ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT …digilib.unila.ac.id/37328/6/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · Bakteri asam laktat (BAL) yang tumbuh selama fermentasi growol (makanan

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTATAMILOLITIK FERMENTASI GROWOL SEBAGAI ANTIMIKROBA

( Skripsi )

OLEH

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG2018

RIYAN WAHYUDI

ABSTRACT

ISOLATION AND CHARACTERIZATION LACTIC ACID BACTERIAAMYLOLYTIC GROWOL FERMENTED AS AN ANTIMICROBIAL

By

RIYAN WAHYUDI

Lactic acid bacterial a (LAB) which grown during growol fermentation(traditional food made by cassava from Kulon Progo Yogyakarta) is an indigenusbacteria, it can grow on starch medium with the amylolytics ability and potentiallyto be used to produce lactic acid from starch. The aims of this study were toisolate amylolytics LAB, to characterize the isolates for degradating starch and todetermine it’s antimicrobial activity. The ability of LAB isolates in starch wasmeasured based on it’s amylolytics index (IA) on agar starch’s medium of thecolonies and the amylase enzymatic activity on dissolved starch as substrate. Theresult showed that 15 isolates were obtained and 2 selected isolates had highamylolytics activity on solid and liquid medium. Two isolates were IG-8-7 andIG-9-7 have IA 6,0 and 3,3 and the unit activity of α-amylase were 18,8 µ/mLand 16,6 µ/mL, respectively the IG-8-7 has antimicrobial activity showed by it’sinhibition zone diameter for 2,8 cm and it was better than IG-9-7 (2,2 cm), andpositive control chloramphenicol of (2,5 cm).

Keywords : Fermentation, Growol, Isolation, Lactic acid bacterial (LAB),Antimicrobial

ABSTRAK

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTATAMILOLITIK FERMENTASI GROWOL SEBAGAI ANTIMIKROBA

Oleh

RIYAN WAHYUDI

Bakteri asam laktat (BAL) yang tumbuh selama fermentasi growol (makanantradisional berbasis singkong khas kulon Progo Yogyakarta) merupakan bakteriindiginus, yang mampu tumbuh pada media pati dengan kemampuan amilolitikdan berpotensi dimanfaatkan untuk produksi asam laktat dari pati. Tujuanpenelitian ini adalah untuk mengisolasi BAL amilolitik dan mengkarakterisasiisolat dalam mendegradasi pati dan isolat yang memiliki aktivitas antimikroba.Kemampuan BAL dalam mendegradasi pati diukur berdasarkan nilai indeksamilolitik (IA) koloni pada medium pati agar dan aktivitas enzim amilase padasubstrat pati terlarut. Hasil penelitian ini diperoleh 15 isolat dan terpilih 2 isolatyang memilki aktivitas amilolitik tertinggi pada medium padat dan medium cair.Dua isolat tersebut yaitu IG-8-7 dan IG-9-7 yang memiliki nilai IA sebesar 6,0dan 3,3, kedua isolat memiliki aktivitas unit enzim amilase berturut-turut sebesar18,8 U/ml dan 16,6 U/ml. IG-8-7 mempunyai aktivitas antimikroba dengandiameter zona hambat sebesar 2,8 cm lebih baik dari IG-9-7 (2,2 cm), maupunkontrol positif kloramfenikol (2,5 cm).

Kata kunci : Fermentasi, Growol, Isolasi, Bakteri Asam Laktat (BAL), Antimikroba

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT

AMILOLITIK FERMENTASI GROWOL

SEBAGAI ANTIMIKROBA

Oleh

Riyan wahyudi

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar

SARJANA SAINS

Pada

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2018

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Pujodadi Kecamatan Trimurjo Lampung

Tengah pada tanggal 16 maret 1995 sebagai anak pertama

dari tiga bersaudara dari pasagan bapak Ismanto dan Ibu

Sriwiyanti.

Jenjang pendidikan diawali dari taman kanak kanak pada tahun 2000 di TK

Dharma Wanita Pujodadi, tahun 2007 menyelesaikan sekolah dasar di SD Negeri

1 Pujodadi Kec. Trimurjo Lampung Tengah, tahun 2010 menyelesaikan

pendidikan tingkat pertama di SMP Negeri 1 Trimurjo dan tahun 2010

menyelesaikan Sekolah Menengah Atas di SMA Muhammadiyah 1 Metro. Tahun

2013 penulis terdaftar sebagai mahasiswa Universitas Lampung melalui jalur

SNMPTN (Seleksi Nilai Masuk Perguruan Tinggi Negeri).

Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum pada mata

kuliah Biokimia 1 Prodi Kimia dan Biokimia 1 Prodi Biologi. Pengalaman

organisasi dimulai dari kader muda himpunan mahasiswa kimia (KAMI) jurusan

Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada periode 2013/2014.

Penulis juga aktif di Himpunan Mahasiswa Kimia (HIMAKI) FMIPA sebagai

anggota bidang SPIK kepengurusan tahun 2014/2015 - 2015/2016. Penulis juga

Dengan Rahmat Allah yang Maha Pengasih dan PenyanyangKupersembahkan Karya Sederhanaku ini

Kepada:

Allah SWT pemilik jiwa ragaku, yang telah menganugerahkan begitu banyak kebahagiaan danpelajaran dalam hidupku serta Nabi Muhammad SAW sebagai suri tauladanku,

Kedua orang tuakuBapakku Ismanto dan Ibuku Sriwiyanti

Tak akan pernah ada sesuatu yang bisa menggantikan kasih sayang, kesabaran, kebaikan dankeikhlasan kalian, semoga Allah membalas dengan sebaik-baiknya pembalasan.

Membahagiakan kalian adalah tujuan utamaku.

Kedua adikku tersayangLeni Indriani dan Dani Prayuga

Terima kasih atas canda tawa, keceriaan yang kalian berikan semoga kalian selalu diberikankemudahan dan kesuksesan dalam menggapai cita dan cinta.

Segenap Keluarga besarku yang selalu mendoakan keberhasilanku,

Guru-guru dan Dosen-Dosen yang selalu membagi ilmunya untukku

Sahabat- sahabat terbaik yang berjuang bersamaku

dan Almamater tercinta Universitas Lampung

MOTTO

لكم خیر لكم إن ك ذ انفروا خفافا وثقاال وجاھدوا بأموالكم وأنفسكم في سبیل هللا

نتم تعلمون

“Berangkatlah kamu baik dalam keadaan merasa ringan maupun berat, danberjihadlah kamu dengan harta dan dirimu di jalan Allah. Yang demikian ituadalah lebih baik bagimu, jika kamu mengetahui”(At Taubah ayat 41).

Agama tanpa ilmu adalah buta, Ilmu tanpa agama adalah lumpuh

(Albert Einstein).

SANWACANA

Segala puji hanya milik Allah SWT yang telah memberikan begitu banyak nikmat,

sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi dengan judul ”Isolasi dan

Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Amiloitik Fermentasi Growol Sebagai

Antimikroba ” sebagai syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains pada Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan rintangan.

Namun, dengan kehendak Allah SWT maka skripsi ini terselesaikan. Penulis

menyadari sepenuhnya bahwa terselesaikannya penyusunan skripsi ini tidak

terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Kedua orang tua yang sangat aku cintai dan sangat berjasa dalam hidupku, Bapak

Ismanto dan Ibu Sriwiyanti serta kedua adikku Leni Indriani dan dani Prayoga

yang telah memberikan kasih sayang, perhatian, semangat, motivasi, dukungan

moril maupun materil, dan doa untuk keberhasilanku.

2. Bapak Mulyono, Ph.D., selaku pembimbing utama yang telah banyak

memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan, gagasan, bantuan, dukungan,

semangat, kritik dan saran kepada penulis dalam proses perencanaan dan

pelaksanaan penelitian serta dalam penulisan skripsi ini.

3. Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si., selaku pembahas pertama yang telah memberikan

kritik, saran dan arahan kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan

baik.

4. Bapak Dr. Novyani, M.Si., selaku pembahas kedua yang telah memberikan

semangat, kritik, saran dan bimbingan kepada penulis sehingga skripsi ini

terselesaikan dengan baik.

5. Ibu Prof. Dr. Ir. Yandri, A.S., M.S. selaku Pembimbing Akademik atas

kesediaannya untuk memberikan bimbingan, bantuan, nasehat dan informasi

yang bermanfaat kepada penulis.

6. Bapak Prof. Warsito, D.E.A., Ph.D. selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

7. Bapak Dr. Suripto Dwi Yuwono, M. T., selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA

Universitas Lampung yang telah memberikan bantuan kepada penulis dalam

menyelesaikan skripsi ini.

8. Seluruh dosen dan staff administrasi di Jurusan Kimia FMIPA Unila yang telah

membantu, mendidik, dan memberikan ilmu pengetahuan yang sangat berguna

kepada penulis selama kuliah.

9. Mas Pendi, Mas Eko, Mba Cici yang selalu memberikan perhatian, pengertian,

doa, semangat, motivasi dan menantikan keberhasilanku.

10. Keponakan Om dewi, anis, Rachel, Nayla yang menjadi penghibur dan

keceriaan bagi om disaat kejenuhan.

11. Keluarga besar Mbah karyo Utomo dan Mbah Sarman yang selalu memberikan

nasehat, motivasi, dukungan, doa dan kasih sayang kepada penulis

12. Sesorang yang selalu setia mendengarkan keluh kesah penulis, Atikah Nur Azizah

S.Pd. Terima kasih untuk nasehat, motivasi, semangat, perhatian dan doanya.

Semoga Allah swt selalu memberikan keberkahannya untuk dirimu.

13. Untuk teman-teman sepermainan dan seperjuanganku yang suka berkumpul di

“Markas” yaitu “THE INCRIDIBLE SIX”, yang terdiri atas Yudha Ari Satria

(The Strongman), Ferdian Dicky Permana (Pemilik Markas yang mungkin bosan

dijadikan tempat tongkrongan), Rezky Adji Pratama (Penakluk Wanita), Christian

Paul PS (Laki-laki telat nakal dan the important man), dan Radho Al-Kausar

(Seorang yang sering linglung). Terimakasih atas kebersamaannya, keceriaan,

dukungan, perhatian, doa, nasihat, kritik, saran, dan waktu yang telah kita

habiskan bersama selama masa perkuliahan. Aku tidak akan melupakan kalian

dan semoga kita dapat bertemu kembali dengan masing-masing pribadi sudah

menjadi orang yang sukses Amiiin.

14. Mulyono’s Research Group, mba Ajeng, mba Ayu Imani, mba Meta, kak Aziez,

Shelta, Melia, Monica, Vyna, Tyas, Bidari, Asrul, Jefry, dan Fernando atas

kerjasama, motivasi dan kebersamaan yang selalu diberikan.

15. Para penyayang bakteri dan jamur (2014) di Lab. Biokimia, Agung Cordova,

Asrul, Luthfi, Rahma, Rica, Riza, Bunga, Bidari, Erika, Ayuning, Hesti, Diva,

Leony atas kebersamaan, canda tawa, bantuan dan semangatnya. Semoga kalian

selalu diberikan kelancaran dalam penelitiannya dan segala urusan dalam

menyelesaikan studi.

16. Para penghuni Lab. Biokimia terdahulu (2012 dan 2013), mbk Arum, S.Farm,

Putri Amalia, M.Si., Ana Febrilianti W., S.Si., Aprilia Isma D.,S.Si , Uswatun

Khasanah, S.Si, Rizky Putri Y., S.Si., Syathira Assegaf., S.Si., Fifi Ardhyanti.,

S.Si, Diani Iska M., S.Si., Mia Permatasari, S.Si., Sinta Dewi O, S.Si., Fathaniah

Sejati, S.Si., Maya Retna S., S.Si., Khomsatun Khasanah, S.Si., Ezra Rhienzky,

S.Si., Sri Wahyuni, C.S.Si. Terima kasih atas bantuan, canda, tawa, motivasi yang

diberikan selama penelitian kepada penulis.

17. Teman-teman Kimia angkatan 2013, Dona, Aulia, Badiatul, Dewi Rumondang,

Fatimah, Fera, Fika, Hermayana, Khalimatus, Indah, Yudha, Esti, Kiki, Nova,

Linda, Lulu, Anita, Megafit, Mawar, Nabilla, Renita, Siti, Tyagita, Yulia, Uut,

Vero, Widya, Yunitri, Della, Eky, Yuvica, Inggit, Awan, Vicka, Arief, Oci,

Maya, Nora, Atun, Diki, Shela, Vyna, Bara, Ridho, Nurpadilla, Wahyuni, Kurnia,

Yolanda, Murnita, Nurma, Erva, Ismi, Eka Oso, Febri, Paul, Fentri, Riska, Eka,

Shelta, Nia, Nurul, Ana, Nita, Anggi, Gesa, Tika, Yuni, Celli, Melia, Anggun,

Radho, Arni, Sinta, Anton, Melita, Monica, Tyas, Citra, Kartika, Ezra, Yunita,

Verdi, Korina, Doddy, dan Ryan Amha atas untuk motivasi dan pengalaman luar

biasa serta kebersamaan yang telah terjalin.

18. Sahabat-sahabatku, Padil, Galih, Dinda, Betty yang telah memberikan semangat,

motivasi, doa dan selalu menghibur penulis. Semoga persahabatan kita terus

terjalin dengan baik sampai tua.

19. Kakak-kakak dan Adik-adik Angkatan 2010, 2011, 2012, 2014, 2015, 2016, dan

2017 yang telah membantu serta mendoakan.

20. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis dalam penyusunan

skripsi ini.

Semoga segala bentuk bantuan dan dukungan yang diberikan mendapat balasan

pahala dari Allah SWT. Akhir kata, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih sangat

jauh dari kata sempurna, namun penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat

dan memiliki nilai guna khususnya rekan-rekan mahasiswa dan pembaca pada

umumnya. Amin.

Bandar Lampung, Juli 2018Penulis

Riyan Wahyudi

melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) selama 40 hari di Desa Dharma Agung,

Seputih Mataram, Kabupaten Lampung Tengah pada tahun 2016.

DAFTAR ISI

HalamanABSTRAK

DAFTAR ISI.............................................................................................................i

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................iii

DAFTAR TABEL ....................................................................................................v

I. PENDAHULUANA. Latar Belakang..................................................................................................1B. Tujuan Penelitian ..............................................................................................4C. Manfaat Penelitian ............................................................................................5

II. TINJAUAN PUSTAKAA. Makanan Fermentasi ......................................................................................6B. Fermentasi ......................................................................................................7C. Growol............................................................................................................9D. Pati..................................................................................................................10E. Bakteri.............................................................................................................12

1. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme ..........................................................132. Identifikasi Bakteri.....................................................................................15

F. Bakteri Asam LAktat BAL .............................................................................15G. Pengertian Asam Laktat ..................................................................................18H. Probiotik ..........................................................................................................19I. Enzim..............................................................................................................20J. Enzim Amilase ...............................................................................................22K. Spektrofotometer UV-VIS ..............................................................................23L. Metode Fuwa ..................................................................................................26M. Aktivitas Antimikroba dan Efeknya ...............................................................26N. Metode Difusi..................................................................................................28

III. METODELOGI PENELITIANA. Waktu dan Tempat Penelitian........................................................................30B. Alat dan Bahan...............................................................................................30

1. Alat-alat yang digunakan...........................................................................302. Bahan-bahan yang digunakan....................................................................31

C. Prosedur Penelitian ........................................................................................31

ii

1. Tahap Persiapan.........................................................................................312. Isolasi Mikroba dari Growol......................................................................333. Koleksi Koloni Tunggal Hasil Isolasi .......................................................354. Penyimpanan Isolat....................................................................................355. Uji Hidrolisi Pati BAL Amilolitik Metode Iodin ......................................356. Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Waktu Optimum Aktivitas Enzim

Amilase ....................................................................................................367. Uji Aktivitas Amilase BAL Amilolitik secara Kuantitatif ........................378. Uji Akivitas Antimikroba ..........................................................................379. Identifikasi Bakteri ....................................................................................38

D. Diagram Alir Penelitian.................................................................................40

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi dan Skrining Bakteri Asam Laktat (BAL) Amilolitik PendegradasiPati ................................................................................................................41

B. Hasil Uji Kualitatif Isolat BAL Pendegradasi Pati Metode Iodin..................45C. Uji Aktivitas Enzim Amilase BAL Amilolitik ..............................................48D. Kurva Pertumbuhan dan Waktu Optimum Degradasi Pati BAL Amilolitik

Dua Isolat Terpilih .........................................................................................56E. Uji Antimikroba .............................................................................................59F. Karakterisasi BAL Amilolitik Pendegradasi Pati...........................................61

1. Morfologi ...................................................................................................612. Motilitas .....................................................................................................63

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan ....................................................................................................65B. Saran ..............................................................................................................65

DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................................67

LAMPIRAN..............................................................................................................72

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Growol ...................................................................................................................10

2. Struktur Amilum ....................................................................................................11

3. Pati Singkong .........................................................................................................12

4. Struktur Sel Bakteri................................................................................................13

5. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme ......................................................................14

6. Skema Alat Spektoskopi UV-VIS..........................................................................26

7. Diagram Alir ..........................................................................................................40

8. Isolat BAL pada Media MRSA a). Pengenceran 10-5, b). Pengenceran 10-6, c).Pengenceran 10-7, d). Pengenceran 10-8, e). Pengenceran 10-9, f). Pengenceran10-10........................................................................................................................42

9. Pemilihan Isolat Amilolitik a). BAL amilolitik menunjukan warna bening (IG-9-13) b). semua isolat menunjukan hasil negatif ..................................................42

10. Penapisan Kultur Tunggal beberapa Isolat a). kontrol negatif b). (i) Isolat IG-9-13 c). Isolat IG-10-1 ...........................................................................................44

11. Lima Belas Stok Isolat BAL Amilolitik ..............................................................45

12. Kurva Standar Glukosa ........................................................................................50

13. Aktivitas Amilolitik 8 Isolat Terpilih...................................................................50

14. Hubungan Indeks Amilolitik dan Aktivitas Unit (U/ml) 8 Isolat ........................51

15. Degradasi BAL Amilolitik a). Kontrol negatif b). Isolat IG-6-10 c). Isolat IG-9-13 ......................................................................................................................53

16. Tanda Panah Menunjukan IG-6-10, IG-8-7, IG-9-7,IG-9-13, IG-10-1, IG-10-5,IG-10-12, IG-11-2. ...............................................................................................53

iv

17. Mekanisme Kerja Enzim Amilase .......................................................................55

18. Kurva Pertumbuhan Sel Isolat IG-8-7 dan Isolat IG-9-7 Terhadap WaktuInkubasi ................................................................................................................57

19. Aktivitas Unit Enzim Amilase Isolat IG-8-7 dan IG-9-7.....................................58

20. Grafik Profil Pertumbuhan Sel dan Aktivitas Unit Enzim Amilase Isolat IG-8-7 dan IG-9-7 terhadap Waktu Inkubasi ................................................................58

21. Uji Antimikrobia Isolat BAL terhadap E. coli (a) Isolat IG-8-7 (b) Isolat IG-9-7............................................................................................................................60

22. Morfologi Makroskopik Isolat (a) IG-8-7 dan (b) IG-9-7 pada Medium PatiAgar dengan Waktu Inkubasi 24-48 jam .............................................................62

23. Pewarnaan Gram a). Isolat IG-8-7, b). Isolat IG-9-7 ...........................................63

24. Hasil Uji Moltilitas pada Isolat (a) IG-8-7 dan (b) IG-9-7 setelah diinkubasiselama 48 jam.......................................................................................................64

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Kandungan Gizi Pati Singkong per 100 gr ................................................................. 12

2. Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. ................................................. 16

3. Indeks Amilolitik 15 Isolat Hasil Isolasi ..................................................................... 48

4. Nilai Absorbansi Larutan Standar Glukosa ................................................................ 49

5. Nilai Indeks Amilolitik 8 Isolat ........................................................................................ 52

6. Nilai IA dan Perkiraan Spesies 8 Isolat Mikroorganisme Amilolitik sertaPigmentasi dengan Waktu Inkubasi 24 jam............................................................... 54

7. Karakterisasi Morfologi secara Makroskopik pada Cawan Petri............................. 62

8. Karakteristik Morfologi secara Mikroskopik ............................................................. 63

1. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Pola hidup masyarakat Indonesia yang cenderung menyadari akan pentingnya

kesehatan menyebabkan kebutuhan pangan tidak terbatas. Pangan diharapkan

mampu berfungsi menjaga kesehatan dan kebugaran tubuh. Salah satunya

makanan fermentasi, produk pangan fermentasi ini biasa disebut sebagai pangan

fungsional. Produk pangan yang banyak yang dikembangkan sebagai pangan

fungsional antara lain adalah produk-produk probiotik. Banyak spesies bakteri

telah lama digunakan manusia, seperti Lactobacillus casei dan Lactobacillus

bulgarius. Bakteri probiotik yang sebagian besar merupakan bakteri asam laktat

misalnya, Lactobacillus sp dan Streptococcus sp (Winarno et al., 2003).

Cartney (1997) melaporkan bahwa bakteri probiotik dapat membantu menjaga

kesehatan usus, penyerapan makanan, produksi vitamin, dan mencegah

pertumbuhan bakteri patogen. Selain itu, dapat meningkatkan fungsi sistem

kekebalan tubuh, metabolisme kolesterol, anti karsinogen, dan menghambat

penuaan dini. Produk makanan fermentasi yang mengandung probiotik ini

dikenal dengan istilah makanan fungsional (Fueller, 1989).

Makanan fungsional lain yang mengandung probiotik, yaitu komponen pangan

yang tidak dapat terhidrolisis oleh enzim-enzim pencernaan dalam saluran

2

pencernaan manusia. Komponen ini menguntungkan tubuh dengan cara

menstimulasi pertumbuhan atau aktivitas sejumlah bakteri misalnya Bakteri Asam

Laktat, Bifidobacterium, Enterococcus, Bacteroides, dan Eubacterium di dalam

usus besar yang pada akhirnya dapat meningkatkan kesehatan tubuh (Gibson &

Roberfroid 1995).

Bakteri asam laktat (BAL) berbentuk batang, tidak membentuk spora, tumbuh

pada suhu optimum ± 40 oC, pada umumnya tidak motil, bersifat anaerob,

katalase negatif, dan oksidase positif, dengan asam laktat sebagai produk utama

fermentasinya. Sifat-sifat khusus BAL adalah mampu tumbuh pada kadar gula,

alkohol, dan garam yang tinggi, dan mampu memfermentasikan karbohidrat

seperti polisakarida (Syahrurahman, 1994). Menurut Salminen et al. (2004),

syarat-syarat yang harus dipenuhi oleh bakteri asam laktat yang berfungsi

sebagai probiotik antara lain: (1) harus nonpatogenik yang mewakili

mikroorganisme normal usus dari inang tertentu dan masih aktif pada kondisi

asam lambung dan konsentrasi garam empedu yang tinggi di dalam usus

halus, (2) harus mampu tumbuh dan bermetabolisme dengan cepat dan

terdapat dalam jumlah yang tinggi pada usus, (3) dapat mengkolonisasi

beberapa bagian saluran usus untuk sementara, (4) probiotik dapat memproduksi

asam-asam organik secara efisien dan memiliki sifat antimikroba terhadap

bakteri yang merugikan, (5) mudah diproduksi, mampu tumbuh dalam sistem

produksi skala besar, dan dapat hidup selama kondisi penyimpanan.

BAL yang memiliki kemampuan memanfaatkan pati sebagai substratnya

dikenal sebagai BAL amilolitik. Aktivitas BAL pada fermentasi bahan berpati

3

berperan terhadap perubahan karakteristik produk untuk memproduksi asam

laktat, enzim spesifik, dan senyawa aromatik (Camargo et al., 1988; Demiate

et al., 1999; Marcon et al., 2006). BAL dapat menghasilkan amilase

ekstraseluler dan memfermentasi pati secara langsung menjadi asam laktat. Hal

ini disebabkan fermentasi dengan BAL amilolitik akan menggabungkan dua

proses yaitu hidrolisis enzimatis substrat karbohidrat (pati) sekaligus

fermentasi yang memanfaatkan gula yang dihasilkan menjadi asam laktat

(Reddy et al., 2008; Petrov et al., 2008).

BAL amilolitik telah diisolasi dari makanan tradisional berbasis serealia dan

kasava terfermentasi (Nwankwo et al., 1989; Olympia et al., 1995; Johansson et

al., 1995; Morlon-Guyot et al.,1998; Sanni et al., 2002). Kajian mikrobiologis

pada fermentasi alami pati kasava asam di Columbia mengarah pada isolasi BAL

amilolitik, Lactobacillus (L) manihotivorans, yang bersifat homolaktik dan

menghasilkan lebih dari 98% L(+)-asam laktat (Morlon-Guyot et al., 1998).

Penelitian selanjutnya berhasil menemukan tujuh isolat L. manihotivorans pada

proses produksi pati kasava asam yang enam di antaranya bersifat amilolitik dan

dua diantaranya dapat memfermentasi beragam karbohidrat (Guyot et al., 2003).

Lacerda et al. (2005) menemukan L. plantarum dan L. fermentum dominan pada

fermentasi alami kasava di Brazil, selain juga menemukan L. perolans dan L.

Brevis.

Salah satu makanan khas Indonesia berbasis kasava terfermentasi adalah

growol. Growol merupakan makanan fermentasi tradisional yang berasal dari

Yogyakarta khususnya Kulon Progo terbuat dari ketela dan mempunyai rasa asam.

4

Uji mikrobiologis yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa BAL yang

tumbuh pada growol adalah jenis Lactobacillus yang bersifat homofermentatif

(Muttarokah, 1998; Ngatirah, 2000), akan tetapi kemampuan amilolitik BAL

tersebut belum diuji. Ngatirah (2000) mengidentifikasi satu isolat dari growol

sebagai Lactobacillus sake. Berbagai sampel bahan baku menentukan komposisi

mikrobiota, termasuk keberadaan BAL amilolitik (Guyot et al., 2000).

Pengembangan penelitian perlu dilakukan untuk mendapatkan strain BAL

dengan kemampuan mendegradasi pati (amilolitik) dan memiliki aktivitas

antimikroba. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat

BAL indigenus dari proses fermentasi pembuatan growol yang memiliki

kemampuan amilolitik dan antimikroba, sehingga dapat dimanfatkan sebagai

inokulum untuk produksi asam laktat dari pati yang sekaligus mempunyai

aktivitas antimikroba.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukan penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. mengisolasi BAL Amilolitik dari air pada proses fermentasi pembuatan

growol.

2. mengidentifikasi BAL yang memiliki kemampuan amilolitik (mampu

mendegradasi pati).

3. mengkarakterisasi isolat BAL amilolitik yang diperoleh dari proses isolasi.

4. mengidentifikasi BAL amilolitik yang memiliki aktivitas antimikroba.

5

C. Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah mengenai

keaneragaman BAL amilolitik yang memiliki aktivitas mengdegradasi pati dan

memiliki aktivitas antimikroba yang berasal dari proses fermentasi pada

pembuatan growol.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Makanan Fermentasi

Indonesia merupakan negara multi pulau dan multi etnis. Keberagaman kondisi

lingkungan dan budaya secara tidak langsung mempengaruhi karakteristik produk

pangan masyarakatnya dan kondisi tersebut melahirkan banyak produk pangan

tradisional khas daerah. Ada banyak jenis pangan tradisional seperti tempe,

bekasam, tempoyak, terasi masih banyak yang lainya yang merupakan pangan

fermentasi (Hosono, 1989).

Pada awalnya tujuan fermentasi pangan adalah untuk mengawetkan pangan yang

bersifat musiman dan mudah rusak. Sejalan dengan perkembangan alternatif

pengawetan pangan maka pengembangan produk pangan fermentasi saat ini lebih

karena tekstur, aroma dan rasanya yang khas. Dampak positif dari produk

fermentasi terhadap kesehatan konsumen juga menjadi alasan pengembangan

produk fermentasi sekarang ini. Pemecahan komponen yang kompleks menjadi

komponen komponen yang lebih sederhana menyebabkan produk fermentasi lebih

mudah dicerna daripada produk pangan asalnya. Pada beberapa produk

fermentasi, dilaporkan pula adanya peningkatan kandungan beberapa vitamin,

antioksidan, dan senyawa lain yang bermanfaat bagi kesehatan. Selain itu, ketika

produk diproduksi sebagai produk probiotik, maka keberadaan mikroba baik yang

7

dapat mencapai usus dalam keadaan hidup dapat membantu menjaga kesehatan

saluran cerna dan tergantung dari jenis bakterinya, juga dapat mencegah

munculnya penyakit-penyakit degeneratif (Buckle et al., 2007).

B. Fermentasi

Fermentasi dapat didefinisikan sebagai perubahan gradual oleh enzim dari

beberapa bakteri, kamir, dan jamur di dalam media pertumbuhan. Perubahan

kimia dan fermentasi meliputi pengasaman susu, dekomposisi pati serta

perubahan gula menjadi alkohol dan karbondioksida. Fermentasi terjadi karena

adanya aktivitas suatu mikroorganisme terhadap substrat yang sesuai sebagai

media pertumbuhan mikroorganisme tersebut. Proses fermentasi menyebabkan

perubahan pada sifat substrat, contohnya pada fermentasi sari buah akan timbul

rasa dan bau alkohol, pada fermentasi ketela dan ketan akan menghasilkan bau

alkohol dan rasa asam yang khas (tape), pada fermentasi susu akan menghasilkan

bau dan rasa asam. Tujuan dilakukanya fermentasi adalah memperbanyak jumlah

mikroorganisme dan meningkatkan aktivitas metabolismenya terhadap media

fermentasi (Hidayat, 2006).

Fermentasi berdasarkan penambahan starter (kultur mikroorganisme), dibedakan

atas dua jenis, yaitu fermentasi spontan dan fermentasi tidak spontan. Fermentasi

spontan adalah fermentasi yang berjalan alami, tanpa penambahan starter,

mikroba yang tumbuh terdapat secara alami pada medium sehingga mikroba

tertentu yang melakukan fermentasi dapat tumbuh dengan baik (Prasetya, 1985

dalam Rustan 2013). Sedangkan fermentasi tidak spontan adalah fermentasi

8

yang berlangsung dengan penambahan starter misalnya tempe, yoghurt, roti dan

lain-lain (Dwiari et al, 2008).

Secara fisiologis dan berdasarkan aktivitas metabolismenya fermentasi terbagi

menjadi dua jenis yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. BAL

homofermentatif akan mengubah gula menjadi asam laktat, sedangkan

heterofermentatif akan memproduksi tidak hanya asam laktat namun juga asam

asetil, etanol dan karbon dioksida. Kedua jenis bakteri tersebut digunakan melalui

uji fermentasi. Apabila BAL yang di uji menghasilkan gas yang tertampung

dalam tabung durham maka bakteri tersebut dinyatakan sebagai heterofermentatif

sedangkan isolate yang tidak menghasilkan atau memprodksi gas disebut

homofermentatif (Suryani, 2008 dalam Nasution 2012).

Secara umum ada empat kelompok fermentasi yang penting secara ekonomi :

1. Fermentasi yang memproduksi sel mikroba (biomass)

Produk komersial dari biomass dapat dibedakan menjadi produksi yeast

untuk industri roti, dan produksi sel mikroba untuk digunakan sebagai

makanan manusia dan hewan.

2. Fermentasi yang menghasilkan enzim dan mikroba

Secara komersial, enzim dapat diproduksi oleh tanaman, hewan, dan

mikroba, namun enzim yang diproduksi oleh mikroba memiliki

beberapa keunggulan yaitu, mampu dihasilkan dalam jumlah besar dan

mudah untuk meningkatkan produktivitas bila dibandingkan dengan

tanaman atau hewan.

9

3. Fermentasi yang menghasilkan metabolit

Metabolit dapat dibedakan menjadi metabolit primer dan metabolit

sekunder. Produk metabolisme primer yang dianggap penting contohnya.

etanol, asam sitrat, polisakarida, aseton, butanol,dan vitamin. Sedangkan

metabolit sekunder yang dihasilkan mikroba contohnya antibiotik,

pemacu pertumbuhan, inhibitor enzim, dan lain-lain.

4. Proses Transformasi

Sel mikroba dapat digunakan untuk mengubah suatu senyawa menjadi

senyawa lain yang masih memiliki kemiripan struktur namun memiliki

nilai komersial yang lebih tinggi. Proses tranformasi dengan

menggunakan mikroba ini lebih baik bila dibandingkan dengan proses

kimia, berkaitan dengan penggunaan reagen kimia yang lebih sedikit.

Selain itu proses dapat berlangsung pada suhu rendah tanpa

membutuhkan katalis logam berat yang berpotensi menimbulkan

kerugian (Gandjar dkk, 2006).

C. Growol

Growol merupakan makanan fermentasi tradisional yang terbuat dari ketela dan

mempunyai rasa asam. Jenis makanan ini banyak dibuat di daerah Yogyakarta

khususnya Kulon Progo dan daerah sekitarnya. Proses pembuatan growol

berlangsung selama 4 hari yaitu dengan cara merendam ketela yang telah dikupas

dan diiris kecil-kecil di dalam air selama 4 hari, kemudian ditiriskan dan

dihancurkan sebelum akhirnya dikukus. Berikut growol seperti yang terlihat pada

Gambar 1.

10

Gambar 1. Growol

Selama perendaman ini terjadi fermentasi alami, berbagai jenis mikrobia yang

tumbuh pada awal fermentasi adalah Coryneform, Streptococcus, Bacillus,

Actinobacter, yang selanjutnya diikuti oleh Lactobacillus dan yeast sampai akhir

fermentasi. Selama proses fermentasi, bakteri asam laktat yang paling dominan

tumbuh, bakteri tersebut bersifat anaerob, amilolitik dan fermentatif. Jumlah

bakteri asam laktat pada growol tiap gramnya sebesar 1,64 ×10 6 (Suharni, 1984).

Jumlah BAL tersebut dapat mempertahankan keseimbangan mikroflora usus yang

sehat, bahwa bakteri probiotik harus hidup untuk dapat memberikan efek

kesehatan dan terdapat dalam konsentrasi minimal 10 6 cfu/g produk (Shah,

2001). Beberapa keuntungan Lactobacillus casei subsp.rhamnosus TGR2 yang

diisolasi dari growol adalah sifat metabolit ekstraseluler yang tetap stabil pada

suhu kamar, pada pemanasan 98ºC tahan selama 30 menit, pH 3 – 8, pada

pemanasan 2ºC selama 5 menit dan pada suhu 4ºC selama 2 hari (Rahayu, 1995).

D. Pati (amilum)

Pati adalah karbohidrat yang merupakan polimer glukosa, dan terdiri atas

amilosa dan amilopektin (Jacobs dan Delcour 1998). Struktur Amilum dapat

dilihat pada Gambar 2.

11

Gambar 2. Struktur Amilum

Pati dapat diperoleh dari biji- bijian, umbi-umbian, sayuran, maupun buah-

buahan. Sumber alami pati antara lain adalah jagung, labu, kentang, ubi jalar,

pisang, barley, gandul, beras, sagu, amaranth, ubi kayu, ganyong, dan sorgum.

Pemanfaatan pati asli masih sangat terbatas karena sifat fisik dan kimianya

kurang sesuai untuk digunakan secara luas. Oleh karena itu, pati akan

meningkat nilai ekonominya jika dimodifikasi sifat-sifatnya melalui perlakuan

fisik, kimia, atau kombinasi keduanya (Liu et al., 2005).

Pati singkong adalah pati yang didapatkan dari umbi singkong (Manihot

utilissima). Sampai saat ini, pati singkong telah banyak dieksploitasi secara

komersial dan masih merupakan sumber utama kebutahan pati. Pati yang

diperoleh dari ekstraksi umbi singkong ini akan memberikan warna putih jika

diekstraksi secara benar. Pati singkong memiliki granula dengan ukuran 5-35

μm dengan rata-rata ukurannya di atas 17 μm (Samsuri, 2008). Kandungan gizi

pati singkong dapat dilihat pada Tabel 1 dan pati singkong dapat dilihat pada

Gambar 3.

12

Gambar 3. Pati Singkong

Tabel 1. Kandungan Gizi Pati Singkong per 100gr

Komposisi Satuan Jumlah

Kalori Kcal 363Karbohidrat % 88,2kadar air % 9,0Lemak % 0,5Protein % 1,1Kalsium mg 84Fosfor mg 1225Besi mg 1,0Vitamin B1 mg 0,4Vitamin C mg 0

Sumber : (Soemarno, 2007)

E. Bakteri

Bakteri merupakan organisme bersel tunggal yang hidup bebas tanpa klorofil dan

memiliki DNA maupun RNA. Sebagian besar bakteri berukuran kecil, yaitu

hanya beberapa micron saja (Gupte, 1990). Beberapa kelompok memiliki

flagella dan dapat bergerak aktif. Bakteri memiliki berat jenis 1.05 – 1.1 g cm-3

dan berat sekitar10-12 g. Ukuran aktual tergantung dari laju pertumbuhan, media

tumbuh, dan sebagainya. Ada tiga bentuk dasar bakteri, yaitu bentuk bulat atau

kokus, bentuk batang silindris, bentuk lengkung atau vibril. Bentuk bakteri

13

dipengaruhi oleh umur dan syarat pertumbuhan tertentu (Hidayat dkk, 2006).

Berikut struktur sel bakteri seperti yang terlihat pada Gambar 4.

Gambar 4. Struktur Sel Bakteri (Honeyman, 2001).

1. Fase pertumbuhan mikroorganisme

Ada empat macam fase pertumbuhan mikroorganisme yaitu fase lag, fase log

(fase eksponensial), fase stasioner, dan fase kematian:

a. Fase lambat (lag phase)

Fase lambat mengikuti inokulasi media nutrient, dan dapat merupakan

periode adaptasi. Bila suatu biakan dipindahkan dari suatu lingkungan

yang lain, maka mikroba itu perlu mengorganisasi kembali konstituen

mikro dan makromolekulnya. Selama fase ini massa sel mungkin saja

bertambah tanpa diikuti oleh pertumbuhan jumlah sel.

b. Fase Eksponensial (log phase)

Fase eksponensial merupakan fase pertumbuhan sel, ini merupakan

periode pertumbuhan yang stabil atau keadaan pertumbuhan yang tenang

dan laju pertumbuhan spesifiknya tetap. Komposisi kimia total cairan

14

fermentasinya sedang berubah, sebab nutrien-nutrien sedang dikonsumsi

mikroba dan produk-produk metabolik sedang diproduksi.

c. Fase Seimbang (stationary phase)

Fase seimbang ini terjadi bila semua sel telah mencapai kesetimbangan

dengan sel-sel yang mati. Pada inkubasi lebih lanjut, beberapa hal

mungkin dapat terjadi. Meskipun pertumbuhan bersihnya telah berhenti,

di sana masih mungkin terjadi metabolisme dan mengakumulasikan

produk-produk dalam sel atau cairan fermentasi. Massa total sel

mungkin tetap tetapi jumlah sel yang hidup mungkin menurun

(Supartono dkk, 2008).

f. Fase Kematian

Jumlah sel yang mati telah meningkat dan lebih banyak dari jumlah sel

yang hidup, faktor penyebabnya adalah ketidaktersediaan nutrisi dan

akumulasi produk buangan yang bersifat toksik (Pratiwi, 2007). Berikut

fase pertumbuhan bakteri dapat dilihat pada Gambar 5. seperti yang

terlihat dibawah ini :

Gambar 5. Fase pertumbuhan mikroorganisme (Pratiwi, 2007)

15

2. Identifikasi Bakteri

Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan cara mengamati morfologi sel,

pewarnaan gram, dan melakukan uji biokimia. Bentuk bakteri dibedakan menjadi

3 yaitu bentuk bulat (kokus), bentuk batang (basil), dan bentuk spiral (Pelczar dan

Chan, 1998). Basil berbentuk serupa tongkat pendek silindris, sebagian besar

bakteri berbentuk basil yang dapat bergandeng-gandeng panjang, bergandeng

dua-dua atau terlepas satu sama lain. Kokus merupakan bakteri dengan bentuk

menyerupai bola-bola kecil. Golongan ini tidak sebanyak golongan basil.

Sedangkan untuk bakteri spiral memiliki bentuk yang bengkok atau berbengkok-

bengkok menyerupai spiral. Bakteri golongan ini merupakan golongan yang

jumlahnya paling sedikit (Dwidjoseputro, 2005).

F. Bakteri Asam Laktat (BAL)

BAL merupakan bakteri Gram positif berbentuk kokus atau batang tidak

membentuk spora dan memiliki suhu optimum ±400 C. Pada umumnya non-motil

karena kemampuan biosintesisnya sangat terbatas, bersifat anaerob dan oksidasi

positif. BAL memiliki beberapa sifat khusus, anatra lain mampu tumbuh pada

kadar gula, alkohol, dan garam yang tinggi, mampu memfermentasikan

monosakarida dan disakarida (Syahrurahman, 2007 dalam Nasution 2012).

Berikut perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, seperti

yang terlihat pada Tabe 2. di bawah ini :

16

Tabel 2. Perbedaan bakteri gram positif dan gram negatif.

No Sifat Bakteri grampositif

Bakteri gramnegatif

1. Komposisi dinding sel Kandungan lipidrendah (1-4%)

Kandungan Lipidtinggi (11-22%)

2. Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan lama

3. Penghambat oleh pewarna biasa(misalnya violet kristal)

Lebih dihambat Kurang dihambat

4. Kebutuhan nutrien Kebanyakanspesies relatifkompleks

Relatif sederhana

5. Ketahanan terhadap perlakuanfisik

Lebih tahan Kurang tahan

(Fardiaz,1992).

BAL termasuk dalam kelompok bakteri yang memenuhi status GRAS (Generally

Recognized as Save), yaitu bakteri baik yang aman bagi manusia. Mekanisme

kerja BAL tidak membusukkan protein, melainkan bekerja dengan cara

memetabolisme berbagai jenis karbohidrat secara fermentative menjadi asam-

asam organik. Makanan atau produk pangan lainnya apabila telah tercemar oleh

BAL akan menjadi rusak karena asam-asam yang dihasilkan selama fermentasi

berlangsung dan jika bakteri pembusuk (bakteri pathogen) berada pada jumlah

yang lebih banyak dibandingkan jumlah BAL pada suatu produk pathogen, maka

produk tersebut akan menjadi busuk (Surono, 2004). Kondisi pH optimum BAL

adalah sekitar 4-5 sehingga bakteri asam laktat dapat berkompetitif dengan

bakteri lain terutama bakteri pathogen yang memiliki pH optimum 7,2-7,6

(Wibowo, 2012).

17

BAL terbagi menjadi delapan genus antara lain Lactobacillus, Streptococcus,

Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium, dan

Corinobacterium. Berdasarkan tipe fermentasinya, BAL terbagi menjadi

heterofermentatif yang menghasilkan asam laktat dan senyawa lain seperti CO2

dan homofermentatif menghasilkan asam laktat sebagai produk utama (Fardiaz,

1992).

Berdasarkan strain bakteri, suhu optimum pada pertumbuhan BAL juga beragam.

Beberapa suhu optimum dan berbagai jenis strain bakteri asam laktat yaitu:

Bakteri psikotropik (bakteri yang mampu tumbuh pada suhu 5o C atau

dibawahnya), seperti genus Leuconostoc dan beberapa spesies Lactobacillus

fakultatif heterofermentatif, khususnya Lactobacillus sake. Lactobacillus

bulgaricus dan Streptococcus thermophillus (kultur stater yogurt) dan beberapa

spesies Labtobacillus obligat homofermentatif tumbuh pada suhu optimum 45o C

dan tidak tumbuh pada suhu 15 o C. Beberapa strain bakteri asam laktat yang

memiliki sifat thermodhuric (tahan pada suhu tinggi) seperti Enterococcus dan

Streptococcus thermophillus dapat tumbuh pada suhu mencapai 50o C.

Berdasarkan suhu optimum dan suhu maksimum bakteri asam laktat secara

umum dibagi menjadi dua kelompok yaitu :

a) Bakteri Mesofilik, yaitu bakteri yang memiliki suhu optimum bagi

pertumbuhannya adalah 25oC dan suhu maksimum 37 oC-40 oC. Contoh

bakteri mesofilik adalah strain Lactococci dan Leuconostoc.

18

b) Bakteri Thermofilik, yaitu bakteri yang memliliki suhu optimum bagi

pertumbuhannya adalah 37 oC-45 oC dan suhu maksimum 45 oC-52 oC.

Contohnya adalah Streptococcus thermophiles (Surono, 2004).

G. Pengertian Asam Laktat

Asam laktat atau 2-hydroxypropanoic acid (CH3-CHOH-COOH) merupakan

senyawa kimia yang banyak digunakan dalam industri. Senyawa asam ini

mempunyai sifat antara lain tak berwarna sampai kekuningan, larut dalam air,

alkohol, eter dan korosif. Asam laktat digunakan sebagai bahan tambahan dalam

produk pangan, yaitu sebagai pengatur pH, bahan pengasam pada produk

kembang gula, jus, sirup, meningkatkan aroma dan rasa pada saus serta bumbu,

mengurangi resiko bakteri patogen pada produk daging. Selain itu asam laktat

juga digunakan sebagai bahan baku pada industri yang memproduksi senyawa

senyawa laktat, bahan baku pada industri farmasi sebagai larutan pengental dan

pembuatan tablet. Industri kosmetik sebagai pencampur zat yang membuat kulit

tampak bercahaya dan zat anti jerawat. Industri kimia sebagai pengatur pH,

penertal dan zat pembersih. Sebanyak 70% dari total asam laktat yang

diperdagangkan digunakan dalam makanan dan pengolahan makanan sebagai

pengatur pH, bahan pengawet dan buffer agent (Jin Bo et al., 2005).

Asam laktat di alam ada dalam dua bentuk optik isomer, yaitu D(-) lactic acid

dan L(+) lactic acid. D(-) lactic acid merupakan isomer yang dapat meracuni

manusia sedangkan L(+) lactic acid adalah isomer yang dipilih untuk makanan

dan industri farmasi karena tubuh manusia hanya menghasilkan enzim L-lactate

19

dehygronase. Isomer L(+) lactic acid juga merupakan bahan pembuatan poly

lactic acid (PLA) (Jin Bo et al., 2005).

H. Probiotik

Probiotik adalah mikroba hidup yang sangat menguntungkan bagi sel inang

karena dapat meningkatkan keseimbangan mikroflora usus. Seleksi mikroba

khususnya BAL sangat diperlukan untuk mendapatkan strain-strain probiotik

yang unggul. Hal tersebut dikarenakan tidak semua BAL berpotensi sebagai

probiotik (Fuller, 1989). Definisi lain probiotik menurut Winarno (2003) adalah

suatu preparat yang terdiri dari mikroba hidup yang dimasukkan ke dalam tubuh

manusia atau ternak secara oral. Probiotik diharapkan mampu memberikan

pengaruh positif terhadap kesehatan manusia atau ternak, dengan cara

memperbaiki sifat-sifat yang dimiliki oleh mikroba alami yang tinggal di dalam

saluran pencernaan makhluk hidup.

Banyak sekali manfaat kesehatan dari produk probiotik, antara lain meningkatkan

ketahanan terhadap penyakit infeksi saluran pencernaan dan menurunkan

risiko terjadinya tumor dan kanker kolon (Roos dan Katan, 2000; Rolfe, 2000),

menurunkan konsentrasi kolestrol serum darah (Rodas et al., 1996; Alkalin et

al.,1997), mengurangi reaksi lactose intolerance, menurunkan tekanan darah

antihipertensi, mempengaruhi respon imun, bersifat antimutagenik, serta bersifat

antikarsinogenik (Fernandes dan Shahani, 1990).

20

I. Enzim

Menurut kuhne (1878), enzim berasal dari kata in-zyme yang berarti sesuatu

didalam ragi. Berdasarkan penelitian maka dapat disimpulkan bahwa enzim

adalah suatu protein yang berupa molekul-molekul besar, yang berat molekulnya

ribuan. Sebagai contoh enzim katalase berat molekulnya 248.000 sedang enzim

urese beratnya adalah 438.000. Pada enzim terdapat bagian protein yang tidak

tahan panas yaitu disebut dengan apoenzim, sedangkan bagian yang bukan

protein adalah bagian yang aktif dan diberi nama gugus prostetik, biasanya

berupa logam seperti besi, tembaga, seng atau suatu bahan senyawa organik yang

mengandung logam. Apoenzim dan gugus prostetik merupakan suatu kesatuan

yang disebut holoenzim, tetapi ada juga bagian enzim yang apoenzim dan gugus

prospetiknya tidak menyatu. Contoh koenzim adalah vitamin atau bagian vitamin

misalnya : vitamin B1, B2, B6, niasin, dan biotin (Kartasapoetra, 1994).

Enzim merupakan substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan berperan

sebagai katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme.

Katalisator adalah substansi yang mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi,

substansi tersebut tidak berubah. Enzim mempunyai ciri dimana kerjanya

dipengaruhi oleh lingkungan. Salah satu lingkungan yang berpengaruh terhadap

kerja enzim adalah pH. Enzim mempunyai pH optimal sekitar pH 7 dan jika

medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi

(Gaman and Sherrington, 1994).

Ada beberapa faktor untuk menentukan aktivitas enzim berdasarkan efek

katalisnya yaitu persamaan reaksi yang dikatalis, kebutuhan kofaktor, pengaruh

21

konsentrasi substrat dan kofaktor, pH optimal, daerah temperatur, dan penentuan

berkurangnya substrat atau bertambahnya hasil reaksi. Penentuan ini biasa

dilakukan di pH optimal dengan konsentrasi substrat dan kofaktor berlebih,

menjadikan laju reaksi yang terjadi merupakan tingkat ke 0 (zero order reaction)

terhadap substrat. Pengamatan reaksinya dengan berbagai cara kimia atau

spektrofotometri. Ada dua teori tentang mekanisme pengikatan substrat oleh

enzim, yaitu teori kunci dan anak kunci (lock and key) dan teori induced fit

(Wirahadikusumah, 1989).

Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah

(Dwidjoseputro, 2005) :

1. Suhu

Oleh karena reaksi kimia itu dapat dipengaruhi suhu maka reaksi

menggunakan katalis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Di samping

itu, karena enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat

menyebabkan denaturasi dan bagian aktig enzim akan terganggu

sehingga konsentrasi dan kecepatan enzim berkurang.

2. pH

Umumnya enzim efektifitas maksimum pada pH optimum, yang

lazimnya berkisar antara pH 4,5-8.0. Pada pH yang terlalu tinggi atau

terlalu rendah umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversibel

karena menjadi denaturasi protein.

3. konsentrasi enzim

Seperti pada katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang menggunakan

enzim tergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada suatu

22

konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksibertambah dengan

bertambahnya konsentrasi enzim.

4. konsentrasi substrat

Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi substrat akan

menaikkan kecepat reaksi. Akan tetapi, pada batas tertentu tidak terjadi

kecepatan reaksi, walaupun konsenrasi substrat diperbesar.

5. zat-zat penghambat

Hambatan atau inhibisi suatu reaksi akan berpengaruh terhadap

penggabungan substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan.

J. Enzim Amilase

Salah satu enzim yang diperlukan untuk pertumbuhan adalah amilase. Amilase

dapat diartikan sebagai segolongan enzim yang merombak pati, glikogen, dan

polisakarida yang lain. Tumbuhan mengandung α dan ß amilase; hewan memiliki

hanya α amilase, dijumpai dalam cairan pankreas dan juga (pada manusia dan

beberapa spesies lain) dalam ludah. Amilase memotong rantai polisakarida yang

panjang, menghasilkan campuran glukosa dan maltosa. Amilosa merupakan

polisakarida yang terdiri dari 100-1000 molekul glukosa yang saling berikatan

membentuk rantai lurus. Dalam air, amilosa bereaksi dengan iodine memberikan

warna biru yang khas. Pada manusia, α amilase pada ludah dan pankreas berguna

dalam hidrolisis pati yang terkandung dalam makanan ke dalam bentuk

oligosakarida, di mana dalam perubahan tersebut dapat dihidrolisis oleh

disakarida atau trisakarida dalam jumlah kecil. Contohnya, α amilase pada

23

mamalia memiliki pH optimum 6-7, bergantung pada ada atau tidaknya ion

halogen (Kartasapoetra, 1994).

Sumber enzim Amilase (alfa, beta dan glukoamilase) merupakan enzim yang

penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase dapat diperoleh dari

berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. Saat ini

sejumlah enzim amilase telah diproduksi secara komersial. Penggunaan mikrobia

dianggap lebih prosepektif karena mudah tumbuh, cepat menghasilkan dan

kondisi lingkungan dapat dikendalikan ( Pujiyanti, 2007 ).

Produksi enzim amilase dapat menggunakan berbagai sumber karbon. Contoh-

contoh sumber karbon yang murah adalah sekam, molase, tepung jagung, jagung,

limbah tapioka dan sebagainya. Jika digunakan limbah sebagai substrat, maka

limbah tadi dapat diperkaya nutrisinya untuk mengoptimalkan produksi enzim.

Sumber karbon yang dapat digunakan sebagai suplemen antara lian : pati,

sukrosa, laktosa, maltosa, dekstrosa, fruktosa, dan glukosa. Sumber nitrogen

sebagai suplemen antara lain : pepton, tripton, ekstrak daging, ekstrak khamir,

amonium sulfat, tepung kedelai, urea dan natrium nitrat (Kartasapoetra, 1994).

K. Spektrofotometer UV-VIS

Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang, intensitas sinar

ultraviolet, dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan

cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada

kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis biasanya

digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan.

Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi

24

tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini sangat berguna untuk

pengukuran secara kuantitatif. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang

200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800

nm. Kebanyakan penerapan spektrofotometri UV-Vis pada senyawa organik

didasarkan n-π* ataupun π-π* karena spektrofotometri UV-Vis memerlukan

hadirnya gugus kromofor dalam molekul itu. Transisi ini terjadi dalam daerah

spektrum (200-700 nm) yang nyaman untuk digunakan dalam eksperimen.

Spektrofotometer UV-Vis yang komersial biasanya beroperasi dari sekitar 175 nm

atau 200-1000 nm. Identifikasi kualitatif senyawa organik dalam daerah ini jauh

lebih terbatas daripada dalam daerah inframerah. Ini karena pita serapan terlalu

lebar dan kurang terinci. Tetapi, gugus-gugus fungsional tertentu seperti karbonil,

nitro, sistem tergabung, benar-benar menunjukkan puncak yang karakteristik, dan

sering dapat diperoleh informasi yang berguna mengenai ada tidaknya gugus

semacam itu dalam molekul tersebut (Day dan Underwood, 1986).

Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert Beer, yaitu bila

cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya

tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It)

(Seran, 2012).

Bagian-bagian dan cara kerja spektroskopi UV-VIS

Fungsi masing-masing bagian:

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan

berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk spektrofotometer UV

menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavy hidrogen,

spektrofotometer VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu

25

wolfram, spektrofotometer UV-VIS menggunakan photodiode yang telah

dilengkapi monokromator.

2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu

mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya

monokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalah

gratting atau lensa prisma dan filter optik.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel UV, VIS, dan UV-VIS

menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari

kuarsa atau gelas, kuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1

cm.

4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel, dan

mengubahnya menjadi arus listrik.

5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat

listrik yang berasal dari detektor.

Cara kerja alat spektrofotometer UV-Vis yaitu sinar dari sumber radiasi

diteruskan menuju monokromator. Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah

melalui sampel dengan sebuah cermin berotasi. Detektor menerima cahaya dari

sampel secara bergantian secara berulang-ulang. Sinyal listrik dari detektor

diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya, selanjutnya perhitungan dilakukan

dengan komputer yang sudah terprogram (Harjadi, 1993). Skema alat

spektroskopi UV-VIS dapat dilihat pada Gambar 6.

26

Gambar 6. Skema alat spektroskopi UV-VIS (Seran, 2012).

L. Metode Fuwa

Pengujian aktivitas amilase dengan metode Fuwa. Aktivitas amilase ditentukan

dengan metode Fuwa (Fuwa, 1954). Metode ini berdasarkan pada pengurangan

jumlah pati hingga menghasilkan warna bening. Uji Fuwa merupakan uji yang

paling spesifik untuk mengidentifikasi aktivitas amilase karena waktu inkubasi

yang dibutuhkan hanya 10 menit. Semakin kecil absorbansi sampel maka akan

semakin baik aktivitas dari enzim tersebut.

M. Aktivitas Antimikroba dan Efeknya

Antibakteri adalah senyawa yang digunakan untuk mengendalikan pertumbuhan

bakteri yang bersifat merugikan. Pengendalian pertumbuhan mikroorganisme

bertujuan untuk mencegah penyebaran penyakit dan infeksi, membasmi

mikroorganisme pada inang yang terinfeksi, dan mencegah pembusukan serta

perusakan bahan oleh mikroorganisme (Sulistyo, 1971). Antimikrobia meliputi

golongan antibakteri, antimikotik, dan antiviral (Ganiswara, 1995).

Mekanisme penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri oleh senyawa

antibakteri dapat berupa perusakan dinding sel dengan cara menghambat

27

pembentukannya atau mengubahnya. Setelah selesai terbentuk, perubahan

permeabilitas membran sitoplasma sehingga menyebabkan keluarnya bahan

makanan dari dalam sel, perubahan molekul protein dan asam nukleat,

penghambatan kerja enzim, dan penghambatan sintesis asam nukleat dan protein.

Di bidang farmasi, bahan antibakteri dikenal dengan nama antibiotik, yaitu suatu

substansi kimia yang dihasilkan oleh mikroba dan dapat menghambat

pertumbuhan mikroba lain. Senyawa antibakteri dapat bekerja secara

bakteriostatik, bakteriosidal, dan bakteriolitik (Pelczar dan Chan, 1988).

Menurut Madigan dkk. (2000), berdasarkan sifat toksisitas selektifnya, senyawa

antimikrobia mempunyai 3 macam efek terhadap pertumbuhan mikrobia yaitu:

1. Bakteriostatik memberikan efek dengan cara menghambat pertumbuhan

tetapi tidak membunuh. Senyawa bakterostatik seringkali menghambat

sintesis protein atau mengikat ribosom. Hal ini ditunjukkan dengan

penambahan antimikrobia pada kultur mikrobia yang berada pada fase

logaritmik. Setelah penambahan zat antimikrobia pada fase logaritmik

didapatkan jumlah sel total maupun jumlah sel hidup adalah tetap.

2. Bakteriosidal memberikan efek dengan cara membunuh sel tetapi tidak terjadi

lisis sel atau pecah sel. Hal ini ditunjukkan dengan penambahan antimikrobia

pada kultur mikrobia yang berada pada fase logaritmik. Setelah penambahan

zat antimikrobia pada fase logaritmik didapatkan jumlah sel total tetap

sedangkan jumlah sel hidup menurun. Bakteriolitik menyebabkan sel

menjadi lisis atau pecah sel sehingga jumlah sel berkurang atau terjadi

kekeruhan setelah penambahan antimikrobia. Hal ini ditunjukkan dengan

penambahan antimikrobia pada kultur mikrobia yang berada pada fase

28

logaritmik. Setelah penambahan zat antimikrobia pada fase logaritmik,

jumlah sel total maupun jumlah sel hidup menurun. Mekanisme

penghambatan antibakteri dapat dikelompokkan menjadi lima, yaitu

menghambat sintesis dinding sel mikrobia, merusak keutuhan dinding sel

mikrobia, menghambat sintesis protein sel mikrobia, menghambat sintesis

asam nukleat, dan merusak asam nukleat sel mikrobia (Sulistyo, 1971).

Daya antimikrobia diukur secara in vitro agar dapat ditentukan kemampuan

suatu zat antimikrobia (Jawetz , 2001). Adanya fenomena ketahanan

tumbuhan secara alami terhadap mikrobia menyebabkan pengembangan

sejumlah senyawa yang berasal dari tanaman yang mempunyai kandungan

antibakteri dan antifungi (Griffin, 1981).

N. Metode Difusi

Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan metode

pengenceran. Disc diffusion test atau uji difusi disk dilakukan dengan mengukur

diameter zona bening (clear zone) yang merupakan petunjuk adanya respon

penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu senyawa antibakteri dalam ekstrak.

Syarat jumlah bakteri untuk uji kepekaan/sensitivitas yaitu 105-108 CFU/mL

(Hermawan dkk., 2007).

Metode difusi merupakan salah satu metode yang sering digunakan. Metode

difusi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu metode silinder, metode lubang atau

sumuran dan metode cakram kertas. Metode lubang/sumuran yaitu membuat

lubang pada agar padat yang telah diinokulasi dengan bakteri. Jumlah dan letak

29

lubang disesuaikan dengan tujuan penelitian, kemudian lubang diinjeksikan

dengan ekstrak yang akan diuji. Setelah dilakukan inkubasi, pertumbuhan bakteri

diamati untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan di sekeliling lubang

(Kusmayati dan Agustini, 2007).

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2017- April 2018, bertempat di

Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia dan Laboratorium Mikrobiologi Jurusan

Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

Laboratorium Biokimia Jurusan kimia Universitas Lampung digunakan untuk

proses isolasi sampai mendapatkan isolat tunggal BAL amilolitik, sedangkan

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Universitas Lampung digunakan

untuk proses karakterisasi BAL amilolitik.

B. Alat dan Bahan

1. Alat-alat yang digunakan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas, mikropipet,

autoclave (model S-90N), laminar air flow (CURMA model 9005-FL),

spektrofotometer UV-VIS, pH meter, timbangan digital, sentrifuse, incubator,

shaker incubator, Mikroskop, vortex-mixer, thermometer, penangas air, lemari

pendingin, mikroskop, pembakar spritus, oven, kertas cakram, Hot Plate stirrer,

magnetic stirrer, kaca preparat, kasa, kapas, rak tabung , spreader, dan jarum ose.

31

2. Bahan-bahan yang digunakan

Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah NaCl, pepton, yeast ektract, de

Man Rogosa Sharp Agar (MRSA), starch soluble, Nutrien Agar (NA), CaCO3,

Natrium azida, NaOH, HCL, safranin, akuades, air salin, iodine, KI2, kristal violet

MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, alkohol, akuades, dan air fermentasi growol.

C. Prosedur Penelitian

1. Tahap Persiapan

Seluruh alat gelas yang digunakan dicuci, dikeringkan dan disterilisasi

menggunakan autoclave selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm.

Sterilisasi ini bertujuan untuk menghilangkan mikroba dan pengotor.

a. Pembuatan air salin

Air salin di buat dengan cara menimbang 0,85 gram NaCl dilarutkan

dalam 100 ml akuades lalu disterilkan dengan autoclave selama 15 menit

dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm.

b. Pembuatan Medium Padat de Man Rogose sharp Agar (MRSA)

Medium ini disiapkan dengan cara menimbang 6,2 gram MRSA,

dilarutkan dalam 100 mL air salin, lalu disterilisasi dengan autoclave

selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm. kemudian di

tuang ke dalam cawan petri dan dibiarkan sampai mengeras.

c. Pembuatan Medium Kultur Cair

Medium ini disiapkan dengan cara menimbang 5 gram pati terlarut, 5 gram

pepton, 5 gram yeast ekstrak. 0,5 gram MgSO4.7H2O, 0,01 gram

FeSO4.7H2O dan 0,01 gram NaCl dilarutkan dalam 1000 mL aquades,

32

dipanaskan sampai homogen, lalu disterilisasi dengan autoclave selama 15

menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm. Medium yang telah

disterilisasi kemudian didinginkan.

d. Pembuatan Medium Penyimpanan

Pembuatan medium penyimpanan agar miring. Cara membuatnya yaitu

dengan cara menyiapkan 10 gram pati larut, 10 gram pepton, 5 gram yeast

extract, dan 15 gram agar pada 1000 ml akuades aquades. Dipanaskan

sampai homogen, dimasukan ke dalam tabung reaksi, dan ditutup dengan

sumbat. Medium tersebut kemudian disterilisasi dengan autoclave selama

15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm. Medium yang telah

disterilisasi diberi label nama (jenis media) dan diletakan miring. Medium

dapat digunakan setelah 3 sampai 4 hari dan telah mengeras seperti agar.

e. Pembuatan Medium Pati Agar

Pembuatan medium ini digunakan untuk uji amilolitik, medium ini

disiapkan dengan cara 10 gram pati larut, 10 gram pepton, 5 gram yeast

extract, dan 15 gram agar pada 1000 ml akuades. Kemudian disterilisasi

dengan autoclave selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm.

kemudian di tuang ke dalam cawan petri dan dibiarkan sampai mengeras

Putri (2012).

f. Persiapan sampel

Pada penelitian ini bahan baku singkong berasal dari desa Pujodadi,

Kecamatan Trimurjo Kabupaten Lampung Tengah Provinsi Lampung.

Proses diawali dengan sortasi bahan baku, yaitu pemilihan singkong yang

masih segar dengan kondisi fisik yang masih utuh, kemudian dikupas.

33

Bahan singkong yang telah dikupas dipotong-potong dengan ukuran ± 5

cm, sehingga diperoleh ukuran bahan yang seragam. Selanjutnya

dilakukan pencucian hingga 2-3 kali dengan air mengalir. Singkong yang

telah bebas dari kontaminan direndam dengan menggunakan air sumur

dengan perbandingan 1: 3 (b:v) selama empat hari (Luwihana, 2011).

Sampel yang digunakan pada penelitian ini dibuat secara mandiri sebelum

dilakukanya proses isolasi.

g. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas α-amilase metode Fuwa

1. Pereaksi Iodin

Dimasukan 2 gram KI dalam labu takar 100 mL dan dilarutkan

dalam 10 mL akuades, ditambahakan 0,2 gram I2. Kemudian

ditambahkan akuades sampai btas miniskus.

2. Larutan Pati

0,1 gram pati dilarutkan dalam 100 mL akuades dan dipanaskan

hingga larut.

3. Larutan HCL

Dihitung pengenceran HCL pekat 12 N menjadi 1N. Maka akan

Diperoleh 8,3 mL HCL pekat yang akan ditambah akuades hingga

batas miniskus pada labu ukur 100 mL.

2. Isolasi Mikroba dari Air Proses Fermentasi Growol

Isolasi dilakukan dengan menggunakan medium padat MRSA dengan

pengenceran bertingkat dengan Metode Spread Plate. Sampel berupa air

rendaman pada proses fermentasi growol selama 4-5 hari. Sampel berupa 1 mL

34

air rendaman growol yang diencerkan sampai 10 kali. Proses pengenceran

bertujuan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi

dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran

tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Pada proses

pengenceran digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran pertama

dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel

mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Cara kerja pengenceran

bertingkat yaitu sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung

reaksi pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi

suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1:9

dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah

termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan

mengocoknya. Satu ml diambil dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian

dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan

membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan

dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang

perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap

tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya

bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama

(ferdiaz, 1992). Selanjutnya 1 seri disetiap pengenceran diambil sebanyak 200 µL

dengan menggunakan mikropipet. Kemudian 200 µL sampel pengenceran

ditanamkan pada masing-masing plate yang berisi medium padat MRSA dan

diratakan dengan metode spreader. Inkubasi dilakukan selama 24-48 jam untuk

mengetahui pertumbuhan mikroba pada medium MRSA.

35

3. Koleksi Koloni Tunggal Hasil Isolasi

Dilakukan koleksi koloni tunggal dari hasil isolasi dengan streak plate method

pada medium MRSA. Bakteri isolat ditanamkan pada medium MRSA dengan

menggoreskan bakteri secara zig-zag dengan jarum ose. Cara ini dilakukan

dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose steril yang telah disiapkan diletakkan pada

sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi

media steril MRSA. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis

horisontal disatu cawan. Ose disterilkan kembali dengan api bunsen. Setelah

kering, ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi

cawan ke dua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.

Diinkubasi selama 24-48 jam untuk mendapatkan koloni tunggal selektif yang

diinginkan.

4. Penyimpanan Isolat

Setelah didapatkan koloni tunggal dari metode Streak Plate, dilakukan

penyimpanan dengan cara menanamkan bakteri pada medium agar miring MRSA

dengan metode zig-zag dan agar tegak dengan metode tusuk. Setelah ditanam

medium agar miring dan agar tegak diinkubasi disimpan dalam incubator sebagai

stok.

5. Uji Hidrolisi Pati BAL Amilolitik dengan metode Iodin

Isolat BAL di goreskan pada MRSA dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24-

48 jam. Selanjutnya diambil dan digoreskan dalam bentuk garis lurus pada media

pati agar. Masing masing petri yang berisi isolat dituangi dengan larutan gram-

36

iodin untuk membentuk warna biru gelap karena terjadinya kompleks pati-iodin.

Koloni dengan kemampuan amilolitik akan menghidrolisis pati pada medium

disekeliling tempat tumbuhnya dan zona degradasi tidak terbentuk warna biru.

6. Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Waktu Optimum aktivitas EnzimAmilase

Setelah diperoleh ekstrak kasar enzim dilakukan pengukuran pertumbuhan

mikroba yang dikenal dengan pengukuran OD (Optical Density). Pengukuran OD

(Optical Density) dilakukan dengan cara sebanyak 0,3 mL kultur diencerkan

dengan menambah 2,7 mL akuades steril lalu dihomogenkan. Kemudian di

masukkan ke dalam kuvet, lalu diukur serapannya menggunakan

Spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 600 nm. Sedangkan untuk

blanko digunakan media Pati terlarut cair tanpa isolat sebanyak 0,3 mL lalu

ditambahkan 2,7 mL akuades steril (Anitha et al., 2012).

Aktivitas enzim α-amilase ditentukan dengan menggunakan metode iodin (Fuwa,

1954). Sebanyak 0,1 mL larutan enzim ditambahkan 0,4 mL aquades dan 0,5 mL

pati, kemudian diinkubasi pada suhu 60°C selama 10 menit. Reaksi dihentikan

dengan penambahan 0,1 mL HCl 0,25 M dan kemudian ditambahkan 0,25 mL

larutan iodin dan 4 mL akuades ke dalam campuran reaksi. Campuran tersebut

dihomogenkan dan diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-VIS

pada λ 600 nm. Kontrol dibuat dengan proses yang sama, namun menggunakan

0,25 mL larutan enzim yang sudah diinaktifkan. Penentuan aktivitas dengan

menggunakan metode iodin dilakukan pada tahapan isolasi, pemurnian dan

karakterisasi enzim.

37

7. Uji Aktivitas Amilase BAL Amilolitik secara Kuantitatif

Isolat yang analisis kualitatif amilolitiknya menunjukkan hasil positif diuji lebih

lanjut dengan analisis amilolitik kuantitatif. Masing-masing isolat berumur 24

jam diambil sebanyak 25 µL dan ditumbuhkan pada media pati terlarut cair media

cair. Diambil sebanyak 2 mL untuk diketahui profil degradasi pati. Untuk uji

degradasi pati 1 mL broth disentrifugasi untuk mengendapkan sel bakterinya,

kemudian supernatant diencerkan 100 kali dengan akuades. Sebanyak 10 mL

supernatan hasil pengenceran dimasukkan tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL

larutan gram iodin. Campuran dihomogenisasi dan absorbansi larutan yang

membentuk senyawa kompleks berwarna biru diukur dengan spektrometer pada

panjang gelombang 585-600 nm. Kadar pati dalam sampel dihitung menggunakan

persamaan garis yang didapatkan dari kurva standar, yaitu:

y = a + bx

Keterangan :

y = absorbansix = kadar pati.

8. Uji aktivitas antimikroba BAL Amilolitik

Dilakukan pengujian dengan metode difusi agar dimana mikroba hasil isolasi

sebagai kontrol. Media NA (Nutrien Agar) sebanyak 15 mL dituang ke dalam

cawan petri steril, diinokulasikan masing-masing suspensi bakteri uji E.coli

sebanyak 0,1 mL, dihomogenkan kemudian didiamkan beberapa saat hingga

memadat. Kemudian pada permukaan media agar diletakkan kertas cakram,

ditetesi masing-masing dengan mikroba hasil isolasi yang telah ditentukan

38

sebanyak 20 µL. Pengujian juga dilakukan terhadap kontrol positif menggunakan

kloramfenikol 30 µg/mL dan kontrol negatif dengan menggunakan akuades.

Cawan petri yang sudah diberi perlakuan dengan berbagai konsentrasi, kontrol

positif, dan kontrol negatif diinkubasi pada 35°C selama 24-48 jam. Daerah

bening di sekitar cakram menunjukkan adanya daerah hambatan bakteri.

Diameter daerah hambat (DDH) diukur dalam satuan milimeter (mm)

menggunakan penggaris.

9. Karaterisasi Mikroba BAL Amilolitik

Identifikasi mikroba BAL amilolitik yang diperoleh dari hasil isolasi dan skrining

dilakukan pengamatan sifat morfologi koloni menurut Metode Bergey’s Manual

Systematic Bacteriology (1923). Karakterisasi morfologi mikroba dapat berupa

pengamatan makroskopik dan pengamatan mikroskopik (Cappucino and Sherman,

2001).

a. Karakterisasi secara Makroskopis

Karakterisasi mikroba secara makroskopis dapat dilakukan dengan melihat

morfologi mikroba pada medium agar dalam cawan petri, pengamatan

morfologi tersebut meliputi pigmentasi, bentuk koloni, elevasi dan tepian

koloni.

b. Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram merupakan karakteristik mikroba secara mikroskopik.

Dengan cara, 1 ose mikroba diletakkan pada kaca preparat yang telah

dibersihkan dengan alkohol, diratakan hingga membentuk lapisan tipis.

39

Setelah kering, difiksasi dengan melewatkan kaca preparat di atas nyala api

spritus, kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet, setelah itu dicuci

dengan air mengalir, kemudian diteteskan larutan iodin, setelah beberapa saat

dibilas kembali menggunakan air mengalir, dicuci lagi menggunakan alkohol.

Setelah kering, ditambahkan beberapa tetes larutan safranin, dan didiamkan

selama 1 menit, dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian

dilakukan pengamatan menggunakan mikroskop. Selanjutnya diamati di

bawah mikroskop, bentuk dan penataan sel-selnya serta gramnya

(Cappuccino, 1983).

c. Uji Moltilitas

Moltilitas diamati dengan menggunakan medium semi padat Sulfide Indole

Moltility (SIM). Uji moltilitas dilakukan dengan cara menusukan 1 ose

mikroba secara tegak lurus hingga setengah tinggi dari media pada tabung

reaksi, kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu diperhatikan jejak

pergerakan mikroba, apabila terdapat serat-seat halus disekitar daerah tusukan

berarti mikroba tersebut moltil (Cappucino, 1983).

40

D. Diagram Alir Prosedur Penelitian

Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang

ditunjukkan dalam Gambar 7.

Gambar 7. Diagram Alir Penelitian

Isolasi dan Skrining MikroorganismeBAL amilolitik

Koleksi Isolat Tunggal BALAmilolitik

Penentuan Kurva Pertumbuhan danWaktu Optimum aktivitas BAL

Amilolitik

Uji Degradasi BAL

Penyimpanan Isolat BALAmilolitik Perpilih

Uji Antimikroba BALAmilolitik

Identifikasi MikroorganismeBAL Amilolitik

Data

SecaraMikroskopik

UjiMoltilitas

SecaraMakroskopik

V. KESIMPULAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat diperoleh kesimpulan

sebagai berikut :

1. Berdasarkan serangkaian proses isolasi dan skrining diperoleh 15 isolat

BAL amilolitik dan terpilih dua terbaik yaitu IG-8-7 dan IG-9-7

2. Isolat IG-8-7 dan isolat IG-9-7 memiliki IA berturut turut 6.0 dan 3.3.

3. Isolat IG-8-7 dan isolat IG-9-7 memiliki AU berturut turut 18.8 dan 16.6

U/ml.

4. Isolat IG-8-7 dan IG-9-7 memiliki aktivitas antimikroba dengan diameter

2.8 dan 2.2 cm.

5. Isolat IG-8-7 mempunyai aktivitas antimikroba berdiameter 2.8 cm lebih

baik dari kontrol positif kloramfenikol dengan zona hambat 2.5 cm.

6. Hasil karakterisasi menunjukan isolat IG-8-7 dan IG-9-7 diperkirakan

berjenis bacillus.

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka untuk penelitian selanjutnya

disarankan perlu dilakukan karakterisasi mikroba lebih lengkap seperti pengujian

66

sifat-sifat fisologis dan biokimianya untuk mengetahui spesifikasi bakteri yang

diperoleh pada penelitian yang dilakukan.

DAFTAR PUSTAKA

Agustin dan Anthoni. 2000. Isolasi Dan Karakterisasi Enzim AmylaseTermostabil Dari Bakteri Isolate. UNAN. Sumbar.

Buckle, K.A., R.A. Edwards, G.H. Fleet, M. Wootton. 2007. Ilmu pangan.Terj,dari Food science oleh Purnomo, H. & Adiono. UI-Press, Jakarta.

Camargo C, Colona, P Buleon A, and Molard D.R. 1988. Fungtional Properties ofSour Cassava (mahilot utilissima) Starch: Polvilho Azedo.”Journal of theScience of Food and Agriculture 81: 429-435.

Cappuccino, J. G. and Sherman, N. 2001. Microbiology: A Laboratory Manual.Addison-Wesley Publishing Company. New York.

Cartney, M.M. 1997. Enzymes probiotics and antioksidan. NewYork:Mediterranean synergy TM. Awarennes Corporation.USA.

Darkuni, Noviar. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi dan Mikologi). UMPress. Malang.

Day, R. A., dan Underwood, A. L. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi Kelima.Penerbit Erlangga. Jakarta.

Day, R.A., dan Underwood, A.L. 2001. Analisis Kimia Kuantitas. Erlangga.Jakarta.

Dillon, V.M. and P.E. Cook. 2000. Biocontrol of undesirable microorganisms infood. In: Dillon, V.M. and R.E. Board (eds). Natural AntimicrobialSystems and Food Preservation. Wallingford: CAB International.

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Dwiari, dan Sri .R . 2008. Teknologi Pangan Jilid 1. Jakarta.

Dwidjoseputro, D. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan.Jakarta.

Elvira, I., 2016. Karakterisasi Sifat Biokimia Isolat Bakteri Asam LaktatHasil Fermentasi Wikau Maombo. Skripsi.Fakultas Teknologi Dan

68

Industri Pertanian, Jurusan Teknologi Pangan, Universitas Halu Oleo.Kendari.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Fernandes, F. Custy and Shahani, M. Khem. 1990. Anticarcinogenic andImmunological Properties of Dietary Lactobacilli. Journal of FoodProtection: August 1990, Vol. 53, No. 8, pp. 704-710

Fuller, R. 1989. History and development of probiotics. In: Probiotics TheScientific Basis. Fuller. (Ed). Chapman & Hall. London, New York,Tokyo, Melbourne, Madras.

Fuwa, H. 1954. A New Method For Microdetermination Of Amylase Activity byThe Use of Amylase As The Subsratre. J. Biochem. 41: 583-603.

Gandjar, I., W. Sjamsuridzal dan Oetari, A. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan.Yayasan Obor Indonesia. Jakarta.

Ganiswara, G., S. 1995. Faramakologi dan Terapi Edisi IV. UI. Jakarta.

Gaman, P.M & K.B. Sherrington, 1994, Ilmu Pangan, Pengantar Ilmu Pangan,Nutrisi dan Mikrobiologi . UGM-Press. Yogyakarta.

Gibson, G. R., and Roberfroid, M. B. 1995. Dietary Modulation of The HumanColonic Microbiota. Introducing The Concept of Prebiotics. Journal ofNutrition 125, 1401-1412.

Griffin, D.H., 1981. Fungal Pshysiology. John wiley and sons. Inc. New York.

Guyot, JP, Brizuela MA, Rodriguez-Sanoya R, and Morlon-Guyot J. 2003.Characteri- zation and differentiation of Lactobacil- lus manihotivoransstrains isolatd from cassava sour starch. International Jour- nal of FoodMicrobiology 87: 187-192.

Harjadi, W. 1990. Ilmu Kimia Analitik Dasar. PT Gramedia. Jakarta.

Hermawan, A., Hana. W, danWiwiek, T. 2007. Pengaruh Ekstrak Daun Sirih(piper battle L) Terhadap Pertumbuhan staphylococcus dan Eschrichiacoli dengan Metode Diffusi Disk. Unair. Surabaya.

Hidayat, H., Sekarini, dan Mageswari, A. 2006. Mikrobiologi Industri. PenerbitAndi. Yogyakarta.

Honeyman, A.L., Friedman H., dan Bendinelli M. 2001. Staphylococcus aureusinfection and disease. Plenum Publishers. New York.

Hosono, T.K. 1989. Makanan Tradisional Nusantara. Gramedia. Jakarta.

69

Jawets, E., Melnick, J. L., Adelberg, E. A., 2001. Mikrobiologi kedokteran, EdisiXXII, diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas KedokteranUniversitas Airlangga, 205-209. Penerbit Salemba Medika. Jakarta.

Jawetz, E, J. melnick, Adelberg. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. EGC : Jakarta.

Jin Bo, Pinghe Yin, Yibong Ma, Ling Zha O, Production of Lactic Acid andFungal Biomassa by Rhizopus Fungi from Food Processing wasteStreams, Jurnal Ind. Microbiol. Biotechnol, 2005, 32: 678 – 686,Enviromental Biotechnology. Australi.

Johansson, ML, Sanni A, Lonner C, and Mo- lin G. 1995. Phenotypically-basedtaxonomy using API 50 CH of lactobacilli from Nigerian ogi, and theoccurrence of starch fermenting strains. Int J Food Microbiol 25:159–68.

Kartasapoetra, A.G, 1994, Teknologi Penanganan Pasca Panen. Rineka Cipta.Jakarta.

Khopkar. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI Press. Jakarta.

Kusmayati, Agustini, N.W.R. 2007. Uji Aktivitas Senyawa Antibakteri dariMikroalga (Porphyridium cruentum). J Biod. 8(1) : 48 – 53.

Kusumaningrum. 2015. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Amilolitikdari Industri Pengolahan Pati Sagu. Jurnal Jom Faperta. 2(1):5-15.

Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali. Jakarta.

Luwihana, S. (2011). Perubahan Kimia dalam Proses Pembuatan Beras Oyekdari Singkong, Ubijalar dan Kimpul. Seminar Nasional PATPI, 16-17September 2011, Manado.

Marcon, MJA, Vieira MA, Santo K, De Simas KN, Amboni RDMC, and AmanteER. 2006. The effect of fermentation oncassava starch microstructure.Journal of Food Process Engineering 29: 362–372.

Madigan, M.T., Martinko, J.M., dan Parker. J. 2000. Brock Biology ofMicroorganisms, 9 Edition. Prentice-Hall Inc. New Jersey.

Murphy, P. 2000. Handbook Of Hydrocolloids. Woodhead Publishing Ltd andCrc. Press Llc, New York.

Muttakaroh. 1998. Lactic Acid Bacteria in fermented food of Yogyakarta.Scription Faculty of Agricultural Technology. Gadjah Mada University,Yogyakarta.

Nasution, F. 2012. Identifikasi dan karakterisasi Bakteri Asam Laktat padakotoran ayam boiler sebagai agensi probiotik. Skripsi. UNM. Medan.

70

Ngatirah. 2000. Seleksi Bakteri Asam Laktat sebagai Agensia Probiotik YangBer-potensi Menurunkan Kolesterol. Tesis S-2. Pascasarjana. UGM,Yogyakarta.

Petrov K, Urshev Z, and Petrova P. 2008. L(+)-lactic acid production from starchby a novel amylolytic Lactococcus lactis subsp. lactis B84. FoodMicrobiology 25: 550– 557.

Pratiwi, S. 2007. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.

Pelczar, M. dan Chan, E. 1988, Dasar-dasar Mikrobiologi, UI-Press, Jakarta.

Poedjiadi, A., dan Suprayanti, T. 2006. Dasar Dasar Biokimia . UI-Press. Jakarta.

Pujiyanti, S. 2007. Menjelajah Dunia Biologi. Platinum. Jakarta.

Putri, W.D.R., Marseno D.W., dan Cahyanto, M N., 2012. Isolasi danKarakterisasi Bakteri Asam Laktat Amilolitik selama FermentasiGrowol, Makanan Tradisional Indonesia. Jurnal Teknologi Pertanian.1(13):52-60.

Rahayu, E.S., T.F Djafar, D Wibowo, and S Sudarmadji.1995. LaporanPenelitian: Isolasi Bakteri Asam Laktat dan Karakterisasi Agensia yangberpotensi sebagai Biosafety makanan Indonesia. PAU Pangan dan GiziUGM. Yogyakarta.

Racmawati, D. 2008. Mikroba Endofit Solusi Bahan Baku Obat yang Murah danRamah Lingkungan. Djambatan. Jakarta

Ray, B. and M. Daeschel. 1992. Food Biopreservatives of MicrobialOrigin. CRC Press. Boca Raton.

Reddy, G, Altaf MD, Naveena BJ, Venkateshwar M, and Kumar EV. 2008.Amylolytic bacterial lactic acid fermentation, a review. BiotechnologyAdvances 26: 22–34.

Rolfe, R. D. 2000. The Role of Probiotic Cultures In The Control OfGastrointestinal Health. J. of Nutr 2000; 130: S396-4024.

Rodas, B. Z. de, Gilliland, S. E., and Maxwell, C. V. 1996. HypocholesterolemicAction of L. acidophilus ATCC 43121 and Calcium in Swine withHypercholesterolemia Induced by Diet. J. Dairy Sci 79:2121-2128.

Roos, N. M. de, and Katan, M. B. 2000. Effect of Probiotic Bacteria onDiarrhea, Lipid Metabolism, and Carcinogenesis: A Review of PapersPublished between 1988 and 1998. Am J Clin Nutr. 71:405-411.

71

Rustan, Idha, R. 2013. Studi Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dariFermentasi cabai Rawit (capsicum fructencens L). Skripsi FakultasPertanian Universitas Hasanudin. Makasar

Salminen, S., Wright, AV., Ouwehand, A. 2004. Lactic Acid Bacteria. MarckelDekker. New York.

Seran, E. 2012. Pengertian Dasar Spektrofotometer Vis, UV, UV-Vis.Https://wanibesak.wordpress.com/2011/07/04/pengertian-dasar-spektrofotometer-vis-uv-uv-vis/. Diakses pada tanggal 23 Februari 2017pukul 10.44 WIB.

Sukarminah, E., D.M. Sumanti dan I. Hanidah. 2010. Mikrobiologi PanganJurusan Teknologi Industri Pangan. Fakultas Teknologi IndustriPertanian. Universitas Padjajaran. Jatinagor.

Sulistyo. 1971. Farmakologi dan Terapi. EKG. Yogyakarta.

Supartono, Wijayati, N. Herlina L. dan Ratnaningsih, E. 2008. Produksi danKarakterisasi Antibiotika dari Bacillus subtilis BAC4 Galur Lokal Baru.Laporan Penelitian Hibah Bersaing. DP2M Dirjen Dikti Depdiknas RI.

Sorono, I. S. 2004. Probiotik, Susu Fermentasi dan Kesehatan. PT.Tri CiptaKarya. Jakarta.

Syafriani, Devi. 2013. Penapisan Bakteri Termo-amilolitik Dari Sumber AirPanas Sungai Medang Kerinci Jambi. Jurnal Biologi Universitas Andalas.Vol:2(2). Sumbar.

Syahrurachman, A. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. BinaRupa Aksara. Jakarta.

Teysset, C.M., F. de la Torre, and J.R. Garel. 2000. Increased production ofhydrogen peroxide by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus uponaeration: involvement of on NADH oxidase in oxidative stress.Journal of Applied Environmental Microbiology 66 (1): 262-267.

Winarno, F.G, Wida Winaryo A., dan Weni Widjajanto. 2003. Flora Ususdan Yoghurt. Cetakan satu. M-BRIO-Press. Bogor.

Wibowo, M.S. 2012. Pertumbuhan dan Kontrol Bakteri. Jurnal PertumbuhanBkteri Widyastuti, Yantyati dan Sofarianawati Eva. 1999. KarakterisasiBakteri Asam Laktat Entercocus sp. Yang diisolasi dari SaluranPencernaan Ternak.jurnal mikrobiologi Indonesia 4(2): 50-53.

Wirahadikusumah, M. 1989. Biokimia protein, enzim, dan asam nukleat. InstitutTeknologi Bandung. Bandung.