Identificando a programação genética da célula através do uso dos microchips de DNA Ana Carolina Deckmann Laboratório de Genômica e Expressão Depto. Genética e Evolução - Instituto de Biologia - Unicamp Minicurso “Da Genômica à Minicurso “Da Genômica à Biotecnologia” - IV Semana de Química/ Biotecnologia” - IV Semana de Química/ 2004 2004
59
Embed
Identificando a programação genética da célula através do uso dos microchips de DNA Ana Carolina Deckmann Laboratório de Genômica e Expressão Depto. Genética.
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Identificando a programação genética da célula através do
uso dos microchips de DNA
Ana Carolina DeckmannLaboratório de Genômica e Expressão
Depto. Genética e Evolução - Instituto de Biologia - Unicamp
Minicurso “Da Genômica à Biotecnologia” - Minicurso “Da Genômica à Biotecnologia” - IV Semana de Química/ 2004IV Semana de Química/ 2004
Projetos Genoma: o que nos dizem?
• Projetos Genoma: deciframento das sequências de DNA, sua organização e estrutura.
• Ao decifrar um genoma, resta a dúvida: se todas as células de um organismo carregam o mesmo genoma, O QUE as torna diferentes umas das outras???
Estudos funcionais
Introdução aos chips de Introdução aos chips de DNADNA
• Os chips de DNA fornecem um método conveniente para explorar o genoma em um nível molecular.
• Análise de milhares de informações genéticas em um único experimento.
• A utilização desta técnica suporta muitas possibilidades e novas aplicações surgem diariamente.
Os Biochips e sua importância
Atualmente, as principais aplicações são:
• Genômica funcional (um genoma)
• Genômica comparativa (vários genomas)
• Genotipagem (SNPs)
• Estudo da cromatina (ChIP-ON-CHIP)
Os Biochips e sua importância
Fundamentos teóricosFundamentos teóricos
•PROPRIEDADE 1) a estrutura em dupla hélice é mantida unida pela complementariedade entre as bases nucleotídicas.
Fundamentos Teóricos
Fundamentos Teóricos
• Consequência: hibridização
DNA fita dupla
DNA desnaturado
hibridização
• PROPRIEDADE 2) a produção de proteínas depende de etapas intermediárias em que o DNA é transcrito em moléculas de RNAm COMPLEMENTARES à sequência do gene!
Fundamentos Teóricos
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
• Consequência: a função gênica pode ser estudada através das etapas de transcrição!
• COMO?
• Medindo quantos híbridos se formam entre DNA e mRNA, e assim quantificando a expressão gênica numa situação de interesse, p.ex., câncer!
• COMO QUANTIFICAR A FORMAÇÃO DE HÍBRIDOS?
Fundamentos Teóricos
transcrição reversa na presença de bases marcadas
CGATTAGC
cDNA marcado
genoma
gene A
transcrição
expressão do gene A
DNACGATTAGC
RNAmGCUAAUCG
transcrição reversa
cDNACGATTAGC
tradução
Proteína A
Fundamentos Teóricos
célula
• DNA marcado por radioatividade
Estudos clássicos de expressão gênica (caso a caso). Ex: Northern blotting.
Fundamentos Teóricos
1) isolar as mensagens produzidas em uma célula (mRNA) e imobilizá-las em um suporte sólido.
2) marcar a sequência do gene de interesse durante a reação de polimerização.
3) Hibridizar!
C 1h 3h 6h 12h 48h
Gene -MHC
rRNA 28S
rRNA 18S
Northern blotting
Fundamentos Teóricos
1) isolar um grande número de genes (BIBLIOTECA DE cDNA) e organizá-los lado a lado em um suporte sólido.
2) marcar as mensagens produzidas em uma célula com radioatividade ou fluorescência durante a reação de transcrição reversa.
3) Hibridizar!
Fundamentos Teóricos
• DNA marcado por fluorescência: macro- e microarrays
Chip Cp Chip Rn
Fundamentos Teóricos
Fabricação dos biochips Fabricação dos biochips de DNAde DNA
BIBLIOTECA DE cDNA
Placas 384 fita molde
fita molde
produtos
X ciclos
AMPLIFICAÇÃO
Eletroforese dos insertos da biblioteca de cDNA de coração de rato.
intensidade Cy5 intensidade Cy3 = razão de expressão
Razão > 1(gene induzido Cy5)
Razão = 1 Razão < 1(gene induzido Cy3)
Geração de dados de Expressão Gênica
Data miningData mining
• Ao considerar cada um dos n chips produzidos como uma das n observações para um dado gene, é possível aplicar técnicas de análise multivariada para extrair significados biológicos dos experimentos de microarranjos de DNA.
• Clustering algorithms: reconhecer padrões nas distribuições de dados, normalmente através de métricas de distância.
• A representação gráfica assume a forma de uma curva normal. • A transformação logarítmica permite representar repressões e induções de igual magnitude como valores numericamente iguais mas de sinais diferentes.•Eisen e col. (1998): LOG positivo = vermelho (gene induzido) LOG negativo = verde (gene reprimido)
• Após o cálculo da distância, o ponto de partida dos algoritmos de clustering é gerar uma matriz de distância.
• Os elementos da matriz são distâncias entre pares (pairwise distance).
Aplicações
Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.
PNAS, 95 (1998)
Michael B. Eisen, Paul T. Spellman, Patrick O. Brown, and David Botstein
The Transcriptional Program of Sporulation
in Budding Yeast
Science, 282 (1998)
S. Chu, J. DeRisi, M. Eisen, J. Mulholland, D. Botstein, P. O. Brown, I. Herskowitz
Aplicações
Molecular Classification of
Cancer: Class Discovery and Class Prediction by Gene
Expression Monitoring.
Science, 286 (1999)
T. R. Golub, D. K. Slonim, P. Tamayo, et al.
Aplicações
Biochips de Biochips de oligonucleotídeosoligonucleotídeos
• Principais áreas em que a aplicação dos chips de oligonucleotídeos podem acelerar os estudos em genômica:
•Expressão gênica
•Genotipagem
•Mapeamento de bibliotecas genômicas
Biochips de Oligonucleotídeos
Técnica de microimpressão: Técnica de microimpressão: FOTOLITOGRAFIAFOTOLITOGRAFIA
• Esta técnica de fabricação in situ foi desenvolvida pela empresa americana Affymetrix, que utiliza para fabricar os GeneChips.
Biochips de Oligonucleotídeos
Biochips de Oligonucleotídeos
Biochips de Oligonucleotídeos
Biochips de Oligonucleotídeos
• Diferenciais:
1) alta densidade permite representação de genomas completos.
2) refinamento da técnica de microimpressão permite criar mutações (mismatchs) de sequências conhecidas.
3) quantificações mais precisas/ alta sensibilidade.
Biochips de Oligonucleotídeos
Biochips de Oligonucleotídeos
Extração DNA
cromossômico
Gene A
Amplificação por PCR na presença de fluoróforo
Cópias marcadas do
gene AHibridização com chip de
oligos
Biochips de Oligonucleotídeos
Gene A
MISMATCH SINALMISMATCH SINAL1A 1A C G G T A C T C G G T A C T aa G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T gg G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T cc G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T tt G A G G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T T aa A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T T gg A G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T T cc A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T T tt A G A G G C T A G C T A 1 1 + +
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G T G aa G G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G T G gg G G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G T G cc G G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G T G tt G G G C T A G C T A 1 1 + +
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A aa G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A gg G C T A G C T A 0 0 ++ ++1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A cc G C T AG C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A tt G C T A G C T A 1 1 + +
Padrão normalPadrão afetado
1 2 3 4
AGCT
Pessoa 1: normal
Biochips de Oligonucleotídeos
Gene A
MISMATCH SINALMISMATCH SINAL1A 1A C G G T A C T C G G T A C T aa G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T gg G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T cc G A G G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1T 1T C G G T A C T C G G T A C T tt G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T T aa A G A G G C T A G C T A 2 2 - -1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T T gg A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T T cc A G A G G C T A G C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T T tt A G A G G C T A G C T A 2 2 - -
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G T G aa G G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G T G gg G G G C T A G C T A 2 2 - -1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G T G cc G G G C T A G C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G T G tt G G G C T A G C T A 2 2 - -
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A aa G C T A G C T A 2 2 - -1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A gg G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A cc G C T AG C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A tt G C T A G C T A 2 2 - -
• Normalmente, nos biochips estão representadas as partes codificantes do genoma (ESTs, cDNAs).
Chromatin Imunnoprecipitation microarrays
• Objetivo: identificar no DNA genômico os sítios de ligação a TFs, histonas e polimerases.
• Biochips de oligonucleotídeos longos (60 pb) de ORFs e regiões intergênicas.• Representação de genomas completos (~40Mb)• Sondas: DNA imunoprecipitado x controle (precipitação sem anticorpo)
Maior sinalconfirmação
da especificidade
da ligação!
mais fragmentos do DNA
correpondente ligados nas proteína de interesse
Chromatin Imunnoprecipitation microarrays
(~1kb)(~1kb)
Projetos em andamento
LGE
Estudo do perfil da expressão gênicaglobal em leucemias linfóides agudas de
linhagens de células B e T
Aluna : Diana Azevedo QueirozOrientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira
Laboratório de Genômica e Expressão – Departamento de Genética e Evolução – Instituto de Biologia - Unicamp
Dissertação de Mestrado em Biologia Funcional e Molecular
Análise do Perfi l de ExpressãoGênica de Mediadores
I nflamatórios em CélulasMononucleares de Pacientes
OrientadoraOrientadora: J oyce Maria: J oyce Maria Annichino Annichino--BizzachiBizzachi
HEMOCENTRO
UNICAMP
ESTUDO DA EXPRESSAO GENICAGLOBAL ENVOLVIDA NA PROTECAO
CARDIACA INDUZIDA PORPRECONDICIONAMENTO
ISQUEMICO E PORCOMPOSTOS QUINAZOLINICOS
Aluna : Ana Carolina Deckmann *Orientador: Prof. Dr. Kleber Gomes Franchini
* Laboratório de Genômica e Expressão – Departamento de Genética e Evolução – IB/ Unicamp Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Ciências Médicas – Unicamp;
LGE
LGE
GeneProjects - interface microarrays
GeneProjects - interface microarrays
GeneProjects - interface microarrays
GeneProjects - interface microarrays
GeneProjects - interface microarrays
GeneProjects - interface microarrays
GeneProjects - interface microarrays
Perspectivas LGE
Implementar ferramenta que faça o caminho inverso.
Consolidar procedimentos para produção de chips para screening e chips para investigação direcionada.
Definir protocolos alternativos para marcação das sondas.