Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores.

Iniciación de la replicación

en eucariotas:

iniciadores y replicadores

¿cuál es la molécula iniciadora?

ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex

Stephen P. Bell & Bruce Stillman

Cold Spring Harbor Laboratory

Nature, 357 (1992), 128

¿Qué pasa en eucariotas superiores?

Donde se relata como sapos y

moscas precipitan el derrumbe...

Experimentos de Harland and Laskey

•Cualquier pedazo de DNA humano de un

tamaño suficiente confiere a un plásmido la

habilidad para ser replicado.

• En estos casos la replicación comienza en

sitios localizados al azar, no sólo en la

porción de DNA humano sino en la secuencia

del plásmido bacteriano.

•Estos resultados sugieren que no se

requeriría una secuencia consenso para

iniciar la replicación en células de

mamíferos.

Estructura del gen de la beta globina

Clonado de diferentes regiones del gen beta globina

en un vector de expresión que contiene promotores

para la RNA polimerasas de fagos T7 y T3

Preparación de sondas complementarias a

las cadenas (+) o (-) de diferentes

regiones del gen de beta globina.

Se obtienen a partir de la transcripción in

vitro de los clones con diferentes regiones

del gen de beta globina

Células

permeabilizadas+BrdU+emetina

Extracción DNA

Fragmentación (500 pb)

Gradiente de CsCl

DNA híbrido

Separación por anti-BrdU

Blotting en filtros

Hibridización con sondas (+) y (-)

Células de pacientes con hemoglobina Lepore

Conserved Initiator Proteins in EukaryotesKimberley A. Gavin, Masumi Hidaka,  Bruce Stillman Science, Vol 270, Issue 5242, 1667-1671 8 December 1995

The origin recognition complex (ORC), a multisubunit protein identified in Saccharomyces cerevisiae, binds to chromosomal replicators and is required for the initiation of cellular DNA replication. Complementary DNAs (cDNAs) encoding proteins related to the two largest subunits of ORC were cloned from various eukaryotes. The cDNAs encoding proteins related to S. cerevisiae Orc1p were cloned from the budding yeast Kluyveromyces lactis, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe,and human cells. These proteins show similarity to regulators of the S and M phases of the cell cycle. Genetic analysis of orc1+ from S. pombe reveals that it is essential for cell viability. The cDNAs encoding proteins related to S. cerevisiae Orc2p were cloned from Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, and human cells. The

human ORC-related proteins interact in vivo to form a complex. These studies suggest that ORC subunits are conserved and that the role of ORC is a general feature of eukaryotic DNA replication.

Paradoja de la especificidad del replicador (ORC)

Mecanismos que determinan la unión específica de ORC...

o posibles respuestas a la paradoja

•Distintos tipos de ORC

•Concentración de ORC

•Actividad transcripcional

•Metilación del DNA y acetilación de histonas

•Intervención de otras proteínas

Preguntas con respuestas pendientes en el área de la replicación

• ¿Existen orígenes de replicación definidos en eucariotas?

• ¿Cómo se logra la especificidad de la proteína iniciadora ORC?

La replicación del DNA y el ciclo celular

Otra pregunta con respuesta abierta:

¿Cómo se regula la actividad de los

orígenes de replicación de modo de

obtener una sóla replicación por ciclo

celular?

“Once, and only once”

Experimentos de fusión celular

•Entender la naturaleza del estado competente (G1)

•Cual es la naturaleza del activador de S

•Caracterizar el estado de incompetencia (G2)

•Caracterizar el desbloqueo y regreso a la competencia

Letters to NatureNature 430, 913-917 (19 August 2004) | doi: 10.1038/nature02813

Structural basis for inhibition of the replication licensing factor Cdt1 by geminin

Changwook Lee1, BumSoo Hong1,5, Jung Min Choi1,5, Yugene Kim1, Saori Watanabe2, Yukio Ishimi3, Takemi Enomoto2, Shusuke Tada2, Youngchang Kim4 and Yunje Cho1