Jurnal Perbandingan Penilaian Sitotoksisitas Dari Enam Tetes Mata Anti-Inflamasi

Perbandingan penilaian sitotoksisitas dari enam tetes mata

anti-inflamasi dalam empat kultur sel permukaan mata,

sebagaimana ditentukan oleh nilai viabilitas sel

Masahiko Ayaki1 Atsuo Iwasawa2 Yoshimi Niwano3

1Department of Ophthalmology, International University of Health and Welfare, Mita Hospital, Tokyo, 2Department of Bioengineering, Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology, Yokohama, 3Laboratory for Redox Regulation, Tohoku University Graduate School of Dentistry, Sendai, Japan

ABSTRAK

Tujuan: tetes mata anti-inflamasi sering digunakan dalam pengobatan gangguan korneal epitelial.

Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi toksisitas dari enam tetes mata anti-inflamasi dalam

empat kultur sel permukaan mata.

Metode: Toksisitas dari enam solusi optalmik anti-inflamasi yang tersedia secara komersial

(diclofenac, bromfenac, pranoprofen, betametason dan fluoromethason) telah dilakukan penilaian

pada tiga baris sel korneal dan sau baris sel konjungtival. Viabilitas sel ditentukan oleh 3 - (4,5-

dimetil-2 thiazoyl) -2,5-difenil-2H-tetrazolium bromide dan neutral red assays setelah mengekspos

sel untuk 10, 30, dan 60 menit dari satu kali lipat, ganda, dan sepuluh kali lipat pengenceran obat.

Sitotoksisitas dibandingkan dengan menggunakan cell viability score (CVS), parameter sitotoksik

terpadu yang mengambil berbagai faktor, seperti pengenceran oleh cairan air mata atau konsentrasi

dengan penguapan, waktu paparan obat, dan jenis permukaan sel mata.

Hasil: Berdasarkan skor CVS, urutan anti-inflamasi tetes mata diuji dari rendah ke tinggi

sitotoksik, dengan % bahan aktif CVS50, dan CVS40/80% untuk setiap solusi yang diberikan dalam

kurung, adalah sebagai berikut: Rinderon® (betametason, 100 %, 100%) >0.02% Flumethoron®

(fluoromethorone, 68%, 22%) = 0,1% Flumethoron® (fluoromethorone, 76%, 22%) > Bronuck®

(0.1% bromfenac, 53%, -8%) = Diclod® (0.1% diklofenak, 44%, -15%) = Niflan® (pranoprofen,

50%, -19%). Rinderon® memperlihatkan toksisitas paling rendah dari semua tetes mata anti-

inflamasi yang diuji. Obat tetes mata yang mengandung non-steroid anti-inflammatory

memperlihatkan sitotoksisitas yang lebih besar dari pada yang mengandung steroid dengan

benzalkonium pada konsentrasi sebanding. Konsentrasi adalah faktor paling signifikan yang

mempengaruhi kelangsungan hidup sel.

Kesimpulan: Sitotoksisitas tetes mata anti-inflamasi dievaluasi dalam penelitian ini tergantung

pada kedua komponen farmasi dan bahan pengawet. CVS adalah indikator singkat dari

sitotoksisitas obat.

1

Kata kunci: benzalkonium klorida, toksisitas, kornea, sel skor viabilitas, obat anti-inflamasi

PENDAHULUAN

Tetes mata anti-inflamasi secara rutin digunakan pasca operasi, serta untuk

mengobati penyakit peradangan pada mata. Sebuah studi sebelumnya memeriksa

sitotoksisitas setelah 48 jam paparan dari jalur sel mata untuk tetes mata anti-inflamasi di

hadapan media kultur menunjukkan bahwa obat tetes mata yang mengandung

benzalkonium klorida (BAK) menunjukan cukup sitotoksisitas.1

Namun, paparan obat tetes mata periode 48-jam bukanlah refleksi akurat dari

situasi aktual di mana obat tetes mata umumnya diterapkan beberapa kali sehari. Selain

itu, permukaan sel-sel mata pasien bersentuhan langsung dengan formulasi tetes mata.

Dengan demikian, untuk mencerminkan situasi yang sebenarnya, kami telah mencoba

untuk meningkatkan tes sitotoksisitas untuk sel-sel mata.2-6 Dalam studi ini, sel-sel

permukaan mata mengalami kontak langsung dengan formulasi obat tanpa adanya media

kultur. Berdasarkan penelitian kami, kami mengusulkan penggunaan cell viability

score(CVS) sebagai parameter sederhana untuk mengekspresikan potensi sitotoksik obat

tetes mata.

Awalnya, kita mendefinisikan CVS50 sebagai jumlah baris sel dengan viabilitas

% ≥ 50 di hadapan sepuluh kali lipat pengenceran obat (misalnya, ketika empat baris sel

yang digunakan, nilai harus 0, 1, 2, 3, atau 4 ) .1 Namun, dalam studi terbaru kami telah

meningkatkan CVS sehingga CVS50 kini didefinisikan sebagai jumlah pengukuran

menunjukkan viabilitas sel% ≥ 50 dan dinyatakan sebagai persentase atas kisaran 0% -

100% .2,3 Menggunakan metode yang ditingkatkan tersebut, jumlah pengukuran adalah

72 (tiga konsentrasi, tiga kali paparan, empat baris sel, dan dua tes) .2,3 Karena obat tetes

mata dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, seperti pengenceran oleh cairan lakrimal atau

konsentrasi oleh hilangnya kelembaban, dan karena dapat bersentuhan dengan jenis sel

yang berbeda (misalnya, sel-sel epitel kornea dan konjungtiva) pada permukaan kornea

untuk jumlah dan waktu yang bervariasi, sitotoksisitas obat tetes mata perlu dievaluasi

secara komprehensif. Dengan demikian, CVS telah dimodifikasi berdasarkan jumlah

pengukuran sitotoksisitas dalam segala situasi, dengan perhitungan konsentrasi, waktu

pemaparan, dan jenis sel.

2

Sitotoksisitas tetes mata merupakan isu kontroversial karena sekali tetes mata

yang diterapkan pada permukaan mata, konsentrasi dan penetrasi obat dapat berubah

sangat cepat. Oleh karena itu, dalam penelitian ini kami mengevaluasi ulang sitotoksisitas

tetes mata anti-inflamasi dengan melakukan penyelidikan komprehensif yang mencakup

berbagai konsentrasi dan waktu pengobatan berdasarkan sistem CVS yang dimodifikasi.

METODE DAN MATERI

Enam tetes mata anti-inflamasi tersedia secara komersial yang diuji dalam

penelitian ini. Nama dagang, komponen aktif, komponen inaktif (pengawet), dan produsen

tercantum dalam Tabel 1. Struktur kimia dari komponen aktif telah diterbitkan di mana

pun.4

Metode untuk kultur sel, alat tes sitotoksisitas, dan evaluasi data yang telah

dijelaskan secara rinci .2 Singkatnya, digunakan baris sel berikut yang tersedia secara

komersial: SIRC (epitel kornea kelinci, ATCC CCL-60, Koleksi Tipe Kultur Amerika

[ATCC] , Manassas, VA), BCE C/D-1b (sel epitel kornea bovine, JCRB-9129, Bank

Penelitian Ilmu Kesehatan dan Sumber Daya, Osaka, Jepang), RC-1 (epitel kornea kelinci,

JCRB-0246, Penelitian Ilmu Kesehatan dan Sumber Daya), dan Chang konjungtiva (sel

konjungtiva manusia, ATCC CCL-20.2, ATCC). Setelah sel telah mencapai titik temu,

media kultur diganti dengan larutan murni atau dua kali lipat dan sepuluh kali lipat

pengenceran larutan uji yang berbeda, dan sel monolayers diinkubasi dengan adanya

solusi ini untuk 10, 30 atau 60 menit.

Garam fisiologis steril digunakan sebagai pengencer untuk setiap tetes mata, dan

itu menegaskan bahwa paparan dari setiap baris sel untuk garam selama 60 menit tidak

berpengaruh signifikan terhadap kelangsungan hidup sel dibandingkan dengan kontrol

yang sesuai. Setelah 10, 30, atau 60 menit inkubasi, solusi oftalmik diganti dengan

medium kultur segar dan sel-sel diinkubasi selama 48 jam lebih. Viabilitas sel diukur

dengan menggunakan 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-il) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide

(MTT, Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO) dan neutral red assay(NR, Wako Pure Chemical

Industries , Osaka, Jepang). Viabilitas sel dalam larutan uji dihitung sebagai persentase

viabilitas kontrol sel dalam medium saja. Percobaan diulang delapan kali, dan hasilnya

disajikan sebagai mean ± SD.

3

Untuk mengevaluasi sitotoksisitas obat tetes mata anti-inflamasi, nilai mean

untuk 1/2 konsentrasi dibandingkan dengan yang lain untuk Rinderon ® (Shionogi dan

Co, Ltd, Osaka, Jepang), obat tetes mata yang mengandung betametason, dengan

menggunakan uji perbandingan ganda Dunnett, dengan P<0,05 ditetapkan sebagai tingkat

signifikansi. Selain itu, efek dari jenis tetes mata, garis sel, waktu pemaparan, konsentrasi,

dan metode uji pada viabilitas sel dievaluasi menggunakan analisis varians untuk

parameter bivalen, dengan P<0,05 diambil untuk menunjukkan signifikansi statistik.

CVS digunakan untuk membandingkan toksisitas larutan uji. CVS50 tersebut

dihitung sebagai jumlah pengukuran menunjukkan viabilitas ≥50% dibandingkan dengan

kontrol. CVS40/80 tersebut dihitung sebagai: (jumlah pengukuran menunjukkan viabilitas

>80%) - (jumlah pengukuran menunjukkan <40% viabilitas). Jumlah pengukuran adalah

72 (tiga konsentrasi, tiga kali paparan, empat baris sel, dan dua tes). Hasil dinyatakan

sebagai persentase dari semua pengukuran (%CVS).

HASIL

Untuk semua baris sel yang telah diuji, viabilitas sel setelah terpapar Rinderon ®

adalah ≥ 80% (Gambar 1-4). Kelangsungan hidup sel setelah paparan dari sel ke tetes mata

lain yang telah diuji adalah tergantung konsentrasi.

CVS untuk tetes mata anti-inflamasi yang diuji dalam penelitian ini dirangkum

dalam Tabel 2. Berdasarkan CVS, urutan tetes mata anti-inflamasi diuji dari sitotoksik

rendah ke toksisitas tinggi, dengan bahan aktif, CVS50%, dan CVS40/80% untuk setiap solusi

yang diberikan dalam kurung, adalah sebagai berikut: Rinderon ® (betametason, 100 %,

4

100%) >0.02% Flumethoron ® (Santen Pharmaceutical Co, Ltd, Osaka, Jepang,

fluoromethorone, 68%, 22%) = 0,1% Flumethoron ® (Santen Pharmaceutical Co, Ltd,

fluoromethorone, 76%, 22%) >Bronuck ® (Senju Pharmaceutical Co Ltd, Osaka, Jepang,

0,1% bromfenac, 53%, -8%) = Diclod ® (Wakamoto Co, Ltd, Tokyo, Jepang, 0,1%

diklofenak, 44%, -15%) = Niflan ® (Senju Pharmaceutical Co, Ltd, pranoprofen, 50%, -

19%).

Rinderon ® menunjukan toksisitas paling dari semua tetes mata anti-inflamasi

yang diuji. Secara mikroskopis mengungkapkan bahwa morfologi dari semua baris sel

yang diobati Rinderon® adalah mirip dengan sel kontrol (data tidak ditampilkan). Secara

keseluruhan, obat tetes mata yang mengandung non-steroid anti-inflammatory drugs

menunjukan toksisitas yang lebih besar daripada yang mengandung steroid.

Gambar 5 menunjukkan viabilitas sel sesuai dengan obat, metode baris sel, waktu

pemaparan, konsentrasi obat, dan uji. Semua faktor ini memiliki pengaruh yang signifikan

terhadap kelangsungan hidup sel, sebagaimana ditentukan oleh analisis varians untuk

parameter bivalen. Konsentrasi obat, diikuti dengan waktu paparan, memiliki efek paling

signifikan pada viabilitas sel. Dari baris sel diuji, Chang konjungtiva dan RC-1 sel

tampaknya menjadi sedikit lebih sensitif terhadap paparan obat bila dibandingkan dengan

dua baris sel lainnya, dengan tes MTT muncul untuk menjadi sedikit lebih sensitif

dibandingkan dengan uji NR untuk mengevaluasi viabilitas sel. Jenis obat merupakan

faktor penting yang mempengaruhi kelangsungan hidup sel dan, dari solusi oftalmik

berbeda yang diuji, Rinderon ® (yang berisi betametason steroid sintetis sebagai bahan

aktif) adalah yang paling randah sitotoksiknya, diikuti oleh ® Flumethoron 0,02% dan

0,1% Flumethoron ®, baik yang mengandung steroid fluoromethorone sintetis sebagai

bahan aktif.

5

6

Viabilitas sel yang terekspos obat tetes mata lainnya, yang diklasifikasikan

sebagai non-steroid anti-inflammatory drugs, rendah. Observasi ini sesuai dengan temuan

% CVS yang dijelaskan di atas.

7

Karena viabilitas sel tampaknya menurun dengan waktu paparan meningkat

untuk semua obat tetes mata selain Rinderon ®, viabilitas sel dalam solusi oftalmik

diencerkan dua kali lipat dibandingkan dengan paparan berikut untuk Rinderon ®

menggunakan Dunnett’s multiple comparison test, seperti yang ditunjukkan pada Gambar

1-4.

DISKUSI

Tetes mata anti-inflamasi dianggap sebagai faktor penyebab utama gangguan

permukaan mata selama pengobatan radang mata, seperti pasca operasi atau untuk

penyakit mata inflamasi. Berdasarkan nilai-nilai CVS yang diperoleh dalam penelitian ini,

potensi sitotoksik tetes mata anti-inflamasi yang diuji adalah, Niflan ® = Diclod ® =

Bronuck ®> 0,02% Flumethoron ® = 0,1% Flumethoron ®> Rinderon ®. Dalam hal

bahan aktif dalam setiap tetes mata, hasil dari penelitian ini mengkonfirmasi temuan

sebelumnya, yaitu bahwa steroid kurang sitotoksik dibandingkan, non-steroids.1 4 Karena

beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa deksametason, suatu steroid sintetik, adalah

sitoprotektif,5-7 betametason mungkin telah diberikan efek sitoprotektif dalam penelitian

ini, menjelaskan mengapa Rinderon ® menunjukan sitotoksisitas terendah dari semua

solusi yang diuji. Alasan lain mengapa obat tetes mata yang mengandung nonsteroidal

anti-inflammatory drugs menunjukkan sitotoksisitas yang lebih besar mungkin karena

penggunaan BAK sebagai pengawet. Studi sebelumnya telah melaporkan hubungan

terbalik antara CVS berbagai obat tetes mata dan konsentrasi BAK yang mengandung

therein.1,2,8-10 Dalam penelitian kami terbaru di mana sitotoksisitas in vitro BAK-obat tetes

mata yang mengandung antiglaucoma dievaluasi, sitotoksisitas yang obat tetes mata diuji

adalah tergantung pada konsentrasi BAK.3 Dalam kasus Diclod ®, yang tidak mengandung

BAK, bahan aktif diklofenak telah digunakan untuk kontrol peradangan pasca operasi dan

nyeri tetapi menberi efek samping termasuk kerusakan kornea yang parah,11-14 yang

menunjukkan sitotoksisitas okular permukaan. Dari bahan-bahan aktif lainnya, polisorbat

adalah racun bagi mata,15 dan beberapa peringatan telah direkomendasikan ketika

mempertimbangkan suntikan intraokular obat yang mengandung asam borat polysorbate.15

Boric acid, metil paraoxybenzoate, dan chlorobutanol telah dilaporkan menunjukkan

toksisitas rendah hanya pada konsenrasi yang dianjurkan atau yg paling umum digunakan. 16-18

8

Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi efek dari berbagai konsentrasi obat dan

waktu paparan dalam empat baris sel yang tersedia secara komersial karena, dalam situasi

klinis, mata terekspos berbagai perawatan obat. Misalnya, obat mungkin terkonsentrasi

pada mata karena penguapan atau drainase menurun, obat dapat teradsorpsi pada mata

untuk jangka waktu lama, atau kerentanan terhadap obat tertentu mungkin berbeda antara

jenis sel (misalnya, konjungtiva dibandingkan kornea epitel sel). Memang, diagram pencar

yang ditampilkan pada Gambar 5 menunjukkan bahwa konsentrasi obat dan waktu

paparan secara signifikan mempengaruhi viabilitas sel.

Salah satu keterbatasan dari studi ini adalah bahwa kita hanya menggunakan

bioassay untuk mengevaluasi sitotoksisitas. Selain sistem kultur sel monolayer

konvensional, seperti yang digunakan dalam penelitian ini, mengevaluasi sitotoksisitas

menggunakan model okular yang sudah dibuktikan, seperti model tiga-dimensi (3D), akan

memberikan informasi yang berguna. Sebagai contoh, penelitian sebelumnya telah

menggunakan epitel model 3D yang dibudidayakan dari sel kornea manusia sebagai

alternatif tes mata Draize untuk menilai potensi bahan kimia yang menyebabkan irritasi

mata.19, 20 Dalam studi lain, respons dose-dependent BAK terungkap , dengan efek toksik

yang signifikan dicatat antara konsentrasi rendah 0,005% dalam model epitel kornea 3D.21

Dengan demikian, penelitian masa depan harus menggunakan salah satu dari model-model

9

baru, seperti model epitel kornea 3D, untuk mengkonfirmasi apakah korelasi signifikan

yang diperoleh dengan sistem CVS disajikan di sini dapat direplikasi dalam model

lainnya. Selain itu, studi masa depan perlu memeriksa korelasi antara sitotoksisitas in vitro

dan in vivo.

PENYINGKAPAN

Para penulis melaporkan tidak ada konflik kepentingan dalam pekerjaan ini.

10

JURNAL

PERBANDINGAN PENILAIAN SITOTOKSISITAS DARI

ENAM TETES MATA ANTI-INFLAMASI DALAM EMPAT

KULTUR SEL PERMUKAAN MATA, SEBAGAIMANA

DITENTUKAN OLEH NILAI VIABILITAS SEL

PEMBIMBING:

Dr. HELMI Sp.M

DISUSUN OLEH:

Eugenius (030.04.071)

KEPANITERAAN KLINIK ILMU KESEHATAN MATA RSUD CILEGON

PERIODE 18 DESEMBER 2012 - 19 JANUARI 2013

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS TRISAKTI

11