KALITSALMETABOLİKHASTALIKLARINTANIve İZLEMİNDELABORATUVAR: MOLEKÜLERANALİZLER AsumanGedikbaşı İstanbulÜniversitesiÇocukSağlığı Enstitüsü PediatrikTemelBilimlerADTıbbiGenetikBD Uluslararası LaboratuvarTıbbı ve19.UlusalKlinikBiyokimyaKongresi 25‐28Nisan2019LaBlancheIslandBodrum KalıtsalMetabolikHastalıklar(KMH),GenetikhastalıklarınTEDAVİ EDİLEBİLİRönemlibirgrubu Büyükçoğunluğutekgenhastalıkları,otozomalresesifkalıtım,AKRABAEVLİLİĞİ SIK! Halksağlığını kollektifolaraketkileyen«NADİRHASTALIKLAR» ınönemlibirgrubu Nadirhastalıklar,sıkgörülenhastalıklarınpatofizyolojikmekanizmalarınınanlaşılması,vetedaviiçinhedefmolekülgeliştirilmesiaçısındanönemli! 29ŞUBATKMHSINIFLAMAAra metabolizma bozuklukları Amino asit metabolizması Organik asidüriler Amonyak detoksifikasyonu Yağ asidi ve ketogenez Karbonhidrat metabolizması ve transport Mitokondriyal hastalıklar Kobalamin ve folat metabolizması Amino asit transport Peptid metabolizması Bakır, demir, çinko transport ve kullanım Kompleks moleküllerin sentez ve yıkım bozuklukları Lizozomal depo hastalıkları Peroksizomal hastalıklar Pürin ve pirimidin metabolizması Konjenital glikozilasyon bozuklukları Lipoprotein metabolizması Safra asidi ve bilirubin metabolizması, kalıtsal kolestaz ve porfiriyalar İzoprenoid ve sterol metabolizması Nörotransmitter bozuklukları ve ilişkili hastalıklar Glisin ve serin metabolizması Pterin ve biyojenik aminler metabolizması Gama-aminobütirat metabolizması B6 vitamini metabolizması Kreatin metabolizması Diğer nörometabolik hastalıklar BEAHMETABOLİZMALABORATUVARI (2013‐2015..) 4 Alttayatanbirmetabolikkusurhakkındagüçlü birşüpheolsabile,kliniközelliklerdedeğişkenlikKMH'nınklinik/biyokimyasalfenotipspektrumugeniştirveçoğuzamanspesifikdeğildir,dahasıkgörülendurumları taklitederSemptomlarınbaşlangıcı fetustanerişkinekadarheryaştaortayaçıkabilir. Dahahafifmutasyonları vehafifbiyokimyasalfenotipleriolanhastalar,pozitiftarama sonuçlarını belirlemekiçinkullanılankesmedeğerleriilekaçabilir ÇocuklardaIEM'inhemklinikhemdebiyokimyasalfenotiplerionyıllardırbilinmektedir;tersine,geç başlangıçlı veyaerişkinbaşlangıçlı varyantlarbüyükölçüdetanınamamaktadır. Kesintanı moleküleranaliz, TheAmericanJournalofHumanGenetics104,76–93,January3,2019 MolekülerTanı NedenGerekli;, Gerekliolmayaninvazivtestlerinkesilmesi Efektifolmayanvepotansiyelolarakzararlı tedavilerdenkaçınma Hastalığınseyrisırasındaortayaçıkması muhtemelkomplikasyonlarınıntakipedilebilmesi Hastalığınkaynağınınbilinmesininhastaveailesiüzerindeyarattığı pozitifetki Doğumöncesitanı seçenekleriningündemegelmesi Ailebireylerininerkenevredesaptanması veprognozlarındaiyileşme Olası tedaviseçenekleri
9
Embed
KALITSAL METABOL K HASTALIKLARIN ğığı TANI ZLEM ...tkbd.org/files/Asuman-gedikbaşı.pdfTüm ekzom dizileme Tüm genom dizileme HedefeYönelik PZR+RE Gerçekzamanlı PZR MLPA Moleküler
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
KALITSAL METABOLİK HASTALIKLARIN TANI ve İZLEMİNDE LABORATUVAR:
MOLEKÜLER ANALİZLERAsuman Gedikbaşı
İstanbul Üniversitesi Çocuk Sağlığı Enstitüsü
Pediatrik Temel Bilimler AD Tıbbi Genetik BD
Uluslararası Laboratuvar Tıbbı ve 19. Ulusal Klinik Biyokimya Kongresi25‐28 Nisan 2019 La Blanche Island Bodrum
Kalıtsal Metabolik Hastalıklar (KMH),
Genetik hastalıkların TEDAVİ EDİLEBİLİR önemli bir grubu
Büyük çoğunluğu tek gen hastalıkları, otozomal resesif kalıtım, AKRABA EVLİLİĞİSIK!
Halk sağlığını kollektif olarak etkileyen «NADİR HASTALIKLAR» ın önemli bir grubu
Nadir hastalıklar, sık görülen hastalıkların patofizyolojik mekanizmalarının anlaşılması, ve tedavi için hedef molekül geliştirilmesi açısından önemli !
29 ŞUBAT
KMH SINIFLAMA
Ara metabolizma bozukluklarıAmino asit metabolizması Organik asidüriler Amonyak detoksifikasyonu Yağ asidi ve ketogenezKarbonhidrat metabolizması ve transport Mitokondriyal hastalıklarKobalamin ve folat metabolizması Amino asit transportPeptid metabolizmasıBakır, demir, çinko transport ve kullanım
Kompleks moleküllerin sentez ve yıkım bozuklukları
Lizozomal depo hastalıkları Peroksizomal hastalıklar Pürin ve pirimidin metabolizmasıKonjenital glikozilasyon bozukluklarıLipoprotein metabolizmasıSafra asidi ve bilirubin metabolizması, kalıtsal kolestaz ve porfiriyalarİzoprenoid ve sterol metabolizması
Altta yatan bir metabolik kusur hakkında güçlü bir şüphe olsa bile, klinik özelliklerde değişkenlik
KMH'nın klinik/biyokimyasal fenotip spektrumu geniştir ve çoğu zaman spesifik değildir, daha sık görülen durumları taklit eder
Semptomların başlangıcı fetustan erişkine kadar her yaşta ortaya çıkabilir.
Daha hafif mutasyonları ve hafif biyokimyasal fenotipleri olan hastalar, pozitif taramasonuçlarını belirlemek için kullanılan kesme değerleri ile kaçabilir
Çocuklarda IEM'in hem klinik hem de biyokimyasal fenotipleri on yıllardır bilinmektedir; tersine, geç başlangıçlı veya erişkin başlangıçlı varyantlar büyük ölçüde tanınamamaktadır.
Kesin tanı moleküler analiz,
The American Journal of Human Genetics 104, 76–93, January 3, 2019
Moleküler Tanı Neden Gerekli;,
Gerekli olmayan invaziv testlerin kesilmesi
Efektif olmayan ve potansiyel olarak zararlı tedavilerden kaçınma
Hastalığın seyri sırasında ortaya çıkmasımuhtemel komplikasyonlarının takip edilebilmesi
Hastalığın kaynağının bilinmesinin hasta ve ailesi üzerinde yarattığı pozitif etki Doğum öncesi tanı seçeneklerinin gündeme gelmesi
Aile bireylerinin erken evrede saptanması ve prognozlarında iyileşme
Olası tedavi seçenekleri
1. EVRE. Kalıtımın hücre içindeki temelini ortaya koyan: KROMOZOMLAR
(1909‐1970)
2.evre :Kalıtımın moleküler temelini ortaya
koyan DNA ÇİFTE SARMALI
25 Nisan 1953 – Nature
3. EVRE Kalıtımın bilgisel temelini ortaya koyan ;
genetik kod ve Rekombinant DNA teknolojilerinin
icadı 1977 SANGER ‐ NATURE
4.EVRE İnsan Genomunun dizilenmesi :GENOMBİLİM (GENOMİK)
Genetikte son yüzyılda sağlanan ilerlemeler kabaca 4 çeyreğe denk gelen 4 ana evre;
13 Ağustos 1918 – 19 Kasım 2013 tarihleri arasında yaşamını sürdürmüş olan Nobel Kimya Ödülü’nü iki kez kazanan İngiliz biyokimyacıdır.
1958’de proteinlerin yapısı, özellikle de insülinin kısmi hidrolizi ile aa dizisinin belirlenmesi çalışması ile kimya dalında Nobel ödülü aldı.
DNA polimerazı kullanarak tek iplikli kalıptan yeni DNA zincirleri sentezleyerek dizileyen Sanger, 1980 Nobel Kimya Ödülü’nü aldı.
Frederick Sanger
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kary Banks Mullis, Amerikalı biyokimyacı. Polimeraz zincir tepkimesini keşfinden (1985) ötürü 1993 yılında Michael Smith ile birlikte Nobel Kimya Ödülüne layık görülmüştür
Biyokimyasal genetik testKlinik sorunlara neden olan enzim/enzimlerineksikliğini, stabilite kaybını, aktivite değişimini tanımlar
Gaz Kromatografi / kütle spektrometri(GS/MS)Sıvı kromatografisi (HPLC)Tandem kütle spektrometresi (MS/MS)
Hangi enzimde sorun olduğu saptanırsa, o enzimi kodlayan gendeki mutasyon, moleküler genetik testler ile saptanır.
Biyokimyasal genetik testKlinik sorunlara neden olan enzim/enzimlerineksikliğini, stabilite kaybını, aktivite değişimini tanımlar
Gaz Kromatografi / kütle spektrometri(GS/MS)Sıvı kromatografisi (HPLC)Tandem kütle spektrometresi (MS/MS)
Hangi enzimde sorun olduğu saptanırsa, o enzimi kodlayan gendeki mutasyon, moleküler genetik testler ile saptanır.
Genetik Test Çeşitleri
Sitogenetik testler
Kromozomları inceler
Karyotip analizi
Hedefe yönelik
FISH testi Tek bölge Çoklu bölgeTelomerikSentromerikTüm kromozom
Array • aCGH • mikroarray
Sitogenetik testler
Kromozomları inceler
Karyotip analizi
Hedefe yönelik
FISH testi Tek bölge Çoklu bölgeTelomerikSentromerikTüm kromozom
Array • aCGH • mikroarray
Moleküler genetik testler
Tüm gen inceleme
Tüm gen dizilemeTüm ekzom dizilemeTüm genom dizileme
Hedefe YönelikPZR + REGerçek zamanlı PZRMLPA
Moleküler genetik testler
Tüm gen inceleme
Tüm gen dizilemeTüm ekzom dizilemeTüm genom dizileme
Hedefe YönelikPZR + REGerçek zamanlı PZRMLPA
Genomda 6 milyar nükleotid, çift sarmal yapıda proteinler ile sıkı bir paketlenme ile interfaz kromatinini oluşturur.
10 nm
147 bç
8-114 bç
Hücre çekirdeği içinde DNA İnsan KromozomlarıBir diploid hücrede 23 çift olarak bulunur
22 çift otozom + 1 çift cinsiyet kromozomu
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 XX
Her kromozom üzerinde, kalıtımın fiziksel ve fonksiyonel ünitesini oluşturan binlerce gen bulunur.
İnsan Genom Projesi, 20.000 protein kodlayan gen, 5.000 fonksiyonel RNA bulunduğunu gösterdi.
Genetik Varyasyonlar• Kromozomlardaki bir bölgede (lokus) DNA dizisi bireylerde alternatif
şekillerde bulunabilir (genetik varyasyon), bunlar o genetik dizinin ‘allelik
formları’ olarak adlandırılır.
• DNA’da çok sayıda genetik varyasyon meydana gelmekte (% 0.1’lik yani
yaklaşık 3 milyon bazlık varyasyon), ancak bunların çoğu hastalıklarla ilişkili
olmamaktadır.
• Bir genetik varyasyon için şayet bir allel toplumda % 1’den daha sık
görülüyorsa ‘polimorfizm’ olarak adlandırılırken, görülme sıklığı daha
düşükse ‘nadir allelik varyant’ adını alır.
Genetik Varyasyonlar: Bireyler ve toplumlar arasında DNA dizi veya yapılarındaki değişimler
Mutasyon: Nükleotit dizinse kalıcı bir değişim
Oluşum mekanizmalası
Popülasyona özgüMAF* değerleri
Polimorfizm: nispeten yaygın varyant (MAF> 0.01)
Nadir Varyant: MAF< 0.01Nadir Varyant: MAF< 0.01
- Genellikle nötr- Hastalıkla ilişkili- Genellikle nötr
- Hastalıkla ilişkili
- Genetik hastalıklar- Genetik hastalıklar
- Genellikle önemi
bilinmiyor
- Genellikle önemi
bilinmiyor
?
*Bir popülasyonda bir varyant için en nadir allelinin görülme sıklığı
Kısa Genetik Varyasyonlar Yüksek Genetik Heterojenite
Ataksi için >300 gen
Aynı Varyasyon: Farklı seviyede etkilenmiş bireyler
Ağır fenotip Daha hafif hatta subklinik fenotip
Eksik penetrans
Değişken ekspresivite
Hastalık ilişkili bozukluğun mutasyon tipine,hastalık ilişkili gen/genleresaptanma oranlarına göre karar verilir.
Eğer belli bir hastalık için iki farklıyöntemin rezolüsyonu benzer ise laboratuarın en iyi optimize ettiği ve ucuza mal ettiği yöntem tercih edilir.
Hangi yöntem/lerin kullanılması gerektiğine nasıl karar verilir?
Sanger zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır.
Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’ nın genomik DNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır.
PCR reaksiyonları sonucu elde edilen DNA parçaları, elektroforezde yan yana yürütülür
Otomatik DNA Dizi Reaksiyon Basamakları
• DNA İzolasyonu• PCR• PCR sonrası Pürifikasyon• Cycle Sequencing (floresan işaretli dideoksinükleotidlerin kullanıldığı döngüsel sekanslama reaksiyonuna)
• Pürifikasyon (Alkol Çöktürme)• Pürifikasyon sonrasında örnekler sekans cihazına yüklenir ve cihaz otomatik olarak örnekleri kapillere çeker, yürütür, lazer ışığı altında optik sensör tarafından okur ve okuduğu ham bilgileri bilgisayar programına aktarır