Une nécessité Identification bactérienne De la galerie Api à la spectrométrie de masse Xavier NASSIF
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Transcript
Une nécessité
Identification bactérienne
De la galerie Api à la spectrométrie de masse
Xavier NASSIF
Identification bactérienne : pourquoi ?
Identification des infections
Optimisation de la prise en charge du patientChoix de l’antibiogrammeTraitement probabilisteLecture interprétative de l’antibiogramme
Epidémiologie
Contrôle des épidémiesLutte contre les infections nosocomiales
Challenge : rapidité, spécificité, faible coût
Agents pathogènes / agents commensaux
3
Technique de spectrométrie MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight) et identifcation bactérienne
�1°étape: la formation d’un cristal entre l’échantillon à analyser (une colonie de l’espèce de pathogène) et une matrice organique sur une surface métallique;
�2°étape: la surface du cristal est irradiée avec un faisceau laser;
�La 3°étape: Les pics dominants sont extraits.
4
Le spectre est fonction de l’espèce bactérienne
S. aureus
S. epidermidis
S. Saprophyticus saprophyticus
S. warneri
S. haemolyticus
Limitation de l’emploi de la spectrométrie de masse pour l’identification bactérienne
= identification des pics spécifiques d ’espèce
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La réduction du temps d’identification: un avantage essentiel
Prélèvement chez le patient
Culture Identification bactérienne et/ou antibiogramme
Prélèvement chez le patient
Culture Identification bactérienne
(en quelques minutes)J+1
Aujourd’hui - Systèmes Automatisés
Andromas – MALDI-TOFAndromas – MALDI-TOF
J+2J+1
La bactérie est identifiée pratiquement 12 heures plus tôt
qu’avec le « Gold Standard »d’aujourd’hui
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Exemple: S. hominis hominis – Pics constants > 0,1
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Souches sélectionnées pour la réalisation des databases
S. aureusMicrococcus luteusMicrococcus lentusS. epidermidisS. w arneriS. xylosusS. intermedi usS. haemolyticusS. saprophyticus su b sp saprophytic usS. saprophyticus su b sp bovisS. lugdunensisS. hominis su b sp hominisS. hominis su b sp novobiosepticusS. capitis su b sp capitisS. capitis su b sp ureolyticusS. capraeS. pasteuriS. cohni su b sp cohniS. cohni su b sp urealyticumS. schei f eri su b sp schei f eriS. schei f eri su b sp coagulansS. sciuri su b sp sciuriS. simulans
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Database:
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Bacteria Graphic Profile Data Base
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Species Strain Micrococcus luteus CIP A270 S. epidermidis 81 clinical isolates S. warneri CIP 106511 CIP 8165 6 clinical isolates S. xylosus CIP 103720 CIP 104065 S. intermedius CIP 81.60 S. h aemolyticus CIP 104114 13 clinical isolates S. saprophyticus subsp saprophytic u s CIP 76.12 5 T CIP 103545 S. saprophyticus subsp bovis CIP 105262 CIP 105261 S. saprophyticus spp * 6 clinical isolates S. lugdunensis CIP 103584 S. hominis subsp homi nis CIP 81.57 CIP 104689 S. hominis subsp novobiosepticus CIP 105719T S. hominis spp * 10 clinical isolates S. capitis subsp capitis CIP 103688 S. capitis subsp ureolyticus CIP 104192T S. caprae CIP 104000T CIP 104520 S. pasteuri CIP 105540T CI P 103830 CIP 103832 S. cohni subsp urealyticum CIP 104024T CIP 104025 S. scheiferi subsp coagulans CIP 104366 S. sciuri subsp sciuri CIP 8162T CIP 103583 CIP 103825 S. aureus 68 clinical isolates
212 souches cliniques testées
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Collaboration avec le Dr Ronco (Hopital Raymond Poincaré, Garches)et le Dr Sivadon (Hôpital Ambroise Paré, Boulogne Billancourt)
234 souches cliniques de SCoN
20 espèces différentes
Gold standard sodA
Systèmes automatisésMALDI-TOF-MS
BD Phoenix
Vitek-2
Banques d’identification Necker
Comparaison de trois systèmes d’identification
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DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%) DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%)S. auricularis (1) y 1 (100) y 1 (100)S. capitis (20) y 20 (100) y 20 (100)S. caprae (14) y 13 (92.9) 1 (7.1) y 9 (64.3) 5 (35.7)S. cohnii (15) y 14 (93.3) 1 (6.7) y 10 (66.7) 5 (33.3)S. epidermidis (56) y 56 (100) y 50 (89.3) 6 (10.7)S. haemolyticus (14) y 12 (85.8) 1 (7.1) 1 (7.1) y 14 (100)S. hominis (29) y 29 (100) y 20 (69) 9 (31)S. intermedius (1) y 1 (100) y 1 (100)S. lugdunensis (14) y 14 (100) y 13 (92.9) 1 (7.1)S. pasteuri (12) y 10 (83.3) 2 (16.7) y 5 (41.7) 7 (58.3)S. saprophyticus (12) y 12 (100) y 11 (91.7) 1 (8.3)S. schleiferi (2) y 2 (100) y 2 (100)S. sciuri sciuri (1) y 1 (100) y 1 (100)S. simulans (14) y 14 (100) y 11 (78.6) 3 (21.4)S. warneri (16) y 16 (100) y 8 (50) 8 (50)S. xylosus (3) y 3 (100) y 3 (100)S. equorum (1) n 1 (100) y 1 (100)S. condimenti (1) n 1 (100) n 1 (100)S. piscifermentans (2) n 2 (100) n 1 (50) 1 (50)S. saccharolyticus (6) n 6 (100) n 4 (66.7) 2 (33.3)Total all strains (234) 218 (93.2) 4 (1.7) 12 (5.1) 177 (75.6) 54 (23.1) 3 (1.3)
Species (Nb)MALDI Phoenix
DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%) Low Id (%)S. auricularis (1) y 1 (100)S. capitis (20) y 12 (60) 3 (15) 1 (5) 4 (20)S. caprae (14) y 14 (100)S. cohnii (15) y 13 (86.7) 2 (13.3)S. epidermidis (56) y 52 (92.9) 4 (7.1)S. haemolyticus (14) y 11 (78.6) 2 (14.3) 1 (7.1)S. hominis (29) y 25 (86.2) 3 (10.4) 1 (3.4)S. intermedius (1) y 1 (100)S. lugdunensis (14) y 12 (85.8) 1 (7.1) 1 (7.1)S. pasteuri (12) y 2 (16.7) 10 (83.3)S. saprophyticus (12) y 10 (83.4) 1 (8.3) 1 (8.3)S. schleiferi (2) y 1 (50) 1 (50)S. sciuri sciuri (1) y 1 (100)S. simulans (14) y 11 (78.6) 2 (14.3) 1 (7.1)S. warneri (16) y 9 (56.3) 3 (18.7) 4 (25)S. xylosus (3) y 3 (100)S. equorum (1) y 1 (100)S. condimenti (1) n 1 (100)S. piscifermentans (2) n 2 (100)S. saccharolyticus (6) n 6 (100)Total all strains (234) 176 (75.2) 32 (13.7) 2 (0,9) 24 (10.3)
Species (Nb)VITEK-2
Résultats de la comparaison de trois systèmes d’identification (1/2)
13
DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%) DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%)1 S. auricularis (1) y 1 (100) y 1 (100)2 S. capitis (20) y 20 (100) y 20 (100)3 S. caprae (14) y 13 (92.9) 1 (7.1) y 9 (64.3) 5 (35.7)4 S. cohnii (15) y 14 (93.3) 1 (6.7) y 10 (66.7) 5 (33.3)5 S. epidermidis (56) y 56 (100) y 50 (89.3) 6 (10.7)6 S. haemolyticus (14) y 12 (85.8) 1 (7.1) 1 (7.1) y 14 (100)7 S. hominis (29) y 29 (100) y 20 (69) 9 (31)8 S. intermedius (1) y 1 (100) y 1 (100)9 S. lugdunensis (14) y 14 (100) y 13 (92.9) 1 (7.1)
10 S. pasteuri (12) y 10 (83.3) 2 (16.7) y 5 (41.7) 7 (58.3)11 S. saprophyticus (12) y 12 (100) y 11 (91.7) 1 (8.3)12 S. schleiferi (2) y 2 (100) y 2 (100)13 S. sciuri sciuri (1) y 1 (100) y 1 (100)14 S. simulans (14) y 14 (100) y 11 (78.6) 3 (21.4)15 S. warneri (16) y 16 (100) y 8 (50) 8 (50)16 S. xylosus (3) y 3 (100) y 3 (100)
Total database species only (224) 218 (97.4) 3 (1.3) 3 (1.3) 177 (79) 47 (21) 0 (0)
Species (Nb) MALDI Phoenix
1 S. auricularis (1)2 S. capitis (20)3 S. caprae (14)4 S. cohnii (15)5 S. epidermidis (56)6 S. haemolyticus (14)7 S. hominis (29)8 S. intermedius (1)9 S. lugdunensis (14)
10 S. pasteuri (12)11 S. saprophyticus (12)12 S. schleiferi (2)13 S. sciuri sciuri (1)14 S. simulans (14)15 S. warneri (16)16 S. xylosus (3)
Total database species only (224)
Species (Nb) DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%) Low Id (%)y 1 (100)y 12 (60) 3 (15) 1 (5) 4 (20)y 14 (100)y 13 (86.7) 2 (13.3)y 52 (92.9) 4 (7.1)y 11 (78.6) 2 (14.3) 1 (7.1)y 25 (86.2) 3 (10.4) 1 (3.4)y 1 (100)y 12 (85.8) 1 (7.1) 1 (7.1)y 2 (16.7) 10 (83.3)y 10 (83.4) 1 (8.3) 1 (8.3)y 1 (50) 1 (50)y 1 (100)y 11 (78.6) 2 (14.3) 1 (7.1)y 9 (56.3) 3 (18.7) 4 (25)y 3 (100)
176 (78.6) 23 (10.3) 2 (0.9) 23 (10.3)
VITEK-2
Résultats de la comparaison de trois systèmes d’identification (2/2)
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� Bases de données
� Cocci Gram + catalase positive � Cocci Gram + catalase négative � Cocci Gram négatif� Bacilles Gram + � Bacilles Gram - oxydase -� Bacilles Gram - oxydase +� Bacilles Gram - ne cultivant pas sur milieux ordinaires� (Anaérobies stricts)� (Campylobacter/Helicobacter)� (Mycobactéries)� Champignons filamenteux� Levures
Edification des bases de données
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3 étapes
�Edification des bases de données (Choix des espèces bactériennes à inclure dans chaque base)
�Validation des bases de données (rassembler une collection de souches dont l’identification est certaine et nécessité de plusieurs souches par espèces)
�Passage en routine
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En fonction des résultats de la validation, création de databases supplémentaires pour certaines espèces ou certains milieux de culture.
Espèces très proches :
création de « sous-databases » avec mise en évidence d’un ou plusieurs
pics spécifiques d’espèce: nécessité d ’un grand nombre de souches
cliniques parfaitement caractérisées.
� Les différentes espèces du complexe Burkholderia cepacia
� Streptocoques oraux : en cours (vérification des identifications par BM : SOD + rpoB)
Enterococcus spp : spectres de faible amplitude sur milieux Uri 4
Enterobacter spp : spectres de faible amplitude sur milieux ESBL
� construction des databases « URI4 » et « ESBL »
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Incorporation de la technique MALDI-TOF dans la routine du laboratoire depuis janvier 2009
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Secteur 1 Secteur 2 Secteur 3
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Saisie automatique des n°de dossiers dans le spectromètre grâce àune douchette de codes barre
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Analyse des hémocultureset des bouillons d’enrichissement des liquides articulaires
� Méthode � Prélèvement de 1 ml de bouillon à partir d’un flacon d’hémoculture positive
� Action d’un détergent
� Lavage à l’eau puis analyse MALDI-TOF
� Essais effectués sur des bouillons artificiellement ensemencés puis sur des hémocultures positives de malades� S. aureus
� staphylocoques à coagulase négative
� P. aeruginosa (création d’une base « hémoculture »)
� K.pneumoniae
� E. faecalis
� K. kingae
Identification des germes dans 100% des cas
� Actuellement � Poursuite des tests sur d’autres bactéries
� passage systématique des hémocultures positive à J0 et comparaison des identifications MALDI J0 - culture J1
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Les principaux avantages de l’identification des pathogènes par spectrométrie de masse
� La rapidité
� La généralisation
� La flexibilité
� L’accès au diagnostic pour certains pathogènes (Champignons)
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Remerciements
Maldi team
P. BercheJL. BerettiA. FerroniM.E BougnouxS. CottynB.DauphinN.DegandJ. MeyerX.Nassif
LogicielsV. BerettiE. Frapy
Collaborations
R. CourcolJL. GaillardA. Le MonnierJL. HerrmannC. PoyartE. RoncoM. SimonetV. Sivadon
Plateforme ProtéomeA. Edelman
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