.R., Lederman, M.M., Mosier, D.E., 2000. Altered viral fitness of HIV-1 following failure of protease inhibitor-based therapy. J Acquir. Immune Defic. Syndr. 25, 289-295.
Pollakis, G., Abebe, A., Kliphuis, A., Chalaby, M.I., Bakker, M., Mengistu, Y., Brouwer, M., Goudsmit, J., Schuitemaker, H., Paxton, W.A., 2004. Phenotypic and genotypic comparisons of. J Virol. 78, 2841-2852.
Prado, J.G., Franco, S., Matamoros, T., Ruiz, L., Clotet, B., Menendez-Arias, L., Martinez, M.A., Martinez-Picado, J., 2004. Relative replication fitness of multi-nucleoside analogue-resistant HIV-1 strains bearing a dipeptide insertion in the fingers subdomain of the reverse transcriptase and mutations at codons 67 and 215. Virology. 326, 103-112.
Quigg, M., Frost, S.D., McDonagh, S., Burns, S.M., Clutterbuck, D., McMillan, A., Leen, C.S., Brown, A.J., 2002. Association of antiretroviral resistance genotypes with response to therapy--comparison of three models. Antivir Ther. 7, 151-157.
Quinones-Mateu, M.E., Arts, E.J., 2002. Fitness of drug resistant HIV-1: methodology and clinical implications. Drug Resist. Updat. 5, 224-233.
Quinones-Mateu, M.E., Ball, S.C., Marozsan, A.J., Torre, V.S., Albright, J.L., Vanham, G., Van Der, G.G., Colebunders, R.L., Arts, E.J., 2000. A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression. J Virol. 74, 9222-9233.
Reed, L.J., Münch, H., 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am Hyg. 27, 493-497.
Robinson, L.H., Myers, R.E., Snowden, B.W., Tisdale, M., Blair, E.D., 2000. HIV type 1 protease cleavage site mutations and viral fitness: implications for drug susceptibility phenotyping assays. AIDS Res Hum Retroviruses. 16, 1149-1156.
LITERATURVERZEICHNIS
121
Rubio A.E., Abraha A., Turk G., Arts E.J., Salomon H., 2006. Determination of ex-vivo fitness of different HIV-1 subtypes and intersubtype BF recombinants circulation in Argentina. WEPE0006.
Sa-Ferreira, J.A., Brindeiro, P.A., Chequer-Fernandez, S., Tanuri, A., Morgado, M.G., 2007. Human immunodeficiency virus-1 subtypes and antiretroviral drug resistance profiles among drug-naive Brazilian blood donors. Transfusion. 47, 97-102.
Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., Erlich, H.A., 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239, 487-491.
Salter, R.D., Howell, D.N., Cresswell, P., 1985. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids. Immunogenetics. 21, 235-246.
Sarmati, L., Nicastri, E., Montano, M., Dori, L., Buonomini, A.R., d'Ettorre, G., Gatti, F., Parisi, S.G., Vullo, V., Andreoni, M., 2004. Decrease of replicative capacity of HIV isolates after genotypic guided change of therapy. J Med Virol. 72, 511-516.
Schmidt, B., Walter, H., Moschik, B., Paatz, C., Van Vaerenbergh, K., Vandamme, A.M., Schmitt, M., Harrer, T., Uberla, K., Korn, K., 2000. Simple algorithm derived from a geno-/phenotypic database to predict HIV-1 protease inhibitor resistance. AIDS. 14, 1731-1738.
Schuurman, R., Brambilla, D., de Groot, T., Huang, D., Land, S., Bremer, J., Benders, I., Boucher, C.A., 2002. Underestimation of HIV type 1 drug resistance mutations: results from the ENVA-2 genotyping proficiency program. AIDS Res Hum Retroviruses. 18, 243-248.
Schuurman, R., Demeter, L., Reichelderfer, P., Tijnagel, J., de Groot, T., Boucher, C., 1999. Worldwide evaluation of DNA sequencing approaches for identification of drug resistance mutations in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Clin Microbiol. 37, 2291-2296.
Segal, M.R., 1995. Extending the elements of tree-structured regression. Stat. Methods Med Res. 4, 219-236.
Segal, M.R., Barbour, J.D., Grant, R.M., 2004. Relating HIV-1 sequence variation to replication capacity via trees and forests. Stat. Appl. Genet Mol Biol. 3, Article2.
Shadan, F.F., Villarreal, L.P., 1995. The evolution of small DNA viruses of eukaryotes: past and present considerations. Virus Genes. 11, 239-257.
Shehu-Xhilaga, M., Crowe, S.M., Mak, J., 2001. Maintenance of the Gag/Gag-Pol ratio is important for human immunodeficiency virus type 1 RNA dimerization and viral infectivity. J Virol. 75, 1834-1841.
Simon, V., Padte, N., Murray, D., Vanderhoeven, J., Wrin, T., Parkin, N., Di Mascio, M., Markowitz, M., 2003. Infectivity and replication capacity of drug-resistant human immunodeficiency virus type 1 variants isolated during primary infection. J Virol. 77, 7736-7745.
LITERATURVERZEICHNIS
122
Stocker, H., Kruse, G., Kreckel, P., Herzmann, C., Arasteh, K., Claus, J., Jessen, H., Cordes, C., Hintsche, B., Schlote, F., Schneider, L., Kurowski, M., 2004. Nevirapine significantly reduces the levels of racemic methadone and (R)-methadone in human immunodeficiency virus-infected patients. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 4148-4153.
Tebit, D.M., Zekeng, L., Kaptue, L., Gurtler, L., Fackler, O.T., Keppler, O.T., Herchenroder, O., Krausslich, H.G., 2004. Construction and characterization of an HIV-1 group O infectious molecular clone and analysis of vpr- and nef-negative derivatives. Virology. 326, 329-339.
Tersmette, M., de Goede, R.E., Al, B.J., Winkel, I.N., Gruters, R.A., Cuypers, H.T., Huisman, H.G., Miedema, F., 1988. Differential syncytium-inducing capacity of human immunodeficiency virus isolates: frequent detection of syncytium-inducing isolates in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and AIDS-related complex. J Virol. 62, 2026-2032.
Trkola, A., Kuster, H., Leemann, C., Ruprecht, C., Joos, B., Telenti, A., Hirschel, B., Weber, R., Bonhoeffer, S., Gunthard, H.F., 2003. Human immunodeficiency virus type 1 fitness is a determining factor in viral rebound and set point in chronic infection. J Virol. 77, 13146-13155.
Tschochner, M., Schwingel, E., Thein, C., Wittmann, S., Paatz, C., Walter, H., 2007. Superiority of infectivity-based over particle-based methods for quantitation of drug resistant HIV-1 as inocula for cell cultures. J Virol Methods. 141, 87-96.
Van Opijnen, T., Jeeninga, R.E., Boerlijst, M.C., Pollakis, G.P., Zetterberg, V., Salminen, M., Berkhout, B., 2004. Human immunodeficiency virus type 1 subtypes have a distinct long terminal repeat that determines the replication rate in a host-cell-specific manner. J Virol. 78, 3675-3683.
Van Vaerenbergh, K., 2001. Study of the impact of HIV genotypic drug resistance testing on therapy efficacy. Verh. K. Acad Geneeskd. Belg. 63, 447-473.
Walker, B.D., Korber, B.T., 2001. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity. Nat Immunol. 2, 473-475.
Walter, H., Low, P., Harrer, T., Schmitt, M., Schwingel, E., Tschochner, M., Helm, M., Korn, K., Uberla, K., Schmidt, B., 2002. No evidence for persistence of multidrug-resistant viral strains after a 7-month treatment interruption in an HIV-1-infected individual. J Acquir. Immune Defic. Syndr. 31, 137-146.
Walter, H., Schmidt, B., Korn, K., Vandamme, A.M., Harrer, T., Uberla, K., 1999. Rapid, phenotypic HIV-1 drug sensitivity assay for protease and reverse transcriptase inhibitors. J Clin Virol. 13, 71-80.
Mateu, M.E., 2003. A novel TaqMan real-time PCR assay to estimate ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness in the era of multi-target (pol and env) antiretroviral therapy. J Gen Virol. 84, 2217-2228.
Wild, C.T., Shugars, D.C., Greenwell, T.K., McDanal, C.B., Matthews, T.J., 1994. Peptides corresponding to a predictive alpha-helical domain of human immunodeficiency virus type 1 gp41 are potent inhibitors of virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 9770-9774.
Wolf, K., Walter, H., Beerenwinkel, N., Keulen, W., Kaiser, R., Hoffmann, D., Lengauer, T., Selbig, J., Vandamme, A.M., Korn, K., Schmidt, B., 2003. Tenofovir resistance and resensitization. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 3478-3484.
Wrin, T., Petropoulos, C.J., Hellmann, N.S., Whitcomb, J.M., Whitehurst, N., Beauchaine, J., Gamarnik, A., Whitehurst, N., 2001. Natural variation of replication capacity measurements in drug-naive/susceptible HIV-1. In Proceedings of the 5th International Workshop on HIV Drug Resistance & Treatment Strategies, Scottsdale, Arizona, Abstract 24.
Zennou, V., Mammano, F., Paulous, S., Mathez, D., Clavel, F., 1998. Loss of viral fitness associated with multiple Gag and Gag-Pol processing defects in human immunodeficiency virus type 1 variants selected for resistance to protease inhibitors in vivo. J Virol. 72, 3300-3306.
Zhang, Y.M., Imamichi, H., Imamichi, T., Lane, H.C., Falloon, J., Vasudevachari, M.B., Salzman, N.P., 1997. Drug resistance during indinavir therapy is caused by mutations in the protease gene and in its Gag substrate cleavage sites. J Virol. 71, 6662-6670.
Internet-Seiten:
http://www.euresist.org
http://www.genafor.org/
http://www.georgetown.edu/
http://www.hivdb.stanford.edu/
http://www.laborlexikon.de
http://www.unaids.org/
http://www.virologie-uni-erlangen.de
DANKSAGUNG
124
9 DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein für die Betreuuung und die
Möglichkeit, diese Arbeit unter hervorragenden Bedingungen und einem angenehmen
Arbeitsklima am Virologischen Institut, Klinische und Molekulare Virolgie, Nationales
Referenzzentrum für Retreoviren durchführen zu können.
Bei Herrn PD Dr. Robert Slany bedanke ich mich herzlich für seine Bereitschaft, die
vorliegende Arbeit als Gutachter vor dem Fachbereich II der Naturwissenschaftlichen Fakultät
zu vertreten. Vielmals bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler für
die Durchführung der Promotionsprüfung.
Besonderer Dank gilt meinem Betreuer Dr. Hauke Walter für die zahlreichen Ideen und
Diskussionen, die dieser Arbeit zugrunde liegen.
Ganz spezieller Dank gilt PD Dr. Barbara Schmidt, die immer ein offenes Ohr für mich hatte
und mir stets mit Rat und Tat zur Seite stand. Außerdem möchte ich mich bei allen aktuellen
und ehemaligen Mitarbeitern für die große Einsatzbereitschaft und gute Zusammenarbeit,
sowie bei Karin Metzner und der Abteilung der Diagnostik und dem Leiter Dr. Klaus Korn
bedanken.
Für die Zusammenarbeit bei mathematischen Fragestellungen gilt mein besonderer Dank
Dr. Thomas Straubinger.
An dieser Stelle sei auch unseren Kooperationspartnern vielmals gedankt in Saarbrücken:
Prof. Dr. Thomas Lengauer, Dr. Joachim Büch, Tobias Sing und Hendrik Weisser, in Berlin:
Dr. Keikawus Arasteh, Dr. Hartmuth Stocker und Christoph Weber, in Ispra:
Dr. Niko Stilianakis, und nicht zu vergessen allen Patienten und Klinikern, die diese Arbeit
durch Teilnahme und Durchführung der klinischen Studien mit ermöglicht haben.
Zudem sei auch allen anderen herzlich gedankt, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben.
ANHANG
125
10 ANHANG
Tab. 33: Liste der in Deutschland zur Zeit zugelassenen antiretroviralen Medikamente, modifiziert nach Schmidt et al., 2006, Springer Verlag)
Emticitabine (FTC) Tipranavir (TPV) a NtRTI: nukleotidischer reverser Transkriptase-Inhibitor; /r: Kombination mit niedrig dosiertem Ritonavir.
Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren
Aminosäure Abkürzung Aminosäure Abkürzung
Alanin A Leucin L Arginin R Lysin K
Asparagin N Methionin M Asparaginsäure D Phenylalanin F
Cystein C Proline P Glycin G Serin S
Glutamin Q Threonin T Glutaminsäure E Tryptophan W
Histidin H Tyrosin Y Isoleucin I Valin V
ANHANG
126
Tab. 34: Charakteristiken der Patienten aus der CAT-Studie. Angegeben sind jeweils Minimum, Median und Maximum, sowie die 25 %- und 75 %-Quantil von VL, CD4- und CD8-Zellzahl.
Pat.: Patient; Anzahl: Probenanzahl, welche in die jeweilige Analyse einbezogen wurde. VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; CD8: CD8-Zellzahl; RC: Repliaktionskapazität; Min.: Minimum; Max.: Maximum; n.d.: nicht durchgeführt.
ANHANG
128
Tab. 35: Charakteristiken der Patienten aus der CAT-Studie. Angegeben sind jeweils Minimum, Median und Maximum, sowie die 25 %- und 75 %-Quartile der vom Genotyp vorhergesagten Replikationskapazitäts-Werte und Resistenzfaktoren.
Die Patienten 3, 7, 12 und 14 wurden in dieser Tabelle ausgeschlossen, weil von den Proben dieser Patienten weniger als drei RC- und RF-Werte vorhergesagt wurden; Pat.: Patient; Anzahl: Probenanzahl, welche in die jeweilige Analyse mit einbezogen wurden; RC: Replikationskapazität; Abkürzungen der Medikamente: s. Anhang.
ANHANG
130
Abb. 28 Eingipflige Verteilung der Resistenzfaktoren von Proben der CAT- und Geno2RC-Datenbank am Beispiel von D4T und TDV. Resistenzfaktor: RF; CAT: engl.: continuously alternating therapy, D4T: Stavudine; TDV: Tenofovir.
d4T
0
5
10
15
20
25
30
0,20
0,25
0,32 0,
40,
50,
60,
81,
01,
31,
62,
02,
53,
24,
05,
06,
37,
910 13 16 20 25 32 40 50 63
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
TDV
0
5
10
15
20
25
30
0,20
0,25
0,32 0,
40,
50,
60,
81,
01,
31,
62,
02,
53,
24,
05,
06,
37,
910 13 16 20 25 32 40 50 63 79 10
0
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
ANHANG
131
SQV
0
5
10
15
20
25
30
0,13
0,20
0,32 0,
5
0,8
1,3
2,0
3,2
5,0
7,9
13 20 32 50 79 126
200
316
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
RTV
0
5
10
15
20
25
30
0,16
0,25 0,
4
0,6
1,0
1,6
2,5
4,0
6,3
10 16 25 40 63 100
158
251
398
631
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
NLV
02468
1012141618
0,16
0,25 0,
4
0,6
1,0
1,6
2,5
4,0
6,3
10 16 25 40 63 100
158
251
398
631
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
ANHANG
132
LPV
0
5
10
15
20
25
30
0,16
0,25 0,
4
0,6
1,0
1,6
2,5
4,0
6,3 10 16 25 40 63 100
158
251
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
ATV
0
5
10
15
20
25
30
35
0,20
0,32 0,
5
0,8
1,3
2,0
3,2
5,0
7,9 13 20 32 50 79 126
200
316
501
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
AZT
0
5
10
15
20
25
30
0,0
0,13
0,20
0,32 0,5
0,8
1,3
2,0
3,2
5,0
7,9 13 20 32 50 79 126
200
316
501
794
1259
1995
3162
4034
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
ANHANG
133
3TC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0,25 0,
4
0,6
1,0
1,6
2,5
4,0
6,3 10 16 25 40 63 100
158
251
398
631
1000
1585
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
DLV
02468
1012141618
00,
130,
200,
32 0,5
0,8
1,3
2,0
3,2
5,0
7,9
13 20 32 50 79 126
200
316
501
794
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
NVP
0
5
10
15
20
25
30
00,
130,
200,
32 0,5
0,8
1,3
2,0
3,2
5,0
7,9 13 20 32 50 79 126
200
316
501
794
1259
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
ANHANG
134
Abb. 29: Zweigipflige Verteilug der CAT- und Geno2RC-Datenbank für die 16 Medikamente SQV, RTV, NLV, APV, LPV, ATV, AZT, ABC, DLV, NVP und EFV. Resistenzfaktor: RF; SQV: Saquinavir; RTV: Ritonavir; NLV: Nelfinavir; APV: Amprenavir; LPV: Lopinavir; ATV: Atazanavir; 3TC: Lamivudine; AZT: Zidovudine; ABC: Abacavir; DLV: Delavirdin; NVP: Nevirapin; EFV: Efavirenz.
EFV
0
5
10
15
20
25
0
0,13
0,20
0,32 0,
5
0,8
1,3
2,0
3,2
5,0
7,9
13 20 32 50 79 126
200
316
501
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
APV
0
5
10
15
20
25
0,0
0,13
0,20
0,32 0,
50,
81,
32,
03,
25,
0
7,9 13 20 32 50 79 126
200
316
501
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
ABC
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0,25
0,32 0,
40,
50,
60,
81,
01,
31,
62,
02,
53,
24,
05,
06,
37,
910 13 16 20 25 32 40 50 63
RF
Anz
ahl
CAT
Geno2RC
PUBLIKATIONEN
135
Publikationen
Walter H., Low P., Harrer T., Schmitt M., Schwingel E., Tschochner M., Helm M., Korn K.,
Überla K., Schmidt B. No Evidence for Persistence of Multidrug-Resistant Viral Strains after a
7-Month Treatment Interruption in an HIV-1-Infected Individual. J Acquir Immune Defic
Syndr. 2002 Oct 1;31(2):137-46.
Tschochner M., Schwingel E., Thein C., Wittmann S., Paatz C., Walter H. Superiority of
Infectivity-Based over Particle-Based Methods for Quantitation of Drug Resistant HIV-1 as
Inocula for Cell Cultures. J. Virol. Methods. 2007 Apr, 141(1):87-96. Epub 2006 Dec 28
Tschochner M., Schwingel E., Wittmann S., Thein C., Paatz C., Vöglein A., Walter H. A new
method to determine the replication capacity of recombinant and full-length HIV-1 viruses. J.