Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm Đông cô (Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lập hợp chất

8/17/2019 Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm Đông cô (Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại n…

http://slidepdf.com/reader/full/khao-sat-ham-luong-mot-so-loai-cao-dieu-che-tu-nam-dong 1/57

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC

------------

NGUYỄN THỊ THU NGÂN

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG MỘT SỐ LOẠI CAO ĐIỀU CHẾ TỪ NẤM ĐÔNG CÔ (LENTINULA EDODES )

LOẠI TƯƠI, KHÔ LOẠI LỚN, KHÔ LOẠI NHỎ VÀ

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO PETROLEUM ETHER

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH HÓA HỌC

2013

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC

------------

NGUYỄN THỊ THU NGÂN

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG MỘT SỐ LOẠI CAO ĐIỀU CHẾ TỪ NẤM ĐÔNG CÔ (LENTINULA EDODES )

LOẠI TƯƠI, KHÔ LOẠI LỚN, KHÔ LOẠI NHỎ VÀ

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO PETROLEUM ETHER

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. LÊ THANH PHƯỚC

2013





Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập − Tự do − Hạnh phúc

Bộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Thanh Phước

2. Đề tài: Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm Đông

cô (Lenti nu la edodes ) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phânlập hợp chất từ cao petroleum ether.

3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thu Ngân MSSV: 2102273

Lớp: Hóa học – Khóa 36

4.

Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức của LVTN:

…………………………………………………………………………………..

b. Nhận xét về nội dung của LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

………………………………………………………………………………….

Những vấn đề còn hạn chế:

…………………………………………………………………………………..

c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõtừng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện

nếu có):

…………………………………………………………………………………..

d. Kết luận, đề nghị và điểm:

..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013

Cán bộ hướng dẫn

TS. Lê Thanh Phước





Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập − Tự do − Hạnh phúc

Bộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN 1. Cán bộ chấm phản biện:

2. Đề tài: Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm Đông

cô (Lenti nu la edodes ) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phânlập hợp chất từ cao petroleum ether.

3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thu Ngân MSSV: 2102273

Lớp: Hóa học – Khóa 36

4.

Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức của LVTN:

..............................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung của LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

..............................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:

..............................................................................................................................

c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõtừng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện

nếu có):

..............................................................................................................................

d. Kết luận, đề nghị và điểm:

..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013

Cán bộ phản biện





Luận văn tốt nghiệp đại học

Nguyễn Thị Thu Ngân MSSV: 2102273

i

LỜI CẢM ƠN

-------------

Để đạt được những kết quả như hôm nay phải trải qua quá trình tìm tòi

nghiên cứu không mệt mỏi. Do kiến thức và kỹ năng chuyên môn còn hạn chếnên tôi đã gặp rất nhiều khó khăn. Tuy nhiên, dưới sự dìu dắt tận tình của quýthầy cô trong bộ môn, sự động viên giúp đỡ của người thân, bạn bè, tôi đãhoàn thành công việc nghiên cứu của mình, trao dồi và tích lũy thêm nhiềukiến thức rất bổ ích cho bản thân, chuẩn bị hành trang khi ra trường.

Lời đầu tiên em xin được gửi lời cám ơn chân thành , sâu sắc đến thầy LêThanh Phước, thầy đã luôn bên cạnh hướng dẫn và chỉ dạy em trong suốt quá

trình em thực hiện đề tài.

Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến tất cả quý thầy cô trong khoa Khoa

Học Tự Nhiên, các thầy cô trong Bộ môn Hóa, cô cố vấn học tập Nguyễn ThịÁnh Hồng. Quý thầy cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho em những kiến

thức rất bổ ích trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Con xin cám ơn cha mẹ đã luôn ở bên con động viên tinh thần, chăm lovà dành cho con những gì tốt nhất, giúp con yên tâm thực hiện tốt công việcnghiên cứu của mình mặc dù gia đình còn rất nhiều khó khăn.

Lời cuối tôi xin được gửi lời chân thành, thân mến đến tất cả các bạnHóa Học K36, các bạn lớp Hóa Dược K36 đã luôn ở bên cạnh tôi, cùng tôivượt qua những ngày tháng đáng nhớ trong cuộc đời.

Xin chân thành cám ơn!







ii

TÓM TẮT

------------

Bằng phương pháp tách chiết thông thường như kỹ thuật chiết rắn – lỏng

và kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, tiến hành điều chế cao tổng etanol từ 3 loại nấmĐông cô (Lentinula edodes ) tươi, khô loại lớn và khô loại nhỏ bán trên thịtrường. Định tính các nhóm chức có trong dịch chiết ban đầu nhận thấy trongthành phần nấm có chứa: alkaloid, flavonoid, terpenoid – sterol, glucoside,

không có saponin và tanin.

Từ cao tổng etanol tiếp tục điều chế 3 loại cao thành phần: petroleumether, etyl acetate, n−butanol. Sau đó so sánh khối lượng các cao thu được từ 3

loại nấm nêu trên.

Dựa vào phương pháp cô lập các hợp chất thiên nhiên, sắc ký cột kết hợp

sắc ký lớp mỏng, cô lập được 2 hợp chất có trong cao petroleum ether từ nấmĐông cô tươi. Phân tích phổ từ viện Hóa Học – phòng NMR xác định được

chất thứ nhất là ergosterol – một sterol có trong tế bào nấm, dưới tác dụng củaánh sáng mặt trời hợp chất ergosterol sẽ được chuyển hóa thành vitamine D 2.

Hợp chất thứ 2 là ergosterol peroxide dạng chuyển hóa của chất thứ nhất. Cả 2hợp chất tìm được đều có hoạt tính sinh học cao và được quan tâm nghiên cứu.







iii

ABSTRACT

------------

By conventional extraction techniques such as solid − liquid and liquid −

liquid extraction. Modulation total ethanol from 3 kinds of shiitake ( Lentinula

edodes) fresh, large dried and small dried on the market. Quantitative analysis

of the functional groups present in the initial organic extracts. Containing the

alkaloids, flavonoids, terpenoids − sterols, glucosides in ingredients of

shiitake. There aren’t present of tanins and saponins.

From the total ethanol extract, continue to product 3 component

categories extract: petroleum ether , ethyl acetate, n− buthanol. Then compare

the volume obtained from 3 kinds of above fungi.

Based on the method isolation of natural compounds, column

chromatography combined with thin layer chromatography. Two compounds

are isolated in extract petroleum ether from fresh shiitake. NMR spectral

analysis, the first substance is identified as ergosterol − a sterol present in

fungal cells, under the influence of sunlight ergosterol compound will be

converted to vitamine D2. The second sudstance is ergosterol peroxide − Thissterol is trans − formed from ergosterol by photo − oxidation with singlet

oxygen. Both of all have bioactivity needs to research.







iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên: Nguyễn Thị Thu Ngân, MSSV 2102273, lớp KH1069A1.

Đề tài thực hiện: “Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm

Đông cô ( Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lậphợp chất từ cao petroleum ether”.

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân,

theo sự gợi ý của cán bộ hướng dẫn. Các thông tin về số liệu, hình ảnh, kết quả

đã được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được

công bố ở bất kỳ luận văn nào trước đây.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Nguyễn Thị Thu Ngân







v

MỤC LỤC

-------------LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i

TÓM TẮT .......................................................................................................... iiABSTRACT...................................................................................................... iii

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. iv

MỤC LỤC ......................................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... viiDANH MỤC BẢNG ...................................................................................... viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT .......................................... ix

Chương 1: GIỚI THIỆU .................................................................................... 1

1.1 Giới thiệu.................................................................................................. 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................. 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 32.1 Giới thiệu chung về chi Lentinula ............................................................ 32.2 Giới thiệu về nấm Đông cô ( Lentinula edodes) ....................................... 4

2.2.1 Tên gọi, xuất xứ và phân loại. ........................................................... 42.2.2 Đặc điểm thực vật .............................................................................. 4

2.2.3 Thành phần hóa học .......................................................................... 5

2.2.4 Công dụng ......................................................................................... 6

2.2.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước ....................................................... 8

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN − PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 10

3.1 Địa điểm, thời gian, phương tiện nghiên cứu ........................................ 10

3.1.1 Địa điểm .......................................................................................... 103.1.2 Thời gian ......................................................................................... 10

3.1.3 Phương tiện nghiên cứu ................................................................... 10

3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 10

3.2.1 Phương pháp chiết tách ................................................................... 10

3.2.2 Phân lập hợp chất hữu cơ ................................................................ 11

3.3 Phương pháp chiết tách .......................................................................... 11

3.3.1 Kĩ thuật chiết ngâm dầm (rắn − lỏng) ............................................. 113.3.2 Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng ................................................................ 12

3.4 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) ...................................................................... 13

3.4.1 Giới thiệu chung .............................................................................. 133.4.2 Chất hấp phụ silica gel .................................................................... 14

3.4.3 Dung môi giải ly .............................................................................. 15

3.4.4 Các kỹ thuật SKLM ......................................................................... 16

3.4.5 Ứng dụng của SKLM ...................................................................... 17

3.5 Sắc ký cột ............................................................................................... 17

3.5.1 Nguyên tắc ....................................................................................... 18

3.5.2 Kỹ thuật triển khai ........................................................................... 183.5.3 Quá trình giải ly cột ......................................................................... 20

Chương 4: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN .......................... 22

4.1 Xử lý nguyên liệu và định tính các nhóm chức ..................................... 224.1.1 Xử lý nguyên liệu ............................................................................ 22







vi

4.1.2 Định tính các nhóm chức ................................................................. 224.2 Điều chế các loại cao ............................................................................. 26

4.2.1 Điều chế cao etanol tổng (EtOH) .................................................... 26

4.2.2 Điều chế cao thành phần ................................................................. 264.2.3 So sánh khối lượng cao ................................................................... 28

4.3 Phân lập hợp chất có trong cao PE......................................................... 284.3.1 Quá trình phân lập chất trên cao PE ................................................ 28

4.3.2 Quá trình phân lập chất trên phân đoạn I cao PE ............................ 294.3.3 Biện luận cấu trúc hợp chất vừa phân lập ....................................... 31

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 34

5.1 Kết luận .................................................................................................. 345.1.1 Khối lượng các loại cao ................................................................... 34

5.1.2 Hợp chất phân lập ............................................................................ 345.2 Kiến nghị ................................................................................................ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 35

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 38







vii

DANH MỤC HÌNH

-------------Hình 2.1: Lentinula aciculospora ...................................................................... 3

Hình 2.2: Lentinula boryana ...................................................................... 3

Hình 2.3: Lentinula cubensis ............................................................................ 3 Hình 2.4: Lentinula edodes ............................................................................ 3

Hình 2.5: Lentinula raphanica .......................................................................... 3 Hình 3.1: Kỹ thuật chiết ngâm dầm ................................................................. 12Hình 3.2: Cách tính giá trị R f ........................................................................... 14

Hình 3.3: Cấu trúc mạng silica gel .................................................................. 15Hình 3.4: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 2 chiều ................................................... 16

Hình 3.5: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế ................................................. 17

Hình 4.1: Nấm Đông cô tươi, khô loại lớn và khô loại nhỏ ............................ 22

Hình 4.2: Định tính alkaloid với thuốc thử Dragendrorff ................................ 23

Hình 4.3: Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer .......................................... 23Hình 4.4: Định tính flavonoid .......................................................................... 24

Hình 4.5: Định tính steroid .............................................................................. 24Hình 4.6: Định tính đường khử ........................................................................ 25

Hình 4.7: Sơ đồ tổng quát quá trình điều chế các loại cao .............................. 27

Hình 4.8: SKLM phân đoạn I, I4 và I5 ............................................................ 30Hình 4.9: SKLM hợp chất PHUOC_NS1 với 3 hệ dung môi khác nhau ....... 30

Hình 4.10: SKLM hợp chất PHUOC_NS2 với 3 hệ dung môi khác nhau ..... 31

Hình 4.11: Hợp chất ergosterol ........................................................................ 31

Hình 4.12: Sự chuyển hóa ergosterol .............................................................. 32

Hình 4.13: Hợp chất ergosterol peroxide ......................................................... 33Hình 4.14: Sự chuyển đổi ergosterol thành ergosterol peroxide ..................... 33







viii

DANH MỤC BẢNG

------------- Bảng 2.1: Giá trị dinh dưỡng trên 100 g nấm Đông cô khô .............................. 6

Bảng 4.1: Bảng xác định độ ẩm ....................................................................... 22

Bảng 4.2: Kết quả định tính một số nhóm chức .............................................. 25Bảng 4.3: Khối lượng cao tổng và hiệu suất thu cao tổng ............................... 26

Bảng 4.4: Khối lượng cao PE và hiệu suất thu cao ......................................... 26

Bảng 4.5: Khối lượng cao Ea và hiệu suất thu cao .......................................... 26

Bảng 4.6: Khối lượng cao n−butanol và hiệu suất thu cao .............................. 27

Bảng 4.7: Bảng tổng kết khối lượng các cao thu được .................................... 28

Bảng 4.8: Kết quả sắc ký cột cao PE nấm tươi ................................................ 29Bảng 4.9: Kết quả sắc ký cột phân đoạn I ....................................................... 29







ix

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

-------------

N1 Nấm tươi N2 Nấm khô lớn

N3 Nấm khô nhỏ

EtOH Etanol

PE Petroleum ether

Ea Etyl acetaten−BuOH n – Butanol

SKLM Sắc ký lớp mỏng

R f Retention factor1H− NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance13C− NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

DEPT Detortionless Enhancement Polarization Transfer

d Doubletdd Doublet of doublet

m Multiplet

s Singlett Triplet

Chemical shift

J Coupling constant

ppm Part per million







1

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Giới thiệu

Hơn 3000 năm trước con người đã biết đến nhiều hiệu quả từ nấm Đôngcô như một vị thuốc quý có tác dụng tăng cường khí lực, kích thích ăn uống,

điều hòa khí huyết,… Cho đến nay lợi ích của nấm Đông cô ngày càng đượckhai thác với những giá trị cao về dược phẩm cũng như thực phẩm. Nấm Đông

cô chứa nhiều protein, carbohydrate, giàu khoáng chất, amino acid thiết yếu,vitamine và các nguyên tố vi lượng,… Đặc biệt các thành phần có hoạt tínhsinh học: lentinan, lentinula mycelium edodes, ergosterol, ergosterol peroxide,

L – ergothionine, eritadenine, các chất kháng oxy hóa như vitamine C, selen,…

có trong nấm Đông cô là tiềm năng lớn trong y học.

Ngày nay khi xã hội ngày càng phát triển, sức khỏe là vấn đề được quan

tâm hàng đầu. Bên cạnh rất nhiều loại thuốc được tạo ra từ quá trình tổng hợp ,

con người ngày càng có xu hướng tìm về với cội nguồn thảo dược thiên nhiên.Chính vì vậy việc nghiên cứu về thảo dược góp phần quan trọng được rấtnhiều nhà khoa học quan tâm. Công việc tìm hiểu, nghiên cứu không nhữnggiúp ta hiểu rõ về thành phần hóa học của thảo dược mà còn giúp ta hiểu hơnvề tác dụng và tính chất của dược liệu.

Trên thị trường hiện nay nấm Đông cô được bán dưới dạng nấm Đông cô tươi, nấm Đông cô được sấy khô có loại lớn và loại nhỏ. Vậy thành phần dinh

dưỡng trong 3 loại nấm trên có gì khác biệt? Trong phạm vi giới hạn của đềtài, nghiên cứu này sẽ góp phần giúp tìm hiểu rõ hơn về hàm lượng chất dinhdưỡng dưới dạng cao được điều chế có trong từng loại nấm Đông cô tươi vàkhô nêu trên. Đây sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu sâu và rộng hơn về loại nấmcó nhiều giá trị về dinh dưỡng cũng như giá trị dược phẩm này. Đồng thời,

phân lập chất trên cao petroleum ether từ nấm Đông cô tươi dựa vào kỹ thuậtsắc ký và xác định cấu trúc chất phân lập được, đó là lý do tiến hành nghiên

cứu và thực hiện đề tài: “Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm

Đông cô ( Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lậphợp chất từ cao petroleum ether”.







2

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Ngâm dầm và thu dịch chiết etanol từ 3 loại nấm Đông cô ( Lentinula

edodes) tươi, khô lớn và khô nhỏ có bán trên thị trường.

Định tính các nhóm chức có trong dịch chiết etanol ban đầu.

Điều chế cao tổng etanol. Từ cao etanol tổng tiếp tục điều chế 3 loại caothành phần: cao petroleum ether, cao etyl acetate, cao n− butanol. So sánh hàm

lượng các cao thu được từ 3 loại nấm nêu trên.

Sử dụng các kỹ thuật cô lập hợp chất thiên nhiên, tiến hành phân lập chất

trên cao petroleum ether và xác định cấu trúc hợp chất phân lập được.







3

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về chi Lentinula

Lentinula là một chi nấm tán mọc trên gỗ, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới bao gồm 8 loài:

Lentinula aciculospora, Lentinula boryana, Lentinula cubensis,

Lentinula raphanica, Lentinula edodes, Lentinula guarapiensis, Lentinula

lateritia, Lentinula novae − zelandiae.

Hình 2.1: Lentinula aciculospora Hình 2.2: Lentinula boryana

Hình 2.3: Lentinula cubensis Hình 2.4: Lentinula edodes

Hình 2.5: Lentinula raphanica

Chi Lentinula được lập bởi Franklin Sumner Earle năm 1909, trong đó phổ biến nhất là loài Lentinula edodes.







4

2.2 Giới thiệu về nấm Đông cô (Lenti nu la edodes )

2.2.1 Tên gọi, xuất xứ và phân loại.

Tên thường: Shiitake, nấm Đông cô, nấm Hương, nấm đen Trung Quốc.

Tên khoa học: Lentinula edodes.

Xuất xứ: Nấm Đông cô là loại nấm ăn có nguồc gốc bản địa ở vùng

Đông Á.

Phân loại như sau:

Giới: Nấm

Ngành: Basidiomycota

Lớp: Homobasidiomycetes

Bộ: Agaricales

Họ: Marasmiaceae

Chi: Lentinula

Loài: Lentinula edodes

2.2.2 Đặc điểm thực vật

2.2.2.1 Mô tả

Nấm còn non nằm trong vỏ cây, khi lớn làm nứt vỏ cây chui ra ngoài.Hình dạng như cái ô, đường kính từ 4 – 10 cm, màu nâu nhạt, khi chín có màu

nâu sậm.

Nấm Đông cô có một chân hình trụ, dài khoảng 3– 10 cm, đường kính0,5 – 1 cm đính vào giữa tai nấm.

Mặt trên tai nấm màu nâu, mặt dưới có nhiều nếp mỏng xếp lại. Trên mặt

nấm có những vảy nhỏ màu trắng. Thịt nấm màu trắng.

2.2.2.2 Phân bố

Nấm Đông cô phân bố rộng ở Châu Á, thường mọc hoang ở Việt Nam,Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan,….

Ở nước ta nấm Đông cô phân bố tự nhiên ở vùng rừng núi Lào Cai (Sa

Pa), Yên Bái, Tuyên Quang, Hoà Bình, Bắc Thái, Cao Bằng, Lạng Sơn. Thường mọc trên thân cây gỗ mục như: Côm tầng ( Elaeocarpus dubius), cây







5

Dẻ đỏ (Quercus), Sồi bộp ( Pasania), Re đỏ (Cinnamomum) vào mùa lạnh nơi có điều kiện thoáng gió, có ánh sáng và ẩm ướ t.

2.2.2.3 Gây trồng nhân tạo

Hiện nay người ta đã biết đến việc gây trồng nhân tạo nhằm khai tháctiềm năng cũng như thu lại hiệu quả kinh tế từ loại nấm này. Mô hình trồngnhân tạo được nhân rộng với quy mô trang trại và có tính thương mại cao.

Người dân đốn các cây cỡ lớn, dài khoảng 5 m, để nằm ở nơi thoáng cóánh sáng mặt trời chiếu vào. Giữ cẩn thận cho vỏ cây khỏi bong ra. Sau khiloại bỏ tất cả cành lá rườm rà, chặt sâu xuống thân cây những rạch ngang sâutừ 6−10 cm, mỗi rạch cách nhau 50−100 cm; mục đích của việc chia cây gỗ

thành nhiều đoạn như thế là để lấy nơi cho nhựa cây thoát ra, cây sẽ mau mục.

Sau đó người ta thường lấy nấm Đông cô đã già đem ngâm vào nước vo gạotrong một ngày đêm rồi tưới lên khúc gỗ. Hoặc lấy bào tử nấm xát ở mặt trêncây gỗ, vì chỉ ở nơi nào có ánh sáng mặt trời chiếu tới thì nấm mới mọc.

Sau một năm, nấm đã bắt đầu nẩy lên và đã có thể thu hoạch nhưng nấmcòn nhỏ, phải đợi khoảng 2 năm thì tốt hơ n. Một cây gỗ chặt như trên sẽ cho

được từ 5−10 kg nấm tươi, có thể cho thu hoạch đến năm thứ 6.

2.2.3 Thành phần hóa học

Nấm Đông cô có hàm lượng protein cao, từ 23−24% trong sợi nấm và có

thể so sánh với lượng protein có trong thịt. Trong thành phần có đầy đủ các

acid amin thiết yếu cơ thể người không tổng hợp được như: isoleucin, leucin,

lysine, methionin, phenylalanine, threonin, histidin, tryptophan, valin [1-3],....

Chất béo với hàm lượng 8−9% trọng lượng khô, bao gồm: các acid béo

tự do, monoglyceride, diglyceride, triglyceride, phospholipids chủ yếu là phosphatidylcholine, sterol,… Các chất béo thiết yếu chiếm từ 54−76% tổnglượng chất béo [1-3].

Tổng lượng carbohydrate gồm: đường pentose, hexose, disaccharide,

trehalose,... Nguồn chất xơ không hòa tan như: cenlulose, ligin, chitin và hòa

tan như: β– glucan, chitosan. Trong đó chitin là thành phần chính cấu tạo nên

vách tế bào sợi nấm. Hàm lượng chất xơ nấm Đông cô khoảng 7−14% [3-5].

Nấm Đông cô chứa nhiều loại vitamine cần thiết cho cơ thể như: B1, B2,

B3, B5, B6, vitamine C, tiền vitamine D. Các k hoáng chất vi lượng cần thiết

như: natri, canxi, phospho, sắt, đồng, magie, selen,… Hơn nữa trong thành phần nấm Đông cô có khoảng 30 enzyme trong đó có những enzyme quantrọng như: amylase, aromatase, cenlulase, 5 –α– reductase [3],....









7

Rau cần xào nấm: Rất tốt cho người mỡ máu cao, người bệnh mạchvành, đồng thời có tác dụng thanh nhiệt bình can.

Gà hầm nấm: Công dụng k iện tỳ, bổ thận, ích khí, dưỡng huyết, dùng đểchữa các chứng bệnh có biểu hiện khí huyết suy nhược, mệt mỏi nhiều, mắt

mờ, đầu choáng, mất ngủ, hay quên.

Nấm nấu đậu: Rất tốt cho trẻ em bị còi xương, người già bị loãng xươngvà chứng phù thũng.

Bầu dục xào nấm: Bổ thận, tráng dương, kích thích tiêu hóa, thích hợp

cho những người yếu sinh lý, đau lưng, mỏi gối, ăn uống không ngon miệng.

Hải sâm xào nấm: Ích khí, bổ âm, cầm máu, tiêu viêm và phòng chống

ung thư, đặc biệt là ung thư dạ dày.

Chân giò hầm nấm: Bồi bổ âm dương, dưỡng huyết, kích thích sự thèmăn, tăng số lượng và chất lượng sữa ở phụ nữ nuôi con bú.

2.2.4.2 Giá trị dược phẩm

Tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể: Các polysaccharide, đặc biệtlà β– glucan trong nấm Đông cô có khả năng hoạt hoá miễn dịch tế bào, thúcđẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào lympho, kích hoạt tế bàolympho T và lympho B − những tế bào đóng vai trò chính trong bảo vệ cơ thể.

Nấm Đông cô được coi là thực phẩm cho những người bị thiếu máu dothiếu sắt, cao huyết áp, tiểu đường, trẻ em suy dinh dưỡng. Là nguồn cung cấpkhoáng chất vi lượng cần thiết cho cơ thể.

Kháng khuẩn và virus: Chất lentinan trong nấm Đông cô có khả năng

kháng khuẩn, virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng, chống bội nhiễm khuẩnở các bệnh nhân AIDS. Nghiên cứu cho thấy hiệu quả điều trị từ việc sử dụng

thuốc có chứa hoạt chất chiết xuất từ nấm Đông cô đạt 80,5% [10-12].

Chống ung thư: Các công ty của Nhật như Công ty Ajinomoto, Yamanouchi đã từ sợi nấm Đông cô bào chế ra lentinan như là một dược phẩmchống ung thư, đặc biệt trong điều trị ung thư dạ dày cho hiệu quả cao, không

có tác dụng phụ, do đó được áp dụng như một phương pháp trị liệu có hiệuquả cao cho các bệnh nhân. Ngay cả trong những trường hợp ung thư đường

dạ dày − ruột đến giai đoạn 3, kết quả vẫn rất khả quan.

Giảm cholesterol: Thành phần eritadenine làm giảm mức cholesterol vàcác lipid trung tính trong máu. Chính vì vậy, nấm Đông cô được sử dụng để

điều trị các bệnh về tim mạch. Ngoài ra còn có tác dụng điều chỉnh rối loạn







8

lipid máu, làm hạ lượng cholesterol, triglyceride và β−lipoprotein trong huyếtthanh, vì vậy có tác dụng điều tiết công năng tim mạch, tăng lưu lượng máu

động mạch vành, hạ thấp oxy tiêu thụ và cải thiện tình trạng thiếu máu cơ tim.

Giải độc và bảo vệ tế bào gan: Giảm thiểu tác hại của các chất nhưcarbon tetrachloride, thioacetamide và prednisone đối với tế bào gan, làm tănghàm lượng glycogen trong gan và hạ thấp men gan.

Thanh trừ các gốc tự do và chống lão hoá: Gốc tự do là các sản phẩm cóhại của quá trình chuyển hoá tế bào. Nấm Đông cô có chứa L – erothioneine,

vitamine C, vitamine E, ergosterol peroxide, polyphenolic và selen, tác dụngthanh tr ừ các sản phẩm từ quá trình chuyển hóa này, làm giảm lượng mỡ trong

cơ thể, từ đó có khả năng làm chậm quá trình lão hóa và kéo dài tuổi thọ.

Hàm lượng vitamine B cao cần thiết trong bảo vệ cơ thể, chống lại nhiềuchứng bệnh như Parkinson và Alzheimer. Ergosterol chuyển hóa thànhvitamine D giúp cơ thể hấp thu tốt canxi và phospho, tăng cường quá trình cốthóa, hạn chế loãng xương. Ngoài ra sự biến đổi hợp chất ergosterol thànhergosterol peroxide là một hợp chất có tính kháng viêm, kháng khuẩn và hạnchế sự phát triển của khối u [12-14].

Aromatase biến androgen được coi là kích thích tố dương trở thành

estrogen kích thích tố âm. Làm hạ kích thích tố âm sẽ làm giảm nguy cơ gây

ra ung thư tuyến tiền liệt và một vài loại ung thư vú. Enzyme 5 –α−reductasengăn chặn sự biến thể của testosterone thành dihydrotestosterone (DHT) mộtloại kích thích tố khởi xướng ra bệnh ung thư tuyến tiền liệt [1-3, 8].

2.2.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước

Đã có rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần dược tínhcó giá trị của loại nấm này, trong đó phải nhắc tới nghiên cứu gần đây của cácnhà khoa học trong phát hiện hợp chất lentinan từ sợi nấm Đông cô có đặc tínhchống ung thư hiệu quả cao.

Trường Công nghệ Sinh Học, Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minhnghiên cứu hàm lượng protein, lipid, carbohydrate,… trong một số loại nấmăn thông thường ở miền Nam, Việt Nam trong đó có Lentinula edodes [4].

Nghiên cứu đa dạng của các loài nấm Đông cô (Lentinula edodes) ở SaPa, Letinula CF. Lateritia ở Langbiang, Đà Lạt và Letinula SP mới tìm thấy ở

Cát Tiên, Việt Nam do Sở Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng, trường Đại họcĐà Lạt, Vườn Quốc gia Cát Tiên, Đồng Nai hợp tác thực hiện [16].







9

Y. Choy và cộng sự thuộc trường Đại học Chungbuk, Hàn Quốc nghiên

cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa các hợp chất có trong

nấm Đông cô [9].

Nghiên cứu của Julita Reguła và Marek Siwulski, Đại học Nông nghiệpPoznan năm 2007 về hàm lượng các nguyên tố vi lượng có trong nấm Đông côloại khô [5].

Nghiên cứu của khoa Vi sinh vật, Đaị học Nihon, Masudo Nhật Bản.Chiết xuất chloroform, etyl acetate và nước các chất kháng khuẩn có nguồn

gốc từ răng miệng Streptococcus spp., Actinomyces spp., Lactobacillus spp.,

Prevotella spp. và Porphyromonas spp. [10].

Định lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học eritadenine trong nấm

Đông cô. Đại học Công nghệ, Thụy Điển [17].

Nghiên cứu của Michael và cộng sự, phân tích thị trường nấm Đông cô

và khảo sát chất lượng nấm được trồng trong những điều kiện khác nhau [15].







10

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN − PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm, thời gian, phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm Đề tài luận văn: “Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm

Đông cô ( Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lậphợp chất từ cao petroleum ether” được thực hiện tại phòng thí nghiệm HóaHữu Cơ – khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ.

3.1.2 Thời gian

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013.

3.1.3 Phương tiện nghiên cứu

3.1.3.1 Dụng cụ Tủ sấy: Dùng để sấy các dụng cụ thí nghiệm như cốc thủy tinh, lọ bi ,….

Máy soi UV: Phương pháp vật lý phát hiện chất trong SKLM. Cân điện tử: Xác định khối lượng các cao và các phân đoạn thu được. Bếp từ.

Cột sắc ký có đường kính 2 cm và 1 cm.

Máy cô quay: Điều chế các cao, cô quay các phân đoạn. Các thiết bị: Cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, bình cầu, ống mao quản,....

3.1.3.2 Hóa chất Các dung môi: Etanol 96

o, petroleum ether 60−90, chloroform, etyl

acetate, n− butanol, aceton để rửa dụng cụ. Các thuốc thử định tính các nhóm chức: Dragendrorff, Mayer, Stiasny,

HCl, NaOH, (CH3COO)2Pb,....

Silica gel 60 (0,04 –0,06 mm), bảng mỏng tráng sẵn.

Dung dich H2SO4 đậm đặc dùng để pha thuốc thử hiện hình.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chiết tách

Nấm Đông cô sau khi mua ngoài thị trường được sắc nhỏ, phơi khô vàxay thành bột. Sau đó sử dụng phương pháp chiết rắn – lỏng, ngâm trongetanol 96

o, thu dịch chiết etanol.

Định tính nhóm chức: Alkaloid, flavonoid, terpenoid − steroid,

glycoside, saponin, tanin trong dịch chiết etanol 96o.







11

Điều chế cao: cao etanol tổng, cao petroleum ether, cao etyl acetate, caon−butanol. Sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng, cô quay thu dung môi.

So sánh các cao điều chế được từ nấm Đông cô tươi, nấm Đông cô khôloại lớn và loại nhỏ.

3.2.2 Phân lập hợp chất hữu cơ

Để có thể phân lập hợp chất thiên nhiên thường sử dụng phương phápsắc ký cột và sử dụng sắc ký lớp mỏng song song sắc ký cột để theo dõi quátrình giải ly. Sắc ký lớp mỏng góp phần nhận định chất tách được đã tinh khiếthay chưa.

Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất phân lập được, ghi phổ 1H− NMR,

phổ 13C− NMR, phổ DEPT− NMR đo tại phòng phân tích cấu trúc Viện Hóa

học, Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc gia, địa chỉ số 18

Hoàng Quốc Việt − Cầu Giấy − Hà Nội.

3.3 Phương pháp chiết tách

3.3.1 Kĩ thuật chiết ngâm dầm (rắn − lỏng)

Ngâm mẫu bột trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không

gỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đều xấp xĩ bề mặt.Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môixuyên thấm vào cấu trúc tế bào và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dungdịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi sẽ cóđược cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa và tiếp tục quátrình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu.

Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xócđều lớp bột hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra

làm dịch chiết bị trào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủvì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dungmôi đến khi đạt mức bão hòa. Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước

bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau.

Trong thực nghiệm, việc chiết rắn − lỏng được áp dụng nhiều, gồm sựngấm kiệt, ngâm dầm, trích với máy chiết soxhlet,… Ngoài ra, còn có chiết

với phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tớihạn, kỹ thuật chiết pha rắn SPE [18-21].







12

Hình 3.1: Kỹ thuật chiết ngâm dầm

3.3.2 Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng Kỹ thuật chiết lỏng − lỏng thường được áp dụng để:

- Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu.

- Phân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từkhông phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính

phân cực khác nhau.

Nguyên tắc: Dung môi không phân cực như: Petroleum ether, hexane,...

sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực: Các alcol béo, ester béo,… Dung

môi phân cực trung bình như: Diethyl ether, chloroform,… sẽ hòa tan tốt các

hợp chất có tính phân cực trung bình chứa nhóm chức ether −O−, aldehyde

−CHO, ketone −CO−, ester −COO−,… Dung môi phân cực mạnh như:

Metanol, butanol, nuớc,… hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnhchứa các nhóm chức −OH, −COOH,….

Việc chiết lỏng − lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcolthô ban đầu được hoà tan vào pha nước. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu

cơ, loại không hòa tan với nước hoặc có thể hỗn hợp được với nước để chiết rakhỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực

của dung môi). Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữucơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước. Việc chiết được thực hiện lần

lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate,

n− butanol,… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiềulần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất

hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn.







13

Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với cácchất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4,… cô quay đuổi dung môi thu

đượ c cao chiết. Để kiểm tra xem các hợ p chất nào đã đượ c chiết vào pha hữu

cơ cũng như các hợ p chất nào còn lại ở trong pha nướ c và chiết bao nhiêu lần

thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký lớ p mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồngthờ i vết của pha nướ c và của pha hữu cơ. Sự chiết bở i một dung môi cụ thể

nào đó đượ c coi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bảng mỏng không còn nhìn

thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ. Cũng có thể

kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm

kính sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kính.

Chiết lỏng − lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độcho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu

trên sẽ có nhiều thay đổi.

Lưu ý: Khi thực hiện kỹ thuật chiết lỏng − lỏng do phải lắc bình lóng

nhiều lần, nên ở những lần chiết sau dung môi trong bình lóng tạo nhủ tương.Để khắc phục nhược điểm này dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch hoặccọ xát vào thành bình, chổ mặt thoáng của dung dịch nhằm xóa bỏ bọt khí ,nhanh chóng phân thành 2 lớp, ngoài ra cũng có thể dùng kỹ thuật chiết pharắn SPE [18-21].

3.4 Sắc ký lớp mỏng (SKLM)3.4.1 Giới thiệu chung

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography (TLC)) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng, trong đó phađộng là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh

là một chất hấp phụ trơ như silica gel hay oxit alumin. Pha tĩnh này được trángthành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm

hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương

pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng.

Muốn thực hiện sắc ký, người ta cho mẫu phân tích hòa tan vào trongmột dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm 1

vết nhỏ gọn lên lớp mỏng. Sấy nhẹ để đuổi phần dung môi hòa tan mẫu, nhưvậy mẫu chỉ còn là dạng bột khô bám trên lớp mỏng. Đặt lớp mỏng theo chiều

thẳng đứng vào trong một bình có dung môi thích hợp, dung môi sẽ bị lực maoquản hút lên phía trên, mẫu chất sẽ được phân chia thành những vết riêng biệt.Các vết sẽ được phát hiện bằng phương pháp vật lý như nhìn bằ ng mắt, soi

dưới đèn tử ngoại hoặc bằng phương pháp hóa học [18-21].







14

Một chất tinh khiết chỉ cho một vết tròn, có giá trị R f không đổi trongmột hệ dung môi xác định. Trị số R f được tính như sau:

Hình 3.2: Cách tính giá trị R f

R f luôn có giá trị nhỏ hơn 1 và thay đổi tùy thuộc vào điều kiện tiến hành: Tính chất của chất hấp phụ. Thành phần của dung môi triển khai. Chiều dày của bảng mỏng. Lượng mẫu chất chấm.

Nhiệt độ. Điều kiện bão hòa khí quyển.

Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm sau:

Thời gian tiến hành nhanh. Lượng mẫu phân tích nhanh. Dụng cụ đơn giản

Hiệu ứng tách tốt hơn so với các phương pháp khác.

Có thể phân tích đồng thời mẫu chất và chất chuẩn trong cùng điều kiện.

3.4.2 Chất hấp phụ silica gel

Trong SKLM, thường dùng các chất hấp phụ: silica gel, Al2O3, cellulose,

Kieselguhr,… Ngoài ra người ta còn trộn thêm chất kết dính hoặc chất chỉ thị phát huỳnh quang. Chất kết dính giúp chất hấp phụ bám tốt vào tấm kính hoặc plastic, làm cho lớp mỏng bền, không bị trầy xước.

Silica gel là chất hấp phụ được sử dụng thông dụng nhất. Silica gel đượcsử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký, chế tạo bằng cách thủy giải natri silicate(cho tác dụng với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưngtụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kíchcỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt,... Ngoài ra người ta còn

bổ sung thêm các hợp chất khác vào silica gel để tăng khả năng tách theo







15

mong muốn. Silica gel thương phẩm nếu có tiếp vị ngữ “G” nghĩa là silica gel

đó có trộn thêm chất kết dính sulfat canxi ngậm nước CaSO4.0,5H2O. Sự hiện

diện của ion canxi hầu như không ảnh hưởng đến quá trình sắc ký.

Si

O

H

O O

O

Si

O

H

O

Si

O

H

O

OSi

O

H

O

O O

Hình 3.3: Cấu trúc mạng silica gel

Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm –Si−OH, đây

là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất đượcsắc ký. Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phâncực (có mang nhóm chức – OH, − NH2, −COOH,...) có khả năng tạo mối

hydrogen mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và giải ly muộn hơn so vớinhững chất khác có tính kém phân cực như alkane, terpene (là những hợp chất

không chứa những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữlại, sẽ ra khỏi cột sớm [18].

3.4.3 Dung môi giải ly

Dung môi triển khai trong SKLM thường là một hỗn hợp có 2, 3 hoặc 4

loại dung môi khác nhau với tỉ lệ thích hợp. Ứng với mỗi loại hợp chất khác

nhau sẽ có hệ dung môi thích hợp.

Nên chọn dung môi có độ tinh khiết cao, hòa tan được mẫu phân tích.Tuy nhiên không khuyến khích dùng dung môi có thể hòa tan tuyệt đối mẫu.Mẫu chất cần phân tích có thể chứa nhiều chất khác nhau, khả năng tách riêngcác chất trong mẫu tùy thuộc vào tỷ lệ phân bố của các chất giữa chất hấp phụ

và dung môi triển khai. Muốn thay đổi khả năng tách, người ta thay đổi thành phần dung môi hoặc thay đổi tỉ lệ giữa các dung môi trong hỗn hợp dung môikhai triển.

Với mẫu chất chưa biết thành phần hợp chất, chưa có tài liệu tham khảo

phải làm một loạt thí nghiệm với các hệ dung môi khác nhau, quan sát các vết, một hệ dung môi triển khai phù hợp khi các vết R f rõ, cách xa và trong giớihạn từ 0,3 đến 0,7. Nếu R f nhỏ hơn 0,3 thì hệ dung môi chưa đủ phân cực, R f

lớn hơn 0,7 thì hệ dung môi quá phân cực [18, 21].







16

3.4.4 Các kỹ thuật SKLM

3.4.4.1 Kỹ thuật SKLM 1 chiều

Dung môi chạy theo một chiều từ đầu dưới bảng mỏng lên đầu trên bảng

mỏng. Lưu ý vết chấm ban đầu trên bảng mỏng không được ngập tr ong dung

môi khi khai triển, mẫu chất sẽ khuyếch tán ngay ra dung môi làm cho các vết bị lem.

3.4.4.2 Kỹ thuật SKLM 2 chiều

Trong trường hợp mẫu phân tích có nhiều cấu tử, kỹ thuật SKLM 1 chiềukhông đủ tin cậy thì tiến hành thêm kỹ thuật SKLM 2 chiều để kết quả táchđược rõ ràng hơn.

Dùng loại bảng 20 20, chấm chất phân tích ở góc bảng cho vào bình sắc

ký chạy hệ dung môi thứ I, quay góc 90o, cho vào bình sắc ký chạy hệ dung

môi thứ II.

Hình 3.4: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 2 chiều

3.4.4.3 Kỹ thuật SKLM điều chế

SKLM điều chế còn được gọi là kỹ thuật sắc ký chế hóa, thường để tách

các chất với lượng nhỏ, có R f xa nhau.

Dùng kỹ thuật SKLM 1 chiều, bảng mỏng có kích thước 20 × 20 cm, độdày chất hấp phụ từ 0,5−1 mm.

Hỗn hợp cần tách được chấm thành 1 đường liên tục trên bảng mỏng.Sau đó triển khai bằng hệ dung môi thích hợp. Trường hợp R f các chất tronghỗn hợp gần nhau, có thể tiến hành khai triển nhiều lần, mỗi lần phải sấy khô

bảng mỏng.







17

Phát hiện các vết bằng cách soi dưới đèn tử ngoại hoặc phun thuốc thửlên mé của bảng mỏng, tránh phun 1 vùng quá rộng vì thuốc thử có thể làm

biến đổi cấu trúc của cấu tử cần tách để tạo phản ứng màu.

Đánh dấu vùng muốn tách mẫu, cạo riêng từng vùng.

Dùng dung môi thích hợp (có thể dùng dung môi khai triển) để lấy riêngmẫu chất ra khỏi chất hấp phụ, quá trình này gọi là phản hấp phụ [21].

Hình 3.5: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế

3.4.5 Ứng dụng của SKLM

Kỹ thuật sắc SKLM hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngànhhóa hữu cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên.

-

Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách, cô lập được.

-

K iểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay không. - Tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát.

- Chuẩn bị cho việc sắc ký cột. - Theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp hữu cơ. - Kiểm tra một hợp chất có kém bền. - Cô lập hợp chất (SKLM điều chế).

3.5 Sắc ký cột

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong mộthỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.

Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha cố định đượcnhồi trong 1 ống hình trụ bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ được gọi là “cột”.Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà quá trình tách trong cộtsẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân

bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion). Ở đây chỉ trình bày sắc ký cộthấp phụ [18-21].







18

3.5.1 Nguyên tắc

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là“cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò

pha động chảy qua chất hấp phụ.

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ vàkhả năng hòa tan của chất đó đối với dung môi rửa cột mà được lấy ra lần lượttrước hoặc sau.

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thườ ng dùng là oxid nhôm, silica gel,

CaCO3 , than hoạt tính, polyamid,… Silica gel là pha tĩnh được dùng rộng rãinhất để tách các hợp chất thiên nhiên.

Dung môi dùng trong sắc ký cột có thể là từng loại riêng biệt hoặc hỗnhợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp. Với các chất hấp phụ cổ điển, dung

môi sử dụng có độ phân cực tăng dần.

Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có nútmài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường được bán sẵn trên thịtrường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ. Hoặc cột cũng có thể tự lắp bằng một

ống thủy tinh thường, đầu dưới nhỏ được nối với một ống cao su, dùng khóakim loại để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi. Việc lựa chọn kích thước cột

rất quan trọng. Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thìsự tách càng tốt.

3.5.2 Kỹ thuật triển khai

3.5.2.1 Chuẩn bị cột - Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô. - Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch).

- Kẹp cột thẳng đứng trên giá.

Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ởmỗi điểm trong cột và tạo thành một khối đồng nhất.

Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột.

Trọng lượng chất phân tích

Trọng lượng chất hấp phụ

Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi,thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,….

Có 2 cách nhồi cột: Nhồi cột ướt và nhồi cột khô.

Tỷ lệ =







19

Nhồi cột ướt : Dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình nhưsilica gel, sephadex,… phải ngâm trong dung môi một thời gian trước khi cho

vào cột để tránh làm nứt cột. Lắc và trộn đều bột hấp phụ với dung môi thànhmột hỗn hợp dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột.

Dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ trong cộtvà cũng không nên quá lỏng để rót nhiều lần vào cột. Chú ý trong quá trìnhnhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều ra bình hứng và không được để khôdung môi trong cột. Sau khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, dung môi vẫntiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng thời gian nữa để cột hoàn tòan ổnđịnh. Giữ cho mặt thoáng trên cột phẳng, tránh làm xáo trộn bề mặt silica gel.

Nhồi cột khô: Dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nởnhư Al2O3, CaCO3,... Chất hấp phụ được nhồi từ từ vào cột ở dạng khô bởi

một phểu có cuống dài. Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và đềuxung quanh cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều. Khi chất hấp

phụ được cho hết vào cột, rót dung môi vào và cho chảy liên tục một thời gianđể cột được ổn định và không được để khô dung môi trong cột.

3.5.2.2 Đưa chất phân tích vào cột

Chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đềutrên mặt thoáng phẳng. Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:

Cho trực tiếp dung dịch mẫu lên cột : Hòa tan chất cần phân tích vào mộtlượng vừa đủ dung môi (càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo hòa tan hoàntoàn. Dung dịch mẫu có nồng độ đậm đặc mới nằm thành một lớp mỏng trênđầu cột. Cột đã ổn định được tháo dung môi cho đến khi mặt thoáng gần sát bềmặt chất hấp phụ thì khóa vòi lại. Dùng ống hút , hút dung dịch đậm đặc chấtcần phân tích chảy dọc thành cột. Mở khóa bên dưới cho dịch mẫu ngấm vàocột (không được để chất hấp phụ ở đầu cột bị khô). Khi toàn bộ lớp dung dịchmẫu đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy một ít dung môi rửa thành cột, cho

dung môi ngấm hết vào cột. Tiếp đến là cho dung môi để bắt đầu tiến hànhquá trình giải ly.

Trộn với một lượng chất hấp phụ: Trộn dung dịch cần phân tích với mộtlượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, sấy khô dung môi rồi cho vào cột bằng cáchtrải thành một lớp đều trên mặt cột.







20

Nhận xét: Trong 2 cách trên, cách cho trực tiếp dung dịch mẫu lên cột làgọn và nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yếu tố sau:

- Chất phân tích hoà tan hoàn toàn.

- Dung dịch chất phân tích phải nạp vào cột đều. -

Khi toàn chất phân tích đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi. - Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột. Nếu mẫu chất

ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày đều nhau chứng tỏ kỹthuật được đảm bảo.

3.5.3 Quá trình giải ly cột

Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể

tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén.

Rửa cột bằng áp suất thường : Dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực. Cộtáp suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ cókích thước hạt lớn.

Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogenhoặc không khí) vào đầu cột. Tốc độ dòng khí có thể được kiểm soát nhờ vàomột van điều chỉnh. Cột dùng với áp suất nén phải có nút bảo đảm kín ở miệng

và có khóa hoặc dây buộc chặt vào miệng cột.

Việc lựa chọn các phương pháp giải ly cột khác nhau tùy thuộc vào việcsử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung

môi ra khỏi cột. Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còntùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly.

Ở sắc ký cột cổ điển, người ta thường hay dùng dung môi tinh khiết cóđộ phân cực tăng dần để rửa cột. Tạp chất có trong dung môi thường làm thay

đổi độ phân cực của dung môi sử dụng, do vậy người ta thường chưng cấtdung môi trước khi sử dụng.

Hiện nay trên thị trường có bán loại silica gel đảo pha. Khi sử dụng silica

gel này làm pha tĩnh, thì pha tĩnh có tính hấp phụ tỉ lệ với tính thân dầu của

hợp chất được sắc ký. Cho nên, pha động sử dụng thường là nước hoặc cáchỗn hợp dung môi có chứa nước. Như vậy các thành phần phân cực trong hỗn

hợp chất cần sắc ký sẽ được giải ly ra trước, thành phần không phân cực sẽ rasau. Phương pháp này được ứng dụng rất hiệu quả đối với các hợp chất có độ

phân cực mạnh trong thực vật như saponin.

Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng

cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột







21

ngột sẽ làm gãy cột. Nguyên nhân do các chất hấp phụ như Al2O3 hoặc silica

gel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt, nhiệt

này làm cho dung môi bốc hơi cục bộ, hơi sinh ra tạo nên bọt khí làm nứt gãycột, hiệu quả tách sẽ không tốt.

Vận tốc chảy của dung môi rửa cột phải được điều chỉnh cho phù hợp;không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp phụ) cũng không

được quá chậm hoặc cho dừng lại một thời gian dài vì sẽ làm cho chất tan bịkhuếch tán, ảnh hưởng đến hiệu quả tách.

Tốc độ di chuyển của một chất trên mặt hấp phụ phụ thuộc vào dungmôi. Trên thực tế, nhiều khi dùng những dung môi đơn thuần không tách được

nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi .

Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột cóthể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiênnhiên không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cộtthường bằng phương pháp SKLM.

Thường trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu thamkhảo để chọn chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệdung môi tách tốt nhất. Khi chọn được chất hấp phụ và hệ dung môi thích hợp,việc ấn định thể tích của mỗi phân đoạn hứng hay thể tích của mỗi loại dung

môi giải ly tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành.







22

Chương 4: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xử lý nguyên liệu và định tính các nhóm chức

4.1.1 Xử lý nguyên liệu Ba mẫu nấm Đông cô (Lentinula edodes) tươi, khô loại lớn và khô loại

nhỏ mua tại siêu thị Metro ngày 14/8/2013, đóng gói dạng bịt nilon 200 g.

Được cắt nhỏ, phơi khô đến khối lượng không đổi và xay thành bột.

Hình 4.1: Nấm Đông cô tươi, khô loại lớn và khô loại nhỏ

Xác định độ ẩm của 3 loại nấm trên trong cùng điều kiện thu được kếtquả như sau:

Bảng 4.1: Bảng xác định độ ẩm

Mẫu nấm Khối lượng ban đầu Khối lượng sau sấy Độ ẩm

Nấm tươi (N1) 778 g 135 g 82,6%

Nấm khô lớn (N2) 190 g 178 g 6,3%

Nấm khô nhỏ (N3) 197 g 182 g 7,6%

4.1.2 Định tính các nhóm chức

4.1.2.1 Định tính alkaloid

Định tính bằng thuốc thử Dragendrorff Công thức: Dung dịch A: 8,0 g Bi(NO3)3.H2O + 25 mL HNO3 30%.

Dung dịch B: 28 g KI + 1 mL HCl 6 N + 5 mL nước cất.

Hỗn hợp hai dung dịch A và B, để yên trong tủ lạnh ở 5 °C cho tủa màu

sậm và tan trở lại, sau đó lọc và thêm nước cất cho vừa đủ 100 mL thu được

thuốc thử Dragendorff.

Dấu hiệu nhận biết: Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịchacid loãng có chứa alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.







23

Hình 4.2: Định tính alkaloid với thuốc thử Dragendrorff

Nhận xét: Cả 3 mẫu nấm đều có kết tủa màu cam, phản ứng dương tính.

Định tính bằng thuốc thử Mayer Công thức: Dung dịch A: 1,36 g HgCl2 + 60 mL nước cất.

Dung dịch B: 5 g KI + 10 mL nước cất.

Trộn dung dịch A và B, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, thu được thuốcthử Mayer.

Dấu hiệu nhận biết: Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acidloãng có chứa alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.

Hình 4.3: Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer

Nhận xét: Có kết tủa màu trắng cả 3 mẫu nấm, phản ứng dương tính.

Kết luận: Trong dịch chiết etanol có chứa alkaloid.

4.1.2.2 Định tính flavonoid

Công thức: Thuốc thử chì acetate (CH3COO)2Pb có tính kiềm, được pha

bão hòa trong nước.

Dấu hiệu nhận biết: Nhỏ dung dịch (CH3COO)2Pb vào ống nghiệm códịch chứa flavol/etanol sẽ xuất hiện kết tủa keo màu trắng xanh. Thêm Na2SO4

vào ống nghiệm sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng của PbSO4 lắng xuống đáy cònkết tủa trắng xanh vẫn lơ lửng trong ống nghiệm.

N1 N2 N3







24

Hình 4.4: Định tính flavonoid

Nhận xét: Có kết tủa trắng xanh, phản ứng dương tính.

Kết luận: Có flavonoid trong dịch chiết.

4.1.2.3 Định tính steroid

Công thức: Hòa tan 1 – 2 mg mẫu thử trong 1 mL chloroform và nhỏthêm 1 mL H2SO4 đậm đặc.

Dấu hiệu nhận biết: Phản ứng dương tính khi dung dịch đổi màu thành

đỏ đậm, xanh, xanh − tím.

Hình 4.5: Định tính steroid

Nhận xét: Dung dịch chuyển sang màu xanh, phản ứng dương tính.

Kết luận: Trong dịch chiết etanol có chứa steroid.

4.1.2.4 Định tính saponin

Thực hiện:

Ống nghiệm 1: 5 mL dung dich NaOH 0,1 N (pH = 13) + thêm 3 giọt

dung dịch alcol chứa mẫu thử. Ống nghiệm 2: 5 mL dung dịch HCl 0,1 N (pH = 1) + thêm 3 giọt dung

dịch alcol chứa mẫu thử.

Bịt miệng 2 ống nghiệm, lắc mạnh, để yên 15 phút và quan sát cột bọt

trong 2 ống nghiệm.

Dấu hiệu nhận biết: Có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin.

Nhận xét: Cột bọt không bền ở cả 3 mẫu nấm.

Kết luận: Không có saponin trong dịch chiết ban đầu.

So sánh N1 N2 N3







25

4.1.2.5 Định tính đường khử Công thức: Felling A: CuSO4.

Felling B: Kali natri tartrat.

Cho vào ống nghiệm vài giọt Felling A, vài giọt Felling B theo tỉ lệ 1 : 1,

lắc, xuất hiện màu xanh thẫm, thêm dung dịch mẫu thử rồi đem đun cách thủy.

Dấu hiệu nhận biết: Nếu có đường khử sau một thời gian đun sẽ xuấthiện kết tủa màu đỏ gạch.

Hình 4.6: Định tính đuờng khử

Nhận xét: Sau khi đun ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch.

Kết luận: Có đường khử trong dịch chiết của cả 3 mẫu.

4.1.2.6 Định tính tanin

Thuốc thử Stiasny

Công thức: 20 mL formol 36% + 10 mL HCl đậm đặc.

Dấu hiệu nhận biết: Có trầm hiện màu đỏ.

Nhận xét: Không có hiện tượng, phản ứng âm tính.

Kết luận: Không có tanin trong mẫu thử.

Từ những kết quả trên, tổng kết sự hiện diện các nhóm chức có trongdịch chiết ban đầu như sau: Có sự hiện diện của các alkaloid, flavonoid,

terpene – steroid, glycoside, không có sự hiện diện của saponin và tanin.

Bảng 4.2: Kết quả định tính một số nhóm chức

Nhóm

chức

Thuốc thử Hiện tượng N1 N2 N3

Alkaloid Dragendrorff K ết tủa cam − nâu + + +

Mayer K ết tủa trắng + + +

Flavonoid (CH3COO)2Pb Kết tủa trắng xanh + + +

Steroid Salkowski Dung dịch màu xanh + + +

Glycoside Felling A, B Kết tủa đỏ gạch + + +

Saponin Độ ổn định bọt Cột bọt không bền − − −

Tanin Stiasny Không có trầm hiện đỏ − − −







26

4.2 Điều chế các loại cao 4.2.1 Điều chế cao etanol tổng (EtOH)

Cân chính xác k hối lượng bột như nhau 3 loại nấm là 135 g và ngâm dầmvới etanol 96o. Cô quay thu hồi dung môi, cân và xác định hiệu suất thu cao.

Bảng 4.3: Khối lượng cao tổng và hiệu suất thu cao tổng

Nấm tươi Nấm khô lớn Nấm khô nhỏ

Bột ngâm (g) 135 135 135

Cao EtOH (g) 54,78 43,69 48,33

Hiệu suất (%) 40,58 32,36 35,8

4.2.2 Điều chế cao thành phần

4.2.2.1 Điều chế cao petroleum ether (PE)

Từ cao etanol tổng, pha với nước cất và chiết lỏng − lỏng với petroleum

ether (trích bằng bình lóng nhiều lần thu lớp dung dịch ở phần trên cho tới khinhỏ một giọt trên tấm kính sạch thấy không còn để lại vết thì ngưng).

Cô quay thu hồi dung môi và tính hiệu suất thu cao PE.

Bảng 4.4: Khối lượng cao PE và hiệu suất thu cao


Cao PE (g) 2,6039 1,5023 4,6248

Hiệu suất thu cao (%) 4,75 3,44 9,57

4.2.2.2 Điều chế cao ethyl acetate (Cao Ea)

Phần dung dịch lớp dưới sau khi được trích với ether dầu hỏa tiếp tụcchiết lỏng – lỏng với etyl acetate (trích bằng bình lóng nhiều lần, thu lớp trêncho tới khi nhỏ một giọt trên tấm kính sạch bay hơi hết dung môi không cònđể lại vết).

Cô quay thu hồi dung môi, cân khối lượng và tính hiệu suất thu cao.

Bảng

4.5: Khối lượng cao Ea và hiệu suất thu cao


Cao Ea (g) 0,45 0,45 0,4

Hiệu suất thu cao (%) 0,82 1,03 0,83

4.2.2.3 Điều chế cao n −butanol (Cao n −BuOH)

Phần dung dich lớp dưới sau khi chiết với etyl acetate tiếp tục được chiếtlỏng – lỏng với n− butanol (tương tự trích nhiều lần với bình lóng và lấy lớp

dung dịch ở trên).







27

Cô quay, thu hồi dung môi và xác định hiệu suất thu cao.

Bảng 4.6: Khối lượng cao n−butanol và hiệu suất thu cao


Cao n−BuOH (g) 20,9 10,06 5

Hiệu suất thu cao (%) 38,15 23,03 10,35

Hình 4.7: Sơ đồ tổng quát quá trình điều chế các loại cao

Bột nấm

135 g

- Chiết lỏng – lỏng vớin− butanol, lấy lớp trên

-

Cô quay, thu hồi dung môi

Cao etanol

tổng

Lớp dưới Cao PE

Phần dịchnước

Cao Ea

Cao

n−BuOH

Lớp dưới

- Ngâm trong etanol 96o

- Cô quay, thu hồi dung môi

- Chiết lỏng – lỏng với PE, lấy lớp trên


- Chiết lỏng – lỏng với Ea, lấy lớp trên








28

4.2.3 So sánh khối lượ ng cao

Từ những kết quả tr ên nhận thấy hiệu suất thu cao tổng đối với nấm tươilớn nhất, tiếp theo là nấm khô nhỏ cuối cùng là nấm khô lớn.

Cao petroleum ether thường chứa các hydrocacbon béo và thơm (alkane

mạch dài, triglyceride, alcol béo, ester béo, acid béo,…), terpene, sterol,…Khảo sát nhận thấy nấm khô nhỏ có khối lượng cao PE lớn nhất, nấm tươi thứhai, cuối cùng là nấm khô lớn.

Cao etyl acetate thường chứa các aglygon do hợp chất glycoside bị thủygiải, monoglycoside, một số loại alkaloid loại bazo yếu,… Khảo sát nhận thấykhối lượng cao etyl acetate của 3 loại nấm là như nhau.

Cao n− butanol chứa alkaloid ở dạng muối tứ cấp kết hợp acid hữu cơ,muối amin, các hydrocacbon có trọng lượng phân tử nhỏ monosaccharide,

oligosaccharide, một số polysaccharide, protein, muối vô cơ,… Khảo sát 3 loạinấm nhận thấy khối lượng cao n−butanol ở nấm tươi là cao nhất, tiếp theo là

nấm khô lớn, nấm khô nhỏ [18].

Bảng 4.7: Bảng tổng kết khối lượng các cao thu được


Bột ngâm (g) 135 135 135

Cao tổng EtOH (g) 54,7813 43,69 48,33Cao PE (g) 2,6039 1,5023 4,6248

Cao Ea (g) 0,45 0,45 0,4

Cao n−BuOH (g) 20,9 10,06 5

4.3 Phân lập hợp chất có trong cao PE

4.3.1 Quá trình phân lập chất trên cao PE

Cao PE của nấm tươi được điều chế từ cao tổng etanol trong quá trình

chiết lỏng − lỏng với petroleum ether. Tiến hành sắc ký cột với cao PE, dung môi khởi đầu giải ly PE 100%,

sau đó tăng dần PE : Ea theo tỷ lệ sau 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3, 6 : 4, 5 : 5, 4 : 6, 3 : 7,

2 : 8, 1 : 9, Ea.

Đường kính và chiều dài cột: d = 2 cm, l = 40 cm.

Khối lượng mẫu: 2 g.

Khối lượng silica gel: 50 g.







29

Nạp silica gel dưới dạng ướt, nạp mẫu dạng dung dịch. Sau khi nạp mẫuhứng thể tích mỗi lọ 10 ml, tiến hành SKLM đồng thời để theo dõi quá trình

giải ly. Gom những phân đoạn giống nhau. Thuốc thử hiện hình H2SO4 10%.

Bảng 4.8: Kết quả sắc ký cột cao PE nấm tươi

Phân đoạn Kết quả SKLM Hệ SKLM Khối lượ ng (g)

I 1 vết vàng, 1 vết nâu, 1 vết xanh PE : Ea

8 : 2

0,519

II 1 vết nâu, 1 vết xanh PE : Ea

8 : 2

0,412

III 2 vết R f gần nhau PE : Ea

6 : 4

0,020

IV 1 vết dơ PE : Ea

6 : 4

0,035

V 2 vết mờ màu vàng Ea 0,086

Tổng khối lượng các phân đoạn của cao PE: 1,072 g

Thu suất quá trình sắc ký cột cao PE: %6,53100.2

072,1 H

Nhận xét: Qua trình tách sắc ký trên cao PE thu được 5 phân đoạn. Trongđó phân đoạn I các vết tương đối rõ, có khối lượng tương đối nhiều hơn các

phân đoạn khác nên tiếp tục sắc ký lần 2 với phân đoạn I.

4.3.2 Quá trình phân lập chất trên phân đoạn I cao PE

Phân đoạn I có khối lượng m = 0,519 g, có 3 vết rõ: 1 vết màu vàng, 1

vết màu nâu và 1 vết màu xanh. Sắc ký cột lần 2 với mong muốn phân lậpđược chất tinh khiết.

Đường kính và chiều dài cột: d = 1 cm, l = 45 cm.

Khối lượng silica gel: 10 g.

Dung môi khởi đầu là PE, tăng dần PE : Ea theo tỷ lệ 99 : 1, 98 : 2, 97 :

3, 96 : 4, 95 : 5, 94 : 6, 93 : 7, 92 : 8, 91 : 9, 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3. SKLM với hệdung PE : EA = 8 : 2 gom chung phân đoạn giống nhau.

Bảng 4.9: Kết quả sắc ký cột phân đoạn I

Phân đoạn Kết quả SKLM Dạng chất Khối lượng (g)

I1 1 vết còn lẫn tạp Sáp có màu xanh 0,026

I2 Vết tạp Sáp màu vàng 0,029

I3 2 vết dơ Tinh thể trắng 0,093

I4 1 vết nâu Tinh thể trắng 0,109

I5 1 vết xanh Tinh thể trắng 0,138







30

Khối lượng tổng cộng các phân đoạn I: 0,395 g.

Thu suất quá trình sắc ký cột cao PE: %1,76100.519,0

395,0 H .

Hình 4.8: SKLM phân đoạn I, I4 và I5

Phân đoạn I4

Sau k hi sắc ký lần 2 được phân đoạn I4 chất dạng timh thể màu trắng

tương đối sạch. SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau được vết gọn và khônglẫn tạp, tạm gọi chất này là PHUOC_NS1, tôi quyết định chọn gửi phổ.

Hình 4.9: SKLM hợp chấtPHUOC_NS1 với 3 hệ dung

môi khác nhau

Phân đoạn I5:

Sau khi sắc ký lần 2 được phân đoạn I5, chất dạng tinh thể màu trắngtương đối sạch. Khảo sát với 3 hệ dung môi khác nhau thu được vết gọn,

không lẫn tạp chất. Không có hoạt tính UV ở bước sóng 254 nm và 356 nm.

Tạm gọi là PHUOC_NS2 và gửi phổ chất này.

Ba hệ dung môi: Bảng 1: PE : C = 1 : 1

Bảng 2: DC

Bảng 3: C : Me = 95 : 5







31

Hình 4.10: SKLM hợp chấtPHUOC_NS2 với 3 hệ dung

môi khác nhau

4.3.3 Biện luận cấu trúc hợp chất vừa phân lập

4.3.3.1 Hợp chất PHUOC_NS1

Các tín hiệu vùng từ trường thấp δ ppm 5,38 (1H, m, H6); 5,57 (1H, m,

H7); tín hiệu δ ppm ở 5,18 (1H, dd, J = 15,2 Hz; J = 8 Hz, H22); 5,22 (1H, dd,

J = 15,2 Hz; J = 8 Hz, H23); tín hiệu δ ppm 3,63 (1H, m, H3).

Các tín hiệu ở vùng từ trường cao δ ppm 0,79 (3H, s, H18); 0,94 (1H, s,

H19); 1,04 (3H, d, J = 7 Hz, H21); 0,83 (3H, d, J = 7 Hz, H26); 0,84 (3H, d, J

= 7 Hz, H27); 0,92 (3H, d, J = 7 Hz, H28).

Từ những tín hiệu phổ1

H –NMR kết hợp với một số tài liệu đã được công bố về hợp chất ergosterol có thể kết luận hợp chất PHUOC_NS1 là ergosterol

[14, 22-24].

Sơ lược về hợp chất ergosterol [23]

Hình 4.11: Hợp chất Ergosterol

Tên thường: Ergosterol, ergosta−5,7,22−trien−3β−ol.

Tên IUPAC: ((3S ,9S ,10 R,13 R,14 R,17 R)−17−(2 R,5 R, E )−5,6dimethyl

hept−3−en−2−yl)−10,13−dimethyl−2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17−dodecah

ydro−1 H −cyclopenta[α]phenanthren−3−ol.

Ba hệ dung môi: Bảng1: DC

Bảng 2: DC : Ea = 8 : 2Bảng 3: PE : Ea = 4 : 6

HO

H H







32

Ergosterol công thức phân tử C28H44O, có 1 nhóm –OH tại C3, 2 nối đôigiữa C5 và C6, C7 và C8, 2 nhóm – CH3 tại C10 và C13, có 1 dây hydrocarbon

– C9H17 tại C17. Nhiệt độ nóng chảy 163oC (điều kiện thường).

Dưới tác dụng của tia UV sự chuyển hóa ergosterol thành ergocalciferol

(vitamine D2) do cắt đứt liên kết giữa C9 và C10 trải qua các giai đoạn như sau:

Hình 4.12: Sự chuyển hóa ergosterol

Cơ thể người không tổng hợp được vitamine D2 mà phải bổ sung thôngqua lượng thức ăn hằng ngày. Vitamine D có vai trò quan trọng để duy trì bộ

xương khỏe mạnh và vững chắc. Duy trì sự ổn định canxi và phospho trongmáu. Vitamine D giúp tăng cường hấp thu và đồng hóa canxi lên tới 50– 80%,

cần thiết cho quá trình cốt hóa, hạn chế loãng xương. Chính vì vậy sự thiếu hụtvitamine D là nguyên nhân gây ra bệnh còi xương đối với cơ thể.

4.3.3.2 Hợp chất PHUOC_NS2

Phổ

1

H – NMR nhận thấy hợp chất PHUOC_NS2 trên khung sườn cơ bảncủa ergosterol. Các tín hiệu vùng từ trường cao δ ppm 1,55 (1H, m, H1a) và1,8 (1H, m, H1b); 1,71 (1H, m, H2a) và 1,9 (1H, m, H2b); 1,25 (1H, m, H4a)

và 2,04 (1H, m, H4b); 1,5 (1H, m, H9); 1,39 (1H, m, H11a) và 1,6 (1H, m,

H11b); 1,9 (1H, m, H12a) và 2,2 (1H, m, H12b); 1,54 (1H, m, H14); 1,23 (1H,

m, H15a) và 1,49 (1H, m, H15b); 1,32 (1H, m, H16a) và 1,76 (1H, m, H16b);

1,24 (1H, m, H17); 0,81 (3H, s, H18); 0,88 (3H, s, H19); 2,05 (1H, m, H20);

1,0 (3H, d, J = 7, H21); 1,8 (1H, m, H24); 1,45 (1H, m, H25); 0,84 (3H, d, J =

4,5 Hz, H26); 0,82 (3H, d, J = 4,5 Hz, H27); 0,9 (3H, d, J = 4,5 Hz, H28).

ErgosterolLumisterol

TachisterolErgocalciferol

HO

H H HO

H H

HO

H

HO

H







33

Các tín hiệu ở vùng từ thấp δ ppm 3,9 (1H, m, H3); 6,25 (1H, d, J = 8,5

Hz, H6); 6,5 (1H, d, J = 8,5 Hz, H7); 5,15 (1H, dd, J = 8 Hz; J = 15 Hz, H22);

5,25 (1H, dd, J = 7,5 Hz; J = 15 Hz, H23).

Từ những tín hiệu phổ 1H –NMR kết hợp với phổ chuẩn từ các kết quả đã

được công bố về hợp chất ergosterol peroxide có thể kết luận hợp chấtPHUOC_NS2 là ergosterol peroxide [25-28].

Sơ lược về hợp chất ergosterol peroxide:

Tên thường: Ergosterol peroxide hay (5α,8α−epidioxy−22 E −ergosta−

6,22-dien−3β−ol).

Tên IUPAC: (3S ,5S ,8S ,9 R,10R,13 R,14 R,17 R)−10,13−dimethyl−17−[(1 R,

2 E ,4 R)−1,4,5−trimethylhex−2−en−1−yl]−1,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,

17−dodecahydro−2 H −5,8−epidioxycyclopenta[a]phenanthren−3−ol.

Công thức phân tử C28H44O3, không có hoạt tính UV, nhiệt độ nóng chảy256

oC. Là hợp chất sterol được hình thành do quá trình oxy hóa ergosterol.

Hình 4.13: Hợp chất ergosterol peroxide

Theo các nghiên cứu đã được công bố, hợp chất ergosterol peroxide cóhoạt tính sinh học cao: đặc tính chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn,kháng virus, hạn chế sự phát triển của các tế bào khối u. Đây là hợp chất rất có

ý nghĩa trong nghiên cứu y học [25, 28].

Trong điều kiện có oxi và ánh sáng có sự chuyển đổi từ ergos terol thành

ergosterol peroxide [25-28].

Hình 4.14: Sự chuyển đổi ergosterol thành ergosterol peroxide



http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/05/Ergosterol-5%2C8-peroxide.svg





34

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

5.1.1 K hối lượng các loại cao

Gần 3 tháng thực hiện đề tài: “Khảo sát hàm lượng một số loại cao điềuchế từ nấm Đông cô ( Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và

phân lập hợp chất từ cao petroleum ether” thu được một số kết quả như sau: Trong 3 loại nấm Đông cô được khảo sát hiệu suất thu cao tổng etanol

ở nấm tươi là cao nhất, thứ hai là nấm khô nhỏ và cuối cùng là nấm khô lớn. Cao PE: Nấm khô nhỏ có khối lượng cao lớn nhất, nấm tươi thứ hai,

cuối cùng là nấm khô lớn.

Cao Ea: Khối lượng cao etyl acetate của 3 loại nấm là như nhau.

Cao n−BuOH: Nấm tươi cao nhất, tiếp theo là nấm khô lớn và cuốicùng là nấm khô nhỏ.

5.1.2 Hợp chất phân lập

Sắc ký cột trên cao petroleum ether của nấm Đông cô tươi phân lập đượchợp chất ergosterol và ergosterol peroxide.

5.2 Kiến nghị

Với giới hạn cho phép của đề tài và hạn chế về thời gian nên chưa khảo

sát được tất cả các loại cao cũng như các loại nấm. Đồng thời vẫn chưa thửhoạt tính sinh học của chất phân lập được.

Tiếp tục tiến hành nghiên cứu thành phần các chất trên nhiều loại cao vànhiều loại nấm hơn nữa, thử hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập được củanấm Đông cô.







35

TÀI LIỆU THAM KHẢO ------ -------

[1] Valentina E. Nikitina, Olga M. Tsivileva1, Alexei N. Pankratov and

Nikolai A. Bychkov, 2007. Lentinula edodes biotechnology from letinan to

lectins. Laboratory of Microbiology and Mycology, Institute of Biochemistry

and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of

Sciences, Russia.

[2] Mohammad Ismail Haji Mokhtar, 2000. Potential of fungi used intraditional Chinese medicine: Shiitake ( Lentinula edodes).

[3] Jane Clarke. Mushrooms the new superfood. Mushroom bureau,

Regal House, 70 London Road, Twickenham, Middlesex, TW1 3QS.

[4] Hung, P. V. and Nhi, N. N. Y., 2012. Nutritional composition and

antioxidant capacity of several edible mushrooms grown in the Southern

Vietnam. School of Biotechnology, International University, Vietnam

National University in HoChiMinh City, Quarter 6, Linh Trung Ward, ThuDuc District, HoChiMinh City, Vietnam.

[5] Julita Reguła and Marek Siwulski. Dried shiitake ( Lentinula edodes)

and oyster ( Pleurotus ostreatus) mushrooms as a good source of nutrient.

Agriculture University of Poznan.

[6] S. Andres and N. Baumann, 2012. Chemical composition and

nutritional value of European species of wild growing mushrooms. Deparment

of applied chemistry, faculty of Argiculture, Univesity of south Bohemia.

[7] Filip S. Reis, Lililian Barros, Anabela Martins and Isabel C.F.R

Ferreira. Chemical composition and nutritional value of the most widelyappreciated cultivated mushrooms: An interspecies comparative study.

Instituto Politecnico de Bragança, Campus de Santa Apolonia, Portugal.

[8] Dawn Soo, 2002. The potential of fungi used in traditional Chinese

medicine: shiitake ( Lentinula edodes).

[9] Y. Choi, S.M. Lee, J. Chun, H.B. Lee and J. Lee. Influence of heat

treatment on the antioxidant activities and polyphenolic compounds of

Shiitake ( Lentinus edodes) mushroom. Department of Food Science andTechnology, Research Center for Bioresource and Health, Chungbuk National

University, Korea.

[10] Hirasawa M, Shouji N, Neta T, Fukushima K and Takada K. Threekinds of antibacterial substances from Lentinula edodes. Department of

Microbiology, Nihon University School of Dentistry Matsudo, Chiba, Japan.

[11] Adejumo, T. O. and Awosanya, O. B., 2005. Proximate and mineral

composition of four edible mushroom species from South Western Nigeria.

Dept of Microbiology, Adekunle Ajasin University, P.M.B. 01, Akungba −

Akoko, Ondo State, Nigeria.

[12] Gao Jinming, HuLina and Liu Jikai, 2001. A novel sterol fromChinese truffles tuber indicum. Department of Phytochemisty, Kunming

Institute of Botany, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204,

People’s Republic of China and College of Life Sciences, Northwest Science







36

and Technology University of Agriculture and Forestry, Yangling, Shaanxi

712100, People’s Republic of China. [13] O. Soubias, F. Jolibois, S. Massou, A. Milon and V. Re at, 2005.

Determination of the orientation and dynamics of ergosterol in model

membranes using uniform13

C labeling and dynamically averaged13

C

chemical shift anisotropies as experimental restraints. Universite P. Sabatier,Toulouse, France.

[14] Dan Qian Chen, Jun Min An, Ya Long Feng, Ting Tian, Xiang

Yang Qin and Ying Yong Zhao, 2013. Cloud point extraction combined with

liquid chromatography for the determination of ergosterol, a natural product

with diuretic activity, in rat plasma, urine and faeces. Key laboratory of

resource biology and biotechnology in Western China, ministry of education,

the college of life sciences, Northwest University.

[15] Michael A. Gold, Mihaela M. Cernusca1 and Larry D. Godsey,

2008. A competitive market analysis of the united states shiitake mushroom

market place.

[16] Nghiên cứu đa dạng của các loài nấm Đông cô ( Lentinula edodes) ởSa Pa, Letinula CF. Lateritia ở Langbiang, Đà Lạt và Letinula SP mới tìmthấy ở Cát Tiên, Việt Nam. Sở Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng, trường Đạihọc Đà Lạt và Vườn Quốc gia Cát Tiên, Đồng Nai.

[17] Josefine Enman, Urika Rova and Kris A. Berglund. Quantification

of the bioactive compound eritadenine in selected strains of shiitake

mushroom ( Lentinus edodes). Division of Biochemical and Chemical Process

Engineering, Lulea University of Technology, SE − 97187 Lulea, Sweden.

[18] Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.

[19] ThS. Hoàng Minh Hảo, KS. Nguyễn Bình Kha. Công nghệ táchchiết hợp chất thiên nhiên.

[20] Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008. Bài giảng các phươ ng pháp phân tích

hiện đại, Đại học Cần Thơ. [21] Nguyễn Ngọc Hạnh, 2002. Tách chiết và cô lập hợp chất thiên

nhiên. Giáo trình cao học, viện Hóa học. [22] TS. Lê Thanh Phước. Các phương pháp quang phổ trong hóa hữu

cơ, Giáo trình đại học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần thơ. [23] ThS. Tôn Nữ Liên Hương, 2008. Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên,

Giáo trình đại học, khoa Khoa học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ. [24] Nguyễn Hữu Đĩnh và Trần Thị Đà, 1999. Ứng dụng một số phương

pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử. Nhà xuất bản Bộ giáo dục. [25] Lưu Thị Ngọc Anh, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang và Nguyễn

Công Hào. Nghiên cứu thành phần hóa học của một số cao chiết từ nấm Hầuthủ ( Hericium erinaceum) trồng tại Lâm Đồng. Trường ĐH Cần thơ. Viện CNHóa học. Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh.

[26] Sang Wook Kim, Sang Shin Park, Tae Jin Min and Kook Hyun Yu,

1999. Antioxidant Activity of ergosterol peroxide. Department of Chemistry,Dongguk University, Seoul 100 − 715, Korea.







37

[27] Angel Trigos and Ana Ortega Regules, 2002. Selective destruction

of microscopic fungi through photo oxidation of ergosterol. Mycologia, 94 (4),

pp. 563 − 568. [28] Trương Bích Ngân, 2012. Nghiên cứu thành phần hóa học của một

số loài thực vật có hoạt tính chống lao vườn Quốc gia Cúc Phương. Viện Hóa

học, Hà Nội.







38

PHỤ LỤC

Phụ lục phổ Ergosterol







39







40

a







41

Phụ lục phổ ergosterol peroxide







42







43







Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm Đông cô (Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lập hợp chất

Documents