UNIVERSIDADE ANHANGUERA – UNIDERP PROGRAMA DE MESTRADO PROFISSIONAL EM PRODUÇÃO E GESTÃO AGROINDUSTRIAL IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM FOLHAS DE Brachiaria spp. E Panicum maximum Renato Nunes Toniasso Médico Veterinário CAMPO GRANDE – MATO GROSSO DO SUL 2014
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IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM FOLHAS DE … · 2021. 3. 29. · quantidades de saponinas. Sabe-se que as B. decumbens são as mais tóxicas, seguidas das B. brizantha
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UNIVERSIDADE ANHANGUERA – UNIDERP
PROGRAMA DE MESTRADO PROFISSIONAL EM PRODUÇÃO
E GESTÃO AGROINDUSTRIAL
IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM FOLHAS DE Brachiaria spp. E Panicum maximum
Renato Nunes Toniasso
Médico Veterinário
CAMPO GRANDE – MATO GROSSO DO SUL 2014
UNIVERSIDADE ANHANGUERA – UNIDERP
PROGRAMA DE MESTRADO PROFISSIONAL EM PRODUÇÃO
E GESTÃO AGROINDUSTRIAL
IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM FOLHAS DE Brachiaria spp. E Panicum maximum
Renato Nunes Toniasso
Orientador: Prof. Dr. Marcos Barbosa Ferreira
Co-orientador: Prof. Dr. Wolff Camargo Marques Filho
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em nível de Mestrado Profissional em Produção e Gestão Agroindustrial da Universidade Anhanguera-Uniderp, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção e Gestão Agroindustrial.
CAMPO GRANDE – MATO GROSSO DO SUL Novembro – 2014
iii
DEDICATÓRIA
Aos meus pais e meus irmãos, pelo apoio
e incentivo em todos os momentos da
minha vida.
À Dayana, minha noiva, por toda a ajuda,
dedicação e carinho
Aos professores, técnicos, estagiários e
todos os demais que contribuíram para a
execução desta obra.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela oportunidade que me concedeu, de realizar este trabalho;
pelo incremento de ânimo, nas horas mais difíceis; pelo conforto espiritual,
quando eu achei que não conseguiria realizar o referido intento; e aos Espíritos
Superiores, por terem me atendido em todas as vezes que os invoquei nas
provações para que me iluminassem;
Aos meus pais, Renato Toniasso e Leide Celia Otoni Nunes Toniasso,
por terem lutado ao meu lado ao longo do caminho da vida, dando-me apoio no
desenvolvimento deste mestrado;
Aos meus irmãos, Eduardo Nunes Toniasso e Adriana Nunes Toniasso,
por terem contribuído com auxílio efetivo e apoio moral, reforçando a confiança
em minha capacidade perante os desafios a que me submeti durante a
realização deste trabalho;
À minha noiva, Dayana Calvis de Almeida, pelo amparo, em cada
momento dos estudos deste mestrado, pois sem a sua valorosa dedicação e
atenção esta conquista acadêmica teria sido bem mais difícil;
Aos colegas e professores do programa de mestrado, pela ajuda que me
dispensaram nos momentos decisivos, sem os quais eu não teria chegado ao
final do curso, completando mais essa etapa da minha vida - destaque especial
para o colega amigo Celso Cavalheiro, o qual sempre esteve colaborando com
seus conselhos, mesmo após o final das aulas;
Ao Prof. Dr. Marcos Barbosa Ferreira e ao Prof. Dr. Wolff Marques
Camargo Filho, respectivamente, meu orientador e co-orientador, pela
orientação prestada, confiança, apoio, amizade a mim dispensados e
necessários para a caminhada rumo à minha titulação;
À Prof.ª Dr.ª Rosemary Matias, à Prof.ª Mª Eloty Justina Dias Schleder e
à Prof.ª Dr.ª Denise Renata Pedrinho, pela disponibilidade, auxilio e
compromisso, a contribuir com o desenvolvimento e a realização da pesquisa
durante os estudos deste trabalho;
À Técnica de laboratório Sueli Marques de Mattos; à acadêmica do
curso de Ciências Biológicas Adriana Oliveira de Sousa; e aos demais
membros da rede de laboratórios da Universidade Anhanguera-Uniderp,
v
campus de Ciências Agrárias, pela contribuição na condução do experimento e
ajuda na parte técnico–prática dos estudos; e
À Universidade Anhanguera – Uniderp e à Coordenação do Programa
de Mestrado Profissional em Produção e Gestão Agroindustrial, pela
oportunidade de poder graduar-me Mestre.
vi
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................... viii
LISTA DE QUADROS.................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS...................................................................................... x
LISTA DE FIGURAS....................................................................................... xi
RESUMO GERAL.......................................................................................... xiv
ABSTRACT GERAL....................................................................................... xv
Casos de fotossensibilização no Brasil foram observados em bovinos
mantidos em pastagens formadas com B. decumbens cv. Basilisk (ou
braquiária australiana), sendo descritos pela primeira vez em 1975 (CAMARGO
et al., 1976; NOBRE; ANDRADE, 1976). A enfermidade tem sido relatada em
bovinos, ovinos, caprinos e equinos mantidos em pastagens de Brachiaria spp.
(LEMOS et al., 1996; LEMOS; SALVADOR; NAKAZATO, 1997; LEMOS et al.,
1998; SEITZ et al., 2004; BRUM et al., 2007; BARBOSA et al., 2006; SILVEIRA
et al., 2009; ALBERNAZ et al., 2010; CASTRO et al., 2011).
Inicialmente a doença foi atribuída à presença do fungo Pithomyces
chartarum, produtor da toxina esporidesmina (DÖBEREINER et al., 1976;
TOKARNIA et al., 1979; FAGLIARI et al., 1990; FIORAVANTI, 1999), mas
alterações histológicas de colangiohepatopatia associada a cristais, causadas
pela presença de saponinas esteroidais, semelhantes às encontradas nas
intoxicações por Panicum spp (HOLLAND et al., 1991), Narthecium ossifragum
(CEH; HAUGE, 1981), Agave lecheguilla (CAMP et al., 1988) e Tribulus
terrestris (GLASTONBURY et al., 1984) têm sido observadas em animais que
desenvolvem fotossensibilização em pastagens de Brachiaria spp. (LEMOS et
al., 1996; LEMOS et al., 1997; LEMOS et al., 1998; BRUM et al., 2007).
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Cruz et al. (2001) conseguiram reproduzir a colangiohepatopatia em
ovinos, pela administração de extratos fracionados de B. decumbens. A
intoxicação por essa gramínea também tem sido reproduzida em experimentos
com ovinos a campo e confinados. Nestes experimentos as contagens de
esporos de P. chartarum estavam nulas ou abaixo de 5.000 por grama de pasto
(CRUZ et al., 2001; SATURNINO et al., 2010).
Além desses importantes avanços, não se conhecem as estruturas
foliares nas quais a protodioscina está armazenada na Brachiaria spp. Tal
conhecimento pode servir de base para melhor compreensão do papel das
saponinas na forrageira, bem como pode lançar novas luzes no conhecimento
atual da fisiologia destes metabólitos secundários nas forrageiras mais
utilizadas no Brasil como pastagens, fornecendo subsídios para a seleção de
novos cultivares menos tóxicas.
Portanto, o presente trabalho teve como objetivo principal a identificação
de saponinas nas folhas de Brachiaria spp. e em cultivares de Panicum
maximum, bem como a descrição das estruturas histológicas que as contém.
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS
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4. ARTIGO
IDENTIFICAÇÃO HISTOQUÍMICA DE SAPONINAS EM FOLHAS DE Brachiaria spp. E Panicum maximum
RESUMO: As espécies de Brachiaria são encontradas, principalmente, na
região Centro-Oeste do Brasil, constituindo fonte importante de alimento para
ruminantes a pasto. No entanto, há ocorrência de intoxicações em decorrência
da presença, nestas pastagens, da saponina protodioscina, a qual ocasiona
lesão hepática que, quando não é fatal, desencadeia processo de
hipersensibilidade à luz solar caracterizada por queimaduras de segundo grau,
que levam ao desprendimento da pele nas áreas expostas, as acometidas. O
Panicum maximum é outra espécie forrageira com cultivares presentes em todo
o Brasil. Existem relatos de que essas pastagens apresentam pequenas
quantidades de saponinas. Sabe-se que as B. decumbens são as mais tóxicas,
seguidas das B. brizantha e B. ruziziensis e, finalmente pelas B. humidicola,
praticamente isentas de saponinas. Até a realização deste trabalho não eram
conhecidas as estruturas histológicas onde as saponinas são armazenadas nas
folhas das Brachiaria spp. e de P. maximum. Assim, este estudo teve como
objetivo adaptar um protocolo histoquímico específico para saponinas e
evidenciar as células que as contêm. Foram utilizadas folhas maduras frescas
de cultivares de quatro espécies de braquiária e de quatro cultivares de P.
maximum. Além da análise histoquímica, realizaram-se testes de persistência
de espuma. Foram observados depósitos de saponinas nas células da bainha e
do mesófilo, responsáveis pelo metabolismo de carbono e a síntese de glicose;
nos tricomas; e nas células buliformes. Tais locais de observações possibilitam
sugerir que estes metabólitos secundários podem estar envolvidos no
armazenamento e transporte da glicose, até à defesa por exsudação como
ocorre na ação alelopática, corroborando com outros autores. Outros estudos
devem ser desenvolvidos para melhor se compreender a importância das
saponinas no metabolismo vegetal das Brachiaria spp. e P. maximum.
2004; OLIVEIRA, 2013). Sua presença e concentração são restritas em termos
32
tanto dentro da planta como entre diferentes espécies de plantas, que
funcionam como sinalizadores químicos, permitindo a estas responderem a
estímulos do ambiente, acionando mecanismos de defesa contra a ação de
herbívoros e de patógenos ou em resposta à competição dentro do
ecossistema, especialmente em situações de estresse (GOTTLIEB; KAPLAN;
BORIN, 1996; RAVEN, 2007). Assim, podem ser encontradas nos locais mais
expostos aos ataques dos agentes nocivos, funcionando como uma barreira
química no sistema de defesa da planta que compõem (WINA et al., 2005). Em
outras situações as saponinas podem desempenhar papel relacionado com a
regulação hormonal (VERONKA et al., 2012).
Não se conhece as estruturas foliares nas quais a protodioscina está
armazenada na Brachiaria spp., o que revela uma lacuna em relação à sua
identificação, espaço esse que merece ser investigado. Tal conhecimento
poderá servir de base para a melhor compreensão do papel das saponinas nas
plantas, bem como para lançar novas luzes sobre o saber atual da fisiologia
desta classe de metabólitos secundários nas forrageiras mais utilizadas no
Brasil, fornecendo subsídios para a seleção de novos cultivares menos tóxicos.
Portanto, o presente trabalho teve como objetivo a identificação de
saponinas no tecido das folhas de Brachiaria spp. e em cultivares de Panicum
maximum, bem como a descrição das estruturas histológicas que as contém.
4.2. Material e métodos
4.2.1. Coleta de folhas de Brachiaria spp.
As coletas das folhas verdes adultas foram feitas manualmente, em um
campo experimental da EMBRAPA – Gado de Corte, Campo Grande - MS,
região Centro-Oeste do Brasil, coordenadas sob a responsabilidade da Dra.
Cacilda Borges do Valle, contendo canteiros cultivados em duplicata com dois
cultivares de B. decumbens: cv. Basilisk (D62) e seu ecótipo BRA001996
(D70); cinco cultivares de B. brizantha: cv. BRS Arapoty, cv. Marandu, cv. BRS
Paiaguás (B6), cv. BRS Piatã e cv. BRS Xaraés; um cultivar de B. ruziziensis:
cv. R124 e dois cultivares de B. humidicola cv. Comum e cv. BRS Tupi, e mais
33
quatro cultivares de Panicum maximum: cv. Colonião, cv. Massai, cv. Mombaça
e cv. Tanzânia, como grupo controle (Figura 6).
H com Marandu Tupi D62 ARAPO B6 XAR PIATÃ R124 D70 Massai Momb Col Tanz REP 4
XAR ARAPO R124 PIATÃ Marandu H com D70 Tupi D62 B6 Tanz Col Massai Momb REP 3
R124 PIATÃ B6 D70 H com Tupi D62 Marandu XAR ARAPO Massai Tanz Momb Col REP 2
B6 D70 R124 Marandu D62 XAR PIATÃ ARAPO H com Tupi Col Tanz Momb Massai REP 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 6. Mapa de canteiros de Brachiaria spp. EMBRAPA Gado de Corte, contendo 14 espécimes com duas repetições (rep). - B. decumbens cv. Basilisk (D62) e ecótipo D70; B. brizantha cv. BRS Arapoty (Arapo), BRS Xaraés (Xar), BRS Piatã (Piatã), Paiaguás (B6); B. humidicola cv. comum (H com) e BRS Tupi (Tupi); B. ruziziensis cv. R124 (R124); P. maximus cv. Massai (Massai), Tanzânia (Tanz.), Mombaça (Momb.) e Colonião (Col).
Parte das folhas colhidas foi submetida ao protocolo de índice
afrosimétrico (SCHENKEL et al., 2000; MATOS, 2009; BRASIL, 2010):
1) As amostras, acondicionadas em sacos de papel rotulados, foram
colocadas em estufa com circulação de ar pré-aquecido a 40ºC e mantidas
para secagem entre 40-45ºC durante dez dias, com monitoramento a cada dois
dias. Após esse período os sacos foram retirados e postos em ambiente seco,
fresco e escuro, por quatro dias;
2) De cada saco foram trituradas e extraídas porções de 30g de massa
seca em moinho de facas tipo Willey (Tecnal®), 20 Mesh (0,850 mm) e
acondicionadas em potes plásticos com tampa opaca, devidamente rotulados;
3) Juntou-se 1g de cada uma das amostras trituradas a 50 mL de água
destilada em um becker e, em sequência aquecida em banho-maria a 60ºC,
por 30 minutos;
4) Resfriou-se esse material por 10 minutos, à temperatura ambiente,
sendo filtrado, em seguida, em um erlenmayer (100 mL). Completou-se o
volume para 100 mL, com água destilada. O decoto foi rotulado, e tampado
com filme PVC;
34
5) Para análise do índice de espuma foram separados dez tubos de
ensaio com tampa e neles distribui-se o decoto em séries sucessivas de 1, 2, 3,
até 10 mL, ajustando-se em todos, o volume para 10 mL, com água destilada
(Quadro 1). Por fim, esses tubos foram manualmente agitados de forma
enérgica e deixados em repouso por 15 minutos;
Quadro 1. Bateria com 10 tubos de ensaio utilizados para determinar o índice afrosimétrico.
Tubos I II III IV V VI VII VIII IX X
Sol. da droga (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Água destilada (mL) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -
Após esse período, observou-se, nos tubos, a formação de anéis de
espuma consistente e persistente, indicando a presença de saponina. Aferiram-
se então as alturas das colunas de espuma, marcando-se a parte os tubos que
apresentaram a diluição em que se registravam anéis com 1 cm de altura, para
determinação do índice. Foi realizado o cálculo do índice a partir do volume
dessa diluição em mililitros da solução extrativa (1%) que se submeteu a tal
condição. Exemplo: o tubo V apresentou anel de 1 cm, então 0,01g:10mL ::
x:5mL, x = 0,005g. O índice é calculado para 1g, da seguinte maneira:
0,005:10::1g:Y=2000, COSTA (2001). Assim, quanto menor a concentração a
apresentar espuma, maior quantidade de saponinas terá a amostra. Esse
método foi executado em triplicata (SCHENKEL, GOSMANN, ATHAYDE, 2000;
COSTA, 2001).
4.2.3. Processamento Histológico
A partir de cortes transversais das folhas, fixados em álcool etílico 70%,
e obtidos pela técnica de corte da “Mão-Livre”, os tecidos foram corados pela
técnica de histologia básica, para identificação anatômica pelo método
adaptado de Kraus; Arduin (1997) e Brasil (2010).
35
4.2.4. Processamento Histoquímico
As folhas sofreram cortes histológicos em suas partes centrais e foram
submetidas ao protocolo histoquímico para saponinas (COSTA, 2001; MOMIM;
KADAM, 2011), adaptado para o objeto do estudo. Todos os procedimentos
foram realizados em ambiente de capela.
1) Os cortes frescos de cada espécime permaneceram imersos por 20
horas dentro de um dessecador com vácuo, em solução aquosa saturada de
hidróxido de bário octahidratada (Ba(OH)2.8H2O), ou barita, utilizando-se
placas de Petri de plástico, com o volume médio de 10 ml da solução, com o
que se formou um precipitado gelatinoso e incolor com as saponinas;
2) Após 20 horas, os cortes foram retirados da solução e lavados em
solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 8% por 1-2 minutos, para deslocar o que
sobrou de barita em excesso, não fixada. Em seguida foram montados em
lâminas de microscopia e banhados, por 20 segundos, com uma gota de
solução de dicromato de potássio (K₂Cr₂O₇) a 10%, a fim de se destruir a
combinação de barita com a saponina. Imediatamente formou-se um
precipitado de cromato de Bário (BaCrO4), de coloração amarela, nas células
que contêm saponinas;
3) Na montagem das lâminas utilizou-se solução de glicerina 50%, com
o intuito de retirar o excesso de K₂Cr₂O7, que deixa toda a lâmina amarelada
em sequência as lamínulas foram vedadas com base de unha comum (KRAUS
e ARDUIN, 1997; BRASIL, 2010). Realizou-se a leitura em microscopia de luz,
o mais rápido possível, para a visualização e captura de imagens das
estruturas contendo as saponinas, nas células, coradas em tons de amarelo,
dando definição da localização onde se concentra a substância em estudo.
4) Entretanto, conforme Costa (2001), o K₂Cr₂O₇ reage também com
taninos, resultando um precipitado castanho-avermelhado nas células, o que
pode influenciar nas leituras das lâminas. Assim procedeu-se à adaptação de
Conrard (COSTA, 2001), que consiste em, após a exposição dos cortes em
K₂Cr₂O₇, lavá-los em água e, em seguida, montá-los em lâmina de microscopia
com uma gota de nitrato de prata (AgNO3) 0,1N. As células que continham o
36
precipitado amarelo de cromato de bário formam um precipitado vermelho, de
cromato de prata (Ag2CrO4).
4.3. Resultados e Discussão
A espuma observada apresentou persistência em todas as
concentrações para os exemplares de Brachiaria spp., exceto a B. humidicola
cv Tupi, que produziu pouca (menor que 5cm) porém persistente espuma. Os
exemplares do grupo Panicum maximum não apresentaram as mesmas
evidências que possibilitassem o cálculo para o índice de espuma (Figura 7).
Figura 7. Ilustração representando a análise afrosimétrica realizada em todos
os espécimes avaliados. Esquerda: teste positivo para a B.brizantha cv. BRS Paiaguás. Direita: teste negativo para P.maximum cv. Mombaça.
O índice afrosimétrico da B. decumbens cv. Basilisk e o ecotipo BRA
001996 foram, respectivamente, de 1250 e 2500. Nas B. brizantha ele variou
de 1000 a 3333,3; na B. ruziziensis cv. R124 foi de 3333,33; na B. humidicola
cv. Comum foi de 1000 e no cv. BRS Tupi manteve-se menor do que 1000
(Tabela 1).
37
Tabela 1. Valores do índice afrosimétrico de Brachiaria spp. e cultivares de Panicum maximum, obtidos após a análise de persistência de espuma em dez diluições diferentes.
Amostras Espuma
persistente* Índice de Espuma
Histoquímica
B. decumbens cv. Basilisk 100% 1250 +
B. decumbens ecótipo BRA 001996 100% 2500 +
B. brizantha cv. BRS Arapoty 100% 2000 +
B. brizantha cv. Marandú 100% 1428,6 +
B. brizantha cv. BRS Paiaguás 100% 3333,3 +
B. brizantha cv. BRS Piatã 100% 1666,7 +
B. brizantha cv. Xaraés 90% 1000 +
B. ruziziensis cv. R124 100% 3333,3 +
B. humidicola cv. Comum 100% 1000 +
B. humidicola cv. BRS Tupi 90% < 1000 +
P. maximum cv. Colonião 0% < 1000 +
P. maximum cv. Massai 90% < 1000 +
P. maximum cv. Mombaça 90% < 1000 +
P. maximum cv. Tanzânia 20% < 1000 +
* Refere-se à percentagem de tubos que apresentaram espuma em uma bateria com dez diluições diferentes, com três repetições.
Quanto à frequência de espuma, nas dez diluições do teste, observou-se
que oito amostras de Brachiaria apresentaram espuma consistente e
persistente (100%) As amostras de B. brizantha cv. Xaraés e B. humidicola cv.
BRS Tupi alcançaram 90% de frequência, sendo que estas amostras
apresentaram menor índice de espuma em relação às demais espécies.
Em relação aos resultados obtidos com Panicum maximum, o índice
afrosimétrico revelou concentrações muito baixas de espuma nas soluções, o
que impossibilita a afirmação de que as saponinas estejam presentes nessas
Poaceae.
O índice afrosimétrico indica a menor diluição do extrato em água capaz
de formar 1 cm de espuma. Quanto maior a coluna de espuma em uma grande
diluição, maior o índice e, consequentemente, maior a toxicidade (COSTA,
Este método não traduz o conteúdo de saponósidos, todavia permite
apreciar o conteúdo relativo de substâncias afrogênicas. Não foram
encontrados até o momento trabalhos relatando o índice de saponinas com
38
pastagens, sendo que esse índice é especificamente aplicado para plantas
medicinais (COSTA, 2001).
Dentre as amostras de Brachiaria utilizadas em outro estudo, as B.
decumbens apresentam maior quantidade de protodioscina (BARBOSA-
FERREIRA et al., 2011), entretanto, resultados de colheitas pontuais revelam
discrepâncias, uma vez que os componentes químicos nos vegetais podem
variar consideravelmente em razão de diferentes fatores como a época do ano,
local de coleta, formas de cultivo, condições climáticas, idade do material
vegetal, período e condições de armazenamento, entre outros (FARIAS, 2000).
Os resultados apresentados no presente trabalho corroboram os achados de
BARBOSA-FERREIRA et al. (2011), que observaram que as concentrações de
protodioscina variam em uma mesma espécie ao longo do tempo, podendo
haver altas concentrações nas B. brizantha e baixas nas B. decumbens em um
determinado momento, equiparando-as. Os índices afrosimétricos corroboram
também o observado pelos mesmos autores, em que as B. brizantha podem se
equivaler em toxicidade à B. ruziziensis. Além disso, as B. humidicola são as
que apresentam as menores concentrações de saponinas.
Os resultados histoquímicos dos cortes histológicos são apresentados
nas próximas Figuras (8 a 15). Imediatamente após a adição de dicromato de
potássio, todos os cortes positivos para saponinas apresentaram coloração
amarela ou amarelo-alaranjada, coloração essa observada somente dentro das
células do mesófilo e da bainha do feixe vascular, permeando a superfície dos
cloroplastos.
39
Figura 8. Reação histoquímica para saponinas, evidenciando em amarelo o
conteúdo de saponinas nas células do mesófilo e da bainha. A) e B) B. decumbens cv. Basiliski, AX10 e A X40 respectivamente. C) e D) B. decumbens ecotipo D70 AX10 e A~X50, respectivamente.
Após a realização do teste com nitrato de prata, observou-se perda da
estrutura celular dos tecidos, com precipitação da saponina em forma de
cristais difusamente distribuídos na lâmina histológica e, em alguns casos,
precipitação vermelha dentro de estruturas celulares (Figura 9).
Figura 9. Reação histoquímica para saponinas, seguida da imersão em nitrato
de prata, evidenciando desorganização celular e cristais de saponina
B A
D C
B A
40
em vermelho, presentes na área do corte tecidual. B. decumbens D70 AX40 e A~X80, respectivamente.
As cultivares de Brachiaria brizantha apresentaram a coloração amarela,
variando em intensidade, o que pode ser devido, em grande parte, à espessura
do corte, realizado à mão livre. A Figura 10 ilustra a histoquímica de B.
brizantha, cultivares Marandu e Xaraés.
Figura 10. Cortes histológicos de B. brizantha evidenciando o conteúdo de saponina, em amarelo, à esquerda, e a reação com nitrado de prata, evidenciando cristais vermelhos de saponina. A e B: B. cv. Marandu; C e D: cv. Xaraés. A e C X10. B~X 50 e D A~X80.
Após a reação com o nitrato de prata, a cultivar Arapoti apresentou
precipitado cristalino, de coloração avermelhada, dentro das células buliformes,
e a cultivar Paiaguás apresentou coloração vermelha na região da inserção dos
tricomas. A cultivar Piatã apresentou pouco precipitado vermelho marginando a
região abaxial do corte histológico, possivelmente por ter ocorrido
extravasamento do conteúdo celular após a reação química (Figura 11).
A B
C D
41
Figura 11. Cortes histoquímicos de B. brizantha, após reação com nitrato de
prata, evidenciando cristais vermelhos de saponina dentro de células buliformes da cv. Arapoti (A), e na região da inserção de um tricoma da cv. Paiaguás (B) AX40, A~X80 e A~X80, respectivamente. A figura C ilustra a presença de precipitado vermelho marginando a região abaxial de cv. Piatã. A~X60.
Após a reação com nitrato de prata, o corte histológico de B. ruziziensis
revelou a presença de cristais de saponina esparsos em algumas áreas
fragmentadas do tecido, no interior de células buliformes e dentro de células da
bainha do feixe vascular (Figura 12).
B PIAT
A PIAT
C PIAT
42
Figura 12. Reações histoquímicas de B. ruziziensis, após reação com nitrato de prata, evidenciando cristais vermelhos de saponina dentro de célula buliforme (A) e dentro de célula da bainha (B) AX40 e A~X50.
Os cortes histológicos de B. humidicola apresentaram cristais vermelhos
de saponinas distribuídos difusamente no sobrenadante do tecido,
caracterizando extravasamento do material após rompimentos celulares (Figura
13).
Figura 13. Cortes histoquímicos de B. humidicola cv. Tupi, após reação com
nitrato de prata, evidenciando cristais vermelhos de saponinas espalhados difusamente sobre o corte tecidual AX40.
As cultivares de Panicum maximum apresentaram colorações
amareladas e esverdeadas após o teste de dicromato de potássio nas mesmas
células observadas para as Brachiaria spp., aparentemente corando os
cloroplastos existentes (Figura 14).
A PIAT
B PIAT
43
Figura 14. Cortes histológicos de Panicum maximum submetidos à
histoquímica para evidenciação de saponinas. Cultivares colonião (A), Tanzânia (B), Mombaça (C) e Massai (D).
Após a reação com nitrato de prata, essas cultivares apresentaram a
presença de cristais de saponinas no sobrenadante e nas células da nervura
central (Figura. 15)
Figura 15. Fotomicrografia de corte histológico de Panicum maximum cv.
Massai submetido à histoquímica para evidenciação de saponinas, com exposição posterior ao nitrato de prata evidenciando-se imagem da nervura central contendo cristais sugestivos de saponinas (setas). A~80X.
B PIAT
A PIAT
D PIAT
C PIAT
44
Apesar de o Panicum dichotomiflorum possuir, comprovadamente, a
saponina esteroidal dicotomina (MEAGHER et al., 1996; RIET-CORREA,
2009), existem relatos conflitantes sobre a concentração desses metabólitos
secundários nos Panicum maximum estudados no presente trabalho.
BURAKOVAS et al. (2006) observaram baixas concentrações de protodioscina,
em P. maximum cv. Tanzânia, Massai e Mombaça, avaliadas por meio de
CCD, CLAE e espectroscopia RMN. Por outro lado Nóbrega et al. (2004)
relataram não haver, no cultivar Tanzânia, detecção destes metabólitos por
meio de CCD. Portanto, esses achados conflitantes podem ocorrer,
possivelmente, devido à baixa concentração desta saponina nos Panicum
maximum estudados.
Na análise histoquímica, o teste usual de saponinas recomendado para
drogas vegetais, segundo a 5a edição da farmacopeia brasileira (BRASIL,
2010) é a reação feita com material fresco seccionado ou material cortado em
micrótomo e incluído em parafina ou macrogol, adicionando-se uma gota dos
reativos sobre uma lâmina com uma secção da amostra.
Este reativo para saponinas é uma gota de ácido sulfúrico. Após a
adição ocorre uma sequência de cor amarela, seguida de cor vermelha e,
finalmente, de cor violeta ou azul-esverdeada. Contudo, esse teste acaba
sendo inviável, como foi observado no trabalho com a Gomphrena arborescens
L.f. (Amaranthaceae), onde a reação dos tecidos submetidos ao ácido sulfúrico
concentrado, para a detecção de saponinas e/ou lactonas sesquiterpênicas nas
folhas foi considerada não conclusiva (FRANK-DE-CARVALHO; GRACIANO-
RIBEIRO, 2005). Além disso, o uso de ácido sulfúrico no presente trabalho
acarretou em destruição precoce das estruturas celulares, impedindo a
identificação dos locais de depósito das saponinas.
O uso da solução aquosa de hidróxido de bário octahidratado, em
contato com as saponinas (protodioscina), presente no órgão vegetal, libera íon
Ba+2, que forma complexo com os pares de elétrons livres das hidroxilas (OH-)
do glicosídeo. Com a retirada do excesso desse hidróxido, que não foi
complexado às saponinas, pelo cloreto de cálcio, ocorrerá à formação de
precipitado amarelo pálido, após a adição de solução aquosa de dicromato de
potássio, que reage precipitando o cromato de bário (VOGEL, 1981). Essa
coloração amarelada pode sofrer oxirredução do cromato, resultando na
45
coloração verde (BACCAN, 2011). Por este motivo, as leituras dos cortes pós-
coloração devem ser realizadas imediatamente, para serem identificadas as
áreas que possuem cor amarela.
As Brachiaria spp. e o Panicum maximum fazem parte do grupo de
plantas C4, comuns nas regiões tropicais, que possuem uma arquitetura foliar
apresentando células parenquimais adaptadas (mesófilo), distribuídas ao redor
do feixe vascular, conhecidas como células da bainha (RAVEN, 2007). Estas
células da bainha são intimamente relacionadas com as células do parênquima
(mesófilo), que dividem a fotossíntese entre si. Assim, duas etapas do
metabolismo C4 com reações químicas dependentes de luz e subsequente
fixação de CO2 na forma de malato, ocorrem nas células do mesófilo (RAVEN,
2007). Este malato é transportado para as células da bainha, onde a enzima
RUBISCO, dentro do ciclo de Calvin-Benson, utiliza o CO2 para formar os
carboidratos que, finalmente, serão armazenados na forma de amido ou
transportados para a planta toda (TAIZ; ZEIGER, 2013).
Em relação à coloração amarelada dos cloroplastos, observada, pela
histoquímica, após a reação com o dicromato de potássio, pode-se sugerir que
as saponinas estariam ligadas a essas organelas, participando de parte do
metabolismo C4, possivelmente na captação dos açúcares formados. Essa
teoria se deve ao fato de as saponinas serem formadas por uma porção
sapogenina e uma porção glicona (SCHENKEL; GOSMANN; ATHAYDE, 2007),
ilustrado na Figura 16. Assim, a porção glicona representaria aquele
carboidrato produzido ao final do metabolismo C4, que seria atraído pela
sapogenina, formando a saponina.
Desta maneira, além do armazenamento da glicose na forma de amido,
a ligação dos carboidratos a uma sapogenina poderia se dar pela necessidade
de transporte tecidual, tornando a saponina um transportador desses nutrientes
às diferentes partes da planta para a produção de ATP.
46
Figura 16. Esquema de degradação da protodioscina em outros metabólitos.
Dentro dos círculos são evidenciadas as moléculas de açúcares. (FONTE: BRUM et al., (2007).
Apesar da reação com nitrato de prata ter causado perda da estrutura
celular em alguns tecidos, a presença de cristais de saponina precipitados no
interior das células da bainha indica que as saponinas estariam contribuindo
com os cloroplastos na acepção dos carboidratos. A presença dentro de
estruturas excretoras como nas células buliformes e nas estruturas tubulares
dos tricomas evidenciaria um caráter excretório das saponinas, que poderiam
ser transudadas pelas folhas com funções diversas, sendo uma delas a
alelopática, conforme sugerido por Veronka et al. (2012), permeando o solo ao
redor da planta e impedindo o crescimento de outras plantas competidoras
suscetíveis ao efeito tóxico das mesmas.
4.4. Conclusões
O teste histoquímico utilizado no trabalho mostrou-se eficiente na
identificação e localização das saponinas (protodioscina) nas células foliares,
do mesófilo e da bainha do feixe dos cultivares das Brachiaria spp. estudadas.
47
Apesar de alguns (testes) experimentos anteriores não se identificarem a
presença da protodioscina, o teste histoquímico identificou presença de
pequena concentração das saponinas nas células de Panicum maximum.
Os testes feitos com ácido sulfúrico não foram eficientes para esse
estudo, pois ele destrói precocemente as estruturas celulares impedindo a
identificação dos locais de depósito das saponinas
Há necessidade de se realizar mais estudos com o intuito de melhorar a
metodologia empregada, incluindo o uso de micrótomo para se efetuar o corte
tecidual e padronizar a espessura dos tecidos a serem corados.
4.5. Referências Bibliográficas
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