1 Kinetika enzimskih reakcija Kinetika enzimskih reakcija Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska biohemija Školska 2014/2015. godina
1
Kinetika enzimskih reakcijaKinetika enzimskih reakcija
Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-medicinska
biohemijaŠkolska 2014/2015. godina
2
Enzimi kao katalizatoriEnzimi kao katalizatori
Definicija katalizatora
• Supstanca koja modifikuje i povećava brzinu odreñene hemijske
reakcije pri čemu se ona ne menja.
• Enzimi su proteinski katalizatori
• Uloga enzima u metabolizmu
• Senzitivni indikatori patoloških procesa
• Povećanje količine enzimskih molekula u cirkulaciji se meri na
osnovu njihove povećane katalitičke aktivnosti
• Kinetika enzimskih reakcija i katalitička aktivnost
3
Kinetika enzimske reakcije i stvaranje Kinetika enzimske reakcije i stvaranje kompleksa enzimkompleksa enzim--supstratsupstrat
Energija aktivacije kod reakcije sa i bez enzimaEsf energija aktivacije reakcije S → P bez katalizatoraEsf’ energija aktivacije u prisustvu katalizatora∆Go promena u slobodnoj energiji za ovu reakciju
Enzim-supstratni kompleksES – molekul supstrata je vezan za aktivni centar enzimaVezivanje transformiše supstrat u aktivno stanjeEnergija transformacije je obezbeñena slobodnom energijom vezivanja S za E. Aktivacija bez dodatne spoljašnje energije Energetska barijera reakcije je snižena
i ubrzana je razgradnja produkta.
ES se razgrañuje i nastaje produkt (P) i slobodan enzim
E + S ↔↔↔↔ ES →→→→ P + E
4
Enzimska kinetikaEnzimska kinetika
• Teorijski sve enzimske reakcije su reverzibilne– Praktično obično je reakcija u jednom pravcu brža
• Kinetika enzimske reakcije je važna za: 1. Metaboličke procese
– U biološkim procesima je niz enzimskih reakcija – Nastali produkt je supstrat za sledeću enzimsku reakciju
2. Laboratorijska odreñivanja– U laboratoriji kod odreñivanja aktivnosti enzima obično imamo
više povezanih enzimskih reakcija kako bi se odredila aktivnost prvog enzima ili koncentracija inicijalnog supstrata u lancu enzimskih reakcija
– Indikatorske reakcije – kinetika indikatorske reakcije ?– Prva reakcija (merna reakcija ) je ograničavajuća
5
Enzimska kinetikaEnzimska kinetika
• Merenje aktivnosti enzima - merenje brzine enzimske reakcije– Promena supstrata u jedinici vremena – Promena produkta u jedinici vremena
-d[S] d[P]dt dt
V = =
6
Faktori koji utiFaktori koji utičču na brzinu enzimski u na brzinu enzimski katalizovanih reakcijakatalizovanih reakcija
• Koncentracija enzima• Koncentracija supstrata• pH• Temperatura• Prisustvo inhibitora, aktivatora, koenzima i
prostetičnih grupa
7
Koncentracija enzimaKoncentracija enzima
Rea
ctio
n ve
loci
ty
Enzyme concentration
Zavisnost brzine enzimske reakcije od koncentracije enzima pod uslovom da je prisutan višak supstrata.
[S] >> [E], V ≈ [E]
8
Koncentracija supstrata Koncentracija supstrata
S - supstrat reakcijeEf - slobodan enzimK1- konstanta asocijacije kompleksaK-1 - konstanta disocijacije kompleksaES – kompleks enzim-supstrat K2 - konstanta razgradnje ES na Ef i PP- produkt reakcije
Šta je Michaelis-Mentenova jednačina ? Matematička ekspresija stvaranja produkta reakcije pod eksperimentalnim uslovima
Michaelis – Menten-ova jednačina definišeZavisnost brzine enzimske reakcije od koncentracije supstrata
Različita je kinetika enzimske reakcije za reakcije:A. sa jednim supstratom B. sa dva supstrata C. uzastopne enzimske reakcije
9
Kinetika zasićenja supstratomStvaranje ES daje hiperboluX - Koncentracija supstrataY – Brzina enzimske reakcije
Inicijalna brzina enzimskih reakcijav0= f [S]
Uslovi merenja enzimske aktivnosti:•Koncentracija enzima konstantna•Porast koncentracije supstrata
Michaelis – Mentenova kriva
Kinetika enzimske reakcije sa jednim Kinetika enzimske reakcije sa jednim supstratomsupstratom
10
Enzimske reakcije sa jednim supstratomEnzimske reakcije sa jednim supstratom
Michaelis – Mentenova jednačina
1. Reakcija prvog redaBrzina enzimske reakcije zavisi od koncentracije supstrata (niske konc)2. Mešovitog tipa3. Nultog redaBrzina reakcije ne zavisi odkoncentracije supstrata
Km Michaelis-Mentenova konstanta
Definicija:Km je koncentracija supstrata pri kojoj se postiže polovina maksimalne brzineVmax – Maksimalna postignuta brzina enzimske reakcije.
[S]0
Vmax
V0
First order withrespect to [S]
Zero order withrespect to [S]
1. Reakcija prvogreda
3.Reakcija nultogreda
2.
11
LineweaverLineweaver-- BurkBurk--ova krivaova krivaDvostruko reciproDvostruko reciproččna krivana krivaLinearna transformacija hiperbole Linearna transformacija hiperbole
12
IzraIzraččunavanje kinetiunavanje kinetiččkih konstanti enzimskih kih konstanti enzimskih reakcijareakcija
• Software za izračunavanje Km i Vmax za enzime• http//med.umich.edu/biochem/enzersources/software.ttm• http://www.sigmaplot.com/products/sigmaplot/enzyme-mod.php
Upotreba Km
• Izbor optimalne koncentracije supstrata
• Za poreñenje vezivanja homolognih ili sličnih supstrata za jedan te isti enzim
• Km služi za poreñenje svojstava sličnih enzima iz različitih izvora
• Izoenzimi odreñeni različitim genskim lokusima razlikuju se u Km
13
Postavljanje metode za odreñivanje enzimaPostavljanje metode za odreñivanje enzima
Izbor optimalne koncentracije supstrataPreduslov za postavljanje metode:1. Ispitati odnos izmeñu brzine enzimske reakcije i koncentracije supstrata
u širokom opsegu2. Odrediti Km3. Ispitati inhibiciju supstratom pri visokim koncentracijama supstrata
• Nulti-red reakcije se održava, ako je supstrat u velikom višku• Koncentracije najmanje 10 puta veće od Km ili od 10 do 100• Kada je S = 10 X Km brzina enzimske reakcije je aproksimativno 91 % od
teorijske vrednosti Vmax.• Red veličine za većinu enzima je za Km 10-5 do 10-3 mol/L• Obično je optimalna koncentracija supstrata u opsegu od 0,001 do 0,10
mol/L.• Optimalna koncentracija supstrata se ne može uvek primeniti zbog
– Ograničene rastvorljivosti supstrata– Koncentracija supstrata inhibira aktivnost enzima neophodnog u drugoj
kuplovanoj reakciji
14
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
Tipovi bisupstratnih reakcija• Pseudo reakcije sa jednim supstratom
• Voda je drugi supstrat
A. Bisupstratne reakcije dehidrogenaza• Bi-Bi sekvencione reakcije• Redosled vezivanja supstrata
• ureñeni (ordered)• neureñeni (random)
B. Bisupstratne reakcije aminotransferazaBi-Bi ping-pong mehanizam
15
• Bi-Bi sekvencione reakcije• Redosled vezivanja supstrata
• neureñeni (random)
• ureñeni (ordered)
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
16
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
• Bisupstratne reakcije dehidrogenaza– Drugi supstrat je NADH ili NADPH– Supstrati se vezuju za dva različita mesta na enzimskoj
molekuli
Km1 i Km
2 su Km vrednosti za oba supstrata
S1 i S2 koncentracije supstrata
Ks1 je ravnotežna konstanta za reverzibilnu reakciju izmeñu enzima i S1
17
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrataBisupstratne reakcije dehidrogenazaBisupstratne reakcije dehidrogenaza
Eksperimentalno odreñivanje Km i Vmaxza svaki supstrat
Koncentracija S1 konstantna(potpuno zasićenje)
Koncentracija S2 se varira i obrnuto
Km vrednosti su različite za dva supstrata
PrimerReakcija laktat dehidrogenazeDva supstrata piruvat i NADHKm za enzim iz goveñeg srcaPiruvat 2x10-5 mol/LNADH 3X10-6 mol/LNagib prave i odsečak na
y-osi zavise od koncentracije drugog Supstrata S2
18
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
•Bisupstratne reakcije aminotransferaza•Nema stvaranja tercijarnog kompleksa ES1S2
•Supstrati se vezuju za isto mesto na enzimskoj molekuli •Prvo se vezuje supstrat S1 za enzim pa se oslobaña P1
•Zatim se vezuje S2 i onda se oslobaña P2
Linearizacija jednačine:
Bi-Bi ping-pong mehanizam
20
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrataBisupstratne reakcije aminotransferazaBisupstratne reakcije aminotransferaza
• Ping-pong mehanizam
Varijacija S2 ne utiče na nagib praveMenja se odsečak na y-osi i Vmax kada koncentracija S2 varira
Eksperimentalno reakcioni uslovi bisupstratnih reakcija se odreñuju tako što se varira koncentracija prvog supstrata,a koncentracija drugog se drži konstantnasve dok se ne postigne maksimum aktivnostiProces se ponavlja sa varirajućim koncentracijama drugog supstrata
Izbor koncentracije supstrata je limitirana•Rastvorljivošću supstrata•Viskozitetom rastvora•Inicijalnom apsorbancijom koncentrovanog rastvora•Relativnom cenom reagenasa
21
Kinetika uzastopnih enzimskih reakcijaKinetika uzastopnih enzimskih reakcija
A. Metabolički procesi B. Analitička enzimologija
Indikatorska reakcija
Odnos aktivnosti indikatorske i merne reakcije varira meñu enzimima i zavisi od:1. Opsega merenja aktivnosti2. Km indikatorskog enzima3. Lag faze - dužina vremenskog intervala
od početka merenja koja se prihvata
Vi max i Ki
m za indikatorsku reakciju
22
Efekat pH Efekat pH
pH optimumiVećina enzima oko 7,0EkstremiPepsin 1,5Alkalna fosfataza 10,5
pH kriva je zavisna od1. Jonizacije supstrata 2. Stepena disocije a.k. u
bočnim lancima
Uticaj na trodimenzionalnu konformacijuDenaturacija enzima pri ekstremnim pH
Izbor puferaDovoljan kapacitet da neutrališe• efekat uzorka (seruma)• stvorenih baza ili kiselina
Uticaj pKa pri izboru puferaMaksimalni kapacitet pufera blizu pKa
Enz
ymat
ic a
ctiv
ity
1.0
2.0
1.5
0.5
2.0 10.08.04.0 6.0 pH
pepsin
trypsin
23
Efekat temperature i optimalna temperaturaEfekat temperature i optimalna temperatura
Q10 relativne brzine enzimske reakcije na dve temperature razlika za 10o CQ10 od 1,7 do 2,5Inicijalna brzina raste sa porastom tVreme potrebno za termostatiranje
Termalna inaktivacija i denaturacijaTemperatura inaktivacije 60-70oCGubitak tercijarne struktureUticaj na temp inaktivacije:
•supstrat i njegova koncentracija•pH•pufer i jonska jačina•prisustvo drugih proteina iz seruma
stabiliše enzimeČuvanje uzorakaAmilaza stabilna na 220C (24 sata), kisela fosfataza nestabilna (u frižideru u kiseloj sredini pH=6,0); Alkalna fosfataza i efekat odmrzavanja; LD-5 (jetreni izoenzim - inaktivacija u frižideruPreporuke IFCCAnalizatori na 37oC
25
Inhibitori i aktivatoriInhibitori i aktivatori
• Ligandi se vezuju za enzim i menjaju aktivnost enzima ali sami se ne menjaju
• Modifikatori ili modulatori ili efektori
– Mali molekuli mogu biti i joni
– Deluju na sve enzimske reakcije
– Specifični za odreñenu reakciju
• Nespecifični inhibitori:
– Jake kiseline ili multivalentni anjoni i katjoni denaturišu i precipitiraju enzime
– Oksidansi SH grupa dovode do inhibicije jer se redukovane SH grupe nalaze u aktivnom centru enzima
• Aktivacija jonima Mg sa ATP
26
Alosterna modifikacija enzimaAlosterna modifikacija enzimaAlosterno mesto; alosterni modulatoriAlosterno mesto; alosterni modulatori
Mesto aktivacijeMesto inhibicije
K klasa menja KmV klasa menja VmaxSigmoidalna kriva
Promena konformacije enzima i aktivnog mesta
27
Inhibicija enzimske aktivnostiInhibicija enzimske aktivnosti
1. Reverzibilna inhibicija– kompetitivna– nekompetitivna– akompetitivna
2. Ireverzibilna inhibicija3. Inhibicija antitelima
• Reverzibilna inhibicijaE + I EI
– Ki konstantna inhibicije – mera afiniteta inhibitora za enzim
28
Kompetitivni inhibitor je strukturni analog supstratu•Inhibicija viškom supstrata•Inhibicija bisupstratnih reakcija•Inhibicija produktomPrimer alkalna fosfataza
1.Reverzibilna inhibicijaKompetitivna inhibicija
+
S P
I
ES E+
+
EI
E
Km se povećavaVmax se ne menja
29
1. Reverzibilna inhibicijaNekompetitivna inhibicija
Nekompetitivni inhibitor se strukturno razlikujeod supstrata
Inhibitor se ne vezuje za supstrat vezujuće mestoKm se ne menjaVmax se redukuje
Tercijarni kompleks
+S P
I
+
+
E
EI
I+
S+
E
ESI
ES
30
1. Reverzibilna inhibicijaAkompetitivna inhibicija
Kombinacija inhibitora sa ES kompleksomNajpre se vezuje prvi supstrat a onda se gradi tercijarni komplesBisupstratne reakcije
+S P
+E
I+
E
ESI
ES
Km se menja i Vmax se menjaSniženje oba parametraParalelna kriva
1/[S]
1/V
No inhibitor
Uncompetitiveinhibitorincrease
-1/ Km
(1 + [I]/Ki)/Vmax
1/Vmax
-1/ Km(1 + [I]/Ki)
31
2. Ireverzibilna inhibicija2. Ireverzibilna inhibicija
Fiziološka inhibicija •Tripsin sa tripsin-inhibitorom•Ireverzibilna inhibicija proteolitičkog dejstva tripsina
Primer ireverzibilne inhibicije
32
2. Ireverzibilna inhibicija2. Ireverzibilna inhibicijaTeTešški metali vezuju SH grupeki metali vezuju SH grupe
ESH
SH
ES
SHg
E
SH
SH
ClAs
ClCH
CHCl As CH
CHClE
S
S
Hg2++ + 2H+
+ 2HCl+
Inhibicija enzima sa jodoacetamidom vezivanjem za SH grupe serinskog ostatka
33
3. Inhibicija antitelima3. Inhibicija antitelima
• Antitela u principu ne inhibiraju enzimsku aktivnost
• Mogućnost inhibicije zbog– Sternih smetnji antitela
– Konformacionih promena
Inhibicija aktivnosti enzimske molekule obeležene haptenom kao rezultat kombinacije sa specifičnim antitelima je osnov homogenog imunoenzimskog eseja EMIT
34
Aktivacija enzima Aktivacija enzima
• Aktivatori povećavaju brzinu enzimske reakcije
• Metalni joni, koenzimi i prostetične grupe
1. Metalni joni
• Mehanizam dejstva metalnih jona na aktivaciju enzima:
– Metalni joni kao integralni delovi strukture enzima
• Zn u alkalnoj fosfatazi i karboksipeptidazi A
• Uloga metalnog jona
– Stabilizacija tercijerne i kvarternerne strukture• Uklanjanje dvovalentnog katjona sa EDTA dovodi do konformacionih promena i inaktivacije
enzima
• Reaktivacija enzima dijalizom u rastvoru metala ili dodatak metalnog jona
35
Aktivacija enzima Aktivacija enzima
• Vezivanje jona za enzim:– čvrsto kao deo strukture enzima i ima dodatnu katalitičku aktivnost
– slabo vezivanje– prolazno vezivanje za enzim ili supstrat
• Neophodnost dodavanja jona, ako postoji deficijencija– efekat dodavanja jona može biti i inhibicija
• Primer• kinaza – fosfo trasferaze Mg2+
• Amilaza - dodatak hloridnog anjona
Karboanhidraza
36
Aktivacija enzimaAktivacija enzima
2. Koenzimi– kompleksnije strukture nego aktivatori– male molekule u odnosu na enzim i supstrat– NAD i NADP– vezani za enzim u toku enzimske reakcije