1 IMMUNHISZTOKÉMIAI MÓDSZEREK Klinikai Kutató MSc Képzés Debrecen, 2013. 03. 20. Dr. Csonka Tamás DEOEC Pathologiai Intézet Definíciók Immunkémia Immunhisztokémia Immunciokémia Immunfluoreszcencia Epitóp paratóp Elsődleges antitest Másodlagos antitest Jelölő rendszerek Kettős jelölés Immunhisztokémiai reakció kivitelezése Preanalitikai Rögzítés módja, időtartama Szövettípus, mérete Antigénfeltárás hatékonysága, eszköze módja Analitikai Reagens minősége, affinitása Jelző/előhívó rendszer Reagens hígitása Inkubációs idő, hőmérséklet Postanalitikai Kontrollok +/- Reakció értékelése, értelmezése Fixálás Keresztkötő – pl. formalin, glutáraldehid Amino, imino, amid, karboxil csoport kovalens keresztkötése Fehérje térszerkezet torzul, epitophoz nem lehet hozzáférni Koagulációs – aceton, metanol Víz helyetesítéssel denaturlája a fehérjét Kevésbé gátol, de a struktúra jobban károsodik Kettő keveréke – pikrinsavas-ecetsavas formalin Aldehid rezisztens Antigén Mérettől függő 4-16 óra 4%-os formaldehidben Paraffin vagy epoxi gyantába ágyazás „Metszetragasztás” APES (3-aminopropil- trietoxiszilán) 2%-os acetonos oldata (2h 56 0 C szárítás) Aldehid érzékeny Antigén Acetonos rögzítés (enyhe koagulációs) Friss-fagyasztott Sejt/szövettenyészet Aspirációs citológia Vérkenet Előnye hogy a lipidek egy részét kioldja => javítja a reagensek penetrációját Hátránya alaposan a tárgylemezre kell szárítani a mintát (2h vagy overnight szobahő); minden lépés <30p
6
Embed
Immunhisztokémia MÓDSZEREK Immunciokémia …crc.med.unideb.hu/wp-content/uploads/2013/10/KLK_18_2014.pdf · 3 Antigén feltárás Optimalizálni kell a hőmérsékletet, az időt,
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Előnye hogy a lipidek egy részét kioldja => javítja a reagensek penetrációját
Hátránya alaposan a tárgylemezre kell szárítani a mintát (2h vagy overnight szobahő); minden lépés <30p
2
Pre-analitikai szakasz hibái
1. Fixálás: módja, időtartama, szövet típusa, mérete Túl rövid fixálás neutrális pufferelt formalinban (NPF)ban Elkésett fixálás Más fixálószer alkalmazása, nem NPF Túl hosszú fixálás NPF oldatban nem probléma!
2. Megfelelő dekalcinálás: Agresszív dekalcinálás
3. Megfelelő víztelenítés 4. Metszetkészítés:
Metszési hibák, szétterített, szétfőzött metszet
Elkésett, vagy túl rövid fixálás következményei:
Antigén veszteség Növekvő háttérreakció Kockázat: bizonytalan immunreakció Gyenge a metszetek tapadása a lemezhez Standard feltárással tovább károsodik a morfológia Kockázat: paraffinblokkban is antigénveszteség tapasztalható
Dekalcinálás hatása az immunhisztokémiára
Erős savak: gyors dekalcinálás-10% HCL - IHC+ Gyenge savak: közepes -10% Formic acid- IHC++ Kálcium kelát: lassú dekalcinálás -5 - 10% EDTA-IHC+++
Metszetek vastagsága, szárítása, és annak hatása
3 - 4 um metszeteket készítünk UltraPlus lemezekre metszetek szárítása 1-2 óra 60°C-on, vagy száríthatjuk 37 °C-
on éjszakán át, majd 1 óra 60°C-on Ha a metszet tapadásával probléma van akkor 16 óra 60°C -on
elfogadható, de néhány antigén kimutathatósága csökken: OR, PR, Ki67, HMB45, Melan-A, S100 poly
Antigén feltárás
Csak formalinos fixációnál
Kevert fixálásnál rövidebb ideig
HIER - Mechanizmusa pontosan nem ismert – feltehetően enyhe de általános hidrolízis
Proteáz emésztésnél – specifikus és erőteljes peptid-kötés hasítása
Deparrafinál, hidratál, és antigén feltáró hatással is bír.
Blokkolás
Endogén peroxidáz Metanolos 0,5% H2O2, 20-30perc
Deparaffinálás után
Szöveti Fc receptor, pozitív töltésű szöveti molekulák, szabad aldehid csoportok, hidrofób csoportok Nagy koncentrációjú indiferens fehérje, pl.: 1-5% BSA, FCS, más állati
szérum, sovány tejpor
Szöveti biotin (ABC módszernél; vese, máj, GIT) Biotin mentes módszer
Direkt módszer Indirekt módszer Enzim-immunkomplex módszer (PAP) Avidin-biotin enzimkomplex módszer (ABC, S-ABC) Enzimmel jelölt avidin módszer EPOS módszer EnVision módszer
Streptavidin-biotin-peroxidáz komplex
Bitoin: 244Da, H-vitamin
Streptavidin: 60kDa, neutrális izoelektromos pont, 4 biotint köt meg
Inkubációs lépések:
1 primer antitest
2 biotinnal jelölt antitest
3 S-ABC komplex (1:3 arány strepatividin:biotinált-peroxidáz)
Antitesthez kapcsolt számtalan biotin, peroxidáz-biotinja révén még több kötés
Biotinnal jelölt anti-egér és anti-nyúl keverék
Lehet anti-kecske, anti- tengerimalac, anti-patkány
antitest Egy antitest kötődése nagyszámú enzimet köt Van peroxidáz és alkalikus foszfatáz jelölt formája Lehet anti-egér+anti-nyúl Ig egyáránt rajta EPOS – ha a dextrán lánchoz a primer antitest