Immunizálás. Immunizálás. Poliklonális és monoklonális Poliklonális és monoklonális ellenanyag el ellenanyag el őá őá llítása, hybridoma llítása, hybridoma technika. Ellenanyag termelés technika. Ellenanyag termelés (fermentáció), tisztítás, jelölés, (fermentáció), tisztítás, jelölés, felhasználási lehet felhasználási lehet ő ő ségek. ségek. Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Immunológiai és Biotechnológiai Intézet PTE KK PTE KK
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Immunizálás.Immunizálás.Poliklonális és monoklonálisPoliklonális és monoklonális
Immunológiai és Biotechnológiai IntézetImmunológiai és Biotechnológiai IntézetPTE KKPTE KK
IgGIdiotípus
Antitestek szerkezete
Az antitest és az epitóp (antigéndetermináns)
Az antitest és az epitóp (antigéndetermináns)
Az antigéndeterminánsok tulajdonságai
A komplex antigén poliklonális immunválaszt váltki, ami eltérő specificitású ellenanyagok
termelődéséhez vezet
Monoklonális ellenanyag:• azonos specificitású ellenanyag molekulák,• egyetlen B-sejtből származó sejtvonal (sejtklón) termeli• egyetlen epitóp felismerésére képesek
Poliklonális ellenanyag:• több, eltérő specificitású ellenanyag keveréke,• több B-sejt klón termékei• egy adott antigén eltérő epitópjait ismerik fel.
Y Y
Y
Ag
Y YY
Ag
Immunizálás
Megfelelő állat kiválasztása:• Monoklonális antitest – egér v. patkány• Poliklonális antitest – nyúl, birka, kecske
Antigén:• haptén (5-10 kD >) – carrier• natív v. módosított molekulák, sejtek• beadás: musculárisan, subcután vagy
intracután
Immunizálás
Adjuvánsok: lassítják az antigén felszívódását és azimmunrendszer nem specifikus stimulációja (makrofágaktiváció) révén fokozzák az ellenanyag termelést.
Lehetővé teszi kezdetben korlátozott osztódásiképességű, de specifikus immunológiaitulajdonsággal rendelkező sejt korlátlan ideig valóin vitro fenntartását.
A módszer alapja, hogy aktivált immunsejteket invitro B-sejt/plazmasejt eredetű tumorsejtekkelfúzionáltatunk.
2. Szelekció: a megfelelő hibridsejtek kiválasztása
• Sp-2 sejtekből hiányzik a HGPRT- és a TK-enzim (purin- éspirimidinszintézis), a lépsejtek rendelkeznek velük, ígyszelektív tenyésztőmédiumban (HAT) a lépsejt-Sp2 hibridekkiválaszthatók
Nukleotid szintézis útjai
Megfelelő antitest-termelő hibrid kultúrák kiválasztása• Tesztelés ELISA-val
• Klónozás:az antitesttermelő sejtek higítása(96 lyukú lemez minden lyukába átlagosan 1 sejt jusson)
Ismételt ellenanyag-tesztelés
Hybridóma-technika III.
Monoklón
4. Antitest előállítás nagy mennyiségben:(1) felülúszó termeltetése hybridoma-sejtekkel in vitro;(2) hybridoma-sejtek beadása ip. egérbe (ascites);(3) fermentor (műegér).
Az enzim szubsztrátot alakít át,amely általában színreakcióval jár.
HRPO,ALP
Immunhisztokémiai metszetek
Fluoreszcens festék konjugátumok
FITC,PE
Immunfluoreszcens festés
PE
FITC
FITC
Áramlási citometria
Toxin konjugátumok
Ricin
A célsejt felületéhez kötődő Ig-hoztoxint (pl. ricint) konjugálhatunk,amely célsejt által internalizált Ig-alegyütt a sejt citoplazmájába jut. Ittleválik az Ig-ról és kifejti toxikushatását (pl. megállítja a sejtfehérjeszintézisét).
Radioizotóp konjugátumok
• γ sugárzók, alacsony dózisban Diagnosztikum – radioaktív imagining Tumorok és mikrometasztázisok
felkutatása, amelyeket más módszerrelnem lehet kimutatni
• α, β sugárzók magas dózisban Terapeutikum – tumorok kezelése
Bispecifikus antitestek
TUMOR
Effektor sejt• NK sejtek• Tc sejtek• Makrofágok
A bispecifikus antitesteket két különböző Ig Fabfragmentumának proteolízisével majd a kétkülönböző fragmentum kémiai keresztkötésévelnyerik.
Antigénként jól használható effektor sejt molekulák:• CD3 T sejtek• CD64 (FcγR1) nagy affinitású FcγR; Mφ • CD89 FcαR; Mφ , granulociták
Tumor specifikussejtfelszíni molekula ellen
FDA által bejegyzett terápiás monoklonális antitestekTermék neve Specificitása Típusa Alkalmazási terület Év