Isolasi & Elektroforesis DNA 2010 BAB I PENDAHULUAN 1.1. Landasan Teori DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Lamdji (1998, dalam wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitian keragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA. Dalam Wahyuni (2009), Nicholl (1993) dan Surzycki (2000) pun menyatakan ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan Kelompok 2 1
26
Embed
Isolasi & Elektroforesis DNA Web viewIsolasi DNA ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, ... Kontrol fragmen ... sesuai dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Landasan Teori
DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang
dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun
atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat
yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel
makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.
Lamdji (1998, dalam wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitian
keragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting
untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi
melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA. Dalam
Wahyuni (2009), Nicholl (1993) dan Surzycki (2000) pun menyatakan ada
tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis),
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA.
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan
tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang
berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida
dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika
isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-
masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin
tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,
sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada
gel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan
konsentrasi rendah, seperti intercalating agent ethidium bromide (EtBr).
Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel
diletakkan pada media UV-transilluminator (Fatchiyah,2006).
Kelompok 2 1
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
Fachiyah (2006) pun mengemukakan beberapa faktor yang
mempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak
menembus gel agarose, sebagai berikut:
1. Ukuran molekul DNA
Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier
lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel
adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.
2. Konsentrasi gel agarose
Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai
dengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah:
log=log-KrT dimana adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah
retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta adalah
electrophoretic mobility DNA.
Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA
No Konsentrasi Gel
Agarose (%)
Effisiensi range Pemisahan
pada DNA linier (kb)
1 0.3 60-5
2 0.6 20-1
3 0.7 10-0.8
4 0.9 7-0.5
5 1.2 6-0.4
6 1.5 4-0.2
7 2.0 3-0.1
3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu
bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-
opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat
yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan
laju migrasi ini karena:
Kelompok 2 2
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
konsentrasi gel agarose
kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
densitas kembaran superheliks pada bentuk I
pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III
tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat,
pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam,
contoh untuk bentuk I
konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg
4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.
Idealnya untuk DNA 2kb pada gel agarose bergerak 5v/cm. Arah dari
bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang
sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA
akan berubah juga.
5. Komposisi basa DNA atau temperature
Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh,
mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30C. Dan elektroforesis gel agarose
dilakukan pada suhu kamar
6. Keberadaan pewarna DNA
Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen
untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela
pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai
15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan
cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan
untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau
RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam
nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN!
EtBr ini powerful mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung
tangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung
pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.
Kelompok 2 3
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
7. Komposisi buffer elektroforesis
Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang
digunakan untuk pembuatan gel agarose. Missal:
Tris-acetate; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling
rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose baik
elektroelusi maupun gel ekstraksi.
Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA
dari agarose kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose.
1.2. Latar BelakangDewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk
mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi
DNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karena
teknologi – teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA
ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan
teknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapat
dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun,
daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Namun, penggunaan
tumbuhan sebagai sumber lebih banyak dilakukan dalam pengisolasian
DNA dewasa ini. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutama
untuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat
terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah dilakukan isolasi,
biasanya DNA akan dielektroforesis.
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi,
mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/ RNA. Elektroforesis
merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet. Cara
pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat
pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas
baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.
Elektroforesis digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakan
flouresensinya.
Kelompok 2 4
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
Berdasarkan hal-hal tersebut diatas dan tak lepas dari tujuan
peningkatan khazanah ilmu pengetahuan terutama dalam bidang ilmu
Genetika, maka kami mengadakan praktikum isolasi hingga elektroforesis
DNA.
1.3. TujuanTujuan praktikum isolasi dan elektroforesis DNA ini diantaranya :
1. Melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman.
2. Mengetahui proses elektroforesis DNA.
3. Memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA
dan Elektroforesis DNA.
BAB II
METODE KERJA
Kelompok 2 5
Diambil daging buah yang sudah matang atau sayuran
Dihancurkan daging buah atau sayuran dengan
menggunakan blender atau sendok yang ditekan – tekan
diatas saringan
Ditampung daging buah dan sayuran yang telah halus
Dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml daging buah atau
sayuran yang telah halus sebanyak 0,1 ml atau 100 µl
Ditambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume total
sampel
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
2.1. Alat dan Bahan
A. Isolasi DNA Tanaman
Untuk melaksanakan isolasi DNA tanaman, diperlukan alat-alat
seperti mikropipet berbagai ukuran, pipet berukuran, tabung 1,5 ml, tips
mikropipet berbagai ukuran, saringan, gelas kimia, sendok, penangas,
vortex, mini sentrifuga, dan blender/lumping. Sedangkan untuk bahan-
bahannya, diperlukan Buffer ekstraksi (100 mM Tris-HCl, pH 8; 50 mM
Kloroform: Isoamil alcohol (24:1), Alkohol 100% (pa), TE (10 mM Tris-
HCl, 1 mM EDTA pH 8), Buah-buahan/sayuran (Bayam, Anggur
Hitam), dan CTAB 2%.
B. Elektroforesis DNA
Untuk melaksanakan elektroforesis DNA, diperlukan alat-alat
seperti Elektroforesisi unit (meliputi comb dan tray), Power supply,
Mikropipet digital, dan Transilluminator UV. Sedangkan untuk bahan-
bahannya diperlukan Buffer TAE 10 x (400mM Tris asetat, 10 mM
EDTA pH 8), Etidium Bromida, Loading Buffer, DNA Marker, dan
Agarose.
2.2. Langkah Kerja
A. Isolasi DNA Tanaman
Kelompok 2 6
Dipindahkan fasa atas ke dalam tabung 1,5 ml yang baru, dan endapan dijaga sampai tidak terbawa
Ditambahkan klorofom 5 tetes : isoamol alcohol (24:1) sebanyak ½ x volume total sampel
Dihomogenkan sampel dengan cara membolak balik tabung sebanyak 50 x
Disentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit
Dipindahkan fasa atas ke dalam tabung baru
Ditambahkan alcohol sebanyak 100 % (-20 c) sebanyak minimal 2x volume total sampel
Ditambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume total
sampel
Ditambahkan SDS 20% sebanyak 20 µl
Dihomogenkan dengan alat vortex selama 5 detik
Diinkubasi dalam penangas air pada suhu 65oC selama 20 menit
Ditambahkan 100 µl 5 M potasium asetat
Dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung sebanyak 50x
Disimpan dalam wadah berisi es selama 10 menit
Disentrifugasi sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
Kelompok 2 7
Disentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit.
Alkohol dibuang dengan hati-hati, agar endapan DNA tidak
terbuang
Sampel dicuci dengan alcohol 70 % 1 x, kemudian dikeringkan sampel pada oven dengan suhu 50 oC selama 10 menit
Dilarutkan endapan DNA dengan TE sebanyak 30 µl
Disimpan sampel pada suhu 4oC, dibiarkan minimal selama 24 jam agar DNA dapat terlatut dengan sempurna
DNA yang diperoleh akan dielektriforensis dan juga diamplifikasi dengan alat PCR
Disiapkan tray / cetakan gel elektroforensis untuk membuat cetakan gel. Ditutup rapat sisi-sisi yang terbuka dengan
menggunakan selotip.
Dibuat gel agarose dengan konsentrasi yang dikehendaki dalam buffer TAE 1 x.
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
B. Elektroforensis DNA
Kelompok 2 8
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
BAB III
HASIL PENGAMATAN
Kelompok 2 9
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
3.1. Hasil Pengamatan Isolasi DNA
Tabel 2. Pengamatan Urutan Poses Isolasi DNANo Gambar Urutan Proses Isolasi DNA Foto Hasil Pengamatan1 Isolasi DNA buah strawberry 0,1 mL
Warna larutan merah pekat (merah darah)Strawberry pekat larutannyah, belum terbentuk endapan, butiran kasar masih tersebar di sekitar larutan.2
Setelah diinkubasi dalam penangas air suhu 60˚C selama 20 menitWarna larutan merah mudaBelum terlihat adanya endapan, hanya butiran halus yang tersuspensi.3Setelah disimpan dalam wadah es selama 10 menitWarna larutan >> merah pucat
Tidak ada endapan
Kelompok 2 10
Isolasi & Elektroforesis DNA 2010
4Setelah di sentrifuge dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menitWarna larutan pink pudarTerbentuk endapan5
Setelah sentrifuge kedua dengan kecepatan 14000rpm selama 10 menit.Warna larutan pink pudar
Warna larutan bening dan tidak ada endapan6Setelah ditambahkan alkohol 00% sebanyak 2x volume total sampel.Larutan beningDNA