INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL...IV Abstract Chlamydomonas reinhardtii is a green microalgae that has the ability to accumulate lipids which can be used in the biodiesel production.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

TESIS

Presentada para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS

Por

Jhorman Alexis Niño Gómez

Microbiólogo Industrial

ANÁLISIS DE LOS FLUJOS METABÓLICOS DE Chlamydomonas reinhardtii PARA SU

APLICACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES

Dirigida por

Dr. Edgar Salgado Manjarrez

Dr. Juan Silvestre Aranda Barradas.

México, D.F. 07 Noviembre de 2013

III

Resumen

Chlamydomonas reinhardtii es una microalga que posee la capacidad de acumular una buena

cantidad de lípidos que son usados en la fabricación de biodiesel. Esta microalga puede crecer

en autotrofía, mixotrofía y heterotrofía. Resulta muy útil poder conocer como varia el

metabolismo de C. reinhardtii bajo cada una de estas condiciones.

En este trabajo se realizó un pool de ensayos cinéticos que involucraban diferentes

condiciones de crecimiento con el propósito de obtener la información necesaria para realizar

un análisis de flujos metabólicos de estas condiciones. Las variables de los ensayos fueron la

intensidad de la luz y la concentración de nitrógeno mostrando como resultado que la mayor

velocidad de crecimiento encontrada fue de 2.4d-1 y una fracción lipídica máxima de 38.87%.

Análisis de superficies de respuesta arrojaron que los puntos más idóneos para alcanzar una

mejor productividad de lípidos, están en las zonas de alta intensidad de luz y baja

concentración de nitrógeno. Seguidamente el análisis de distribución de flujos de carbono

mostro que el metabolismo mixotrófico (CO2 y acetato) favorece en mejor medida la

acumulación de lípidos. Finalmente se concluye que la construcción de estos modelos

metabólicos sirven como base para la construcción de una herramienta cada vez más

poderosa en el análisis y simulación de la distribución del carbono en C. reinhardtii bajo

diferentes condiciones de crecimiento y/o modificaciones genéticas

IV

Abstract

Chlamydomonas reinhardtii is a green microalgae that has the ability to accumulate lipids which

can be used in the biodiesel production. This microalgae exhibits autotrophy, heterotrophy or

mixotrophy depending on environmental conditions, and it is very useful to know how C.

reinhardtii metabolism varies under each of these conditions in regard to its ability to

accumulate Lipids.

In this work, several kinetic assays involving different growth conditions were carried out, in

order to obtain essential information for the metabolic flux analysis of the algae under these

conditions. Assay variables were the light intensity and the nitrogen concentration. Results

show that the higher growth rate was 2.4 d-1 and a maximum lipid fraction of 38.87% of dry

biomass. Response surface analysis showed that the most suitable conditions for achieving

better lipid productivity, are high light intensity and low nitrogen concentration. Carbon flux

analysis shows that mixotrophic metabolism (CO2 and acetate) allows greater accumulation of

lipids.

Finally concluded that the construction of these metabolic models serve as a base for the

construction of increasingly powerful tool in the analysis and simulation of the carbon

distribution in C. reinhardtii under different growth conditions and / or genetic modifications

VI

Agradecimientos

Agradezco primero a Dios, por haberme dado la oportunidad de vivir esta maravillosa y

enriquecedora experiencia.

Agradezco a mi asesor Edgar salgado Manjarrez por toda su dedicación y colaboración en la

construcción de este trabajo.

A mi Prometida Mayerly Anaya quien con su incondicional y constante apoyo permitió que

pudiese seguir adelante a pesar de las dificultades.

A mis padres que a pesar de tantas vicisitudes siempre me han apoyado a alcanzar mis

sueños.

A los doctores Juan Aranda, Agustín Badillo y Elvia Inés García por sus aportes en cada

momento.

A mis amigos Exiliados (Juan, Daniel, Leidy, Julián), les deseo lo mejor en lo que falta de este

camino, a mis amigos Mexicanos (PePe, Karla, Ruben, Jacob) agradecimientos por hacernos

sentir a cada instante como en nuestra casa.

Finalmente un agradecimiento especial a CONACYT y al Instituto Politécnico Nacional, por

brindarme la oportunidad de seguir adelante en mi proceso de formación.

VII

Trabajo llevado a:

Evento: XV Congreso nacional de biotecnología y bioingeniería.

Fecha: 23-28 de junio de 2013.

Ciudad: Cancún, Quintana Roo.

Modalidad: Poster.

VIII

Contenido

1. Introducción general ............................................................................................................ 1

1.1. ANTECEDENTES......................................................................................................... 3 1.1.1. Las microalgas ....................................................................................................... 3 1.1.2. Chlamydomonas reinhardtii ................................................................................... 8 1.1.3. Compartimentalización metabólica ...................................................................... 24 1.1.4. Ingeniería metabólica. .......................................................................................... 27 1.1.5. Modelos estequiométricos del crecimiento celular ............................................... 29

1.2. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................ 37 1.3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 38

1.3.1. Objetivo general ................................................................................................... 38 1.3.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 38

1.4. HIPÓTESIS ................................................................................................................ 39

2. Materiales y métodos ........................................................................................................ 40

2.1. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconinico (BCA) ................... 40 2.2. Cuantificación de carbohidratos por el método fenol-sulfúrico .................................... 41 2.3. Cuantificación de la biomasa seca .............................................................................. 42 2.4. Cuantificación de Acetato ........................................................................................... 44 2.5. Suministro de luz y medición de la intensidad lumínica .............................................. 44

3. Factores limitantes del crecimiento de Chlamydomonas reinhardtii ................................... 45

3.1. Introducción ................................................................................................................ 45 3.2. Materiales y Métodos .................................................................................................. 46 3.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 47

3.3.1. Modelo de caja negra (CHONSP) al medio TAP .................................................. 48 3.4. Conclusiones .............................................................................................................. 51

4. Efecto de la intensidad luminosa y el fotoperiodo sobre el crecimiento de Chlamydomonas reinhardtii. ................................................................................................................................ 52

4.1. Introducción ................................................................................................................ 52 4.2. Materiales y Métodos .................................................................................................. 54

4.2.1. Evaluación de intensidad luminosa ...................................................................... 54 4.2.2. Evaluación de los fotoperiodos ............................................................................ 55

4.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 55 4.3.1. Evaluación de la intensidad luminosa .................................................................. 55 4.3.2. Evaluación de fotoperiodo .................................................................................... 57

4.4. Conclusiones .............................................................................................................. 58

5. Efecto de la aeración sobre la velocidad de crecimiento en autotrofia ............................... 60

5.1. Introducción ................................................................................................................ 60 5.2. Materiales y métodos .................................................................................................. 62 5.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 63 5.4. Conclusiones .............................................................................................................. 73

6. producción de moléculas candidato a biocombustible: superficie de respuesta ................. 74

6.1. Introducción ................................................................................................................ 74 6.2. Materiales y Métodos .................................................................................................. 74 6.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 77 6.4. Conclusiones .............................................................................................................. 87

7. ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS ........................................................................... 88

IX

7.1. Introducción ................................................................................................................ 88 7.2. Materiales y métodos .................................................................................................. 90 7.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 96 7.4. Conclusiones ............................................................................................................ 100

8. Anexos ............................................................................................................................ 101

8.1. Fundamento de las técnicas analíticas utilizadas ..................................................... 101 8.2. Abreviaciones de compuestos .................................................................................. 112

9. Bibliografía ...................................................................................................................... 115

X

Índice de ilustraciones

ILUSTRACIÓN 1. VÍAS HACIA VARIOS PRODUCTOS ENERGÉTICOS A PARTIR DE ALGAS. .............................................. 4

ILUSTRACIÓN 2. PRINCIPALES RUTAS METABÓLICAS PARA LA SÍNTESIS DE ALMIDÓN EN MICROALGAS. ................... 7

ILUSTRACIÓN 3. ESTRUCTURA CELULAR DE C. REINHARDTII. ....................................................................................... 8

ILUSTRACIÓN 4. CRECIMIENTO DE CÉLULAS EN CULTIVO SINCRÓNICO. ...................................................................... 9

ILUSTRACIÓN 5. CICLO SEXUAL Y ASEXUAL EN C. REINHARDTII. ................................................................................ 10

ILUSTRACIÓN 6. ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LUZ POR MICROALGAS Y CIANOBACTERIAS. .................................... 13

ILUSTRACIÓN 7. COMPORTAMIENTO DE LA INTENSIDAD LUMÍNICA A TRAVÉS DEL POND. (FLECHA SEÑALA EL

FONDO DEL POND) ............................................................................................................................................. 13

ILUSTRACIÓN 8. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII BAJO DIFERENTES INTENSIDADES DE LUZ. ....... 14

ILUSTRACIÓN 9. CURVAS DE CRECIMIENTO EN DIFERENTES CICLOS OSCURIDAD:LUZ PARA APHANOTHECE

MICROSCOPICA .................................................................................................................................................. 15

ILUSTRACIÓN 10. PORCENTAJE DE FIJACIÓN DE CO2 VS DISMINUCIÓN DEL TIEMPO DE LUZ EN EL CULTIVO DE

APHANOTHECE MICROSCOPICA ......................................................................................................................... 15

ILUSTRACIÓN 11. AGREGACIÓN DE LA PROTEÍNA LCIB EN PRESENCIA DE LUZ. ......................................................... 16

ILUSTRACIÓN 12 PROCESO DE FOTOSÍNTESIS EN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII ................................................. 17

ILUSTRACIÓN 13. CICLO DE CALVIN BENSON. ............................................................................................................. 18

ILUSTRACIÓN 14. VIA C4 EN PLANTAS ........................................................................................................................ 18

ILUSTRACIÓN 15. VÍA METABÓLICA DEL GLIOXILATO, ASIMILACIÓN DEL ACETATO POR C. REINHARDTII. ............... 22

ILUSTRACIÓN 16. PRINCIPALES RUTAS METABÓLICAS DE C. REINHARDTII EN FOTOAUTOTROFÍA. ........................... 28

ILUSTRACIÓN 17. MODELO DE CAJA NEGRA. .............................................................................................................. 30

ILUSTRACIÓN 18. DISTRIBUCIÓN DE FLUJOS DE UNA RED METABÓLICA HIPOTÉTICA. .............................................. 31

ILUSTRACIÓN 19. DISTRIBUCIÓN DE FLUJOS METABÓLICOS DE UN CULTIVO MIXOTRÓFICO DE CHLORELLA SP. ..... 34

ILUSTRACIÓN 20. CURVA DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO ............... 40

ILUSTRACIÓN 21. RESIDUOS DEL AJUSTE LINEAL DE LOS DATOS EXPERIMENTALES, METODO DE PROTEINAS. ....... 41

ILUSTRACIÓN 22. CURVA DE CALIBRACIÓN POR EL MÉTODO DE DUBOIS ................................................................. 41

ILUSTRACIÓN 23. RESIDUOS DEL AJUSTE LINEAL DE LOS DATOS EXPERIMENTALES, METODO DE CARBOHIDATOS. 42

ILUSTRACIÓN 24. CURVA DE CALIBRACIÓN BIOMASA SECA VERSUS ABSORBANCIA. ................................................ 43

ILUSTRACIÓN 25. CURVA DE CALIBRACIÓN RECUENTO CELULAR VERSUS ABSORBANCIA (675NM). ........................ 43

ILUSTRACIÓN 26. DIFERENTES INTENSIDADES DE LUZ EVALUADAS A NIVEL MATRAZ. .............................................. 54

ILUSTRACIÓN 27.CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII MEDIDO EN ABSORBANCIA A 675NM EN DIFERENTES

INTENSIDADES DE LUZ ........................................................................................................................................ 56

ILUSTRACIÓN 28. VELOCIDADES DE CRECIMIENTO VS INTENSIDAD DE LUZ .............................................................. 57

ILUSTRACIÓN 29. CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII EN DIFERENTES FOTOPERIODOS ............................................. 58

ILUSTRACIÓN 30 EVOLUCIÓN DE LAS ESPECIES QUÍMICAS DEL CO2 DISUELTAS EN AGUA. ....................................... 60

ILUSTRACIÓN 31. MECANISMOS DE CONCENTRACIÓN DE CARBONO INORGÁNICO. ................................................ 62

XI

ILUSTRACIÓN 32. MEDICIÓN DE CO2 AMBIENTAL. ..................................................................................................... 64

ILUSTRACIÓN 33. DISPONIBILIDAD DEL CARBONO EN UN SISTEMA AIREADO ........................................................... 67

ILUSTRACIÓN 34. DISPONIBILIDAD DEL CARBONO EN UN SISTEMA NO AIREADO ..................................................... 67

ILUSTRACIÓN 35. SISTEMA CERRADO DE CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII ............................................................. 68

ILUSTRACIÓN 36. CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII EN SISTEMA CERRADO, VALORES DE BIOMASA SECA. ............ 68

ILUSTRACIÓN 37. CONSUMO DE CO2 EN SISTEMA CERRADO, TRAMO DE LOS 2 PRIMEROS DÍAS. ............................ 69

ILUSTRACIÓN 38. GRÁFICA DEL MODELO PLANTEADO Y LOS DATOS ORIGINALES. ................................................... 70

ILUSTRACIÓN 39. DINÁMICA DE TRANSFERENCIA DE CO2 AL LÍQUIDO (MEDIO TAP). ............................................... 71

ILUSTRACIÓN 40. MODELO DEL PROCESO DE TRANSFERENCIA DEL CO2 EN EL MEDIO TAP. .................................... 72

ILUSTRACIÓN 41. DISEÑO EXPERIMENTAL TIPO BOX-BEHNKEN ................................................................................ 75

ILUSTRACIÓN 42. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO EN LOS SISTEMAS A, B, K, L Y M. ........................... 78

ILUSTRACIÓN 43. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LOS SISTEMAS C Y D ........................................ 78

ILUSTRACIÓN 44. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LOS SISTEMAS E Y F. ........................................ 79

ILUSTRACIÓN 45. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LOS SISTEMAS G Y H. ....................................... 80

ILUSTRACIÓN 46. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LOS SISTEMAS I Y J. .......................................... 81

ILUSTRACIÓN 47. FRACCIÓN DE LÍPIDOS ACUMULADA EN LOS SISTEMAS CON Y SIN NITRÓGENO EN EL MEDIO. ... 83

ILUSTRACIÓN 48. FRACCIÓN DE LÍPIDOS EN MEDIO TAP CON AMONIO. ................................................................... 84

ILUSTRACIÓN 49.FRACCION DE LÍPIDOS EN MEDIO TAP SIN AMONIO. ...................................................................... 85

ILUSTRACIÓN 50. PRODUCTIVIDAD DE LÍPIDOS EN MEDIO TAP CON AMONIO. ........................................................ 85

ILUSTRACIÓN 51. PRODUCTIVIDAD DE LÍPIDOS EN MEDIO TAP SIN AMONIO. .......................................................... 86

ILUSTRACIÓN 52. RED METABÓLICA COMPLETA DEL SISTEMA MIXOTRÓFICO. ......................................................... 96

ILUSTRACIÓN 53. MAPA DE LOS FLUJOS METABÓLICOS DE C. REINHARDTII BAJO CRECIMIENTO MIXOTRÓFICO,

AUTOTRÓFICO Y HETEROTRÓFICO. .................................................................................................................... 98

ILUSTRACIÓN 54. REACCION DE CARBOHIDRATOS CON LA SOLUCION DE FENOL-SULFURICO-AGUA. .................... 104

ILUSTRACIÓN 55. ESQUEMA DE LA CÁMARA DE NEUBAUER. .................................................................................. 110

XII

Índice de Tablas

TABLA 1. RENDIMIENTOS DE ACEITES DE DIFERENTES CULTIVOS TERRESTRES VERSUS MICROALGAS. ...................... 4

TABLA 2. CONTENIDO DE LÍPIDOS DE DIVERSOS GRUPOS DE MICROALGAS. ............................................................... 5

TABLA 3 COMPOSICIÓN MILIMOLAR PRESENTE EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO PARA C. REINHARDTII .......... 11

TABLA 4. CONDICIONES DE CULTIVO EN LABORATORIO PARA C. REINHARDTII ......................................................... 12

TABLA 5. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE LA BIOMASA DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII CRECIDA EN

AUTOTROFÍA ...................................................................................................................................................... 19

TABLA 6. COMPOSICION DE LA BIOMASA DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII EN AUTOTROFÍA. .......................... 19

TABLA 7. RENDIMIENTOS ESPERADOS Y OBSERVADOS DE LA TECNOLOGÍA. ............................................................. 21

TABLA 8. INFLUENCIA DEL ACETATO EN LA FOTOSÍNTESIS DE C. REINHARDTII.......................................................... 22

TABLA 9. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE LA BIOMASA DE C. REINHARDTII CRECIDA EN MIXOTROFÍA. ................... 23

TABLA 10. RENDIMIENTO DEL CARBONO FIJADO EN TRES METABOLISMOS DIFERENTES EN C. REINHARDTII ......... 23

TABLA 11. COMPARTIMENTALIZACION DE ENZIMAS PRESENTES EN EL METABOLISMO CENTRAL DEL CARBONO EN

C. REINHARDTII. .................................................................................................................................................. 25

TABLA 12. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA CURVA DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS. .................................................. 40

TABLA 13. ANALISIS DE VARIANZA PARA CURVA DE CALIBRACION DE CARBOHIDRATOS. ........................................ 41

TABLA 14. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA CURVA DE CALIBRACIÓN DE BIOMASA SECA. ............................................ 44

TABLA 15. FÓRMULAS MÍNIMAS PARA BIOMASA DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII ........................................... 47

TABLA 16. SOLUCIONES DE SALES Y FOSFATOS DEL MEDIO TAP ................................................................................ 47

TABLA 17. ELEMENTOS TRAZA DEL MEDIO TAP.......................................................................................................... 48

TABLA 18. PERPARACION DE MEDIO TAP (1L) ............................................................................................................ 48

TABLA 19. RESULTADO DEL ANÁLISIS DE CAJA NEGRA AL MEDIO TAP PARA EL CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII. . 49

TABLA 20. ANÁLISIS DE CAJA NEGRA ASUMIENDO AGOTAMIENTO DE NH3. .............................................................. 50

TABLA 21. CONDICIONES DE CULTIVO PRUEBA DE INTENSIDAD DE LUZ. ................................................................... 54

TABLA 22. CONDICIONES DE CULTIVO PARA LA PRUEBA DE FOTOPERIODO ............................................................. 55

TABLA 23. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DE LA INTENSIDAD DE LA LUZ. ............................................. 56

TABLA 24. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DEL FOTOPERIODO. ............................................................. 58

TABLA 25. VARIACIÓN EN LAS MEDICIONES DE CARBONO AMBIENTAL. ................................................................... 64

TABLA 26. CODIFICACIÓN DEL DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................................................. 75

TABLA 27. CONDICIONES DE CULTIVO EN ENSAYOS FINALES. .................................................................................... 76

TABLA 28. RESUMEN DE LOS PARÁMETROS CALCULADOS PARA LOS 5 SISTEMAS DE CRECIMIENTO. ...................... 82

TABLA 29. AUMENTO EN EL PORCENTAJE DE LÍPIDOS POR EL AGOTAMIENTO DEL NITRÓGENO. ............................ 83

TABLA 30. PRODUCTIVIDADES DE LIPIDOS EN LOS SISTEMAS CON Y SIN AMONIO. .................................................. 84

TABLA 31. RUTAS Y REACCIONES DE LA RED METABOLICA GENERAL. ....................................................................... 93

TABLA 32. TOPOLOGIA DE LA RED MIXOTRÓFICA. ..................................................................................................... 96

TABLA 33. MATRIZ ESTEQUIOMETRICA DEL MODELO MIXOTROFICO DE C. REINHARDTII. ....................................... 97

1

1. INTRODUCCIÓN GENERAL

Desde hace algunos años, ha aumentado en el mundo la necesidad de investigar sobre fuentes

de energía alternativas a las tradicionales, petróleo, gas y carbón, esto debido a la inminente

disminución en número de reservas lo que hace necesario el lanzamiento de nuevas opciones

energéticas que compitan tanto en calidad como en economía con las no renovables. Una de

tantas opciones es el uso de microalgas para la obtención de metabolitos de interés en la

fabricación de compuestos energéticos. Entre los más relevantes se encuentran la producción

de lípidos para fabricación de Biodiesel (Chisti, 2007) la obtención de carbohidratos para

fabricación de alcoholes (Leon-Banares et al., 2004), obtención de bío-moléculas altamente

energéticas tipo hidrocarburos (Banerjee, 2002), producción de biomasa completa y post-

proceso para obtención de Syngas (Field et al., 1998), metano, gasolina, keroseno, diesel e

hidrógeno (Rochaix, 2002). De esta manera, el espectro de acción que tienen las microalgas en

la industria energética es muy amplio, sin embargo no es el único sector en el que estos

importantes organismos fotosintéticos juegan un rol substancial, vale la pena mencionar el área

médico-farmacéutica en la que las microalgas tienen un aporte muy significativo en la síntesis

de moléculas que son objeto de investigación y desarrollo de nuevos fármacos y terapias

médicas, está también el sector de los alimentos, la industria textil y de tintes o pigmentos y

finalmente un tópico de alto interés en los últimos años, el consumo del CO2 ambiental. Este

tema ha sido centro de muchas discusiones gubernamentales y hoy en día se hace un

reconocimiento económico a las industrias que demuestren su aporte al medio ambiente

secuestrando CO2 de alguna forma ambientalmente amigable. En este sentido,

Chlamydomonas reinhardtii, una microalga verde perteneciente al orden de los Volvocales,

cumple con las anteriores premisas, y es objeto directo de esta investigación.

C. reinhardtii, tiene dentro de sus principales características que puede crecer autotrófica,

mixotrófica y heterotróficamente, sintetizando biomoléculas como las que se enunciaron

anteriormente, resaltando la producción de hidrógeno, y a la vez consumiendo CO2. Las

microalgas junto con otros organismos marinos son los responsables de la fijación de casi la

mitad del carbono de la atmósfera (Leon-Banares et al., 2004).

Esta microalga ha sido el organismo modelo en investigaciones sobre la genética y bioquímica

de los principales procesos foto-autotróficos como la fotosíntesis, el uso de carbono inorgánico

y la respiración autótrofa entre otros (Chisti, 2007). Sin embargo, como en la mayoría de

modelos biotecnológicos, esta alga eucariota tiene algunas limitaciones en la producción de los

metabolitos de interés. Estas barreras bio-tecnológicas pueden ser superadas con la ayuda de

la ingeniería metabólica y sus metodologías.

La ingeniería metabólica se puede definir como la modificación racional y directa de las

reacciones que constituyen el metabolismo de un organismo, con el propósito de mejorar sus

2

propiedades o su productividad (Qin et al., 2001). Dentro de las herramientas que ofrece la

ingeniería metabólica están el análisis de flujos metabólicos (AFM) y el análisis de flujos

metabólicos acoplados a carbono 13 (AFM 13-C). El AFM utiliza límites o restricciones

estequiométricas en forma de un modelo metabólico ajustado a mediciones de algunos

metabolitos de interés. Sin embargo esta técnica es mejorada cuando se implementa el método

de isotopos marcados (AFM 13-C), ya que permite analizar la distribución completa del carbono

en las redes metabólicas del microorganismo. El uso del análisis de flujos metabólicos (AFM)

de manera inicial, brinda una alternativa muy real en el cálculo de los flujos de un metabolismo

en particular. El cálculo de estos es una herramienta fundamental para estimar los flujos

intracelulares a partir de flujos extracelulares. La ventaja de este método es que permite

analizar a priori el efecto de las modificaciones ambientales o genéticas inducidas que pueden

imponerse a un microorganismo en el marco de un proceso biotecnológico (Manish et al.

2007), es también muy importante en el estudio de la fisiología celular ya que permite organizar

el conocimiento metabólico de un microorganismo en una red de reacciones bioquímicas y

provee una medida del grado de relación entre varias vías metabólicas (Nielsen et al. 1994).

El AFM también se ha utilizado para desarrollar estrategias de maximización en la

productividad de muchos metabolitos de interés comercial como: ácidos orgánicos,

aminoácidos, polisacáridos y antibióticos (Manish et al. 2007). Esto permite conocer mejor el

metabolismo celular del microorganismo bajo estudio y hacer mejoras en los rendimientos de

los metabolitos de interés.

En este trabajo se pretende realizar el análisis de flujos metabólicos de Chlamydomonas

reinhardtii bajo condiciones de mixotrofía con el propósito de vislumbrar las potencialidades de

la cepa bajo condiciones de cultivo específicas, en términos de acumulación de metabolitos

importantes para la fabricación de biocombustibles.

3

1.1. ANTECEDENTES

1.1.1. Las microalgas

Las microalgas son organismos unicelulares eucariotas que pertenecen junto con las

cianobacterias al grupo de fotótrofos más importantes en la fijación de más de la mitad del

dióxido de carbono (CO2) atmosférico y producción de altas cantidades de oxígeno.

Estos organismos son claves en el equilibrio planetario, ya que la dinámica del CO2 en la Tierra

está, en gran medida, determinada por ellos y, además, constituyen la base de las cadenas

tróficas que permiten la vida en los océanos (Banerjee et al., 2002).

Su función de crecimiento y reproducción también está asociada a labores ambientales como la

descontaminación de cuerpos de aguas, su presencia y/o ausencia también es indicadora de

contaminación de aguas y se conocen muchos usos industriales entre los que se tiene la

producción de pigmentos, proteína para consumo humano y animal, productos farmacéuticos,

producción de metabolitos de interés industrial, depuradores de aguas y recientemente tienen

interés en la producción de metabolitos para biocombustibles (Qin et al. 2001).

1.1.1.1. Potencial de las algas

Las microalgas han sido investigadas para diferentes propósitos encontrándose que de sus

componentes los más importantes para el hombre son lípidos, pigmentos, proteínas,

carbohidratos e hidrogeno.

En este sentido, una gran variedad de productos industriales pueden ser obtenidos de este

potencial, y esto se esquematiza en la ¡Error! La autoreferencia al marcador no es válida..

Los géneros de algas de interés para la producción de energía se ubican principalmente en los

grupos de algas verdes y diatomeas destacándose entre ellos los siguientes: Botryococcus sp.,

Scenedesmus sp., Chlorella sp., Chlamydomonas sp., Nitzschia sp., Prymnesium sp. (Chisti,

2007).

Producción de aceites para obtención de biodiesel

La característica que hace que las algas sean vistas como una importante alternativa en la

obtención de biocombustibles (especialmente biodiesel, ya que de la gasificación de la biomasa

y la fermentación de esta misma se producen otros biocombustibles líquidos y gaseosos) es el

alto porcentaje de aceites que acumulan estos microorganismos. Comparado con el aceite

4

extraído de los cultivos terrestres, las algas tienen un alto rendimiento en producción de aceite

transformable en biodiesel.

Fuente: Comprehensive Oilgae Report. July-2009

En la Tabla 1 se exponen diferentes cultivos oleaginosos terrestres que han sido empleados

hasta el momento en la producción de aceite para fabricación de biodiesel, encontrando a las

microalgas con un rendimiento de 1200-10000 galones por acre cultivado muy por encima del

cultivo de la palma con 635 galones por acre cultivado.

Tabla 1. Rendimientos de aceites de diferentes cultivos terrestres versus microalgas.

Cultivo Rendimiento de Aceite, Galones/Acre

Maíz 18

Algodón 35

Soya 48

Grano de mostaza 61

Girasol 102

Canola 127

Jatrofa 202

Palma 635

Alga (10g/m2dìa a 15% TAGs*) 1200

Alga (50g/m2dìa a 15% TAGs) 10000

Ilustración 1. Vías hacia varios productos energéticos a partir de algas.

5

*TAGs: triacil-gliceroles.

Fuente: Philip (NERL). 2007

La alta capacidad de acumulación de biomasa confiere a las algas productividades cerca de 30

a 35 veces mayor a la encontrada en el cultivo de palma, el cual es el cultivo oleaginoso de

preferencia en la producción de biodiesel en América. Además, el cultivo de microalgas posee

numerosas ventajas como por ejemplo: no son necesarias grandes extensiones de tierra, no se

necesitan terrenos fértiles, no es nocivo con el sitio de cultivo, no se necesita agua de calidad

(incluso es cultivada en aguas residuales).

La cantidad de aceite transformable varía entre las especies de algas. En cultivos controlados

en condiciones de laboratorio se han obtenido valores que oscilan entre 11-40% del peso seco

en aceite, aunque hay reportes de algunas especies que han alcanzado hasta 70-86 de su

peso seco en aceites (Qin et al., 2001). En la Tabla 2, se muestran los porcentajes de lípidos

en diferentes cepas de microalgas.

Tabla 2. Contenido de lípidos de diversos grupos de microalgas.

Cepas %lípidos

Scenedesmus obliquus

Scenedesmus quadricauda

Scenedesmus dimorphus

Chlamydomonas reinhardtii

Chlorella vulgaris

Chlorella pyrenoidosa

Spirogyra sp.

Dunaliella bioculata

Dunaliella salina

Euglena gracilis

Prymnesium parvum

Tetraselmis maculata

Porphyridium cruentum

Spirulina platenses

Spirulina maxima

Synechoccus sp.

Anabaena cylindrica

12–14

1.9

16–40

21

14–22

2

11–21

8

6

14–20

22–39

3

9–14

4–9

6–7

11

4–7

Fuente: Becker et al., 1994.

6

Producción de bioetanol

El bioetanol se ha convertido en una atractiva opción en el desarrollo de tecnologías que

complementen y finalmente remplacen el uso de la gasolina. El bioetanol es producido de

biomasa renovable como caña de azúcar o almidón y proporciona ciertas ventajas como por

ejemplo que es biodegradable, se mezcla fácilmente con la gasolina sin necesidad de

modificación alguna de los sistemas en donde es aplicado y proporciona altos niveles de

octanaje (Harris, 2009).

El bioetanol produce muy pocas emisiones de dióxido de carbono y material particulado,

aunque produce un nivel relativamente elevado de óxido nitroso. Diversos tipos de biomasa

pueden ubicarse como materia prima para la producción de bioetanol. Estas pueden

clasificarse generalmente en tres grupos: de base de sacarosa (caña de azúcar, remolacha),

de base de almidón (maíz) y lignocelulósicos (madera o residuos agrícolas). La elección de la

materia prima depende principalmente de factores económicos e industriales como la

disponibilidad y costo de los materiales de partida. Sin embargo, el problema principal con la

mayoría de los materiales mencionados es que compiten con la agricultura por la disponibilidad

de terrenos adecuados o que por el contrario su producción de etanol no es suficiente a escala

industrial. Además, la mayoría de los materiales de partida para producción bioetanol

dependen de las estaciones climáticas y de las locaciones geográficas. Otro problema presente

en los cultivos más empleados como es el caso del maíz y el almidón, es la necesidad de

implementar fertilizantes que erosionan los suelos empleados. Además, la lignina no puede ser

fermentada y su degradación biológica es muy difícil.

Las microalgas, han sido postuladas como potencial solución a los problemas en las materias

primas de los procesos de fermentación existentes (Heifetz et al., 2000). Las microalgas

proporcionan carbohidratos y proteínas que pueden emplearse como fuentes de carbono para

la fermentación, y últimamente se han reportado algas modificadas genéticamente que tiene la

capacidad de realizar fermentación de carbohidratos y producir alcohol. Además, presentan

una serie de ventajas comerciales y de sostenibilidad sobre los sistemas ya existentes. Estos

incluyen:

Crecen rápidamente con o sin presencia de suelo

Tiene el potencial de absorber CO2 y otros gases de invernadero para sus procesos

fotosintéticos, esto reduce la cantidad de estos gases en la atmosfera.

Poseen un ciclo muy pequeño de cosecha (~1-10 días) comparado con otras fuentes de

fermentación (cosecha en 1 a 2 años) y esto proporciona suficientes suministros para

satisfacer la demanda existente de producción de etanol (Báez et al. 2004).

7

A la fecha, pocos estudios reportan el uso de microalgas en la producción de bioetanol. Moen

et al., en 2008, demostraron que las algas marinas son un excelente sustrato en la producción

de bioetanol. Otro estudio realizado por Hirayama et al., en el 1998, proponen una auto-

fermentación de la biomasa de microalgas (que previamente fueron utilizadas en procesos

como la extracción de aceite) para producción de etanol. La técnica es simple y requiere un

tiempo de fermentación más corto que los de los sistemas convencionales. Ueda et al., en

1996 diseñaron un sistema detallado para fermentación de microalgas. En una primera etapa,

las células de Chlorella vulgaris fueron fermentadas en un ambiente anaeróbico de oscuridad

para producir el etanol. El etanol producido de los procesos fermentativos fue purificado y

utilizado como combustible. El CO2 producido fue recirculado y empleado en el cultivo de las

microalgas.

La segunda etapa comprende la utilización de la biomasa microalgal remanente en un proceso

de digestión anaeróbica. Este proceso produce metano, el cual puede usarse para producir

electricidad (Field et al., 1998). Hon-Nami en 2006, reportó que la fermentación de biomasa de

Chlamydomonas perigranulata, producía etanol, butanodiol, ácido acético y CO2.

Ilustración 2. Principales rutas metabólicas para la síntesis de almidón en microalgas.

Fuente: Radakovits et a.l, 2010

8

1.1.2. Chlamydomonas reinhardtii

Es un alga verde de aproximadamente 10 µm de tamaño, fotosintética. Su estructura celular es

eucariota similar a las plantas superiores con cloroplastos que tienen por lo general de 3 a 7

tilacoides agrupados en bandas, así como también pirenoides con gránulos de almidón

periféricos. Los tilacoides pueden estar organizados de manera semejante a los grana de las

plantas superiores. Los pirenoides se encuentran en muchas algas verdes y se ha demostrado

que constan de proteína y que contienen la enzima almidón sintetasa, la cual participa en la

producción de almidón. El nutriente de reserva primario es el almidón verdadero (Stern et al.

2009).

Ilustración 3. Estructura celular de C. reinhardtii.

Fuente: Nickelsen and Kück (2000).

En la Ilustración 3 se observa la estructura y organelos de la microalga detallados de la

siguiente manera: núcleo (N), nucléolo (Nu), flagelos (F), cloroplasto (C), mancha ocular ( E),

pirenoide (P), mitocondria (M), aparato de Golgi (G), gránulos de almidón (S) y vacuolas (V).

1.1.2.1. Ciclo de vida

En Chlamydomonas el ciclo de vida es muy variado y depende de las condiciones de

crecimiento que tengan las células. Las dos vías son la sexual y la asexual (Stern et al. 2009).

En la vía asexual, las células se dividen por mitosis y en la vía sexual lo hacen por meiosis.

9

La fase logarítmica de los cultivos es mantenida en un fotoperiodo de 12:12 (horas de luz :

oscuridad) a 22-25°C normalmente bajo dos o tres generaciones, en un periodo de 24 horas

toda la división en un ciclo toma lugar en una rápida sucesión en el periodo de oscuridad como

se indica en la Ilustración 4.

Todas las células hijas son retenidas dentro de la célula madre hasta que el periodo de división

es completado, y luego son liberadas por la acción de una enzima lítica, normalmente justo

antes del fin del periodo de oscuridad.

El número de divisiones en un ciclo de 24 horas es altamente dependiente de las condiciones

de crecimiento. En luz a 25°C normalmente las células se dividen 3 veces produciendo 8 hijas,

pero a baja luz o baja temperatura normalmente se dan solo dos divisiones (Andersen, 2005).

En la Ilustración 4 se observa un cultivo en ciclo 12:12, mostrando un incremento en el tamaño

celular al inicio del periodo de luz (hora 0) y posterior división en 8 células hijas en las

siguientes 2 - 4 horas del periodo oscuridad (hora 14 en adelante).

El otro tipo de reproducción es la sexual o meiótica. Como se observa en la Ilustración 5 las

células son haploides y en este género la célula vegetativa sufre cambios hasta funcionar como

un gametangio. Se divide y se forman 4, 8, 16 a 32 gametos flagelados, que son liberadas al

agua. Allí se unen dos gametos formando un huevo o cigoto. Este cigoto luego se divide

meióticamente dando cuatro zoosporas flageladas, las que aumentan de volumen dando una

célula vegetativa cada una, como se observa en la ilustración 5. Pueden crecer en un simple

medio de sales inorgánicas, también pueden crecer en la oscuridad total si se presenta una

Ilustración 4. Crecimiento de células en cultivo sincrónico.

Fuente: Harris, 2009

Hora 0 Hora 8

Hora 14 Hora 16

10

fuente alterna de carbono. En la división de las clorófitas, los flagelados inicialmente, poseen

clorofila a, b y carotenoides que amplían el espectro de calor para fotosintetizar (Stern et al.

2009).

Fuente: Karen VanWinkle-Swift, 2010

C. reinhardtii ha sido ampliamente utilizada como modelo en diferentes áreas como la biología

celular, molecular, en genética, en optimización de bio-procesos entre otras, debido

principalmente a que presenta una gran facilidad de ser cultivada en laboratorio tanto en

medios líquidos como sólidos y no es altamente estricta en sus condiciones de crecimiento.

Puede crecer autotrófica, mixotrófica o heterotróficamente y en diferentes condiciones

ambientales, esto ha permitido tener un amplio espectro de condiciones de crecimiento en

laboratorio, empezando por los medios de cultivo. Existen varios medios probados para el buen

crecimiento de esta microalga como se observa en la Tabla 3 Composición milimolar presente

en diferentes Medios de cultivo para C. reinhardtiisin embargo el más ampliamente usado es el

TAP (Tris–acetato–fosfato) (Stern et al. 2009).

Ilustración 5. Ciclo sexual y asexual en C. reinhardtii.

11

Tabla 3 Composición milimolar presente en diferentes Medios de cultivo para C. reinhardtii

Componente Sager-granick Eversole Sueoka Kuhl Bold TAP

Macronutrientes mM

NH4 3.7 93.5 9.35 6x10-5 - 7.48

K 1.88 0.52 22.12 10.0 2.70 1.94

Na 5.1 0.0027 0.27 5.5 3.37 0.27

Ca 0.36 0.09 0.068 0.10 0.17 0.34

Mg 1.2 2.03 0.081 1.0 0.30 0.41

Fe+3 0.37 - - - - -

NO3 3.7 - - 10.0 2.94 -

Cl 1.83 112.9 9.55 0.20 0.78 8.22

SO4 1.2 2.03 0.182 1.03 0.38 0.51

PO4 1.31 0.115 13.6 5.0 1.72 1.00

Tris - 50.0 - - - 20.0

Citrato 1.7 - - - - -

Acetato - - - - - 17.4

Nutrientes traza

Fe+2 - 1.79 17.9 25 17.9 17.9

Zn 3.5 7.65 76.5 1.0 30.7 76.5

Cu 0.25 0.63 6.3 0.001 6.3 6.3

Co 0.84 0.68 6.8 - 1.7 6.8

Mn 2.0 2.56 25.6 1.0 7.3 25.6

Mo 0.82 0.62 6.2 0.007 4.9 6.2

BO3 16 18.4 184 1.0 184 184

EDTA - 13.4 134 25 171.1 134

Fuente: Bold, 1942, Watanabe, 2005, Gorman y Levine, 1965.

C. reinhardtii crece muy bien en acetato, sin embargo otras fuentes de carbono han sido

probadas como glucosa, arabinosa y galactosa encontrando que aunque no es tóxico y no

inhibe el crecimiento, no permite un buen desarrollo de la cepa en condiciones de no

fotosíntesis. Como fuentes de nitrógeno se han probado con buenos resultados el amonio, el

nitrato, la urea, glutamina y arginina. El pH puede mantenerse en un rango de 7-8, para esto el

medio TAP presenta el mejor sistema de amortiguamiento (Grossman et al. 2007).

En la Tabla 4 se muestran las condiciones de cultivo para inóculos de experimentación a nivel

de laboratorio más recomendados (Andersen, 2005).

12

Tabla 4. Condiciones de cultivo en laboratorio para C. reinhardtii

Parametro Rango Recomendado

Temperatura (°C) 15-35 20-25

pH 6-8.5 7-8

Intensidad luz (μmol/m 2s PAR) 35-700 100

Fotoperiodo horas (luz:oscuridad) - 12:12

CO2 (%v/v) 0.03-5 1

Densidad celular (cell/mL) 1-5x106 3x106

Aireación (vvm) 0.5-3 1-1.5

Fuente: Forster et al., 2005

1.1.2.2. Luz y fotoperiodo

Dentro de los factores ambientales que más afectan el crecimiento de las microalgas se

encuentra a la luz como uno de los más relevantes. En la naturaleza la intensidad de la luz

puede encontrarse en algunos lugares lo suficientemente baja como para no permitir que la

población se desarrolle de manera adecuada, o por el contrario, lo suficientemente alta como

para actuar de manera inhibitoria sobre las células. La intensidad de saturación o inhibición

depende de manera conjunta de otros factores ambientales como la temperatura, los niveles de

CO2 y la disponibilidad de nutrientes (Andersen, 2005).

Del espectro completo que emite la luz, el rango que es eficientemente asimilado por las

microalgas se encuentra entre los 400 y 700 nanómetros (nm) como se observa en la

Ilustración 6, esta parte del espectro solar es llamado radiación fotosintética activa (siglas en

ingles PAR) (Jacob-Lopes et al., 2008).

En los proyectos de investigación en microalgas conviene más utilizar luz artificial dentro de los

laboratorios en lugar de usar la luz del sol, con la intención de minimizar el error aportado por la

alta variabilidad en radiación a lo largo del día. Además, se sabe que en los procesos que se

usan piscinas o sistemas abiertos tipo estanques (ponds), la agitación se vuelve un factor

limitante en la eficiencia fotosintética ya que la concentración de luz transmitida a la superficie

del estanque va disminuyendo a medida que aumenta la profundidad del mismo, como se

observa en la Ilustración 7.

En la Ilustración 8 se observa la velocidad específica de crecimiento de C. reinhardtii bajo

diferentes intensidades de luz, encontrando su máxima en un intervalo entre 400-650 µmol/m/s.

Este intervalo de iluminación es el más ampliamente utilizado en investigación con C.

reinhardtii.

13

Ilustración 6. Espectro de absorción de luz por microalgas y cianobacterias.

Fuente: Marcel Jensen, 2004.

Ilustración 7. Comportamiento de la intensidad lumínica a través del pond. (Flecha señala el fondo del

pond)


14

Ilustración 8. Velocidad de crecimiento de C. reinhardtii bajo diferentes intensidades de luz.


De manera paralela a la intensidad de la luz, los ciclos de fotoperiodo son otro factor relevante

en el crecimiento de las microalgas y cianobacterias. Como se ve en la Ilustración 9 e

Ilustración 10, Eduardo Jacob-López et al., en 2008, reportaron el efecto de los fotoperiodos en

el crecimiento, acumulación de biomasa y fijación de carbono inorgánico en una cianobateria.

Ellos encontraron que los ciclos de fotoperiodo en los que prevalece la luz sobre la oscuridad

favorecen el crecimiento y por tanto la fijación de carbono como se ve en las gráficas de la

Ilustración 9, además de que en cianobacterias aún no está demostrada la capacidad de

acumular energía fotosintética para la fase de oscuridad (Stephanopoulos, 1998).

15

Ilustración 10. Porcentaje de fijación de CO2 vs disminución del tiempo de luz en el cultivo de

Aphanothece microscopica

Fuente: Eduardo Jacob-Lopes et al, 2008

Ilustración 9. Curvas de crecimiento en diferentes ciclos oscuridad:luz para Aphanothece microscopica

16

En C. reinhardtii, el efecto que tiene la intensidad de la luz y los fotoperiodos aplicados al

cultivo ha sido estudiado con diferentes propósitos. Pedro J. Aparicio et al., en 1985 estudiaron

el efecto que tiene la intensidad de la luz en la producción de hidrógeno encontrando que

cuando el cultivo es expuesto a bajas irradiancias (30 µE.m2.s-1) o total oscuridad, la

producción de hidrógeno aumenta y se hace constante hasta por 50 horas (Mittag, 2005).

La luz y el fotoperiodo también tiene una implicación bastante importante en el ritmo circadiano

de la célula. Mittag et al., en 2005, reportaron la influencia de los fotoperiodos y la intensidad de

la luz en los ciclos circadianos de C. reinhardtii. Los ritmos o ciclos circadianos son programas

de regulación endógena que controlan procesos metabólicos, fisiológicos y de motilidad celular.

Modulan procesos como la foto-acumulación o fototaxis, quimiotaxis hacia nutrientes, por

ejemplo hacia las fuentes de nitrógeno en total oscuridad, la capacidad celular de adhesión a

las superficies de vidrio y la división celular entre otros (Jansenn et al., 2004.)

La presencia de luz en cultivos de C. reinhardtii también es fundamental en procesos de

transporte carbono inorgánico. Yamano et al., en 2010, demostraron la influencia de la luz en la

producción de la proteína LCIB transportadora de carbono inorgánico al interior del cloroplasto

como se observa en la Ilustración 11, cuando al quitarse el suministro de luz, la proteína

marcada fluorescentemente se disocia en la célula perdiendo su función.

Fuente: Yamano et al, 2010

C. reinhardtii es una de las microalgas reportadas con mayor potencial para la obtención de

metabolitos de interés en la mayoría de sectores que se mencionaron anteriormente. Esta

microalga tiene la capacidad de crecer autótrofamente usando CO2 y luz, mixótrofamente

usando acetato y luz y heterótrofamente usando solo fuentes de carbono orgánicas

principalmente el acetato.

Ilustración 11. Agregación de la proteína LCIB en presencia de luz.

17

1.1.2.3. Crecimiento autotrófico

Chlamydomonas reinhardtii tiene de manera natural los mecanismos fisiológicos requeridos

para crecer en autotrofia inclusive cuando la concentración de CO2 es baja. El proceso de

fotosíntesis realizado por esta microalga proporciona el potencial reductor necesario para que

se dé la fijación de CO2 por el ciclo de Calvin. Como se observa en la Ilustración 12 la

fotosíntesis aporta a la célula el ATP y NADPH+ necesarios para que posteriormente se fije el

carbono que ha entrado a la célula en forma de CO2 o HCO3 (Stern et al., 2009). El mecanismo

de fijación requiere de la concentración de carbono inorgánico cerca del pirenoide donde se

ubica la enzima RuBisCo que es la que realiza la primera parte del ciclo de fijación. Si la

concentración es como la del aire o más alta, el ciclo de Calvin es la ruta que se usa

(Ilustración 13), si es más baja, se usa una vía alterna similar a la de las plantas, la vía C4

Ilustración 14.

Ilustración 12 proceso de fotosíntesis en Chlamydomonas reinhardtii

Fuente: tomada de http://www.kegg.jp

http://www.kegg.jp/

18

Ilustración 13. Ciclo de Calvin Benson.

Fuente: Takashi yamano et al, 2008

Ilustración 14. Via C4 en plantas

Fuente: Takashi yamano et al, 2008

Este modelo autotrófico de crecimiento es el más ampliamente utilizado por las microalgas de

manera natural ya que utiliza como fuentes de carbono y energéticas sustratos de fácil

adquisición en los ecosistemas naturales. También es el modelo preferido en los escenarios de

investigación y producción de biomasa de microalgas de manera artificial, ya que además de

19

ser su metabolismo natural, estos procesos involucran el secuestro de CO2 que al ser un gas

de efecto invernadero provoca la investigación sobre su reducción ambiental (Grossman et al.,

2007).

Los cultivos de C. reinhardtii crecidos en autotrofia al igual que otras microalgas varían sus

parámetros cinéticos y composición bioquímica según los mecanismos usados en el cultivo

como medio de cultivo, irradiación, ciclos de luz: oscuridad, relación nitrógeno-fósforo, cantidad

de CO2, estrategia de cultivo (continuo, discontinuo, lote) entre otros, así se tiene que la

composición y productividad de un cultivo de esta microalga puede variar ampliamente de un

sistema a otro. Por ejemplo, en la Tabla 5 se observa los resultados obtenidos por Nanette R.

Boyle and John A. Morgan en el 2009, la composición de la biomasa de Chlamydomonas

reinhardtii obtenida vía fotosintética con una velocidad de crecimiento de 0.066 ± 0.007 h-1,

usando medio TAP a 25°C con agitación de 200 rpm, irradiación de 65 µE/m2/s, CO2 0.03% y

ciclos de 16:8 (Stern et al., 2009).

Tabla 5. Composición bioquímica de la biomasa de Chlamydomonas reinhardtii crecida en

autotrofía

Componente celular Composición porcentual de la biomasa total

Carbohidratos 50.8

Proteína 26.1

Lípidos 18.9

Clorofila a 0.9

Clorofila b 1.5

Fuente: Nanette R Boyle and John A Morgan, 2009.

De manera comparativa, Anna M. J. Kliphuis et al en 2011, cultivaron Chlamydomonas

reinhardtii en fotosíntesis obteniendo los resultados que se muestran en la Tabla 6.

El medio de cultivo usado TAP a 25°C con agitación de 200 rpm, irradiación de 45 µE/m2/s,

CO2 0.03% y ciclos de 16:8.

Tabla 6. Composicion de la biomasa de Chlamydomonas reinhardtii en autotrofía.

Componente celular Composición porcentual de la biomasa total

Proteína 40.23

Carbohidratos 25.47

Lípidos 17.28

DNA 0.21

20

Fuente: Anna M. J. Kliphuis et al, 2011

1.1.2.4. Crecimiento heterotrófico

En el crecimiento heterótrofo, las células son crecidas en oscuridad utilizando una fuente de

carbono orgánica como el acetato y el oxígeno como aceptor de electrones. Los productos del

metabolismo son el CO2 y el agua. Ya que en el metabolismo heterótrofo la fuente de carbono

actúa a la vez como fuente de energía, el rendimiento del carbono celular es mucho menor

comparado con la biomasa fotosintética que usa a la luz como fuente de energía.

Debido a que el cultivo de microalgas vía heterotrófica se asemeja al ya conocido cultivo de

bacterias y no implica el desarrollo de fotobiorreactores y sistemas de iluminación, los costos

de producción y operación de los sistemas pueden reducirse considerablemente. Sin embargo

el uso de fuentes de carbono como glucosa o acetato no es económicamente viable a escala

industrial, por lo cual se ha explorado el uso de otras tecnologías como la ingeniería genética

para reducir costos. En el caso de C. reinhardtii, se ha probado una modificación para que la

cepa fotótrofa sea heterótrofa obligada, aumentando sus rendimientos de lípidos y justificando

así el uso de fuentes orgánicas costosas (Aparicio et al. 1985 ).

Sin embargo, en el tema energético, esta microalga pese a tener potencial, aun no produce las

cantidades de metabolitos que se requieren para que un proceso sea totalmente competitivo.

Hoy en día se han identificado varios cuellos de botella en cada una de las etapas de

producción de metabolitos para biocombustibles. Ejemplificando en el caso de producción de

aceites para transesterificación, se identifican desafíos muy grandes en las etapas de cultivo,

cosecha, extracción y manejo de residuos, es decir en todas las etapas del proceso. Sin

embargo una ventaja que tiene este proceso es que comparte tecnología con los procesos de

industrias establecidas hace muchos años. En la etapa de separación de biomasa, de

extracción de aceites y de transesterificación, se han logrado tener homologaciones de

tecnología muy importantes. Sin embargo, en la fase de cultivo y selección de cepas, las

tecnologías no resultan muy homologables, y se requiere investigar mucho más en esta fase

para obtener un organismo que pueda satisfacer la demanda del proceso. En la Tabla 7 se

puede observar lo que para estos autores en 2010 se consideran rendimientos que pueden

RNA 5.99

Clorofila 5.14

cenizas 5.68

21

llegar a ser competitivos con el combustible fósil a nivel comercial, y se ve también los

resultados más optimistas hasta esta fecha en procesos inferiores a escala industrial.

Tabla 7. Rendimientos esperados y observados de la tecnología.

Criterio Esperado Observado

Rendimiento de alga por

hectárea por año (Ton)

150 5-70

% de aceite por biomasa seca 30 4-25

Fuente: NREL document learned lessons ASP program 2010

Esta realidad, ha impactado diversos sectores del mundo energético. En algunos casos, se ha

estimulado el desarrollo de nuevas y diferentes tecnologías (optimización en procesos de

separación de biomasa y extracción de acetites), en otros se ha profundizado en la

investigación a nivel genético de las microalgas. Muchas empresas han cesado sus actividades

al encontrarse en una escala piloto o semi-industrial con que sus productividades no alcanzan

lo mínimo necesario. Otras, por el contrario, como es el caso de Solazyme (www.

Solazyme.com) o Sapphire Energy (www.sapphireenergy.com), han buscado apoyo económico

externo para financiar sus actividades de contingencia ante esta lamentable realidad. Por

ejemplo, estas empresas, han enfocado sus investigaciones en la primera etapa del proceso,

basándose en lo que se describió arriba: que en las etapas corriente abajo del cultivo otras

tecnologías ya existentes pueden colaborar mucho, por lo que sus esfuerzos se enfocan

principalmente a la búsqueda de cepas con potenciales muy altos; a la reducción de costos de

cultivo mediante uso de materiales económicos; y a la modificación genética y metabólica de

las cepas de microalgas. A esta última opción (modificación genética, silenciamiento de rutas

metabólicas) ha enfocado sus esfuerzos Solazayme, encontrando rendimientos de biomasa y

aceites muy superiores a los convencionales (150g/L de biomasa seca con 70-75% de aceite.

1.1.2.5. Crecimiento mixotrófico

Chlamydomonas reinhardtii es facultativa, capaz de crecer mixótrofamente en acetato, pero no

tan bien en glucosa u otra fuente de carbono similar (Field, 1998). Muchos estudios de estrés y

regulación de luz han sido llevados a cabo en células crecidas usando acetato. Heifetz et al.,

en 2000, se interesaron por el efecto del acetato en la fotosíntesis y en procesos relacionados.

El acetato es metabolizado a triosa, seguidamente y en vía dependiente de ATP, entra al ciclo

22

del glioxilato, si el carbono inorgánico es reducido a triosa durante la fotosíntesis (ver

Ilustración 15) (Stern, 2009).

Ilustración 15. Vía metabólica del glioxilato, asimilación del acetato por C. reinhardtii.

Fuente: Allmer et al, 2006

El metabolismo del acetato puede afectar negativamente la utilización del carbono inorgánico.

Estudios previos han reportado que el acetato inhibe la fotosíntesis y simula la respiración de

células en presencia de luz y posiblemente incrementa la actividad oxidasa alternativa (Nielsen

y Villadsen, 1994).

La capacidad del acetato para inducir liasa-isocitrato, enzima clave en el ciclo del glioxilato, es

atenuada en presencia de luz y carbono inorgánico (Nielsen y Villadsen, 1994). Por el contrario,

el acetato reprime la expresión de proteínas de cloroplasto involucradas en la captura de luz y

fijación de carbono.

Sin embargo, Heifetz et al., en 2000, encontraron que pese a la disminución de la actividad

fotosintética en presencia de acetato, la velocidad de crecimiento no disminuía manteniendo

valores muy similares a medida que aumentaba la concentración de acetato.

Como se ve en la Tabla 8 la velocidad de crecimiento no varía considerablemente en presencia

de acetato, sin embargo la fijación de carbono inorgánico sí lo hace, lo cual indica el aumento

en la fijación de carbono orgánico en detrimento de la fijación del inorgánico.

Tabla 8. Influencia del acetato en la fotosíntesis de C. reinhardtii.

Acetato mM Tasa de crecimiento h-1 Fotosíntesis (fijación de CO2)

0 0.149 465

3.7 0.162 308

7.4 0.153 360

14.7 0.153 257

23

29.4 0.148 207

Fuente: Heifetz et al., en 2000

De manera comparativa con la Tabla 5 en ese mismo estudio se realizó un crecimiento

mixotrófico de Chlamydomonas reinhardtii para evaluar las diferencias composicionales. Lo

resultados se muestran en la Tabla 9

Tabla 9. Composición bioquímica de la biomasa de C. reinhardtii crecida en mixotrofía.

Componente celular Composición porcentual de la biomasa

Carbohidratos 38.1

Proteína 30.3

Lípidos 27.9

Clorofila a 0.7

Clorofila b 1.3

Fuente: Nanette R Boyle and John A Morgan, 2009

En mixotrofía se presentan como productos del crecimiento los relacionados tanto al

crecimiento autótrofo como heterótrofo, esto es, oxígeno, agua y CO2. Usando balances

estequiométricos entre estos productos y los sustratos del cultivo se pueden estimar las

diferencias entre el metabolismo autótrofo y el mixótrofo de la cepa, determinando así los flujos

de carbono en la red para realizar una posible modificación sobre el sistema que permita

obtener más de algún metabolito en especial (Kliphuis et al. 2011). Debido a la variación en la

distribución del carbono en cada esquema de crecimiento (mixo, auto y heterotrofia), los

rendimientos celulares varía, y esto se ve relacionado de manera directa con la productividad

de biomoleculas internas como los lípidos.

En la Tabla 10 se observa que el rendimiento fotosintético es mayor y que el 100% del carbono

fotosintético es usado para sintetizar material celular.

Tabla 10. Rendimiento del carbono fijado en tres metabolismos diferentes en C. reinhardtii

Condición de crecimiento Rendimiento (g biomasa/mol carbono)

Autotrófico 28.9

Heterotrófico 15.6

Mixotrófico Incrementa cuando incrementa la intensidad de luz

13.5 a 22.9

Fuente: Nanette R Boyle and John A Morgan, 2009

24

Como se observa en esta tabla, en el crecimiento mixotrófico el rendimiento de carbón fijado

aumenta a medida que aumenta la luz, esto quiere decir que a medida que aumenta la

actividad fotosintética la fijación de carbono inorgánico se establece predominante y la fuente

de energía se diferencia del carbono (Kliphuis et al. 2011).

1.1.3. Compartimentalización metabólica

La compartimentalización celular es la diferenciación de proteínas y procesos bioquímicos de

síntesis y degradación especializada en organelos que permite a la célula realizar funciones

específicas en zonas particulares de su estructura (Atteia A, 2009).

Es muy conocido que en el caso de las microalgas el cloroplasto resulta ser uno de los

organelos más funcionales de la célula, ya que es allí donde se realizan funciones vitales como

la fotosíntesis y fijación del CO2 entre otras.

El almidón es sintetizado y degradado también en el cloroplasto en los ciclos de luz: oscuridad.

Bajo condiciones de no estrés el almidón parece ser el material de reserva preferido por las

células de C. reinhardtii, pero cuando hay condiciones de estrés, las células aumentan la

acumulación de lípidos (Spalding, 2009).

Como ya se ha dicho, bajo condiciones de mixotrofía C. reinhardtii puede asimilar CO2 y

acetato como fuentes de carbono.

El acetato es incorporado a la célula e inmediatamente transformado en AcCoA (Acetil CoA)

principalmente por dos vías mediadas por ATP, una vía lo hace de manera directa y la otra vía

involucra dos enzimas en dos pasos hasta llegar a AcCoA.

En cultivos heterótrofos (oscuridad), la asimilación de acetato esta reportada para metabolismo

aerobio (respiración) pero no para el anaerobio (fermentación) (Xenie Jonhson, 2013).

El AcCoA es utilizado en el ciclo TCA (ácidos tricarboxilicos) para obtener 3 moléculas de

NADH, 1 de FADH2, 2 de ATP y 2 de CO2, el NADH y el FADH2 son oxidados en la cadena

respiratoria para producir más ATP. Cuando el ATP está presente, el oxalacetato es convertido

en fosfoenol piruvato (PEP), este PEP es utilizado en la gluconeogénesis hasta llegar a

glucosa. Así las células de C. reinhardtii crecidas en la oscuridad y con acetato en condiciones

aeróbicas acumulan almidón. Posteriormente cuando el acetato se acaba, el almidón es

degradado por via glucolisis para proveer de ATP y NADH al sistema.

La via de las pentosas fosfato puede actuar de diferentes ―modos‖, un modo consume ATP,

para liberar estructuras de carbono requeridas en otras vías sintéticas, otro modo libera poder

reductor y un tercer modo esta acoplado a la parte alta de la vía de glicolisis, el cual produce

ATP, NADPH y CO2. Estos modos se activan y desactivan dependiendo de las necesidades

25

energéticas del sistema. La vía de las pentosas fosfato puede ser considerada como una vía

alterna a la parte alta de la glicolisis: G6P puede ser convertida en F6P (Xenie Jonhson, 2013).

En C. reinhardtii se encontró que la vía glicolítica está altamente compartimentalizada. Esta vía

es dividida en dos parte, una parte alta, que va desde la glucosa hasta el G3P (gliceraldehido 3

fosfato) ubicada en el cloroplasto y una parte baja que va desde el G3P hasta el piruvato,

ubicada en el citosol. En la tabla se muestra la compartimentalización de diferentes enzimas

participantes en las principales vías del metabolismo del carbono en C. reinhardtii

Tabla 11. Compartimentalizacion de enzimas presentes en el metabolismo central del carbono en C. reinhardtii.

Enzima Reacción Mit Cit Clor

Síntesis de almidón

amilasa Almidón -> glucosa - - √

Almidón fosforilasa Almidón -> G1P - - √

fosfoglucomutasa G1P -> G6P - - √

Glicolisis

Hexokinasa Glucosa + ATP -> G6P - - √

ADP-glucosa pirofosforilasa ADP- glucosa <- G1P + ATP - - √

Fosfoglucosa isomerasa G6P -> F6P - - √

Fosfofructokinasa F6P + ATP -> F16P - - √

Fructosa 1,6 bifosfatasa F6P <- F16P - - √

Fructosa bifosfato aldolasa F16 <-> G3P - - √

Triosa fosfato isomerasa G3P <-> DHAP - - √

Gliceraldehido fosfato deshidrogenasa G3P <-> G13P - √ √

Fosfoglicerato kinasa G13P <-> 3PGA - √ √

Fosfoglicerato mutasa 3PGA <-> 2PGA - √ -

Enolasa 2PGA <-> PEP - √ -

Piruvato kinasa PEP -> Piruvato + ATP - √ -

Fosfoenol piruvato carboxikinasa PEP + HCO3 -> oxalacetato + GTP - √ -

Fosfoenol piruvato carboxilasa PEP + HCO3 -> oxalacetato - √ -

Vía pentosas fosfato

Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa G6P ->6-PGL + NADPH - √ √

6 fosfogluconato deshidrogenasa 6-PGL ->Ru5P + NADPH + CO2 - √ √

Asimilación de acetato

Acetil-coa sintetasa AcCoA <- acetato + ATP √ √ √

Fosfato acetil transferasa AcCoA <- Acetil-P √ - √

26

Acetato kinasa Acetil-P <- acetato + ATP √ - √

Síntesis de lípidos

Acetil-coa carboxilasa Malonil-Coa <- Actil-Coa + ATP +

HCO3

- - √

B- cetoacetil sintetasa, ácido graso

sintetasa

FA + HCO3 <- ac-Coa + ma-Coa +

NAPH

- - √

Glicerol 3 fosfato deshidrogenasa Glicerol 3P <- DHAP + NADPH - - √

Mit: mitocondria, Cit: citosol, Clor: cloroplasto.

(-): ausencia

(√): presencia

Fuente: Xenie Jonhson, 2013

Ball en 1998 realizo ensayos con carbono marcado radioactivamente que demostraron que el

cloroplasto de C. reinhardtii exporta un 23% de 3-PGA (acido 3 fosfoglicerico), 15% de DHAP

(dihidroxi acetona fosfato), 20% de hexosas fosfato y 13% de glicolato formados en presencia

de luz y CO2.

En condiciones heterotróficas, la fosforilación oxidativa está sustentada por la asimilación de

acetato que alimenta el ciclo TCA, y el ATP producido allí es exportado fuera de la mitocondria.

Si el ATP es abundandte en el citosol, esto puede reversar la actividad de la fosfoglicerato

kinasa en el citosol y así permitir la liberación de 1,3BPG (1,3-bifosfoglicerato) y G3P. Este G3P

es importado al cloroplasto donde una parte es usada para la síntesis de hexosas

(gluconeogenesis), la otra parte puede ser oxidad y desfosforilada en cloroplasto produciendo

ATP y 3PGA, este último puede ser retornado al citosol, donde podría ser tenido en cuenta

para la síntesis de almidón en la oscuridad (Harris, 2009).

Biosíntesis de lípidos en Chlamydomonas reinhardtii

Así como en el caso del almidón, los precursores para síntesis de ácidos grasos están en el

cloroplasto. La acumulación y posterior activación de AcCoA y malCoA (malonil-CoA) en el

cloroplasto, origina la ruta de síntesis de ácidos grasos. Aunque no está aún clara la interacción

del CO2 y el acetato en el origen de AcCoA, se presume que la via que viene desde el 3-PGA a

PEP es la principal ruta de acción (Fan J, 2011).

Se sabe que la síntesis de ácidos grasos más importante que se lleva a cabo bajo condiciones

de no estrés es la de lípidos polares asociados a constituyentes celulares como los de las

membranas. La síntesis de lípidos constituidos por triacil gliceroles (TAG`s) que son los ácidos

grasos importantes en la fabricación de biodiesel, está asociada a condiciones de estrés,

donde las células inician un proceso de acumulación de TAG`s como material de reserva

27

energético que posteriormente puede ser utilizado por vía de la beta oxidación de ácidos

grasos (Nguyen HM, 2011).

La acumulación de lípidos neutros en C. reinhardtii por estrés nutricional puede deberse a

procesos multifactoriales. Una condición altamente conocida y aplicada en la industria es la

deprivación de nitrógeno en el medio. Bajo este modelo de crecimiento la célula inicia una alta

acumulación de TAG`s como material de reserva dando altos rendimientos lipídicos (Fan J,

2011). Esta técnica es muy promisoria, aunque tiene dos aspectos claves en la manipulación.

Primero, bajo limitación de nitrógeno, el crecimiento celular es reducido, lo cual implica que

para obtener algo de aumento en la biomasa se tendrá que usar el material energético

acumulado. Y segundo, la deprivación de nitrógeno también induce la anulación del aparto

fotosintético, lo cual obliga a el uso de fuentes de carbono externas del tipo orgánicas,

haciendo esto que se deban revalorar los niveles costo-efectivos de la producción de lípidos.

En condiciones de autotrofía donde el CO2 es la única fuente de carbono, la vía de

acumulación de almidón es la vía más eficiente en reserva de carbono, por otra parte la

acumulación de ácidos grasos es un proceso que deriva en un mayor gasto energético y

perdida de carbono, por tanto no es el principal proceso de acumulación de materiales

energéticos en sistemas sin limitación de nutrientes. Finalmente cabe resaltar que

investigaciones relacionadas al efecto dual en la acumulación de lípidos y almidón han

mostrado diversos resultados, y que las pruebas fehacientes del mecanismo energético

utilizado por C. reinhardtii para estos casos aún no están muy claras (Xenie Jonhson, 2013).

1.1.4. Ingeniería metabólica.

La ingeniería metabólica es un área que incluye la construcción, re-direccionamiento y

manipulación del metabolismo celular a través de actividades enzimáticas heterólogas y/o

endógenas a niveles que permiten la biosíntesis o biocatálisis de compuestos deseados

(Palsson, 2009). Los investigadores en ingeniería metabólica, parecen ver a las células como

fábricas bioquímicas que transforman un material en un compuesto de valor agregado. Debido

a que los rendimientos y productividades de los procesos están ligados a su viabilidad

comercial, la capacidad de regular de manera precisa el flujo de energía y material a través de

vías celulares se convierte en un punto crítico en la optimización del proceso, ofreciendo

alternativas a la ingeniería tradicional o a los procesos de diseño químico (Báez et al. 2004).

La aplicación de la ingeniería metabólica comienza con un análisis de una función celular

especifica (puede ser una ruta o grupos de rutas metabólicas) basada en los resultados de este

análisis se diseñan cepas mejoradas y subsecuentemente se construyen con ingeniería

genética. Simultáneamente se determinan las condiciones ambientales que propician la

28

producción del conjunto enzimático para conducir el metabolismo hacia la obtención del

producto requerido.

Algunos de los campos en los que más ha incidido la ingeniería metabólica son [11]:

Producción de proteínas heterólogas

Extensión de la gama de sustratos de un microorganismo

Rutas metabólicas para nuevos productos

Rutas metabólicas para la degradación de xenobióticos

Mejoras en la fisiología celular total

Eliminación o reducción de la formación de subproductos

Mejoras de los rendimientos o productividad

Fuente: Randor Radakovits et al, 2010

El comportamiento celular no puede ser explicado solamente considerando los elementos

constitutivos de la célula, el metabolismo celular comprende un gran número de rutas

metabólicas (Harris, 2009). Además, los procesos biológicos presentan relaciones complejas y

tienen un comportamiento cinético no lineal y heterogéneo por lo que es deseable la

construcción de modelos matemáticos que describan éstos procesos y permitan el análisis de

sistemas biológicos complejos.

Ilustración 16. Principales rutas metabólicas de C. reinhardtii en fotoautotrofía.

29

Los modelos estequiométricos basados en representaciones del metabolismo celular

comparten dos características: el uso de una red metabólica y el asumir estado pseudo-

estable. Estos modelos derivan de una red metabólica del microorganismo bajo investigación

por lo que la información de las reacciones estequiométricas involucradas en la red metabólica

es el punto de inicio; además, desprecian el comportamiento dinámico intracelular, asumiendo

el estado pseudo-estable de los metabolitos intracelulares. Las dos razones principales para

utilizar esta suposición son: primero, porque esto evita las dificultades en el desarrollo del

modelo cinético lo cual es una consecuencia de la falta de mediciones intracelulares

experimentales y segundo porque sólo el análisis estructural del metabolismo proporciona

información acerca de las características del estado estable de la célula bajo estudio (Baker et

al. 2007).

Los modelos estequiométricos han sido utilizados para estimar la distribución de los flujos

metabólicos bajo circunstancias dadas en la célula a un momento determinado (análisis de

flujos metabólico), para predecir los flujos sobre la base de alguna hipótesis optimizada

(análisis de flujo de balance) y como herramienta para el análisis estructural del metabolismo

(Nielsen y Villadsen, 1994).

Una de las grandes contribuciones de la ingeniería metabólica a la biología y a la biotecnología

es la integración del análisis macroscópico de un bioproceso como la fermentación y el análisis

microscópico de las reacciones de los metabolitos intracelulares como la red de reacciones

Enzimáticas (Stephanopoulos, 1998).

1.1.5. Modelos estequiométricos del crecimiento celular

1.1.5.1. Modelo de caja negra

En este modelo la biomasa celular es considerada una caja negra que intercambia material con

el ambiente, como se muestra en la Ilustración 17, y procesando esto a través de muchas

reacciones celulares agrupadas en una, normalmente el crecimiento de la biomasa. Los flujos

de entrada y salida de la caja negra son: tasas de consumo de sustratos y tasas de formación

de productos. Adicionalmente hay una acumulación de biomasa dentro de la caja negra que es

representado por un flujo particular que es la tasa especifica de crecimiento µ (Klamt et al,

2002). Se considera entonces una sola reacción:

S + N + O2 X + P+ CO2 Ecuación 1

Dónde:

S: sustrato carbonado.

30

N: fuente de nitrógeno.

X: biomasa.

P: producto.

Esto implica que todos los rendimientos de biomasa en sustrato (así como los de otros

compuestos consumidos y producidos por la célula) permanecen constantes.

Consecuentemente la tasa de captación de sustrato es proporcional con la tasa específica de

crecimiento de la biomasa:

-qs= Yxs. µ Ecuación 2

Dónde:

qs: tasa de consumo de sustratos.

Yxs: rendimiento de biomasa en sustrato.

µ: tasa especifica de crecimiento.

rs rp

µ

Ilustración 17. Modelo de caja negra.

La ecuación 1 podría ser esquematizada en una matriz elemental E de m sustancias y n

elementos obteniendo:

Que puede reacomodarse como:

Gl=m-n Ecuación 3

Donde Gl: son los grados de libertad de la matriz E.

Si la resta entre los elementos que componen las diferentes sustancias y las sustancias es de

por ejemplo 1, esto significa que se requiere medir una sustancia en el sistema para satisfacer

los grados de libertad. Con el valor de esta sustancia medida, se podrán calcular los valores

correspondientes a las sustancias no medidas. La cantidad de sustancias que se midan serán

las restricciones que tendrá el sistema, y esto le otorgara la característica de

sobredeterminado, subdeterminado o determinado.

31

1.1.5.2. Análisis de flujos metabólicos

Al conjunto de coeficientes de reacción en una ruta metabólica se le llama distribución de flujos

metabólicos. La fisiología celular puede ser interpretada y comprendida observando la

distribución de flujos metabólicos bajo las condiciones de investigación de una fermentación. El

impacto de una modificación genética sobre metabolismo en un microorganismo determinado

puede ser estudiado comparando la distribución de los flujos entre la cepa sin modificación del

microorganismo y la del microorganismo recombinante en el cual, un gen específico ha sido

introducido, mejorado o borrado genéticamente (Llaneras et al. 2008).

Si se conocen las rutas o redes metabólicas del microorganismo que se piensa analizar, se

pueden calcular los flujos metabólicos internos con la ayuda de flujos externos o tasas o

rendimientos del proceso como se observa en la ¡Error! No se encuentra el origen de la

eferencia..

Ilustración 18. Distribución de flujos de una red metabólica hipotética.

Fuente: Jan Tanis, 2006.

El punto de inicio para realizar este análisis es el establecimiento de la red o redes metabólicas

que se piensas usar en el modelo. Una red metabólica está definida por un conjunto de

compuestos (nodos) y un conjunto de reacciones o flujos que conectan un compuesto con otro

(flechas) como se ve en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. La

nformación genómica es un buen punto de inicio para la reconstrucción de una ruta metabólica.

32

De allí se obtienen tanto las enzimas que participan en una ruta como el conjunto completo de

proteínas que pueden participar (Stephanopoulos, 1998).

En la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. se esquematiza que el flujo 3 y 4

orman una reacción reversible. Esto significa que B o D pueden ser transformados de vuelta a

su estructura química original. En muchos documentos esta reacción es dividida en 2 flujos

separados, lo cual resultara en flujos positivos en lugar de una mezcla de flujos positivos y

negativos.

El criterio más importante en el análisis de flujos metabólicos es la consideración del estado

estable en el sistema. Esto significa que todas las concentraciones de intermediarios

metabólicos en el modelo son constantes, en otras palabras, que su cambio en el tiempo debe

ser igual a 0. Esta consideración es hecha debido a que los cambios en las concentraciones de

los metabolitos son mucho más rápidos que los cambios en la tasa de crecimiento o en la

dinámica extracelular. Este estado estable puede ser escrito en ecuaciones en términos de

balance de masa. Estas ecuaciones describen el cambio de concentración sobre el tiempo

basado en los flujos a través de la red metabólica. El cambio de concentración es la diferencia

entre las tasas en las cuales el metabolito es producido o consumido. Un ejemplo de

ecuaciones de balance de masa extraído de la ¡Error! No se encuentra el origen de la

eferencia., se presenta en la ecuación 4.

dA/dt = -q1+b1

dB/dt = q1+q4-q2-q3

dC/dt= q2-q5-q6-b2

dD/dt = q3+q5-q4-q7-b3

dE/dt = q6+q7-b4 Ecuación 4.

En la Ilustración 18, los flujos Vi se reprensentan por la letra q en la ecucion 4.

La información estequiométrica involucrada en una ruta metabólica con m metabolitos y n

reacciones puede ser representada por una matriz estequiométrica (M) en la cual, los

renglones corresponden a los metabolitos y las columnas a las reacciones. Esta matriz es muy

importante ya que representa la transformación del conocimiento biológico en términos

matemáticos.

Una vez que la matriz es establecida, los balances de masa que involucran a los metabolitos

intracelulares pueden ser representados por la ecuación diferencial ordinaria (Nielsen y

Villadsen, 1994):

33

Un balance de sustancias al interior de las células conduce a:

q q Ecuación 5

Donde x es la fracción masa de la sustancia en la biomasa, Y es la matriz estequiométrica de

las reacciones metabólicas, qI el vector de las de intercambio, llamadas todas de manera

genérica ―flujos metabólicos‖.

Esta es la ecuación de balance de masa dinámico y describe la evolución sobre el tiempo de la

concentración de cada metabolito, Esta ecuación implica que, para conocer la evolución

dinámica de los metabolitos intracelulares, información acerca de la estequiometría (M),

crecimiento de biomasa (μ) y las reacciones de los flujos intracelulares debe ser conocida

Si las concentraciones de la biomasa se encuentran en estado estable o equilibrio dinámico

nos referimos a ese estado como crecimiento balanceado y entonces,

Ecuación 6

La mayor parte de las sustancias se encuentran a muy baja concentración, estos

―intermediarios metabólicos‖ que son usualmente moléculas pequeñas contribuyen muy poco a

la biomasa total y para ellas,

Ecuación 7

De manera general pueden encontrarse ciertos flujos en función de otros, como se hace con

los modelos de caja negra. Para esto puede acomodarse la ecuación 7 como:

q q (

) (

q

q )

Donde M es una matriz metabólica que incluye tanto la información del metabolismo como la de

intercambio. De esta manera, pueden encontrarse algunos flujos en función de otros como se

mostrará más adelante.

Este análisis establece un mapa que proporciona información acerca de la contribución de

cada reacción a todo el proceso metabólico de consumo de sustrato y formación de productos

como se observa en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia..

34

Ilustración 19. Distribución de flujos metabólicos de un cultivo mixotrófico de Chlorella sp.

Fuente: Chen Yang, 2000.

Para realizar un análisis de los flujos de cierta red metabólica se debe tener en cuenta las

características de esta red metabólica para así conocer la capacidad de resolución que tiene el

sistema.

El análisis de grados de libertad muestra cuántas variables mínimas deben medirse para poder

resolver el modelo matemático. De aquí se dividen los sistemas en determinados, sub-

determinados y sobre-determinados.

1.1.5.3. Sistemas determinados.

Este tipo de sistemas son aquellos en los que pueden ser calculados de manera directa los

flujos ya que el número de variables es igual al número de ecuaciones o en este caso flujos y

metabolitos.

35

En el sistema determinado la solución es única si exactamente son medidos Gl flujos. Para

obtener la solución, los flujos que van a ser medidos en q pueden ser agrupados en un nuevo

vector qm y los elementos restantes (los que necesitan ser calculados) en otro vector qc. De

manera similar, los coeficientes estequiométricos de la matriz M son divididos agrupando los de

las reacciones medidas en Mm y los restantes en Mc de tal forma que la ecuación general se

convierte en (Smolke, 2010):

Mm qm + Mc qc = 0 Ecuación 8

Si Mc es una matriz cuadrada (dimensiones mxm) y puede ser invertida, qc (flujos

intracelulares desconocidos) puede ser encontrada a partir de (Manish et al. 2007):

qc = -(Mc)-1 Mm qm Ecuación 9

Si menos de los flujos Gl son medidos, el sistema está subdeterminado y los flujos

desconocidos pueden ser determinados imponiendo un criterio de optimización sobre los

balances metabólicos (Stephanopoulos, 1998).

1.1.5.4. Sistema sub-determinado.

Si el número de flujos medidos es más pequeño o menor que los grados de libertad del sistema

(¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.3), un número infinito de soluciones

xisten para resolver los flujos de esta red.

En este caso la programación lineal u optimización lineal puede ser usada para determinar la

distribución de flujos intracelulares, siempre que haya un objetivo función claro se pueda

especificar (por ejemplo la maximización de la tasa de crecimiento celular). Con este

acercamiento es posible tener una única solución para los flujos intracelulares por optimización

del objetivo función sujeto a los límites del balance de metabolitos (Nielsen y Villadsen, 1994).

El sistema indeterminado origina un infinito de soluciones a la ecuación, pero las que tienen

sentido biológico residen en un subconjunto llamado el conjunto factible. Este se puede definir

como las capacidades del genotipo metabólico de un organismo, puesto que define todas las

distribuciones de flujo que se pueden lograr con un juego particular de genes metabólicos. El

uso particular del genotipo metabólico bajo unas condiciones concretas se puede definir como

fenotipo metabólico desplegado en esas condiciones.

36

1.1.5.5. Sistemas sobre-determinado

Si más de los flujos Gl son medidos el sistema se vuelve sobre-determinado y si la matriz Mc

es de rango completo, los flujos metabólicos son calculados usando valores medidos con el

método de mínimos cuadrados de tal forma que (Shimizu et al. 2002):

Mc = -[(Mc)T Mc]

-1 (Mc)T qm Ecuación 10

Así, por supuesto, los flujos obtenidos en un sistema sobre-determinado pueden usarse para

calcular no solo un mejor estimado de los flujos no medidos, sino también de los flujos

medidos.

En este sistema la matriz estequiométrica no es cuadrada y no puede ser invertida (ya que se

están midiendo más flujos de los necesarios), para resolver este inconveniente se aplica la

pseudo-inversa de Moore-Penrose como se observa en la Mc = -[(Mc)T Mc]-1 (Mc)T qm

Ecuación 10

De esta manera los requerimientos para la resolución de un sistema sobre-determinado se

vuelven los mismos que para un sistema determinado.

Como se mencionó anteriormente, en el proceso de uso de microalgas para producir

biocombustibles, es necesario que se optimicen los niveles de producción de metabolitos,

usando cualquiera de las estrategias mencionadas. Es por esto, que en este proyecto se

propone analizar los flujos metabólicos de Chlamydomonas reinhardtii con el fin de describir

los patrones metabólicos involucrados en el proceso de producción de dichos metabolitos.

37

1.2. JUSTIFICACIÓN

El inminente agotamiento de las reservas de crudo, los fenómenos causados por el

calentamiento global y la contaminación ambiental entre otros muchos factores han estimulado

de manera significativa el avance en los estudios científicos que lleven a obtener nuevas

fuentes energéticas a un costo competitivo y ambientalmente amigables. Resaltan dentro de

las más importantes en estas alternativas la eólica, la energía solar, la hidroeléctrica, los

biogases y los biocombustibles líquidos, dentro de este último grupo los más importantes son el

biodiesel y el bioetanol. Estos combustibles líquidos y biogases pueden ser obtenidos de

diversas fuentes, una de ellas son las microalgas.

La síntesis y producción de sustancias biocombustibles en algas se realiza por la fijación del

CO2, siendo esta otra razón más para interesarse en el uso de microalgas para la obtención de

una fuente alternativa de energía. Sin embargo, es ampliamente conocido que el desarrollo de

muchas energías renovables esta apenas surgiendo y que cada una de ellas se encuentra en

el camino barreras técnico-económicas importantes que los mantiene aún al margen del

comercio mundial. Uno de los desafíos que tienen los biocombustibles es lograr competir

económicamente con el precio actual del petróleo. Para esto es necesario, lograr aumentar los

rendimientos y las productividades en la producción de biocombustibles de microalgas. En este

punto la biotecnología, específicamente la ingeniería metabólica juega un papel muy importante

en lograr superar estas barreras tecnológicas que hoy separan las energías alternativas de la

realidad mundial.

El uso de herramientas como el análisis de flujos metabólicos permite al hombre poder

vislumbrar los niveles máximos de producción a los que determinado organismo puede llegar, y

usando modelos matemáticos se puede predecir el comportamiento específico de un

organismo bajo determinadas condiciones. En el caso de C. reinhardtii, objeto de este estudio,

se realizó un análisis de sus flujos metabólicos bajo condiciones de crecimiento mixótrofas para

conocer las interacciones existentes entre las rutas bioquímicas de los principales metabolitos

de interés y las reacciones involucradas en la fijación de CO2, pensando en evaluar sus

máximos rendimientos teóricos para proponer futuras estrategias de optimización del proceso.

38

1.3. OBJETIVOS

1.3.1. Objetivo general

Analizar los flujos metabólicos de la microalga Chlamydomonas reinhardtii con el propósito de

vislumbrar posibles optimizaciones en la obtención de metabolitos de interés en el marco de la

producción de biocombustibles.

1.3.2. Objetivos específicos

Definir y montar las técnicas para determinación de los productos, sustratos y/o

metabolitos de interés.

Diseñar y ejecutar los experimentos relacionados al cultivo de Chlamydomonas

reinhardtii bajo diferentes grados de mixotrofía.

Establecer un modelo metabólico de Chlamydomonas reinhardtii en mixotrofía para la

producción de biocombustibles

Realizar el análisis de flujos metabólicos para las condiciones evaluadas.

39

1.4. HIPÓTESIS

Analizando la distribución de flujos metabólicos en función de las condiciones de cultivo, se

puede llegar a establecer las condiciones de cultivo más convenientes así como las rutas

bioquímicas de Chlamydomonas reinhardtii que convienen re-direccionar con el fin de

maximizar la producción de compuestos de interés en el marco de la obtención de

biocombustibles.

40

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Las curvas de calibración fueron estandarizadas de acuerdo con lo indicado en la metodología

específica de cada una (ver anexo 1) mostrando los siguientes resultados:

Las muestras se realizaron por triplicado, y se analizaron utilizando el software Wolfram

Mathematica Ver 9.

2.1. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconinico (BCA)

Y= Ecuación 11

Ilustración 20. Curva de calibración de proteínas por el método del ácido bicinconínico

En la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. se observan además del ajuste

ineal obtenido en la ecuación, las bandas de confiabilidad del método (bandas en color

Morado), estas bandas reflejan la zona de predicción de valores ajustados al método, o

intervalo de confianza

Tabla 12. Análisis de varianza para curva de calibración de proteínas.

Grados de libertad Suma de cuadrados Suma de Medias Valor- F Valor- p

X 1 2.39 2.39 847.09 1.79x10-22

Error 28 0.079 0.0028

Total 29 2.475

41

En la Tabla 12 se observan los valores del error y el valor P que reflejan buena confianza

estadística así como en la se muestra la distribución normal de los residuos del método.

Ilustración 21. Residuos del ajuste lineal de los datos experimentales, metodo de proteinas.

2.2. Cuantificación de carbohidratos por el método fenol-sulfúrico

Y= Ecuación 12

Ilustración 22. Curva de calibración por el método de Dubois

El análisis de varianza del método demuestra un valor P muy pequeño reflejando alta confianza

en los resultados del método.

Tabla 13. Analisis de varianza para curva de calibracion de carbohidratos.


X 1 2.7 2.75 907.28 3.65x10-21

Error 25 0.075 0.0031

42

Total 26 2.81

En la tabla 13 se observan los residuos distribuidos de en una forma normal aleatoria.

Ilustración 23. Residuos del ajuste lineal de los datos experimentales, metodo de carbohidatos.

2.3. Cuantificación de la biomasa seca

La curva de calibración de esta técnica debe ser realizada cada vez que alguna condición

externa (nutricional o medioambiental) que pueda afectar la morfología o cantidad de pigmento

celular sea varíe sobre el sistema.

En este caso se usaron las condiciones enumeradas en condiciones de cultivo para C.

reinhardtii:

Medio de cultivo: TAP

Tiempo: 4 días

Diluciones usadas: 0%, 10%, 25%, 50%, 75% y 100%

En esta técnica se midió la biomasa seca, el recuento celular usando la técnica de recuento en

cámara de Neubauer y la Absorbancia a 675 nm de longitud de onda, con el propósito de

obtener más información con la medición de una sola variable (absorbancia).

El ajuste lineal a las variables biomasa seca en gramos/L y Absorbancia en nanómetros está

dado por a siguiente ecuación:

Ecuación 13

43

Ilustración 24. Curva de calibración biomasa seca versus absorbancia.

Igualmente se obtuvo la regresión lineal de los datos de recuento versus la absorbancia

respondiendo al siguiente ajuste:

Ecuación 14

Ilustración 25. Curva de calibración recuento celular versus absorbancia (675nm).

Con respecto a la técnica de lípidos, a continuación se muestra la gráfica que representa los

experimentos de estandarización con sus respectivas bandas de confianza.

El bajo valor de P muestra los niveles de confianza en el método, preferentemente dentro del

intervalo de confianza obtenido en el Anova.

44

Tabla 14. Análisis de varianza para curva de calibración de biomasa seca.


X 1 0.928 0.928 984.545 1.13x10-15

Error 16 0.018 0.000097

Total 17 0.945

Las técnicas de cuantificación de CO2 e intensidad de luz, fueron realizadas con equipos

especiales, ya que no se requirieron curvas de calibración, sus fundamentos se muestran en el

Anexo 1.

2.4. Cuantificación de Acetato

El acetato (ácido acético) hace parte del medio de cultivo en los ensayos de mixotrofia y

heterotrofia.

Su cuantificación se realiza por medio de cromatografía liquida de alta resolución HPLC en un

cromtografo Varian con bomba Pro Star 210 y detector de índice refractivo Pro Star 350. La

columna que se usó para la cuantificación es la Resex ROA-organic acid de Phenomenex

cuyas características son:

Dimensiones: 300x7.8mm

Fase móvil: ácido sulfúrico 0.005N

Flujo: 0.6mL/min

2.5. Suministro de luz y medición de la intensidad lumínica

En los cultivos que requieren iluminación se usaran tiras flexibles de bombillos tipo led

monocromáticos color blanco frio de 12V.

La intensidad lumínica se ajustó usando un led-dimmer de 12V.

La intensidad lumínica en luxes se cuantificó con un Luxómetro digital marca Steren modelo

HER-410.

45

3. FACTORES LIMITANTES DEL CRECIMIENTO DE Chlamydomonas reinhardtii

3.1. Introducción

El crecimiento de C. reinhardtti está gobernado por varios factores nutricionales y medio

ambientales dentro de los que resaltan, la fuente de carbono, la luz y la fuente de nitrógeno

como los más relevantes. Para tener altas tasas de producción autotrófica, los suplementos

más importantes son de CO2 y HCO3. Contrario a las plantas terrestres el CO2 atmosférico no

satisface los requerimientos de carbono para la alta productividad de los sistemas de

producción algal. Las tasas de difusión del CO2 atmosférico en los estanques abiertos pueden

sustentar productividades de cerca de 10 g m-2 d-1 en masa seca (Lee et al., 1995). El sistema

CO2-H2CO3-HCO3-CO3 es el amortiguador más importante generalmente presente en cuerpos

de agua dulce y es el mejor control para mantener los niveles de pH en los rangos óptimos

para el crecimiento de especies de microalgas cultivadas. Cultivar microalgas con el CO2

ambiental es una estrategia muy extendida a nivel mundial, teniendo en cuenta que enriquecer

el medio con CO2 puro resulta en un incremento considerable de los costos del proceso.

Después del carbono, el nitrógeno es el nutriente más importante que contribuye a la

producción de biomasa. El contenido de nitrógeno de la biomasa puede estar entre el 1-10% y

esto no solo varía entre diferentes grupos (bajo en diatomeas) sino entre especies particulares,

dependiendo de la adición y la disponibilidad. La limitación de nitrógeno en el medio de cultivo

tiene como consecuencias entre otras la decoloración de las células (disminución de la clorofila

y aumento de los carotenoides) y acumulación de ciertos compuestos orgánicos como

polisacáridos y ciertos aceites (Becker, 1994). Es un constituyente esencial de todas las

proteínas estructurales y funcionales en las células algales. Cuando las microalgas son

crecidas bajo condiciones limitadas de nitrógeno, el más sorprendente efecto es la activa y

específica degradación de ficobilisomas (Collier & Grossman, 1992), los cuales participan muy

activamente en la recolección de la luz y están constituidos en parte por proteínas. Numerosos

estudios muestran que la biosíntesis y acumulación de lípidos esta reforzada por la limitación

de nitrógeno o cultivos privados de microalgas de varios grupos taxonómicos. En contraste con

los lípidos polares de células con suficiente nitrógeno, los lípidos neutros en forma de

triacilglicerol se vuelven componentes predominantes de las algas con limitación de nitrógeno

(Thompson, 1996).

El medio de cultivo TAP como se mencionó en el capítulo 1, aporta nitrógeno y carbono

orgánico, sin embargo y teniendo en cuenta que C. reinhardtii puede crecer bajo condiciones

de mixotrofía en donde puede llegar a usar las dos fuentes de carbono, es necesario realizar

cálculos previos en los que se encuentre la disponibilidad teórica de estos nutrientes. El

46

nitrógeno puede llegar a ser un nutriente limitante muy importante en el crecimiento de C.

reinhardtii. La estimación de factores limitantes del crecimiento es una herramienta crucial en el

desarrollo de la experimentación que permite la seguridad de elaborar un análisis basado en la

composición bioquímica del microorganismo conociendo en qué punto se dio alguna limitación

de un nutriente específico. El modelo de caja negra permite obtener datos de consumo de

nutrientes y producción de metabolitos externos, dejando ver las cantidades de nutrientes que

se requieren para alcanzar determinada cantidad de biomasa o de sustancia específica.

Por otra parte, C. reinhardtii puede crecer bajo condiciones de heterotrofia, esto es, usando una

fuente de carbono orgánica y el oxígeno como aceptor de electrones. Bajo estas condiciones

las microalgas utilizan el carbono disponible tanto para fuente de carbono como de energía,

produciendo menos cantidad de biomasa, y al ser el oxígeno el aceptor de electrones tiende a

parecerse a un cultivo aerobio de bacterias, lo que facilita los cálculos para el rendimiento de

biomasa con respecto a la aireación.

Para el desarrollo de los cálculos pertinentes en los capítulos siguientes es necesario conocer

rendimientos teóricos de carbono, oxígeno, acetato y amonio. Debido a esto es importante

determinar si algún nutriente puede llegar a limitar el crecimiento normal en algún punto del

ensayo.

3.2. Materiales y Métodos

Para el desarrollo de este trabajo fue necesario el montaje y la estandarización de las técnicas

analíticas que se listan a continuación y que han sido detalladas en el capítulo 2:

Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico (BCA)

Cuantificación de carbohidratos por el método fenol-sulfúrico

Cuantificación de la biomasa seca

Cuantificación de lípidos por gravimetría y fluorescencia

Cuantificación de clorofila

Cuantificación de acetato

Cuantificación de CO2

Medición de la intensidad de la luz.

Se utilizó el software Mathematica 9.0 para determinar mediante la aplicación del modelo

de caja negra, las limitaciones en nutrientes que pudiese tener el medio TAP. Así mismo se

estimaron los rendimientos teóricos correspondientes a los sistemas de mixotrofía y

heterotrofía.

47

3.3. Resultados y discusión

En procura de obtener los datos de los rendimientos teóricos de conversión de sustratos y

aprovechamiento de nutrientes del medio TAP, el primer paso fue la elección de la formula

mínima de la biomasa con la que se realizarían estos cálculos.

Para esta elección se revisaron fuentes bibliográficas (Kliphuis, 2011, Janssen, 2011, Nannet

R Boyle, 2009, Jansenn, 2004, Pallson et al, 2011) que aportan datos de formulaciones de

biomasa de Chlamydomonas reinhardtii bajo condiciones de crecimeinto específicas como se

observa en la Tabla 15.

Tabla 15. Fórmulas mínimas para biomasa de Chlamydomonas reinhardtii

Modelo Formula Referencia

Autotrofía CH1.62O0.41N0.14S0.003P0.01 Kliphuis et al 2011

Autotrofía CH1.821O0.605N0.103

Boyle and Morgan, 2009

Mixotrofía CH1.869O0.561N0.059

Heterotrofía CH1.829O0.465N0.178

Autotrofía CH1.7O0.47N0.18S0.06P0.021 Palsson et al, 2011

Heterotrofía CH1.81O0.58N0.2 Microorganismo estándar

Por comparación de las condiciones de crecimiento utilizadas en los diferentes ensayos, las

fórmulas elegidas fueron CH1.62O0.41N0.14S0.003P0.01 publicada por Kliphuis et al 2011 y

CH1.869O0.561N0.059 publicada por Boyle y Morgan en 2009, para los sistemas autótrofo y

mixotrofo respectivamente.

El primer cálculo que se realizó fue aplicar el modelo de caja negra al medio de cultivo TAP que

se utilizara en los ensayos para determinar aspectos como la producción de biomasa máxima

teórica, la disponibilidad de nutrientes y algunos elementos limitantes del medio.

El medio de cultivo TAP tiene la siguiente composición:

Tabla 16. Soluciones de sales y fosfatos del medio TAP

Solución de sales Cantidad

NH4Cl 15.0 g

MgSO4. 7H2O 4.0 g

48

CaCl2. 2H2O 2.0 g

Agua 1L

SOLUCIÓN FOSFATOS

K2HPO4 28.8 g

KH2PO4 14.4 g

agua 100mL

Tabla 17. Elementos traza del medio TAP

Compuesto Cantidad Agua

EDTA 50 g 250 ml

ZnSO4. 7 H2O 22 g 100 ml

H3BO3 11.4 g 200 ml

MnCl2. 4 H2O 5.06 g 50 ml

CoCl2. 6 H2O 1.61 g 50 ml

CuSO4. 5 H2O 1.57 g 50 ml

(NH4)6Mo7O24. 4 H2O 1.10 g 50 ml

FeSO4. 7 H2O 4.99 g 50 ml

Tabla 18. Perparacion de medio TAP (1L)

Compuesto/solución Cantidad

Tris-HCL 2.42 g

Solución de sales 25 ml

Solución de fosfatos 0.375 ml

Solución elementos traza 1.0 ml solución

Acido glacial acético 1.0 ml

Fuente: Gorman, D.S., and R.P. Levine (1965).

3.3.1. Modelo de caja negra (CHONSP) al medio TAP

Fuente de carbono: CO2 (autotrofia)

CO2 + H2O + NH3 + H2SO4 + H3PO4 CH1.62O0.41N0.14S0.003P0.01 + O2 Ecuación 15

Gl= 7-6 = 1.

49

Asumiendo 1C-mol de biomasa (para satisfacer el grado de libertad de la ecuación 16) y CO2

como única fuente de carbono (suministrado de manera constante al medio), se procede a

multiplicar la matriz estequiométrica que relaciona los coeficientes de la ecuación 8, por un

vector que contiene los coeficientes de la fórmula mínima de la biomasa.

Dónde:

qc: corresponde al vector que contiene los compuestos del medio que se quieren calcular

Los resultados del análisis se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Resultado del análisis de caja negra al medio TAP para el crecimiento de C.

reinhardtii.

Sustancia Biomasa 1*

mol

Biomasa 2*

mol

TAP/L

mol

CO2 -1 -1 -

H2O -0.582 0.123 55

NH3 -0.14 -0.12 0.007

H2SO4 -0.003 -0.003 0.0008

H3PO4 -0.01 -0.01 0.007

O2 1.112 0.56

1C-mol X 23.72 g 28.2 g

NH3 limitante (0.007) 1.18g/L 1.41g/L

Biomasa 1: CH1.62O0.41N0.14S0.003P0.01

Biomasa 2: CH1.869O0.561N0.059

qc

ηc ηh ηN ηs ηpηo

−1

∗

Ecuación 16

50

Como se observa, el compuesto NH3 que aporta la fuente de nitrógeno puede llegar en un

momento determinado a ser el limitante para el crecimiento ya que se encuentra 20 veces

menos de lo que se requiere para la producción de 1C-mol de biomasa. Asumiendo

formalmente al NH3 como el compuesto más limitante del medio se realizó el cálculo de la

cantidad de biomasa que puede aportar el medio TAP bajo estas condiciones, y se evaluó si

algún otro componente puede llegar a ser limitante. El resultado para la fórmula mínima que se

está empleando en este trabajo (formula en autotrofia tabla 11) es 1.18g/L (0.05C-mol) usando

CO2 como única fuente de carbono.

Tabla 20. Análisis de caja negra asumiendo agotamiento de NH3.

Sustancia Biomasa 1*

mol

CO2 -0.05

H2O -0.029

H2SO4 -0.00015

H3PO4 -0.0005

O2 0.055

biomasa 0.05

Como se observa en la tabla 20, una vez se agota el NH3 y teniendo en cuenta que el

suministro de CO2 es constante, ninguna sustancia aparece como limitante, esto es, el

consumo requerido hasta el agotamiento del amonio, es menor a la cantidad aportada por el

medio de cultivo (ver Tabla 19). Este calculó teórico no pudo realizarse en los caso de

mixotrofía y heterotrofía debido a que sus ecuaciones estequiométricas dan más de 1 grado de

libertad.

Por otra parte, se calculó el rendimiento de la biomasa con respecto a la fuente de carbono

orgánico (acetato) para los sistemas que la contengan.

Según la fórmula de heterotrofia el carbono presente en la biomasa es:

Ccel = 0,47gCcel/gcel

El carbono presente en el acetato es:

CH2O = 0,4 gC/gsust

El rendimiento de la biomasa con respecto al acetato se calcula de la siguiente manera:

Yxsg = 0,66 * 0,41g/0,4g

51

Yxsg = 0,78

Dónde:

Ccel: gramos de carbono que contiene la biomasa/g de biomasa

CH2O: gramos de carbono que contiene el ácido acético/gramos de ácido acético

Yxsg: rendimiento de biomasa con respecto al sustrato (en gramos).

Con esta información se puede entonces calcular el rendimiento celular con respecto al

oxígeno, esto pensando en los ensayos de mixotrofía y heterotrofía.

Así pues tenemos que según la fórmula para calcular el rendimiento de oxígeno según la

fuente de carbono y la composición de la biomasa:

1

−

1

Ecuación 17

Dónde:

YO2: rendimiento de oxígeno

X: átomos de carbono de la fuente de carbono

W: átomos de hidrógeno de la fuente de carbono

Z: átomos de oxígeno de la fuente de carbono

%O: porcentaje de oxígeno en la biomasa

%C porcentaje de carbono en la biomasa

%N: porcentaje de nitrógeno en la biomasa

%H: porcentaje de hidrógeno en la biomasa

1

−

1

11

Ecuación 18

YO2= 0.93

3.4. Conclusiones

El modelo de caja negra aplicado sobre el medio de cultivo (TAP), para el crecimiento bajo

condiciones de autotrofía, reflejo que el nutriente limitante es el nitrógeno. Por el contrario las

fuentes de carbono no mostraron valores limitantes permitiendo el desarrollo del sistema hasta

el agotamiento de la fuente de nitrógeno.

52

4. EFECTO DE LA INTENSIDAD LUMINOSA Y EL FOTOPERIODO SOBRE EL CRECIMIENTO DE Chlamydomonas reinhardtii.

4.1. Introducción

Entre los factores ambientales que afectan la tasa de crecimiento de las microalgas, la luz es

uno de los más importantes. La intensidad de la luz para el cultivo de microalgas se maneja en

un intervalo bastante amplio, entre 500 y 50.000 Lux, y tanto los valores de crecimiento como el

de fotoinhibición depende de muchos factores entre los que se cuenta la temperatura, el nivel

de CO2 presente en el medio, la concentración y tipos de nutrientes, entre otros (Janssen,

2002).

Los efectos de la luz en la composición bioquímica de las microalgas son ampliamente

controlados por los procesos llamados fotoaclimatación o fotoadaptación. En estos procesos,

las células algales bajo cambios dinámicos en composición celular, propiedades fisiológicas,

biofísicas y de ultraestructura aumentan la fotosíntesis y el crecimiento (Dubinzky Z, 1995). Una

tendencia común de la respuesta celular a la disminución de la intensidad de la luz es

incrementar la clorofila a y otros pigmentos (como clorofila b, c, ficobiliproteinas y carotenoides

principalmente). De otro lado en respuesta a la alta intensidad de la luz, la clorofila a y otros

pigmentos (zeaxantinas, B-carotenos, astaxantina) que sirven como fotoprotectores tales como

plastoglobuli o plástidos (Ben-Amonts et al., 1982) o cuerpos lipídicos citoplasmáticos juegan

un rol en prevenir la energía de la luz excesiva que llega a la maquinaria fotosintética. La

acumulación de carotenoides puede, en general resultar de la alteración de la acumulación de

carbono y flujo de nitrógeno dentro de las condiciones de estrés celular (Harris, 2009).

Las altas intensidades de luz tienden a reforzar la producción de polisacáridos en células de

microalgas. Friedman et al, en 1991 reportaron un aumento de 0.6 a 3 veces más en

polisacáridos obtenidos en cultivos de Porphiridium sp y Porfiridium aeurogineum, cuando

crecieron en intensidad lumínica aumentada de 5500 a 22000 lux. Numerosos estudios con

microalgas de varios grupos sugieren que el contenido celular de lípidos y ácidos grasos

poliinsaturados (PFUA), incluyendo el ácido eicosapentaenoico (EPA 20:5ω3), está relacionado

a la intensidad de la luz. Assaf Sukenyk, en 2002 mostró que Nannochloropsis presentó un alto

contenido de lípidos y altas proporciones de ácido eicosapentaenoico al ser cultivada bajo

condiciones de limitación de luz. Krauss et al en 2002 demostraron que C. reinhardtii tuvo su

máxima tasa de crecimiento cuando fue sometida a 20,000 lux de intensidad en ensayos de

laboratorio.

Así como la intensidad de la luz juega un papel muy importante en el desarrollo de la célula, el

tiempo de exposición a esta luz aparece como otro factor muy importante. La fotosíntesis es un

proceso que comprende dos pasos, el primero es llamado reacciones de luz, que solo ocurren

53

cuando el cultivo está expuesto a la iluminación y el segundo llamado reacciones de oscuridad

o de fijación de carbono o reacciones sin luz que ocurre tanto en ausencia como en presencia

de luz. De esta manera, en el primer paso las células transforman la luz en energía química

que es almacenada en compuestos altamente energéticos que son usados posteriormente en

las reacciones de fijación de carbono (Iverson, 2006).

En cultivos fotosintéticos la cantidad de energía recibida de la luz tiene una relación directa con

la tasa de fijación de carbono determinando la productividad de la biomasa y el crecimiento

celular. En la naturaleza la disponibilidad de la luz está en forma no continua (día y noche).

Sicko-Good en 1998 demostró la importancia de los fotoperiodos en el metabolismo de las

microalgas (especialmente diatomeas). Esta investigación reveló que las células se dividen

principalmente en el inicio de la fase lumínica, y que la acumulación de lípidos se da

mayormente en la fase oscura. Así mismo se encontró que después de evaluar 10

combinaciones de fotoperiodos, los mejores rendimientos celulares se obtuvieron en el periodo

de total iluminación seguido del periodo 12:12, demostrando así la importancia de los ritmos

circadianos naturales de las microalgas.

Debido a lo anterior, es claro que para poder encontrar el mayor potencial de una cepa de

microalga se deben realizar estudios de estandarización de las condiciones óptimas de

crecimiento, y así como se hace con los nutrientes, se debe hacer también con la intensidad de

la luz y el fotoperiodo. En este apartado se muestran los resultados de las evaluaciones

experimentales de intensidad de luz (3000, 8000, 20000 y 3000 lux) y fotoperiodo (12:12 y

8:16, luz y oscuridad respectivamente) sobre el crecimiento de C. reinhardtii con el propósito de

encontrar la mejor condición que nos permitiera realizar una evaluación metabólica con menos

limitaciones.

54


4.2.1. Evaluación de intensidad luminosa

Ilustración 26. Diferentes intensidades de luz evaluadas a nivel matraz.

La evaluación consistió en seguir el crecimiento de C. reinhardtii durante 8 días a diferentes

intensidades de luz (3000, 8000, 20000 y 30000 lux), con el propósito de encontrar el intervalo

de mejor crecimiento para posteriormente realizar la evaluación de fotoperiodo.

Las condiciones de la prueba fueron las siguientes:

Tabla 21. Condiciones de cultivo prueba de intensidad de luz.

Condición Valor

Inoculo 10%

Volumen de trabajo 400 mL

Volumen del reactor 1000 mL

Fuente de luz Tira LED de 9 voltios

Intensidades evaluadas 3000, 8000, 20000 y 30000 Lux.

Tiempo de la prueba 8 días

Intervalo de muestreo 1 día

Temperatura 27ºC

Medio de cultivo TAP

Agitación 110 rpm

55

Las muestras fueron procesadas bajo la técnica de peso seco para obtener los datos de

recuento celular y biomasa seca a partir de la absorbancia. Cada intensidad de luz se evaluó

en sistemas duplicados y cada punto de muestreo se midió por triplicado.

La intensidad de la luz fue ajustada y medida como se describe en el apartado de

estandarización de técnicas analíticas.

4.2.2. Evaluación de los fotoperiodos

Esta se realizó en los intervalos reportados en los que se presenta mejor crecimiento para C.

reinhardtii. Las condiciones de la prueba se muestran en la Tabla 22

Tabla 22. Condiciones de cultivo para la prueba de fotoperiodo

Condición Valor

Inoculo 10%



Fuente de luz Bombillos LED de 9 voltios

Fotoperiodos evaluados (L:O) 24:0, 12:12, 8:16.

Intensidad de luz 15 000 Lux


Intervalo de muestreo* 1 día

Temperatura 27ºC


Agitación 110 rpm

*Las muestras fueron tomadas tanto en la fase oscura como en la de luz


4.3.1. Evaluación de la intensidad luminosa

En la Ilustración 27 se muestra el crecimiento medido en absorbancia a 657 nm de longitud de

onda para cada uno de los sistemas evaluados.

56

Ilustración 27.crecimiento de C. reinhardtii medido en absorbancia a 675nm en diferentes intensidades

de luz

Las velocidades de crecimiento de los sistemas por duplicado fueron calculadas por estimación

de parámetros en el programa Mathematica 9.0 bajo la siguiente ecuación:

Ecuación 19.

Arrojando los siguientes resultados:

Tabla 23. Velocidad de crecimiento en función de la intensidad de la luz.

Velocidad de crecimiento (d-1) Intensidad de luz (Lux)

0.56 ± 0.0075 3000

0.86 ± 0.0025 8000

1.09 ± 0.005 20000

0.98 ± 0.029 30000

El error señalado corresponde a la desviación estándar.

Estas velocidades se trazaron en una gráfica en contraste a la intensidad de la luz con el

propósito de encontrar un punto de máxima velocidad.

57

Ilustración 28. Velocidades de crecimiento vs intensidad de luz

En la Ilustración 28 se observa que la intensidad de la luz tiene un efecto en la velocidad de

crecimiento alcanzando la máxima en la zona de los 20000 lux, y que después de ésta el efecto

tiende a disminuir. En los ensayos con 30000 lux, se presentó una alta tasa de evaporación, lo

cual dificulta el normal desarrollo y comparación con los demás sistemas (esta evaporación fue

compensada por adición de volumen en cada muestreo). En los sistemas con 20000 lux

también se presentó evaporación aunque en menor medida, y finalmente en los sistemas de

3000 y 8000 lux no se dio evaporación notable.

Teniendo en cuenta esto y sabiendo que el propósito es encontrar una condición que ofrezca si

no la máxima, la más cercana a la máxima velocidad de crecimiento para proceder con los

ensayos de fotoperiodo, la intensidad de luz con mayor tasa de crecimiento sin llegar a

presentar problemas de calentamiento y/o evaporación es de aproximadamente 15000 lux.

4.3.2. Evaluación de fotoperiodo

En la Ilustración 29 se muestra el comportamiento global del crecimiento de C. reinhardtii en

los diferentes fotoperiodos.

58

Ilustración 29. Crecimiento de C. reinhardtii en diferentes fotoperiodos

Las velocidades de crecimiento de los sistemas por duplicado fueron calculadas por estimación

de parámetros en el programa Mathematica 9.0 bajo la ecuación 19 mostrando los siguientes

resultados:

Tabla 24. Velocidad de crecimiento en función del fotoperiodo.

Velocidad de crecimiento (d-1) Tiempo de duplicación (días) Fotoperiodo (L:O*)

0.8±0.06 0.86 8:16

1.1±0.05 0.63 12:12

1.09±0.005 0.64 24:0

*L:O= luz : oscuridad

4.4. Conclusiones

Muy similar a lo que reporto Krauss et al en 2002, la mejor velocidad de crecimiento se alcanzó

cerca de los 20000 lux de intensidad. Sin embargo como se mencionó en los resultados las

altas intensidades de luz (20000 y 30000) se presentó un problema de calentamiento y

evaporación de agua del sistema, incorporando un ruido perjudicial para el análisis de los datos

en los ensayos metabólicos. En la curva de velocidades de crecimiento versus intensidades de

luz se aprecia que la intensidad deja de aportar al crecimiento de manera importante después

de pasar la barrera de los 18000 a 20000 lux, por lo que se decidió utilizar 15000 lux como una

intensidad apropiada para realizar los posteriores ensayos de metabolismo. Con respecto al

fotoperiodo sucedió algo similar, se encontró que en los ensayos de 12:12 y 24:0 se obtuvieron

las velocidades de crecimiento más altas (1.1±0.05 d-1 y 1.09±0.005 d-1 respectivamente), sin

59

embargo se decidió utilizar la condición de 12:12 para los posteriores ensayos teniendo en

cuenta dos factores principalmente:

Variabilidad metabólica bajo periodos de luz:oscuridad

Ahorro de energía en los ensayos.

De esta manera quedaron las condiciones de luz y fotoperiodo establecidas en 15000 lux

como intensidad máxima y 12:12 de fotoperiodo.

60

5. EFECTO DE LA AERACIÓN SOBRE LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO EN AUTOTROFIA

5.1. Introducción

Los niveles de CO2 son un factor limitante para el crecimiento de las microalgas, no solo por su

baja concentración en el ambiente, sino también por su baja afinidad y por la muy baja rotación

catalítica de la Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (enzima presente en la fijación de

carbono vía fotosíntesis). Normalmente el equilibrio entre el CO2 disuelto en los ambientes

acuáticos y el presente en la atmósfera es muy lento y a esto se le suma la muy baja difusión

del CO2 en el agua comparada con la difusión en el aire (104 veces menos). Martin H. Spalding

en 1982 reportó que las especies de CO2 disueltas que representan el carbono inorgánico (Ci)

disponible para la fotosíntesis son CO2, HCO3 y CO3-2, obtenidas después de una serie de

reacciones de protonización, hidratación y deshidratación. En la Ilustración 30 se observan

estas especies y sus cambios con respecto al pH.

Fuente: http://www.ugr.es/~fgarciac/qma_practica_1_2.html

Igualmente Spalding en 1982 reporta una baja hidratación de CO2 a HCO3 debido al consumo

de CO2 para fotosíntesis. A pH por encima de 6.3 la especie predominante es el HCO3. Esto,

sumado a la baja disolución de HCO3 a CO2 y a la baja solubilidad del CO2 atmosférico son las

causas principales de la baja disponibilidad de Ci en las aguas naturales. Esto ha hecho que

Chlamydomonas así como otras especies fotosintéticas desarrollen mecanismos que permiten

asimilar CO2 y HCO3 para soportar la fotosíntesis, también como mecanismos para acoplarse

bien y rápidamente a los cambios bruscos de Ci en el medio. Uno de los principales son los

mecanismos de concentrar el CO2 de manera intracelular para abastecerse en períodos de

poco Ci disuelto.

Ilustración 30 Evolución de las especies químicas del CO2

disueltas en agua.

http://www.ugr.es/~fgarciac/qma_practica_1_2.html

61

Berry et al. (1976) demostró que C. reinhardtii puede crecer en altas (1-5%) o en bajas (0.03%)

concentraciones de CO2 observándose cambios fisiológicos importantes como el metabolismo

de plantas C3 y C4 respectivamente.

En Chlamydomonas sp., Marcus, et al. (1984) y Tsuzuki M (1983) reportaron que el transporte

de CO2 es pasivo y que el transporte de la especie HCO3 es activo, también reportaron esto

debido a la velocidad de transporte celular. Dieter F. Sultemeyer et al 1989, demostraron que

las dos especies son transportadas de manera activa pero que el CO2 disuelto es la

selectivamente más preferida por Chlamydomonas sp.

Sin embargo la afinidad por el CO2 también depende de la aclimatación de las células, Badger

y Price en 1992, demostraron que las células que estaban aclimatadas a concentraciones altas

(1-5%) de CO2 presentaban una K1/2 Ci similar a la Km de la RubisCo. Por el contrario las

células crecidas en condiciones limitantes de CO2 (0.03%) mostraron una afinidad de 10 a 100

veces menor por el Ci (Thyssen et al., 2001).

Se han detectado rasgos característicos de las células que crecen en baja o alta concentración

de CO2. Las células que crecen en bajas concentraciones activan genes que regulan los

mecanismos de concentración de carbono (CCM) y a su vez se ha demostrado que en bajas

concentraciones se presenta un crecimiento células retardado, un tamaño celular más pequeño

y una disminución paulatina de la constante de afinidad K1/2. Además se puede distinguir un

tercer estado de aclimatación a muy baja concentración de CO2, presentando los mismos

rasgos e incluyendo la poca cantidad de clorofila. Los genes involucrados, aumentan su

transcripción a medida que el CO2 del medio disminuye. Se ha encontrado en C. reinhardtii la

expresión de varios genes envueltos en la aclimatación a bajas concentraciones de CO2, estos

actúan principalmente en el transporte de Ci, la anhidrasa carbónica y la fotorespiración.

La expresión o represión de genes involucrados en la disponibilidad del CO2 no solo tienen

efecto en estos mecanismos sino que afectan de manera significativa al conjunto de vías

metabólicas, por lo tanto la regulación debe estar mediada por otras variables también, como la

cantidad de luz, de nitrógeno, de fósforo entre otros. Uno de los cambios metabólicos más

relevantes a la aclimatación en bajas concentraciones de CO2, es la acumulación de almidón

cerca del pirenoide en el cloroplasto. (Kuchitsu et al., 1988, 1991 ; Ramazanov et al., 1994;

Geraghty and Spalding, 1996).

En la Ilustración 31 se esquematiza el proceso de activación de los mecanismos de

concentración de carbón inorgánico por parte de C. reinhardtii cuando las células están

expuestas a bajas concentraciones de CO2.

62

Ilustración 31. Mecanismos de concentración de carbono inorgánico.

Teniendo en cuenta los cambios metabólicos importantes que puede sufrir el cultivo al

someterse a muy bajos niveles de carbono inorgánico, es necesario realizar algunos ensayos

previos para garantizar la no limitación de la fuente de carbono en el sistema.

5.2. Materiales y métodos

Según se describió en la sección de métodos analíticos, se midió el CO2 en las zonas de

cultivos con el propósito de evaluar su variación en el tiempo. Así mismo, se realizaron ensayos

en sistemas cerrados para determinar la transferencia de carbono y su velocidad de consumo.

Para calcular las velocidades de transferencia y consumo de CO2 las condiciones asumidas

fueron las siguientes:

Reactor: Erlenmeyer de 1L

Volumen de trabajo: 500 mL

pH:7

Concentración del CO2 en el aire: 400 ppm

Coeficiente Kl para sistemas aireados con 1v/v/m flujo: 26.2 cm/h*

Coeficiente Kl para sistemas agitados y sin aireación: 6.4 cm/h*

Área de transferencia: 0.1cm-1*

*datos obtenidos de un trabajo de evaluación de transferencia de CO2 en condiciones similares a las

aquí planteadas (Chai, 2012).

Como se observa, el valor de Kl fue diferente para los sistemas (con y sin aireación), utilizando

la misma área con el propósito de determinar la velocidad de transferencia en cada caso.

Para los ensayos en el sistema cerrado se usaron las siguientes condiciones de cultivo:

63

Medio de cultivo: TAP

Volumen de trabajo: 400 mL

Velocidad de la bomba peristáltica: 1000 rpm

Volumen de gas (aire): 1340 mL

Concentración inicial de CO2: 5854 ppm (aire enriquecido por adición de CO2 gaseoso

inyectado al sistema)

Concentración inicial de biomasa seca: 157 ppm

Para estimar los parámetros cinéticos se usó la función FindFit en el programa Mathematica

ver. 9.0, ajustando los datos a la siguiente ecuación:

∗ Ecuación 20


Se realizaron mediciones de la concentración de CO2 ambiental en el laboratorio de

bioingeniería con el propósito de determinar la concentración y analizar la variación de este gas

en el tiempo. Estos datos son fundamentales ya que los sistemas de crecimiento mixo y

autotróficos requieren la inyección de aire para suministrar la fuente de carbono, a su vez debe

poderse cuantificar el consumo del CO2 en el sistema para determinar parámetros cinéticos

como por ejemplo rendimientos, velocidades de consumo y transferencia de masa.

Debido a que la velocidad de consumo de carbono inorgánico en los sistemas aireados no es

muy alta, la variación de CO2 en el ambiente puede llegar a incorporar demasiado ruido en los

datos obtenidos de forma que se dificulte obtener los parámetros cinéticos representativos.

Teniendo en cuenta que para producir 0.1 g de biomasa se requiere el consumo de 180 ppm

de CO2 (según los cálculos teóricos del capítulo 2) entonces el sistema en teoría consume entre

7-10 ppm de CO2 por hora (para una velocidad de crecimiento de 0.025h-1).

Debido a esto se realizaron mediciones de CO2 en el cuarto de siembras (zona donde se

realiza la experimentación), en tres ocasiones distintas, dos mediciones que tuvieron una

duración de 24 h y la última medición que duro 72 h como se observa en la Ilustración 32.

64

Como se puede ver en la Tabla 25. Variación en las mediciones de carbono ambiental. la

variación en el ambiente del laboratorio es más alta que el consumo por hora del sistema, por

lo que no es posible realizar una estimación adecuada de los parámetros con tal variación, por

tanto se requirió la implementación de un sistema de ambiente controlado para poder

cuantificar la disminución del CO2.

Tabla 25. Variación en las mediciones de carbono ambiental.

Parámetro Día 1 Día 2 Día 3-4-5

Desv. estándar (ppm) 36.69 34.65 14.55

Promedio (ppm) 549.739 568.963 558.436

Max (ppm) 864 846 798

Min (ppm) 500 540 531

La opción para contrarrestar este ruido aportado por el ambiente es entonces realizar ensayos

de crecimiento y consumo de CO2 en sistemas cerrados para evaluar tanto las velocidades de

consumo y crecimiento, como la transferencia del gas en el sistema, sin embargo inicialmente

se realizaron cálculos teóricos de la disponibilidad del CO2.

Para determinar teóricamente si el carbono suministrado al sistema (CO2 del aire), es suficiente

para soportar el crecimiento del alga, se realizó un cálculo teórico de la velocidad de consumo

y transferencia del CO2.

Sabiendo que la velocidad de transferencia del CO2 en el sistema acuoso se calcula de la

siguiente forma:

Ilustración 32. Medición de CO2 ambiental.

65

∗ Ecuación 21

Dónde:

VTCO2: es la velocidad de transferencia del CO2 a la fase acuosa

CL*: concentración de equilibrio en el líquido.

CL: concentración en el líquido.

Asumiendo que se alcanza rápidamente el equilibrio entre las fases se puede calcular la

concentración del gas en el líquido usando la ecuación de la ley de Henry:

[CO2 ac] = Xa*H Ecuación 22

Dónde:

[CO2 ac] : es la concentración del CO2 disuelta en el sistema.

Xa: es la fracción molar del CO2 presente en el gas de entrada al sistema.

H: es la constante de Henry para el CO2 bajo condiciones establecidas.

En función del pH tenemos que:

1 1 − − 1 1 Ecuación 23

Dónde:

Ka1: constante acida para el H2CO2

Ka2: constante acida para el HCO3

Finalmente resolviendo las ecuaciones anteriores usando las condiciones iniciales tenemos

que en un sistema aireado de este tipo, la velocidad de transferencia del CO2 es:

VTCO2= 156.781 ppm de CO2/L/h Ecuación 24

Y que por tanto para un sistema no aireado (agitado a 120rpm), la velocidad de transferencia

es de:

VTCO2= 38.3 ppm de CO2/L/h Ecuación 25

Asumiendo que en un sistema aireado se producen aproximadamente 0.1g de biomasa seca

diaria, y que para un sistema no aireado la producción diaria es aproximadamente 0.07g de

biomasa seca, se puede obtener datos de estimación de la velocidad de consumo de CO2:

66

Condiciones iniciales:

Velocidad de crecimiento µ: 0.25 d-1

Rendimiento del sustrato en biomasa Yxs: 0.17

Biomasa inicial X: 100 mg/L

VCCO2

Ecuación 26

Dónde:

VCCO2: es la velocidad de consumo del sistema.

Resolviendo la VTCO2= 38.3 ppm de CO2/L/h Ecuación 256 con las condiciones

iniciales, se tiene que:

Para un sistema aireado la velocidad de consumo del CO2 es:

VCCO2= 147 ppm/L/d Ecuación 27

Para un sistema agitado la velocidad de consumo es:

VCCO2= 102.9 ppm/L/d Ecuación 28

Finalmente para calcular la disponibilidad del CO2 disuelto que el cultivo podría consumir basta

con restar las dos velocidades obtenidas anteriormente:

DCO2 = VTCO2 – VCCO2 Ecuación 29

La disponibilidad de CO2 disuelto varía en función de la velocidad de consumo ya que ésta

aumenta al aumentar la cantidad de biomasa en el sistema. En cultivo de microalgas aireados

como se mencionó arriba, la biomasa puede llegar a duplicarse cada 24 h, y en sistemas no

aireados el crecimiento sería menor, aproximadamente 0.07 g/d (datos obtenidos del modelo

de caja negra).

Asumiendo estas condiciones, se puede calcular el tiempo aproximado en el que el sistema

podría empezar a presentar problemas de disponibilidad de CO2 disuelto para el consumo.

67

Ilustración 33. Disponibilidad del carbono en un sistema aireado

Ilustración 34. Disponibilidad del carbono en un sistema no aireado

Como se puede observar en la Ilustración 33 y en la Ilustración 34 la disponibilidad del CO2 en

el sistema aireado llegaría hasta los 11 días aproximadamente, esto debido a su alto

coeficiente de transferencia impulsado por la aireación, por el contrario en un sistema agitado

sin aireación el CO2 se transfiere mucho menos mostrando una disponibilidad cercana a los 4

días.

De acuerdo a lo calculado, se realizaron ensayos de crecimiento en sistemas cerrados con el

propósito de mantener una concentración de gas inicial homogénea y así poder evaluar el

consumo del CO2 en el tiempo omitiendo el error proporcionado por la variación del medio

ambiente.

Estos ensayos aportarían información fundamental para los ensayos futuros de mixotrofía y

autotrofía, y los parámetros más importantes que se pueden deducir serán el coeficiente de

transferencia de gas al líquido, la constante de Henry experimental, y las condiciones de

68

consumo necearías para el óptimo crecimiento de Chlamydomonas reinhardtii usando CO2

como fuente de carbono.

El sistema que se utilizó se muestra en la Ilustración 35. Sistema cerrado de crecimiento de C.

reinhardtii

En este ensayo (sistema cerrado), se midió el crecimiento versus el consumo del CO2, este

último parámetro fue tomado de la lectura que marcaba el sensor de la fase gaseosa.

En la Ilustración 36 se muestra el comportamiento de la microalga durante los 11 días de

evaluación.

Ilustración 36. Crecimiento de C. reinhardtii en sistema cerrado, valores de biomasa seca.

En esta grafica se puede ver los datos experimentales (puntos), y el ajuste a la ecuación de

crecimiento exponencial (línea).

Los datos fueron ajustados a la ecuación de crecimiento exponencial (Ley de Malthus) para

obtener los mejores parámetros del modelo y analizar si corresponden a este comportamiento y

cuál es el tramo de los datos que se escogerán para calcular los parámetros.

Ilustración 35. Sistema cerrado de crecimiento de C. reinhardtii

Recirculación de aire

Sensor de CO2

69

En la gráfica la línea azul representa los datos ajustados al modelo planteado en la anterior

ecuación, lo cual muestra un buen comportamiento de los datos experimentales y un punto final

(día 8) de la fase exponencial.

En los datos de consumo de CO2, se observa una rápida caída en la concentración, pasando

de 5800 ppm a cerca de 1000 ppm en tan solo un día aproximadamente, por esta razón y para

efectos de visualización gráfica no se incluyen todos los datos en la figura, solo se incluyen los

datos de la zona de la caída hasta que se llega a una concentración constante (cerca de los

400 ppm de CO2).

Ilustración 37. Consumo de CO2 en sistema cerrado, tramo de los 2 primeros días.

El ajuste de parámetros no lineal utilizado permitió la estimación de la velocidad de crecimiento

(µ= 0.16 d-1) y la concentración de biomasa inicial (xo=0.32g/L).

Esta información se utilizó para desarrollar un modelo de crecimiento y consumo que se

acoplara a los datos experimentales, las ecuaciones utilizadas para modelarlo fueron las

siguientes:

Crecimiento de C. reinhardtii (ecuación de Monod)

r

Ecuación 30

Consumo de CO2 (ecuación de Pirt)

Ecuación 31

Resolviendo estas ecuaciones para las siguientes condiciones iniciales se obtiene la ilustración

38

70

Ks=0.01, so=4.8, tf=15.

Dónde:

Ks: constant de afinidad al sustrato.

So= concentración de sustrato inicial (g/L).

Tf= tiempo final del ensayo (dias).

Ilustración 38. Gráfica del modelo planteado y los datos originales.

En esta grafica se observa que los datos de crecimiento se ajustan al modelo planteado, sin

embargo los datos de consumo no se acercan a lo descrito en el modelo.

Este comportamiento del consumo requiere un tratamiento un poco más detallado para obtener

un parámetro más confiable, por esta razón se realizó un experimento sobre la transferencia

del CO2 del gas al medio de cultivo sin microorganismos.

Este ensayo conto con condiciones similares al anterior, sin microorganismos y con una

concentración de CO2 inicial más elevada (7090 ppm).

71

Ilustración 39. Dinámica de transferencia de CO2 al líquido (medio TAP).

En esta gráfica se observa que la transferencia del carbono al líquido es alta hasta las 3 horas

aproximadamente, en donde llega a alcanzar un equilibrio. El proceso de transferencia del CO2

al medio liquido está gobernado por la influencia de parámetros como el coeficiente de

transferencia (KL), el área de transferencia (A) y la constante de partición de la ley de Henrry

(He) principalmente, por tanto responde a la siguiente ecuación:

∗

∗ (

∗

) ∗ ∗

∗ Ecuación 32

Dónde:

Vg=volumen del gas

y0= concentración inicial del CO2 en el gas

A=área de transferencia

Kg=coeficiente de transferencia en el gas

He= constante de Henry

VL= volumen del liquido

y= concentración del CO2 en el líquido.

Sabiendo esto se puede simular el comportamiento del fenómeno de transferencia del carbono

en el medio de cultivo y compararlo con los datos experimentales.

72

Ilustración 40. Modelo del proceso de transferencia del CO2 en el medio TAP.

Un previo ajuste de parámetros sobre la ecuación 32 , permitió encontrar los valores de Kga,

He y y0 que mejor se ajustaban a los datos experimentales:

Kga= 0.038 minutos-1

He=14.8 L*atm/mol

y0=6793 ppm

Debido a que en la gráfica de crecimiento, el aumento de la biomasa es constante aún en este

intervalo de tiempo, lo que esto sugiere es que la transferencia del carbono es alta en el

sistema (que inicialmente no tiene carbono disuelto), y que por tanto este comportamiento se

enmascara en la simulación del consumo dando la impresión de que la velocidad de consumo

es muy alta.

En la Ilustración 37 igualmente se observa un tramo largo de aparente consumo que en

realidad es transferencia al líquido, y posteriormente se ve el inicio del consumo de CO2, sin

embargo, en este tramo de la curva, también sucede algo particular, es que el consumo de

carbono llega a un punto en que se detiene, y sin embargo el microorganismo sigue creciendo.

Sin haber medido composición interna y sabiendo que no existe ninguna otra fuente de

carbono en el medio, una alternativa viable puede ser la activación de un metabolismo mixto en

el sistema. Lo anterior es, que una porción del cultivo está utilizando el carbono como fuente de

crecimiento y otra parte no, esta parte que no lo está usando, puede estar usando el oxígeno

producto de la fotosíntesis para activar la vía de la fotorespiración. Esta vía puede activarse en

el momento en el que el sistema llega a niveles de CO2 inferiores a los del ambiente. La enzima

RuBisco puede llegar a reconocer al oxígeno como a un sustrato, esto se llama reacción

paralela o secundaria.

73

5.4. Conclusiones

La alta variación del CO2 en el medio ambiente hizo que se precisara de un sistema cerrado

para estimar los parámetros de transferencia y consumo de carbono inorgánico en el medio,

encontrando que bajo las condiciones de experimentación descritas, el sistema no presenta

limitaciones en la transferencia de carbono. Para las condiciones experimentales reportadas se

obtuvo un Kga de 0.038 min-1, muy parecidos a los reportados por Malcata et al, en 2003 bajo

condiciones experimentales muy similares ( 0.0148 min -1).

Con estos resultados se puede realizar la experimentacion bajo las condiciones de aireación y

agitación descritas teneindo la seguridad de que el carbono inorgánico no va a ser nutriente

limitante en el proceso.

74

6. PRODUCCIÓN DE MOLÉCULAS CANDIDATO A BIOCOMBUSTIBLE: SUPERFICIE DE RESPUESTA

6.1. Introducción

Como se mencionó en los capítulos anteriores, el aumento en la acumulación de lípidos

supone uno de los principales retos en los proyectos de biocombustibles a partir de microalgas.

Para esto, evaluar las condiciones fisicoquímicas más influyentes en la acumulación, es la

estrategia más practicada, encontrándose variaciones en las condiciones ambientales como

intensidad de la luz, temperatura, salinidad e inyección de CO2, así como nutrientes tipo fuente

de carbono y de nitrógeno. C. reinhardtii puede asimilar acetato como fuente de carbono bajo

condiciones de mixotrofía y de heterotrofía. El acetato es incorporado a la célula por proteínas

transportadoras mediadas por ATP, y una vez dentro de la célula puede ser procesado por dos

vías. La vía del glioxilato y el ciclo del TCA. En condiciones heterótrofas (aerobiosis y

oscuridad), la vía que se activa es la del glyoxilato principalmente, y en condiciones de

mixotrofía el ciclo de TCA y la vía de las pentosas se activan aportando esqueletos

carbonados, energía así como poder reductor. (Nannet & Boyle, 2009.). Después del carbono,

el hidrógeno y el oxígeno, el nitrógeno es elemento más importante en la formación de

estructura celular conteniéndose en la masa seca de microalgas en un promedio del 1-10%. C

reinhardtii puede asimilar el amonio (NH4), como fuente de nitrógeno principalmente debido a

que es una fuente energéticamente eficiente y que requiere menor gasto energético para su

asimilación (Harris, 2009). El crecimiento microlgal depende de la presencia de nitrógeno, sin

embargo Jezequel et al en 2000, reportan un pequeño periodo de tiempo de crecimiento

después del agotamiento de la fuente de nitrógeno. Este leve aumento de biomasa se debe al

uso de nitrógeno interno (proteínas). El agotamiento del nitrógeno induce en las células de C.

reinhardtii el aumento en la acumulación de lípidos como material de reserva. Teniendo en

cuenta lo plateado en el capítulo 3, se determinó que la intensidad de la luz y la concentración

de nitrógeno serían las variables a evaluar en estos ensayos, con el propósito de conocer la

respuesta de C. reinhardtii cultivada en zonas de hetero, mixo y autotrofía (Ferreiraa, 2007).


Basados en los datos obtenidos en los capítulos anteriores, se realizó el montaje de los

ensayos en los que se evaluó el crecimiento y la acumulación de algunos metabolitos bajo un

diseño experimental en el que se analizaron dos variables que permitían hacer un recorrido por

el metabolismo desde la zona heterótrofa hasta la zona autótrofa pasando por la mixótrofa.

75

Diseño experimental:

El diseño experimental se basó en la metodología Box-Behnken para dos factores con tres

niveles (Ferreiraa, 2007).

La elección de esta metodología obedeció a la ventaja que presenta este modelo de requerir

menor cantidad de ensayos utilizando 4 puntos radiales en su valor medio y un punto central.

Ilustración 41. Diseño experimental tipo Box-Behnken

El diseño propone realizar 2 repeticiones en todos los puntos radiales y 5 repeticiones para el

punto central.

Cada factor se evalúa en 3 niveles (-1, 0 y 1).

La concentración de amonio máxima correspondió a la reportada en el medio TAP, la

concentración intermedia es 1/2 de la máxima y la concentración mínima es 1/3 de la máxima.

Las variables fueron denominadas como:

N: nitrógeno

ƛ: intensidad luminosa

En la Tabla 26 se listan los ensayos realizados.

Tabla 26. Codificación del diseño experimental

variables naturales variables codificadas

código Nitrógeno (mg/L) intensidad luz (Lux) X Y

E 187.5 0 0 -1

F 187.5 0 0 -1

G 125 7500 -1 0

H 125 7500 -1 0

Nitrógeno

Intensidad

de Luz

76

C 375 7500 1 0

D 375 7500 1 0

I 187.5 15000 0 1

J 187.5 15000 0 1

A 187.5 7500 0 0

B 187.5 7500 0 0

K 187.5 7500 0 0

L 187.5 7500 0 0

M 187.5 7500 0 0

Las demás condiciones de cultivo y operación se muestran en la Tabla 27.

Tabla 27. Condiciones de cultivo en ensayos finales.

Condición Valor

Inoculo 10%



Fuente de luz Tira LED de 9 voltios


Tiempo de muestreo 1 día

Temperatura 27ºC


Agitación 110 rpm

Con el propósito de cuantificar la mayor cantidad de sustancias posibles para reducir los

grados de libertad del sistema, se decidió medir las siguientes sustancias

Acetato

Amonio

Lípidos

Proteínas

Carbohidratos

Clorofila

Biomasa

Las técnicas de medición se puntualizaron en el capítulo 2.

Para la estimación de parámetros se utilizaron las siguientes ecuaciones:

77

Biomasa:

∗ Ecuación 33

∗

Ecuación 34

Sustratos:

∗ Ecuación 35

Ecuación 36

Productos:

∗ Ecuación 37

∗ Ecuación 38.


Una vez obtenidos los datos de las variables medidas se realizó un alisamiento de los datos

con el propósito de disminuir el error experimental. Esta técnica se aplicó para todos los datos y

se realizó en el programa Mathematica 9.0, usando una función de interpolación y ajuste

manual. Con la recuperación de los datos alisados se procedió a calcular los parámetros

necesarios para el análisis de los datos.

En las siguientes gráficas se muestra el promedio del comportamiento de cada uno de los

sistemas agrupados por puntos experimentales.

78

N:0 ƛ:0

Ilustración 42. Resumen del comportamiento cinético en los sistemas A, B, K, L y M.

En este sistema donde la concentración de nitrógeno inicial fue de 192 mg/L en promedio de

las 5 réplicas, se observa un crecimiento aparentemente exponencial hasta el día 5

aproximadamente, donde la concentración de amonio presente en el sistema estaba por debajo

de 1 mg/L. Este sistema presentó las siguientes características:

Biomasa máxima: 839.5 mg/L

Fracción de lípidos máxima: 35.66%

N:1 ƛ:0

Ilustración 43. Resumen del comportamiento cinético de los sistemas C y D

%

Días

mg/L

%

Días

mg/L

79

En los sistemas C y D como se ve en la

Ilustración 433 el crecimiento se dio hasta el día 10 aproximadamente, casi al final de la cinética.

Siendo estos sistemas los que tenían mayor concentración de nitrógeno inicial (381.5)

permitieron una buena acumulación de biomasa, sin embargo la producción de lípidos no fue

tan elevada.

Estos sistemas presentaron las siguientes características:



N:0 ƛ:-1

Ilustración 44. Resumen del comportamiento cinético de los sistemas E y F.

Los sistemas E y F, representan el único punto heterótrofo de la evaluación. Al no tener luz y

usar el acetato como fuente de carbono, este sistema presentó menor crecimiento que los

mixótrofos. La concentración inicial de amonio fue en promedio de 189 mg/L, permitiendo el

crecimiento hasta el día 5 aproximadamente. En este sistema se puede ver al nitrógeno

%

mg/L

Días

80

actuando como nutriente limitante tal como se describió en el capítulo 2, ya que requiere hacer

un gasto energético mayor para sintetizar los metabolitos usando al acetato como fuente de

carbono y energía a la vez.

Estos sistemas presentaron las siguientes características:



N: -1 ƛ:0

Ilustración 45. Resumen del comportamiento cinético de los sistemas G y H.

Los sistemas G y H como se puede apreciar en el diseño experimental (tabla 26), corresponden

al punto en el que la concentración de nitrógeno es la mínima de toda la evaluación (124.41

mg/L en promedio). Por tal motivo el crecimiento en estos sistemas fue muy bajo, contrastando

esto con una buena acumulación de lípidos.

Las características de los sistemas son:



N: 0 ƛ: 1

%

mg/L

Días

mg/L

81

Ilustración 46. Resumen del comportamiento cinético de los sistemas I y J.

Finalmente los sistemas I y J representan la zona con mayor intensidad de luz y concentración

media de nitrógeno, en ese punto se ve un crecimiento hasta el día 4 aproximadamente,

limitado igualmente por el nitrógeno.

Las características de estos sistemas fueron:


Fracción máxima de lípidos: 31.96%

Griffiths en 2009, reportó que para las microalgas verdes un tiempo promedio de duplicación

corresponde a 24 h, equivalente esto a una velocidad de crecimeinto de 0.69 d-1. En los 13

puntos experimentales evaluados en este trabajo se encontró que la menor velocidad de

crecimeinto fue de 0.84 d-1 para el sistema F (N:0 ƛ:-1) y la máxima velocidad encontrada fue

de 2.1 d-1 para el sistema B (N:0 ƛ:0).

En la tabla 27 se muestran los resultados de los parámetros calculados según la metodología

para cada uno de los puntos experimentales.

82

Tabla 28. Resumen de los parámetros calculados para los 5 sistemas de crecimiento.

Variables naturales variables codificadas Respuestas

código Nitrógeno (mg/L) intensidad luz (Lux) X Y vel cto d-1

Yxs Ypn %Lip NH4+ %Lip NH4- P NH4+ P NH4-

E 187.5 0 0 -1 0.986 0.3 0.71 11.58 32.56 16.22 18.5

F 187.5 0 0 -1 0.84 0.37 0.91 12.97 30.82 18.72 19.96

G 125 7500 -1 0 1.37 0.32 0.94 18.3 34.91 26.44 17.39

H 125 7500 -1 0 1.37 0.54 1.76 21.27 35.56 42.63 36.25

C 375 7500 1 0 1.93 0.77 0.85 14.5 33.2 28.93 28.93

D 375 7500 1 0 1.73 0.7 0.76 18.67 34.3

27.54 27.54

I 187.5 15000 0 1 1.81 0.68 1.26 16.9 30.911 34.15 31.94

J 187.5 15000 0 1 1.93 0.71 1.24 15.6 33.03 36.7 32.22

A 187.5 7500 0 0 1.765 0.69 1.52 18.3 38.68 25.93 33.13

B 187.5 7500 0 0 2.1 0.77 1.67 17.87 38.87 38.17 39.9

K 187.5 7500 0 0 1.51 0.52 1.34 22.5 34.04 35.57 33.23

L 187.5 7500 0 0 1.43 0.39 1.33 21 34.91 27.48 29.91

M 187.5 7500 0 0 1.4 0.36 1.13 20.42 32.5 29.13 28.18

Vel cto: velocidad de crecimiento.

Yxs: rendimiento de la biomasa con respecto al sustrato.

Ypn: rendimiento del producto (lípidos) con respecto al nitrógeno.

P: productividad

83

Se realizó un análisis de la productividad de lípidos en la fase del crecimiento que tenía amonio

en el medio, y en la zona en la que ya el amonio había sido totalmente consumido, con el

propósito de encontrar información sobre la acumulación de lípidos producto de la ausencia de

nitrógeno.

Ilustración 47. Fracción de lípidos acumulada en los sistemas con y sin nitrógeno en el medio.

En la Ilustración 47 se aprecia claramente el aumento del porcentaje de acumulación de

lípidos, pasando de la zona en la que el medio aún tiene amonio (círculos sin relleno) a la zona

en la que este porcentaje aumenta una vez se agota el nitrógeno del medio (círculos con

relleno).

En la Tabla 29 se puede ver el aumento que tuvo cada sistema una vez se agotó el nitrógeno

del medio de cultivo (los códigos en el eje X de la ilustración 68 corresponden a cada sistema).

De esta manera se aprecia que el aumento es muy similar en todos los sistemas evaluados, las

diferencia principales en la productividad de cada sistema se debe a la concentración inicial de

nitrógeno que tenía el medio, esto influyó en la producción de biomasa y en el tiempo en el que

se dio el aumento de lípidos.

Tabla 29. Aumento en el porcentaje de lípidos por el agotamiento del nitrógeno.

Código Sistema Aumento en la fracción (%)

1 N:0 ƛ:-1 19.415 ± 1.10

2 N:-1 ƛ:0 15.45 ± 1.27

3 N:1 ƛ:0 17.41 ± 2.03

4 N:0 ƛ:1 15.7205 ± 1.20

5 N:0 ƛ:0 15.782 ± 2.38

NH4 -

O NH4 +

84

Sheehan et al. 1998 reportaron productividades de 25-50 mg/L/día para C. reinhardtii cultivada

en medio TAP. En la Tabla 30 se muestran las productividades de lípidos obtenidas en los 5

sistemas de evaluación con y sin amonio en el medio de cultivo.

Tabla 30. Productividades de lipidos en los sistemas con y sin amonio.

Sistema NH4 +

mg/L/día

NH4 –

mg/L/día

N:0 ƛ:-1 17.47 19.23

N:-1 ƛ:0 34.535 26.82

N:1 ƛ:0 28.235 28.235

N:0 ƛ:1 35.425 32.08

N:0 ƛ:0 31.2 32.87

Como se explicó en la metodología de este capítulo, se calcularon los rendimientos de lípidos

en mg/L/día para cada sistema experimental, así como los rendimientos de este metabolito.

Estos datos fueron usados para trazar las gráficas de superficie de respuesta. En estas

gráficas se muestran las zonas con mayor actividad del parámetro evaluado, así como su valor

máximo y coordenadas de ubicación. A continuación se exponen las gráficas correspondientes

a las fracciones de lípido y sus productividades tanto en el medio con amonio como en el medio

sin amonio.

Ilustración 48. Fracción de lípidos en medio TAP con amonio.

85

El valor máximo de la fracción de lípidos que se estimó por el método cuadrático fue de 20.54%

con respecto a la biomasa, y se ubica en la zona de color naranja en la coordenadas X:-0.43 Y:

0.17.

Ilustración 49.Fraccion de lípidos en medio TAP sin amonio.

Esta gráfica que corresponde a los días en los que el amonio se agotó totalmente para cada

uno de los sistemas refleja el aumento en la fracción de lípidos encontrando un máximo valor

de 37.14% ubicado en X: -0.45 Y:0.017.

Ilustración 50. Productividad de lípidos en medio TAP con amonio.

Como se observa en la Ilustración 50, la zona donde se encuentra el valor máximo está en la

frontera del gráfico ubicándose por encima de los 35 mg/L/día y en la zona de menor

concentración de nitrógeno y mayor intensidad de luz.

86

Ilustración 51. Productividad de lípidos en medio TAP sin amonio.

En las gráficas de superficie de respuesta se aprecia que con respecto a la fracción de lípidos

(porcentaje), esta fue más alta en la zona en la que se había agotado el nitrógeno en el medio.

Sin embargo un comportamiento común en las dos gráficas es que la mayor acumulación se

ubica en la misma zona, cerca de la máxima intensidad de luz y muy baja concentración de

nitrógeno.

Por otra parte en las gráficas de productividad (Ilustración 50 y Ilustración 51), en donde se

relaciona más directamente la biomasa se observa que en presencia de nitrógeno la máxima

productividad se ubica en la zona de alta intensidad de luz y baja concentración de nitrógeno,

pero una vez se agota el amonio (grafica sin NH4), la productividad máxima cambia de zona

ubicándose cerca de una media-alta intensidad de luz y alta concentración de nitrógeno. Esto

tiene que ver con el hecho de que la alta producción de biomasa está ligada al nitrógeno y que

una vez este se agote la productividad de lípidos será mayor en el punto donde se alcanzó

mayor concentración de biomasa.

Ya que las ilustraciones 50 y 51 sugieren que una mayor intensidad de luz aumentaría la

productividad cabe recordar que en el capítulo 4 en la ilustración 29 se observa que la

acumulación de biomasa empieza a disminuir por encima de los 20000 lux y allí mismo se

discuten las razones de no realizar las evaluaciones con más de 15000 lux de intensidad.

Como se esperaba la productividad más alta está presente en los puntos que tienen una mayor

concentración de nitrógeno, ya que alcanzan mayor cantidad de biomasa, sin embrago estos

resultados aplican para cultivos en lote, en los que habría que esperar a que se agote el

nitrógeno o se logre el máximo de biomasa para inducir la acumulación por ausencia de

nitrógeno.

87

James et al en 2010, reportaron un aumento en porcentaje total de lípidos en C. reinhardtii de

16 a 40% una vez se agotaba el nitrógeno del medio de cultivo.

Finalmente, los datos obtenidos en la experimentación de este capítulo fueron analizados para

obtener los parámetros requeridos para realizar el análisis de flujos metabólicos. Estos

parámetros se muestran en el anexo.

6.4. Conclusiones

De los puntos experimentales evaluados, los que sugieren ser más idóneos para alcanzar una

mejor productividad de lípidos, están en las zonas de alta intensidad de luz y baja

concentración de nitrógeno. Sin embargo la alta concentración de nitrógeno inicial permitiría

una mayor cantidad de biomasa, resultando esto en una alta productividad de lípidos.

Una posible estrategia sugerida por los resultados plasmados en las gráficas de superficie de

repuesta podría ser un lote alimentado o un sistema continuo en el que se logre una cantidad

de biomasa alta producto de una alta concentración de nitrógeno inicial, y cuando esta

sustancia (nitrógeno) empiece a agotarse y llegue cerca de los 10 mg (zona en la que se

dispara el aumento de lípidos) el sistema empezará a acumular lípidos, de tal forma que se

alimente el cultivo con nitrógeno sin sobrepasar esta frontera cercana a los 10 mg,

garantizando así el estrés celular por carencia de nitrógeno pero con la cantidad mínima

suficiente para que las células puedan seguirse reproduciendo.

88

7. ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS

7.1. Introducción

El metabolismo es la suma de todas las transformaciones que toman lugar en una célula u

organismo. Estas transformaciones ocurren a través de una serie de reacciones que

constituyen las vías metabólicas. Estas vías metabólicas ayudan principalmente a obtener

energía por la degradación de nutrientes ricos en energía captados del ambiente, convertir

moléculas de nutrientes en moléculas características de las células (precursores), transformar

estos precursores en macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos y sintetizar y

degradar biomoléculas específicas para funciones celulares especializadas (Provost, 2006).

En términos generales el metabolismo se compone de las vías y reacciones cuya función es

sintetizar moléculas mayores que sirven como estructura celular o reservas energéticas

(anabolismo) y por otra parte de las vías y reacciones que se encargan de degradar moléculas

grandes con el propósito de obtener la energía necesaria para que se puedan realizar las

funciones de síntesis y polimerización (catabolismo).

De acuerdo el nivel de complejidad celular existen más o menos reacciones metabólicas. En el

caso de Chlamydomonas reinhardtii, el metabolismo primario se puede resumir en las

siguientes vías:

Fotosíntesis

Ciclo de Calvin

Ciclo de Krebs

Vía de las pentosas fosfato

Síntesis de pigmentos

Síntesis de aminoácidos

Síntesis de ácidos grasos

Síntesis de ácidos nucleicos

Reacciones de inter-conversión

Metabolismo del piruvato

Metabolismo del tetrahidrofoláto

Vía de glicolisis/gluconeogénesis

Vía de la beta-oxidación

Reacciones energéticas asociadas a motilidad

Vía de producción de hidrogeno

Asimilación de nitrógeno

Asimilación de azufre

Reacciones de transporte intra/extra-celular

89

En términos generales estas reacciones metabólicas pueden ser descritas como flujos, y las

sustancias que en ellas participan (metabolitos) son llamados nodos metabólicos. Los nodos

conectan las reacciones en una red, y los flujos aportan la información de trayectoria en la

distribución del carbono a través de la red metabólica.

La cuantificación precisa de la magnitud de los flujos de tales vías metabólicas, es de hecho un

logro importante para la fisiología celular y la ingería metabólica, especialmente en el contexto

de la producción de metabolitos donde el objetivo principal es tratar de convertir la mayor parte

de sustratos en productos de interés (Nielsen & Stephanopoulos, 1998). Esta cuantificación de

flujos metabólicos se realiza por la aplicación de modelos matemáticos que describen el

comportamiento de la red metabólica de estudio.

El modelamiento matemático es una herramienta muy poderosa en física, química, biología e

ingeniería para la interpretación y predicción de fenómenos naturales y resultados

experimentales.

Un modelo matemático es siempre una simplificación del fenómeno actual, por medio del cual

además es posible establecer diferentes estrategias matemáticas que resuelvan el mismo

modelo, dependiendo de los objetivos de este modelo y de las medidas disponibles (Dochain &

Bastin, 1990).

En la biotecnología se han implementado diversos modelos matemáticos con el propósito de

elucidar procesos metabólicos difíciles de entender a simple vista. Inicialmente funcionaban

para describir procesos macroscópicos que involucraban la transformación de sustratos en

productos, estos modelos fueron originalmente conocidos como modelos de caja negra ya que

el funcionamiento interno no era esclarecido entonces (Provost, 2006).

Recientemente los esfuerzos se han dirigido hacia la obtención de modelos macroscópicos que

permitan la descripción del metabolismo intracelular (Hagg, Wower, & Bogaerts, 2005). Como

se describió en el capítulo 1 (Introducción), una metodología poderosa para la cuantificación

de estos flujos es el análisis de flujos metabólicos, que basa su funcionamiento en la

descripción de flujos intracelulares a través de una matriz estequiométrica usando tasas

extracelulares relativamente fáciles de medir experimentalmente.

En este trabajo se usó como base la metodología descrita por Provost en 2006, del cual se

obtienen flujos metabólicos de una red extensa a través de varios pasos que involucran el

análisis convexo en lugar del algebra lineal.

El análisis convexo se basa en la resolución geométrica de sistemas lineales no negativos

(redes metabólicas), generando como respuesta un grupo de vectores conocidos como ―rayos

90

extremos‖. Posteriormente y como se muestra en la metodología de este capítulo, estos rayos

son computarizados para obtener vectores de flujos metabólicos asociados a las reacciones de

la red.

En este capítulo se detalla la aplicación de esta metodología de análisis convexo y se

presentan los resultados de los diferentes sistemas metabólicos descritos en el capítulo 6, así

como las diferencias en la distribución del carbono para cada condición de crecimiento.

7.2. Materiales y métodos

A continuación se detallan los procedimientos matemáticos necesarios para obtener flujos

metabólicos a partir de la matriz estequiométrica inicial del sistema.

Desarrollo matemático

Por definición, el objetivo del análisis de flujos metabólicos es determinar la distribución del flujo

del carbono en un sistema vivo. En este caso el sistema se basa en el crecimiento de C.

reinhardtii bajo diferentes condiciones externas que influyeron en su crecimiento y acumulación

de ciertos componentes celulares (ver capítulos anteriores para mayor detalle). Teniendo en

cuenta estas variaciones metabólicas en el sistema tenemos que:

Ecuación 39

Dónde:

x= metabolito interno, (sustrato, producto o componente celular).

Y= matriz estequiométrica del sistema.

qm= vector de tasas metabólicas.

qI= vector de tasas de intercambio.

µ= velocidad de crecimiento.

x= concentración de sustancia.

Para este caso específico donde el interés son los flujos metabólicos podemos reacomodar la

Ecuación 39 de la siguiente manera:

91

Ecuación 40

De la ecuación 40 vale la pena destacar que qI solo aplica a las sustancias intercambiadas con

el medio ambiente y que para el caso de los intermediarios metabólicos (metabolitos pequeños)

como su concentración es muy pequeña su acumulación es normalmente 0 o muy cercana a 0

pudiendo así descartarse este componente de la ecuación.

En el mismo sentido, como la concentración del metabolito es muy baja, el término de dilución,

μx, es también despreciable.

Estos intermediarios metabolicos entran en la definición de modos elementales. Los cuales se

definen como el conjunto de soluciones qm que satisfacen:

Ecuación 41

Sin embargo, considerar el sistema en la forma de Y solo permite analizar el movimiento de los

flujos intracelulares (ciclos) con lo cual conviene adicionar las sustancias intercambiadas

(sustratos y productos) a la matriz Y para obtener una matriz estequiométrica de forma M que

contenga las entradas y salidas de sistema. Atendiendo a lo anterior podemos escribir la

ecuación de balance como:

(

) (

) ( − −

) (

) Ecuación 42

Dónde:

qs= mediciones experimentales de sustratos.

qp= mediciones experimentales de productos.

En la ecuación 42 se ha partido Y en tres matrices para separar sustratos y productos de las

otras sustancias que son estrictamente intracelulares. Con este arreglo los modos elementales

se definen como las qm contenidas en los primeros n renglones de q que satisfacen:

Ecuación 43

En este trabajo se usó algoritmo propuesto por el grupo de trabajo de S. Schuster y R.

Schuster en 1993 llamado ―METATOOL1‖, para la resolución de los modos elementales

partiendo del sistema mostrado en la ecuación 42.

1 Fuente de METATOOL:

http://pinguin.biologie.unijena.de/bioinformatik/networks/metatool/metatool5.0/metatool5.0.html

92

Conviene notar que usualmente existen varios modos elementales que satisfacen la ecuación,

por lo que pueden acomodarse en una matriz E, de modos elementales que satisface, en

congruencia con la anterior,

Una vez obtenidos los modos elementales Enxe se puede tomar una parte de la ecuación 42 y

realizar un cálculo que involucre la matriz estequiométrica Y y los recién obtenidos modos E:

(

)

(

) Ecuación 44

Aunque los modos elementales ofrecen diversas soluciones para el sistema Y qM =0, no todas

esas soluciones satisfacen a la ecuación 44, de hecho, sólo una combinación de los modos

elementales pueden reproducir los resultados experimentales,

q

Donde w es un vector de pesos, De ahí que la ecuación 44 pueda ser reescrita como:

( s

p) (

qs

qp) (

q

q ) (

)

Esta matriz es ejecutada bajo el algoritmo de METATOOL ver 5.0, arrojando como resultado

una matriz W que incluye columnas cuyos valores son los pesos (w) y un último renglón de

unos que involucra el producto necesario para el arreglo mostrado en la ecuación 44. Cada

vector de pesos multiplicado por los modos elementales E proporciona un grupo de vectores

cuyas dimensiones son por un lado la cantidad de reacciones de la red y por otro la cantidad de

pesos encontrados en W. De esta manera tenemos los flujos metabólicos asociados a cada

reacción, notando que la suma de todos estos vectores son las posibles combinaciones que se

pueden obtener en la distribución del carbono por la red metabólica (posibles escenarios de

distribución de los flujos metabólicos).

Modelo metabólico

Se tomaron como base los modelos metabólicos reportados en (Nannet & Boyle, 2009) y en

(Klipuis, 2010), además se usaron las bases de datos KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and

genomes) y BioCyc (data base collection) como elementos de partida para la construcción del

modelo metabólico aquí reportado.

93

Rutas metabólicas

Como se detalló en el capítulo 6, los sistemas experimentales corresponden a crecimiento en

autotrofía, mixotrofía y heterotrofía, y teniendo en cuenta las sustancias o metabolitos de

interés, se obtuvo una red metabólica con las siguientes características:

Tabla 31. Rutas y reacciones de la red metabolica general.

Ruta metabólica Reacciones

Fotosíntesis 8 Light + 3 ADP + 3 Pi + H[+] + 2 cNADP O2 + H2O + 2 cNADPH + 3 ATP

Ciclo de Calvin CO2 + H2O + cRu15DP 2 cG3P

ATP + cG3P ADP + H[+] + c13DPG

H[+] + cNADPH + c13DPG cNADP + Pi + cGAP

cGAP cDHAP

cDHAP + cGAP cF16P

H2O + cF16P Pi + cF6P

cF6P + cGAP cE4P + cX5P

H2O + cE4P + cGAP Pi + cS7P

cGAP + cS7P cR5P + cX5P

cX5P cRu5P

cR5P cRu5P

ATP + cRu5P ADP + H[+] + cRu15DP

Glicolisis/gluconeogénesis G6P G1P

F6P G6P

ATP + F6P ADP + F16P + H[+]

F16P + H2O F6P + Pi

DHAP + GAP F16P

DHAP GAP

GAP + NAD+Pi 13DPG + H[+] + NADH

13DPG + ADP 3PG + ATP

3PG 2PG

2PG H2O + PEP

ADP + H[+] + PEP ATP + PYR

Ciclo del ácido cítrico CoA + NAD + PYR AcCoA + CO2 + NADH

AcCoA + H2O + OXA CIT + CoA + H[+]

CIT + NAD AKG + CO2 + NADH

AKG + CoA + NAD CO2 + NADH + SUCCoA

ADP + Pi + SUCCoA ATP + CoA + SUC

FAD + SUC FADH2 + FUM

FUM + H2O MAL

FAD + MAL FADH2 + OXA (cambia el NAD y NADH por FAD y FADH)

ATP + CO2 + H2O + PYR ADP + OXA + Pi + 2 H[+]

ATP + OXA ADP + CO2 + PEP (aparece en gluconeogenesis)

CO2 + H2O + PEP H[+] + OXA + Pi (aparece en gluconeogenesis)

Ciclo de las pentosas fosfato G6P + H2O + NADP 6PG + NADPH + 2 H[+]

6PG + NADP CO2 + NADPH + RU5P

RU5P R5P

RU5P X5P

94

R5P + X5P GAP + S7P

GAP + S7P E4P + F6P

F6P + GAP E4P + X5P

Síntesis de

aminoácidos/proteína

AKG + H[+] + NADPH + NH4[+] GLU + H2O + NADP

ATP + GLU + NH4[+] ADP + GLN + H[+] + Pi

AKG + GLN + H[+] + NADPH NADP + 2 GLU

3PG + GLU + H2O + NAD AKG + H[+] + NADH + Pi + SER

SER NH4[+] + PYR

AcCoA + H2S + SER Ace + CYS + CoA + H[+]

ATP + Ace + CoA ADP + AcCoA + Pi

GLU + PYR AKG + ALA

H[+] + THR 2-oxobutan + NH4[+]

2-oxobutan + GLU + H[+] + NADPH + PYR AKG + CO2 + H2O + ILE + NADP

2 H[+] + ALA + NADPH + PYR CO2 + H2O + NADP + VAL

2 PYR + AcCoA + GLU + H[+] + NAD + NADPH AKG + CoA + LEU + NADH + NADP + 2 CO2

2 PEP + ATP + E4P + NADPH ADP + CHO + NAD P + 4 Pi

CHO PRE

GLU + H[+] + PRE AKG + CO2 + H2O + PHE

GLU + NAD + PRE AKG + CO2 + NADH + TYR

CHO + GLN ANTH + GLU + H[+] + PYR

ANTH + H[+] + PRPP + SER CO2 + GAP + PPi + TRYP + 2 H2O

3 H2O + 2 NAD + ATP + GLN + PRPP AICAR + AKG + HIS + Pi + 2 NADH + 2 PPi + 5 H[+]

GLU + OXA AKG + ASP

ASP + ATP + GLN + H2O ADP + ASN + GLU + H[+] + Pi

2 ATP + 2 H2O + CO2 + GLN CaP + GLU + Pi + 2 ADP + 3 H[+]

2 GLU + ASP + ATP + CaP + NADH AKG + AMP + ARG + FUM + H2O + NAD + PPi + Pi

3 H[+] + 2 NADH + GLU PRO + 2 H2O + 2 NAD

AKG + O2 + PRO CO2 + HydPro + SUC

ASP + ATP + H[+] + NADPH ADP + ASA + NADP + Pi

2 H[+] + ASA + GLU + NADH + PYR AKG + DAP + H2O + NAD

DAP CO2 + H[+] + LYS

ASA + H[+] + NADPH HSER + NADP

ATP + H2O + HSER ADP + H[+] + Pi + THR

AcCoA + CYS + H2O + HSER Ace + CoA + HCYS + H[+] + NH4[+] + PYR

HCYS + MTHF H[+] + MET + THF

4.306 ATP + 3.306 H2O + 0.111 ALA + 0.094 GLY + 0.093 LEU + 0.059 PRO + 0.059 VAL + 0.058 LYS + 0.057 THR + 0.055 SER + 0.05 GLN + 0.05 GLU + 0.047 ARG + 0.047 ASN + 0.047 ASP + 0.045 PHE + 0.036 ILE + 0.031 TYR + 0.022 MET + 0.017 HIS + 0.013 HydPro + 0.012 CYS + 0.001 TRYP PROTEINA + 4.306 ADP + 4.306 Pi + 4.314 H[+]

Síntesis de ácidos

grasos/lípidos

ACP + AcCoA + H[+] AcACP + CoA

ATP + AcCoA + CO2 + H2O ADP + H[+] + MalCoA + Pi

ACP + MalCoA CoA + MalACP

10 H[+] + 10 NADPH + 5 MalACP + AcACP C12:0ACP + 5 ACP + 5 CO2 + 5 H2O + 10 NADP



C160ACP + H[+] + NADH + O2 C16:1ACP + NAD + 2 H2O





95



GLYC3P + 0.474 C16:0ACP + 0.446 C18:3ACP + 0.276 C18:2ACP + 0.253 C16:3ACP + 0.16 C18:1ACP + 0.148 C16:2ACP + 0.104 C12:0ACP + 0.051

C14:0ACP + 0.048 C18:0ACP + 0.04 C16:1ACP Lipido + 2 ACP + 2 H[+]

Síntesis de ácidos nucleicos 4 ATP + 2 GLN + 2 H2O + ASP + CO2 + GLY + N10FTHF + PRPP AICAR + FUM

+ PPi + THF + 2 GLU + 4 ADP + 4 Pi + 7 H[+]

ASP + CaP + H[+] + O2 + PRPP CO2 + H2O + H2O2 + PPi + Pi + UMP

2 H2O2 O2 + 2 H2O

ATP + UMP ADP + UDP

ATP + UDP ADP + UTP

ATP + GLN + H2O + UTP ADP + CTP + GLU + Pi + 2 H[+]

ATP + CDP ADP + CTP

AICAR + N10FTHF H2O + IMP + THF

ATP + H2O + IMP + NAD + NH4[+] AMP + GMP + NADH + PPi + 3 H[+]

ATP + GMP ADP + GDP

ATP + GDP ADP + GTP

ASP + GTP + IMP AMP + FUM + GDP + Pi + 2 H[+]

ATP + H[+] + METHF + NADPH + UDP ADP + DHF + H2O + NADP + dTTP

ATP + CDP + H[+] + NADPH ADP + H2O + NADP + dCTP

ATP + GDP + H[+] + NADPH ADP + H2O + NADP + dGTP

ATP + H[+] + NADPH H2O + NADP + dATP

2.372 H2O + 1.372 ATP + 0.18 dATP + 0.18 dTTP + 0.32 dCTP + 0.32 dGTP

DNA + PPi + 1.372 ADP + 1.372 Pi + 2.372 H[+]

1.4 H2O + 0.56 ATP + 0.34 GTP + 0.16 UTP + 0.34 CTP 0.4 ADP + 0.4 H[+] +

0.4 Pi + PPi + RNA

Síntesis de clorofila 12 H[+] + 8 ATP + 8 GLU + 8 NADPH + 2.5 O2 PPorphyrin + 4 NH4[+] + 6

CO2 + 8 AMP + 8 NADP + 8 PPi + 13 H2O

18 H[+] + 15 NADPH + 8 ATP + 4 GAP + 4 PYR Phytyl-PP + 4 ADP + 4 AMP +

4 CO2 + 7 PPi + 8 H2O + 15 NADP

ATP + H2O + MET AdMET + H[+] + PPi + Pi

AdHCYS + H2O Ad + HCYS

ATP + Ad ADP + AMP + H[+]

144 4 NADPH + 2.5 O2 + 2 ATP + AdMET + Mg2[+] + PPorphyrin + Phytyl-PP AdHCYS + Clorofila + PPi + 2 ADP + 2 H2O + 2 Pi + 3 H[+] + 4 NADP

Síntesis de carbohidratos G1P Pi + STARCH

G1P Carbohidratos + Pi

Las reacciones correspondientes a síntesis de aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, y

clorofila fueron transformadas a reacciones resumidas que parten de los intermediarios

metabólicos (AcCoA, ATP, GAP etc.). Estas rutas pasaron de varias reacciones a una reacción

general de síntesis, con el propósito de disminuir la cantidad de sustancias presentes en la red.

De esta manera se obtuvo una red metabólica general (mixotrofía) que fue usada como base

para evaluar los sistemas autótrofos y heterótrofos eliminando las rutas metabólicas que no

correspondían con cada tipo de metabolismo.

96


Topología de la red

La red metabólica tiene las siguientes características:

Tabla 32. Topologia de la red mixotrófica.

Variable Codificación Numero

Reacciones n 55

Sustratos Ys 3*

Productos Yp 6*

Intermediarios metabolicos Yx 42

*El CO2 puede actuar como sustrato o producto dependiendo del sistema evaluado.

Diagrama de la red metabólica

El siguiente diagrama de adyacencia fue obtenido con el software Mathematica 9.0. En este

diagrama se aprecian los metabolitos como nodos (puntos) y las reacciones que estos

conectan aparecen como flechas.

Ilustración 52. Red metabólica completa del sistema mixotrófico.

Este diagrama representa el modelo completo en mixotrofía, del mismo se derivan los modelos

autotróficos y heterotróficos al suprimir las reacciones propias de cada sistema.

97

Calculo de los flujos metabólicos

Para el cálculo de los flujos metabólicos se usaron las velocidades de consumo y generación

de sustancias determinadas en el capítulo 6.

Se decidió realizar el análisis de la distribución de los flujos de carbono en los puntos de

mixotrofía, autotrofia y heterotrofia para los 5 puntos experimentales mostrados en el diseño de

Box-Behnken. Debido a la similitud en las velocidades dentro de cada grupo (mixo, auto y

heterotrofía) se promediaron los flujos de cada grupo y se obtuvo así un mapa de flujos

representativo para cada grupo. A continuación se muestra la matriz estequiometria base de

los cálculos y el mapa de flujos obtenido para los tres modelos metabólicos planteados.

Tabla 33. Matriz estequiometrica del modelo mixotrofico de C. reinhardtii.

Filas: sustancias; Columnas: reacciones.

En gris los valores diferentes de 0; en Azul los sustratos; en naranja los productos.

CO2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

NH4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Acetato 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Lípidos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -3105 0 -14711 0 0 0 0 -16711 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -29422 0 -1000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 0

Carbohidratos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 2 0 0 0

Proteína 0 77 0 0 -368 0 1 0 0 170 0 -1632 -70 0 0 0 -153 -269 219 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1871 0 0 0 -1 0 -35 -569 170 0 0 0 0 -1368 1

SUC 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

FUM 0 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

FADH2 0 0 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MAL 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OXA 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

DHAP 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

GAP 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F16P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

D13PG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

NADH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P3G 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ATP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

PEP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F6P 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G6P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G1P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

AcCoA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

AKG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

cNADPH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

c13DPG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

cGAP 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

cDHAP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

cF16P 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

cF6P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

cE4P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

cX5P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

cS7P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

cR5P 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

cRu5P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

DHA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0

NADPH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0

GLYC 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

GLYC3P 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 -1 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

RU5P 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0

R5P 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

X5P 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

E4P 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

PYR 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

cRu15DP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0

cG3P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

98

Ilustración 53. Mapa de los flujos metabólicos de C. reinhardtii bajo crecimiento mixotrófico,

autotrófico y heterotrófico.

99

Cabe la pena destacar dentro el procedimiento del algoritmo METATOOL que la sensibilidad es

bastante alta, lo cual hace bastante complejo el cálculo de los flujos, debido a que no pueden

calcularse todos los flujos usando todas las sustancias medidas a la vez como restricciones del

sistema. Sin embargo, en el cálculo de los pesos (Ecuación 44), pueden usarse combinaciones

de estas sustancias que permitan al algoritmo devolver los valores adecuados para todas las

sustancias, incluyendo aquellas que no se usaron en el cálculo de los pesos. En el caso de

estos flujos se utilizaron diferentes combinaciones en cada caso, realizándose la corroboración

de los valores arrojados en el producto E*W´ para las sustancias no usadas en el cálculo (ver

ecuación 43).

Análisis de los flujos metabólicos

Como se observa en la Ilustración 53, el sistema mixotrófico (cuadros amarillos) tiene una

distribución a lo largo de toda la red, fijando carbono inorgánico en el cloroplasto por medio de

las reacciones de fotosíntesis y ciclo de Calvin. Así mismo realiza la incorporación del acetato

al citosol que es rápidamente convertido en AcCoA. Teniendo en cuenta que la mixotrofìa en

los 4 puntos experimentales mostrados en el capítulo 6, corresponde a los puntos iniciales del

sistema, momento en el cual el medio de cultivo contenía acetato (días iniciales de la

evaluación), se aprecia una mayor captación de carbono inorgánico que en el modelo

autotrófico. El modelo autotrófico fue asumido una vez se agota el acetato del medio del cultivo

(después del 4 día aproximadamente), en este momento se aprecia una disminución de la

velocidad de crecimiento y en términos de velocidad, una disminución en la velocidad de

acumulación de lípidos. En el mapa de flujos de carbono se aprecia que la cantidad de

precursor para la síntesis de lípidos (AcCoA) es menor en el punto autótrofo que en el punto

mixotrofo, esto debido principalmente a la cantidad de carbono que ingresa a cada sistema y a

los esfuerzos energéticos de cada modelo. Cuando el microorganismo solo dispone de CO2

para su crecimiento, la fotosíntesis es quien realiza el mayor trabajo energético del sistema, por

otra parte cuando se dispone de acetato en el medio de cultivo, el gasto energético se suple

por el funcionamiento de la vía de las pentosas fosfato y el ciclo de Krebs principalmente. Así

que, al tener un metabolismo mixto se dispone de mayor carbono para la síntesis de moléculas

intermediarias.

Por su parte, el modelo heterotrófico representado en el mapa metabólico en cuadros azules,

muestra ser menos eficiente en la síntesis de intermediarios metabólicos como la AcCoA, ya

que este sistema debe disponer del acetato para realizar la polimerización de macromoléculas

así como la producción de la energía requerida. Como se aprecia en el mapa, el

funcionamiento del modelo heterotrófico tiene un aspecto diferente a los otros dos, esto es

100

debido a que el carbono ingresa al sistema en forma de AcCoA, teniendo que dirigirse hasta las

vías de pentosas y síntesis de carbohidratos en contraflujo de los sistemas mixotroficos y

autotróficos.

En este trabajo no se modelo la parte energética de cada sistema, debido a la complejidad en

el cálculo de los flujos, sin embargo esto complementaria mucho más el análisis.

Otro punto importante de resaltar, es que la simplificación que se realizó de la síntesis de

lípidos y proteínas (usando solo intermediarios metabólicos) no permite en gran medida un

análisis más profundo sobre la distribución del carbono en estos puntos. Por ahora solo se

puede realizar un juicio sobre la distribución del carbono hasta el intermediario mayor y

precursor de estos componentes celulares (AcCoA).

7.4. Conclusiones

Vale la pena incorporar al modelo, una red metabólica que incluya los componentes

energéticos completos para que el análisis pueda ser mucho más profundo.

El uso de redes cada vez más complejas podría aportar más información en el análisis, aunque

es bien conocido de la complejidad de manejar matemáticamente sistemas muy grandes, sin

embargo este modelo podría mejorarse al usar las reacciones completas de síntesis de

macromoléculas.

De igual forma que como se concluyó en el capítulo 6, el sistema mixotrófico involucra una

mayor productividad de lípidos, por tanto se muestra como el modelo metabólico más eficiente

en este trabajo.

En el mapa metabólico así como en los resultados de las cinéticas mostrados en el capítulo 6,

se logra inferir que el sistema de mixotrofía efectivamente parece ser la suma de los

metabolismos auto y heterotrófico. Esto tiene mucho significado si se logra pensar en procesos

de producción que logren combinar la fijación del CO2 (gas de efecto invernadero), y el uso de

residuos orgánicos que contengan fuentes de carbono como el acetato (aguas residuales

domesticas o industriales), combinando en un solo proceso una solución a dos impactos

ambientales y optimizando la producción de biomasa y lípidos de microalgas.

Estos modelos metabólicos aquí planteados pueden usarse como base en la construcción de

una herramienta más poderosa para la simulación metabólica de C. reinhardtii bajo diferentes

condiciones de crecimiento y/o modificaciones genéticas, permitiendo analizar la distribución

del carbono y afectación de rutas metabólicas.

101

8. ANEXOS

8.1. Fundamento de las técnicas analíticas utilizadas

Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico (BCA)

El ensayo del ácido Bicinconínico fue descrito en primera instancia por Smith et al (1) de

manera similar al ensayo de Lowry, ya que depende de la conversión de Cu+2 a Cu+ en

condiciones alcalinas. Este Cu+ es luego detectado por reacción con el BCA. Los dos ensayos

son similares en sensibilidad, pero el BCA es más estable bajo condiciones alcalinas, y además

tiene la ventaja de que puede ser llevado a cabo en un solo paso comparado con los dos pasos

requeridos en Lowry.

La reacción resulta en el desarrollo de un color purpura intenso con un máximo de absorbancia

a 562 nm. Ya que la producción de Cu+ en esta prueba es función de la concentración de la

proteína y el tiempo de incubación, el contenido de proteínas de muestras desconocidas puede

ser determinado espectrofotométricamente por comparación con unos patrones de proteína

estándar.

Proteína + Cu2+ • Cu1+

Cu1+ + BCA complejo purpura BCA- Cu1+ Ecuación 45

Otra ventaja es que es el BCA presenta poca interferencia con sustancias como si lo presenta

el método de Lowry. En particular, no es afectado por detergentes ni agentes desnaturalizantes

como la urea o el cloruro de guanidina, aunque es más sensible a la presencia de azúcares

reductores.

Esta metodología ya ha sido altamente utilizada en procesos que incluyen biomasa de

microalgas (Nannet R Boyle, 2009.), (Markus Fuhrmann, 2001.), (Schwenzfeier, Wierenga, &

Gruppen, 2011)

Reactivo de BCA

Preparación del reactivo:

Reactivo A: BCA 1%, Na2CO3 2%, tartrato sódico 0,16%, NaOH 0,4% y NaHCO3 0,95%.

Ajustar a pH 11,25 con NaOH. Echo para 100 mL de agua.

Reactivo B: CuSO4 al 4%.

Reactivo de trabajo (RT): mezclar 100 volúmenes de A con 2 volúmenes de B.

102

La solución es de color verde manzana y es estable por una semana a temperatura ambiente y

protegida de la luz.

Se debe preparar una curva de calibración con diferentes diluciones de un stock de 1mg/mL de

BSA.

Una vez obtenida la curva las muestras se miden así:

Se prepara una solución acuosa de biomasa aproximadamente de 1-5 mg de Biomasa /10mL

de agua. (Ver nota 5 para la adición de SDS)

De esta solución se toman 100 µL y se le adicionan 2 mL del reactivo de trabajo RT.

Se incuba a 60°C por 30 min.

Enfriar la muestra a temperatura ambiente

Medir absorbancia a 562 nm.

Notas:

Los reactivos A y B son estables indefinidamente a temperatura ambiente y protegidos de la

luz.

La sensibilidad del ensayo puede ser incrementada por la incubación de las muestras más

tiempo. Alternativamente, si el color se torna más oscuro, calentar las muestras puede ayudar a

detener esta reacción. Tener cuidado de hacerlo igual para todas las muestras.

Seguido al paso de calentamiento, el desarrollo de color es estable por al menos una hora.

Nótese que como en el ensayo de Lowry, la respuesta del ensayo BCA es dependiente de la

composición de aminoácidos en la proteína y además una concentración absoluta de proteína

no puede ser determinada. La curva estándar BCA puede ser usada solo para comparar

concentraciones de proteína similares en las soluciones.

Algunos reactivos interfieren con el ensayo BCA, pero mucho menos que como en Lowry. La

presencia de lípidos da absorbancias muy altas por lo que se recomienda adicionar

dodecilsulfato de sodio al 2% (SDS) en las muestras.

Cuantificación de carbohidratos por el método fenol-sulfúrico

Este procedimiento se basa en la técnica descrita para la determinación espectrofotométrica de

carbohidratos, mono y polisacáridos (Dubois M, 1956) además del procedimiento descrito por

(Arredondo, 2007) para el análisis de carbohidratos de microalgas.

103

Los métodos clásicos en análisis cuantitativo de carbohidratos están basados en la formación

de productos coloreados al tratar los analitos con ácidos inorgánicos fuertes y la condensación

del producto final furfural con agentes cromogénicos fuertes (usualmente fenol o una amina

aromática).

Diversos procedimientos incluyen la reacción del ácido sulfúrico con fenol, orcinol, cisteína y

antrona. El método de Dubois et al. 1956, fue originalmente descrito como una técnica no

específica para carbohidratos, pero posteriormente fue comparado con el método de la antrona

y con el N-etilcarbazol y se encontró que era el más adecuado para el análisis de

carbohidratos. El método colorimétrico de fenol-ácido sulfúrico (Dubois) involucra el tratamiento

de la solución que contiene los carbohidratos (5- 100 mg/mL) con una solución acuosa de fenol

(5% m/v) y el ácido sulfúrico concentrado: un producto característico de color amarillo es

producido, con una absorción máxima para las hexosas en 490 nm y 480 nm para las

pentosas, deoxi azucares y ácido urónico. Este método es sensible a una amplia variedad de

carbohidratos, incluyendo azúcares, azúcares metilados y polisacáridos acídicos y neutros; es

poco sensible a la interferencia con proteínas y el color producido es muy estable. Su único

inconveniente es la interferencia de las pentosas de los ácidos nucleícos, pero por su gran

simplicidad es el de uso más extendido en las investigaciones con especies microalgales

(Churms, 2005).

El fenol es un alcohol altamente reactivo que reacciona con los azúcares reductores.

Este proceso requiere una gran cantidad de energía, proporcionada por la reacción entre el

ácido sulfúrico y el agua.

El producto resultante es un compuesto amarillo-marrón, con pico de absorción a 485 nm,

longitud a la cual la relación entre la concentración y la intensidad del color es lineal ver

Ilustración 54

104

Ilustración 54. Reaccion de carbohidratos con la solucion de fenol-sulfurico-agua.

Materiales y reactivos empleados:

Vortex

Plancha de calentamiento

Balanza analitica

Agitador orbital

Centrífuga

Horno

Cabina de extracción

Pipeta graduada 1 mL

Pipeta graduada 5 mL

Tubo de vidrio tapa rosca 20 mL

Pipeta pasteur

Tubo de vidrio para centrifuga 20 mL

Espectrofómetro perkinElmer Lambda XLS

Ácido Sulfúrico

Fenol

Agua tipo1 ASTM

HCl

Procedimiento:

Etapa de lisis:

El material debe ser lavado con jabón libre de fosfatos y HCl al 10% v/v (lavar con

abundante agua destilada)

Pesar en un tubo de vidrio tapa rosca 5 mg de muestra de biomasa de microalgas.

Rotular cada uno de los tubos y sus réplicas con la identificación asignada a la muestra

Adicionar con una pipeta graduada de 5 mL, 5 mL de una solución de ácido sulfúrico 1M

(realizar en la cabina de extracción)

Agitar el tubo en vortex durante 1 min

Introducir el tubo en el baño ultrasonido a la máxima potencia durante un ciclo de 20

min (emplear la respectiva protección auditiva).

Retirar el tubo del baño ultrasonido y secarlo

Agitar el tubo en vortex durante 1 min

Cubrir el tubo con papel aluminio

Calentar en un baño termostato durante 60 min a 100ºC (realizar en cabina de

extracción)

Dejar reposar a temperatura ambiente (realizar en cabina de extracción)

Agitar los tubos en vortex durante 1 min

Etapa de extracción:

Centrifugar durante 20 min a 4000 rpm a 4°C en tubos de vidrio para centrifuga de 20

mL.

Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur teniendo la precaución de no redisolver

los restos celulares sedimentados (realizar en cabina de extracción)

105

Medir el volumen de extracto ácido retirado del tubo de centrífuga

Etapa de cuantificación:

Adicionar 1 mL de extracto ácido en un tubo de vidrio tapa rosca con una pipeta de 1

mL (realizar en cabina de extracción).

Adicionar 1 mL de fenol, mezclar en vortex durante 1 min

Dejar reposar la mezcla durante 40 min (realizar en cabina de extracción)

Adicionar 5 mL de ácido sulfúrico concentrado (realizar en cabina de extracción). Esta

reacción es muy fuerte, deben tomarse todas las precauciones del caso.

Agitar en vortex el tubo por 1 min (realizar en cabina de extracción)

Dejar reposar a temperatura ambiente (realizar en cabina de extracción).

Leer en el espectrofotómetro a 485 nm

La lectura del blanco se realiza remplazando el extracto ácido por 1 mL de ácido

sulfúrico 1M

En caso de ser necesario diluir debe tenerse en cuenta este dato en los cálculos finales

Determinar el valor del porcentaje de carbohidratos a través de la siguiente expresión:

% Carbohidratos = {[(m.A485nm)/Vm].Ve}/Ps.100 Ecuación 46.

Dónde:

Ps= Peso de la biomasa (aprox. 5 mg)

Ve= Volumen del extracto ácido

Vm= Volumen de la muestra (1 ml o menos si es necesario diluir)

m= pendiente de la curva de calibración (anexo 1)

A485nm= Absorbancia registrada por la muestra a 485 nm

Cuantificación de clorofila

Esta metodología detalla el procedimiento de análisis en laboratorio para la cuantificación por

espectrofotometría de la Clorofila a, b y c (método tricromático).


Filtros de fibra de vidrio Whatman (GF/F 0.7 µm de diámetro).

Tubos de Centrífuga

Papel aluminio

Acetona 90%

Refrigerador

Macerador de vidrio

Equipo de Ultrasonido

Centrífuga refrigerada

Pipetas de 5, 10 ml

Espectrofotómetro perkinElmer Lambda XLS

106

Para la preparación de acetona al 90% realice la siguiente operación:

C1*V1=C2*V2 Ecuación 47.

Donde,

C1= Concentración de la Acetona pura (grado analítico)

C2= Concentración requerida (90%)

V1= Volumen requerido de la acetona analítica

V2= Volumen a ser preparado

Procedimiento:

Tomar una muestra del cultivo y filtrarla

Los filtros debidamente doblados se colocan dentro de tubos de centrifuga previamente

forrados en papel aluminio, con el fin de evitar la degradación de la clorofila por la

exposición directa a la luz

Agregar 5 ml de acetona al 90% al tubo de ensayo y colóquelo en un equipo ultrasonido

al máximo nivel de intensidad por 1 minuto.

Ajustar el volumen a 10 ml y refrigérelos inmediatamente a 4 ºC por 24 horas.

Centrifugue por 15 min a 4000 rpm.

Proceder a la lectura de las absorbancias a las longitudes de onda de 750, 664, 667 y

630 nm.

Medir cuidadosamente con una pipeta el volumen que queda en el tubo de centrífuga,

sumarlo al volumen usado en la celda de cuarzo y anotarlo como volumen total del

extracto.

Cálculo de los resultados:

Los cálculos para encontrar la cantidad de clorofila-a en mg/m3 se realizan aplicando las

ecuaciones de Jeffrey & Humphrey (1975), que se describen a continuación.

(Ca) Clorofila-a = 11.85*(E664) - 1.54*(E647) - 0.08*(E630). Ecuación 48

(Cb) Clorofila-b = 21.03*(E647) - 5.43*(E664) – 2.66*(E630). Ecuación 49

(Cc) Clorofila-c = 24.52*(E630) - 7.60*(E647) – 1.67*(E664). Ecuación 50

Dónde:

E: Es la absorbancia obtenida a las diferentes longitudes de onda. A cada longitud de onda se

le debe restar la lectura control (750 nm) hace antes de aplicar la ecuación, (664nm-750nm;

647nm-750nm y 630nm-750nm).

Finalmente, después de aplicar las ecuaciones anteriores, la concentración de clorofila a, b o c,

en la muestra, se cuantifica de la siguiente manera:

107

Ecuación 51.

Donde;

Ca es la concentración de Clorofila a ó b ó c

Cuantificación de CO2:

El CO2 de la fase gaseosa se mide con el equipo Extech CO2 datalogger.

Este equipo mide en un rango entre 1-10.000 ppm de CO2 de la fase gaseosa del sistema, con

un record de muestreo de hasta 5000 datos.

Cuantificación de la biomasa seca:

El cálculo de la biomasa seca de un cultivo de microalgas se realiza usando como herramienta

analítica fundamental las curvas de calibración por peso seco de microalgas realizadas

anteriormente. Se debe tener claro que para usar una curva de calibración para calcular la

biomasa seca de un cultivo de microalgas, este debe cumplir las mismas condiciones de

crecimiento del inóculo usado en la realización de la curva de peso seco.

Este procedimiento está basado en el manual de métodos y herramientas analíticas en la

evaluación de la biomasa microalgal (Voltolina, 2007). En este se describe el procedimiento

para realizar el cálculo de la biomasa seca basados en el uso de una curva de calibración por

peso seco para microalgas, además de explicar la importancia de esta herramienta analítica

para realizar un seguimiento a los procesos de cultivo de microalgas.

El crecimiento microbiano se puede determinar de diferentes formas entre las que se incluye el

recuento celular en cámara o en placa, la densidad óptica, la estimación de biomasa en peso

seco y en el caso específico de las microalgas la cuantificación de la clorofila (Becker, 1994).

Estas técnicas indican crecimiento celular y desarrollo de un cultivo pero si hablamos en

términos de productividad la técnica de estimación de la biomasa por peso seco es la que

brinda datos más reales, ya que por ejemplo el recuento celular en cámara es una técnica

usada para indicar concentración celular pero no indica cantidad celular en masa que es el dato

que al final se usa para evaluar la productividad y redimiendo de un proceso o un cultivo. El

recuento en cámara tiene la ventaja que permite evaluar las condiciones en las que se

encuentra el cultivo (contaminación, inhibición etc.) pero tiene la desventaja de no poder ser

reproducible ya que los errores adicionados en cada conteo se suman, el muestreo, la dilución,

el llenado de la cámara y el rango de concentración celular. La cuantificación por absorbancia

directa del cultivo tiene la ventaja de ser una técnica rápida, pero la desventaja de ser

imprecisa ya que la absorbancia está basada en la clorofila y todos los cultivos no tienen la

108

misma concentración siempre, un cultivo con menos luz es un cultivo con alta concentración de

clorofila pero la misma concentración celular por tanto tampoco es reproducible. Determinar la

cantidad de biomasa en peso seco de un cultivo es una técnica que permite al evaluador

establecer que bajo determinadas condiciones nutricionales y ambientales (componentes de

medio de cultivo, luz, agitación, aireación, temperatura, pH etc.) el microorganismo se

desarrolla de una forma específica y que esta representa en términos de peso equis cantidad

de biomasa, dándole una herramienta importante en la evaluación de condiciones o variables

en el proceso de optimización de un cultivo.

La evaluación de biomasa en peso establece como resultado la cantidad en gramos que tiene

un cultivo celular de determinada edad y con determinadas condiciones y por esto es necesario

realizar la calibración de la curva cada vez que las condiciones anteriormente mencionadas

cambien de manera incidente sobre el crecimiento del microorganismo.


Espectrofotómetro y celdas.

Solución salina al 0.85%

Viales muestreadores.

Papel absorbente

Procedimiento:

Teniendo en cuenta lo aclarado en el alcance, que el cultivo debe cumplir con las mismas

condiciones de cultivo y obviamente ser la misma cepa de microalga, el cálculo de la biomasa

seca es una medición simple y muy fácil de realizar.

Lo primero que se debe hacer es homogenizar muy bien el cultivo a evaluar. Seguidamente

procedemos a tomar la muestra de cultivo en un vial muestreador (5mL aproximadamente). Si

se sospecha o se conoce de sustancias o partículas suspendidas que interfieran con la

medición se procede a lavar la muestra con solución salina. La muestra se procede a leer en el

espectrofotómetro a 675nm.

Este dato obtenido de absorbancia va a ser remplazado posteriormente en la formula obtenida

en la curva de calibración por peso seco.

Cuantificación del crecimiento por recuento en cámara de Neubauer

El crecimiento de un cultivo de microalgas se expresa como el incremento de biomasa ya sea

en forma de número de células (cel/mL), o en peso seco, cantidad de proteína, de pigmentos

109

etc. Este incremento puede ser estimado por diferentes métodos, entre los cuales los más

utilizados en los laboratorios son el recuento celular a través de microscopio o mediante

contadores de partículas (aunque estos son generalmente costosos), determinación del cambio

de densidad óptica del cultivo o por cuantificación de biomasa seca. De estos, el recuento

celular es el más utilizado por ser un método sencillo y poco costoso, el cual permite además

un mejor seguimiento del cultivo mediante su inspección visual. La correspondencia entre la

concentración celular y la información proporcionada por otros métodos no es constante, ya

que éstos dependen del estado fisiológico de las células, de la fase de crecimiento y de las

condiciones ambientales a las cuales está sometido el cultivo (Voltolina, 2007).

Para obtener resultados confiables se recomienda aplicar algunos métodos simultáneamente

incluyendo observaciones microscópicas cualitativas para evitar errores debido a la

contaminación de los cultivos.


Cámara de Neubauer

Micropipeta de 10-10 microlitros

Microscopio

Puntas para micropipeta

Procedimiento:

A continuación se describen las actividades para recuento de microalgas en cámara de

Neubauer.

Una de las dificultades para el recuento al microscopio es obtener una buena reproducibilidad,

por lo cual es importante seleccionar un adecuado tamaño de muestra, dilución, tipo de cámara

de recuento, objetivo del microscopio y técnica de llenado de la cámara.

Para microalgas de mayores dimensiones como muchos dinoflagelados, los tipos de cámara

que se usan comúnmente son la Sedwick-Rafter con regilla de Fuchs-Rosenthal.

En este procedimiento se establecen las condiciones para en cámara de Neubauer la cual tiene

0.1 mm de profundidad, consta de 9 cuadros con lados de 1 mm (área total de recuento 0.9

mm2), cada uno de los cuales corresponde a un volumen de 0.1 microlitro. Los cuatro extremos

están subdivididos en 16 cuadros pequeños. El cuadro central contiene 25 cuadros, cada uno

con un área de 0.04 mm2, a su vez divididos en 16 cuadros más pequeños ver Ilustración 55.

Para células más grandes de 6 micras, y con cultivos relativamente poco concentrados, se

aconseja que el recuento se haga en los cuatro cuadros marcados como L.

110

Ilustración 55. Esquema de la cámara de Neubauer.

Cuando las células son pequeñas y la concentración del cultivo es alta, es preferible usar 5

cuadros menores del cuadro central marcado como X.

Agitar el cultivo para permitir homogeneidad de la muestra.

Tomar una muestra de 1 mL y colocarla en un tubo previamente lavado y seco.

Si la muestra está muy concentrada realizar diluciones en serie hasta alcanzar una

adecuada concentración para contar en la cámara

Agitar la alícuota y tomar 10 micro litros de muestra

Montar en la cámara de Neubauer en una celda

Realizar el mismo procedimiento para la otra celda de la cámara.

Montar al microscopio y contar en 10x.

Realizar el recuento y anotar los datos en la bitácora.

Cálculos:

Si se contaron todas las células presentes en los 4 cuadros de 1 mm2 marcados como L, la

concentración celular se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula:

C:N*104*dil. Ecuación 52

Dónde:

C= células/mL

N= Promedio de células presentes en los cuatro cuadros (1mm2)

dil = Factor de dilución. (Cuando se consideró necesario).

104= Factor de conversión de 0,1 GL a 1 mL

111

Si la células se cuentan en el cuadro central (25 cuadros) considerando solo los 5 cuadros

menores del cuadro marcado con X, la fórmula para calcular la concentración celular es la

siguiente:

C: {(N/ (4*10-6))}*dil Ecuación 53

Donde:

C: cel. /mL

N: promedio de células presentes en los 5 cuadros del cuadro central.

dil = Factor de dilución. (Cuando se consideró necesario).

Cuantificación de CO2:

Fase gaseosa:

El CO2 en la fase gaseosa es determinado mediante el equipo Extech detector air quality CO2

datalogger (CO210) de la compañía Flir. Este instrumento tiene un rango de medición de 1-

10000 ppm de CO2 en la fase gaseosa y una memoria de muestreo de 5000 datos. El principio

de monitoreo depende de la técnica de absorción en el infrarojo cercano no dispersivo.

Fase líquida:

Teniendo en cuenta que el CO2 en la fase gaseosa se disuelve originando diversas especies

que están en función del pH, la concentración de CO2 disuelto en la fase líquido es

determinando utilizando los datos de la fase gaseosa y aplicando la ley de Henry como se

muestra a continuación:

CO2 + H2O CO2ac +H2O Ecuación 54

CO2ac +H2O H2CO3 Ecuación 55

H2CO3 H+ + HCO3- Ecuación 56

HCO3- H+ + CO3

-2 Ecuación 57

Según la ley de Henry:

Xa= Pa / H Ecuación 58

Dónde:

Xa: fracción molar del compuesto a

Pa: presión parcial del compuesto a

H: constante de Henrry

112

Así, se puede calcular la concentración de CO2 disuelto en el agua de la siguiente forma:

[CO2ac]=Xa * H Ecuación 59

1 1 − − Ecuación 60

Dónde:

Ka1: constante ácida para el H2CO2

Ka2: constante ácida para el HCO3 -

8.2. Abreviaciones de compuestos

Abreviación Compuesto

13DPG 1,3-difosfoglicerato FADH2 Flavin adenin dinucleotido reducido

2-oxobutan 2-oxobutanoato FORM Ácido Formico

2PG 2-fosfoglicerato FUM Fumarato

3PG 3-fosfoglicreato G1P Glucosa 1-fosfato

5FTHF 5-Formil-THF G6P Glucosa 6-fosfato

6PG 6-fosfogluconato GAP Gliceraldehido 3-fosfate

AcACP Acetil-ACP GDP Guanosina difosfato

AcCOA Acetil-CoA GLN Glutamino

Ace Acetato GLU Glutamato

ACP Acetil-transportador GLY Glicina

Ad Adenosina GLYC Glicerol

AdHCYS S-Adenosil-L-homocisteina GLYC3P Glicerol 3-phosphate

AdMET S-Adenosil-L-metionina Glycerate Glicerato

ADP Adenosina difosfato GLYC_ex Glicerol (extracelular)

AICAR 5-Aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleina glyoxylate Glioxilato

AKG 2-Oxoglutarato (alfa-ketoglutarato) GMP Guanosina monofosfato

ALA Alanina GTP Guanosina trifosfato

AMP Adenosina monofosfato H[+] Protón

ANTH Antranilato H[+]_ex Proton (extracelular)

APS Adenilil sulfato H2O agua

ARG Arginina H2O2 Hidrógeno peróxido

ASA L-Aspártico semialdehido H2O_ex agua (extracelular)

ASN Asparagina H2S Sulfuro de hidrógeno

ASP Aspartato HCYS Homocisteina

ATP Adenosina trifosfato HIS Histidina

Biomass Biomasa HSER Homoserina

113

Biomass_ex Biomasa (g) HydPro Hidroxiprolina

C12:0ACP Dodecanoil-ACP (ácido Laurico) HydPyr 3-Hidroxipiruvato

C14:0ACP Tetradecanoil-ACP (ácido Miristico) ILE Isoleucina

C16:0ACP Hexadecanoil-ACP (ácido Palmitico) IMP Inosina monofosfato

C16:1ACP Trans-Hexadeca-2-enoil-ACP (ácido

Palmitoleico)

LEU Leucina

C16:2ACP Ácido Hexadecadienoico Light Fotones

C16:3ACP Ácido Hexadecatrienoico Light_ex Fotones (extracelular)

C18:0ACP Octadecanoil-ACP (ácido estearico) LYS Lisina

C18:1ACP Cis-11-ocadecanoate-ACP (ácido Oleico) MAL Malato

C18:2ACP Ácido Linoleico MalCoA Malonil-CoA

C18:3ACP Acido Alfa-linoleico MET Metionina

CaP Carbamoil fosfato METHF 5,10-Methileo-THF

CARB Carbohidrato Mg2[+] Magnesio

CDP Citidin difosfate Mg2[+]_ex Magnesio (extracelular)

Chlorophyll Clorofila MTHF Methil-THF

CHO Corismato MYLTHF 5,10-Methenil-THF

CIT Citrato N10FTHF 10-Formil-THF

CO2 Carbón dioxido NAD Nicotinamida oxidizado

CO2_ex Carbón dioxido (extracelular) NADH Nicotinamida reducido

CoA Coenzima A NADP Nicotinamidafosfato oxidizado

CTP Citidin trifosfato NADPH Nicotinamidafosfato reducido

CYS Cisteina NH4[+] Amonio

DAP Diaminopimelato NH4[+]_ex Amonio (extracelular)

dATP Deoxi ATP NO2 Nitrito

dCTP Deoxi CTP NO3 Nitrato

dGTP Deoxi GTP NO3_ex Nitrato (extracelular)

DHA Dihidroxiacetona (Glicerona) O2 Oxígeno

DHAP Dihidroxiacetona-P O2_ex Oxígeno (extracelular)

DHF Dihidrofolato OXA Oxaloacetato

DNA Ácido Deoxiribonucleico

dTTP Deoxi TTP PEP Fosfoenolpiruvato

E4P Eritrosa 4-phosphate PHE Fenilalanina

F16P Fructoae 1,6-bifosfato Phytyl-PP Fitil-difosfato

F6P Fructosa 6-fosfate Pi Ortofosfate

FAD Flavin adenina dinucleotido oxidizado Pi_ex Ortofofate (extracelular)

PPi Pirfosfato SO4_ex Sulfato (extracelular)

PPorphyrin Protoporfirina STARCH Almidón

PRE Prefanato STARCH_ex Almidón (extracelular)

PRO Prolina SUC Succinato

PROTEIN Proteina SUCCoA Succinil Coenzima A

PRPP Fosforibosilpirofosfato THF Tetrahidrofolato

114

PYR Piruvato THR Treonina

R5P Ribosa 5-fosfato TRYP Triptofano

RNA Ácido Ribonucleico TYR Tirosine

Ru15DP Ribulosa 1,5-bisfosfato UDP Uridin difosfato

RU5P Ribulosa 5-fosfato UMP Uridin monofosfato

S7P Sedoheptulosa 7-fosfate UTP Uridin trifosfato

SER Serina VAL Valina

SO3 Sulfito X5P Xilulosa 5-fosfato

SO4 Sulfato

115

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