UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Programa de Pós-Graduação de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos Escola de Química Tese de Doutorado Estratégias de Processamento Verde de Saponinas da Biodiversidade Brasileira Bernardo Dias Ribeiro RIO DE JANEIRO MARÇO/2012
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Estratégias de Processamento Verde de Saponinas da … · ii ESTRATÉGIAS DE PROCESSAMENTO VERDE DE SAPONINAS DA BIODIVERSIDADE BRASILEIRA Bernardo Dias Ribeiro TESE DE DOUTORADO
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Programa de Pós-Graduação de Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Escola de Química
Tese de Doutorado
Estratégias de Processamento Verde
de Saponinas da Biodiversidade Brasileira
Bernardo Dias Ribeiro
RIO DE JANEIRO
MARÇO/2012
ii
ESTRATÉGIAS DE PROCESSAMENTO VERDE DE SAPONINAS DA BIODIVERSIDADE BRASILEIRA
Bernardo Dias Ribeiro
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO CORPO DOCENTE DO CURSO DE PÓS-
GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS DA ESCOLA
DE QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO, COMO PARTE DOS
REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS.
Orientadores:
Profª. Maria Alice Zarur Coelho, D. Sc.
Prof. Daniel Weingart Barreto, D. Sc.
RIO DE JANEIRO
MARÇO/2012
ESTRATEGIAS DE PROCESSAMENTO VERDE DESAPONINAS DA BIODIVERSIDADE BRASILElRA
TESE DE DOUTORADO APRESENT ADA AO CORPO DOCENTE DO CURSO DE POS-
GRADUAc;=Ao EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUIMICOS E BIOQUIMICOS DA ESCOLA
DE QUIMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO.
ProF. Maria Alice Za J..r..e elho, D. Sc. - EQ/UFRJ(Orientadora)
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Prof. Daniel Weingart Barr 0, D. Sc. - EQ/UFRJ(Orientador)
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ProF Claudia Regina Elias Mansur, D. Sc. - IMA/UFRJ
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ProF Isabel Maria Delgado Jana Marrucho Ferreira, Ph.D. - ITQB/UNL, Portugal
~ProF. Suely Pereira Freitas, D. Sc. - EQ/UFRJ
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AGRADECIMENTOS Quatro anos é muito tempo. Muita coisa acontece.
Nunca imaginei ao começar o Doutorado o quanto as coisas iriam mudar em 4 anos, o quanto eu iria mudar. Agradeço a Deus por ter me dado a oportunidade de evoluir como pessoa, de ser mais compreensivo, paciente e atencioso com os meus próximos.
Nesses 4 anos, eu casei com minha querida Aline, companheira de todos os momentos proporcionados pela tese ou não. Sua ternura, calma, paz, amor e apoio com certeza influenciaram na minha evolução como pessoa. Te amo muito.
Aprendi que a família é mais importante do que o trabalho, porque é a família que realmente te dá o suporte nas horas difíceis. Agradeço a vocês por tudo que me ensinaram na vida: minha mãe Sonia, que apesar de todos os obstáculos encontrados na vida, sempre teve fibra para me ensinar um homem sério e responsável; meu avô Afrânio, que me deu o exemplo de como ser persistente e sempre lutar pelos seus objetivos na vida; minha avó Maria, que me ensinou a ser bom com as pessoas e sempre ajudar o próximo que estiver necessitado; meu tio Afrânio, que me ensinou a gostar de futebol e do Botafogo. Aos demais familiares, obrigado por vocês existirem na minha vida, e torcerem pela minha felicidade.
Aprendi que a vida nunca é previsível, e que a saudade é inevitável. Um grande abraço e um beijo para avô José, tia Marília e tia Zelinda, que vocês estejam nos braços de Deus.
Durante esse tempo, eu aprendi muito, não só sobre produtos naturais, enzimas, líquidos iônicos e tecnologias limpas, mas também sobre pessoas, e quanto elas podem ser complexas.
Aprendi que amizade não tem idade, mas que nem todos querem ser seu amigo.
Aprendi que algumas amizades são eternas, e que elas fazem falta.
Aprendi que não sou uma pessoa focada, mas sim multifocal.
Percebi que muitos sentem realmente minha falta, e que torcem pelo meu sucesso.
Nesses 4 anos, comecei com dois orientadores, quase fiquei sem e depois cheguei a ter 3, mas no fim continuei com os mesmos do inicio: Prof. Daniel Barreto, e Profª Maria Alice. Ambos eu conheço desde 2003. Prof Daniel foi quem me ensinou a pensar industrialmente, a visualizar um processo, e de como “vender” uma idéia. Prof Alice foi quem me acolheu, e quem confiou no meu potencial, me dando a oportunidade de cooperar na organização do material do livro, e de ainda ser um dos seus autores, mesmo sendo aluno de graduação. Além disso, me ensinou como deve ser um pesquisador, e me deu recentemente a oportunidade de fazer um estágio doutoral em Portugal junto a Prof Isabel Marrucho, para que se possa desenvolver uma linha de pesquisa sobre liquidos iônicos, e de ir a um Congresso Internacional. Por isso, é justo lhe chamar de “madrinha cientifica”.
Convivi com muitas pessoas nesses quatro anos, dentro e fora da UFRJ:
- Laboratório de Engenharia de Sistemas Biológicos, E-103, EQ/UFRJ: Mariana, Patrícia, Marcelle, Raquel, Roseli, Roberta, Thiana, Priscilla, Gizele, Ana Iraidy, André, Luana, Kelly, Tatiana, Ariane, Verônica, Lívia, Conrado, Diego, Naíra, Raísa, Yang, Pedro, Renata, Natália, Hélio, Aline, Daniel Torres e todos os outros, agradeço pelo ambiente agradável de trabalho e pela convivência pacifica;
- Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais, I-160, EQ/UFRJ: Josélia, Fábio, Eduardo, Thiago, Udson, Bruno, Daniel Lima, pela ajuda quando foi necessário, e também pela convivência pacifica e divertida;
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- Laboratório de Termodinâmica Molecular, ITQB/UNL: Prof Isabel Marrucho, Liliana, Filipa, Filipe, João, Ana Belém, Rui e Helga pela recepção positiva que tive de todos, pelo aprendizado com os liquidos iônicos, e espero continuar o contato com todos vocês;
- Profª Suely Freitas, EQ/UFRJ: agradeço por ter me auxiliado no momento que fiquei praticamente órfão, onde me cedeu aluno de IC, comprou reagentes e ainda me aceitou como co-orientador de projeto final;
- Prof Márcio Nele, EQ/UFRJ: agradeço por ter permitido o uso do tensiomêtro no Laboratório de Engenharia Química, nas várias vezes que precisei;
- Prof Fernando Pellegrini, e Fábio Pedro, EQ/UFRJ: agradeço por ter me emprestado o bolhômetro e rotâmetro;
- Profª Denise Freire, e Bruno, IQ/UFRJ: agradeço por ter permitido e me auxiliado no uso do sistema de ultrafiltração no Laboratório de Biotecnologia Microbiana;
- Profª Ana Cláudia Vieira, FF/UFRJ: agradeço por sua grande ajuda ao fazer as análises para confirmação de espécies das plantas trabalhadas, e além disso, pela grande amizade que obtive;
- Profª Daniela Alviano, IM/UFRJ: agradeço pela cooperação ao realizar as análises de atividade antimicrobiana de todas as amostras de saponinas;
- Ricardo Reis, Coordenador de Coleções Vivas do Jardim Botânico, por ter cedido 3 folhas de sisal (Agave sisalana);
A todas as demais pessoas que contribuíram, direta e indiretamente, para que o presente texto pudesse ser desenvolvido;
Aos membros da banca examinadora, pelo aceite do convite;
A CAPES, pela bolsa de doutorado concedida (03/2008-11/2009);
Ao CNPq, pela bolsa de doutorado concedida; (12/2009 -02/2010);
A FAPERJ, pela bolsa de doutorado NOTA DEZ concedida; (03/2010 -02/2012).
“Seja a mudança que você quer ver no mundo”
Dalai Lama
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Resumo da proposta de pesquisa apresentada à Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro (EQ/UFRJ) como parte integrante do Exame de Qualificação para o Doutorado. RIBEIRO, Bernardo Dias. Estratégias de Processamento Verde de Saponinas da Biodiversidade Brasileira. Rio de Janeiro, 2012. Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Saponinas, glicosídeos amplamente distribuídos na natureza, incluem um grupo diverso de compostos caracterizados por sua estrutura triterpênica ou esteroidal e um ou mais açúcares a esta ligada através de glicosilações. Sua diversidade estrutural é refletida por suas propriedades físico-quimicas (formação de espuma, emulsificação, solubilização, adoçante, amargor) e biológicas (hemolítico, antimicrobiano, molusquicida, inseticida, ictiocida), que são exploradas em várias aplicações nas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica e também em biorremediação de solos. Algumas plantas, como Quillaja saponaria e Yucca schidigera, são exploradas comercialmente para extração de saponinas, utilizadas na emulsificação de bebidas ou em síntese de drogas esteroidais. As duas plantas, porém, não são brasileiras: a Quillaja saponaria é nativa do Chile e a Yucca schidigera, do Mexico. Os objetivos desta tese consistem na busca por matérias-primas vegetais oriundas da agrobiodiversidade brasileira que possuam saponinas com potencial de aproveitamento econômico. Para isso, duas plantas, no máximo, serão selecionadas pela comparação das suas propriedades fisico-químicas e antimicrobianas, e estas serão caracterizadas e utilizadas como matéria-prima para o estudo e desenvolvimento de métodos de extração e concentração verdes das saponinas. Posteriormente, serão realizados testes de aplicação das saponinas como ativador e/ou inibidor enzimático para uso em alimentos e/ou cosméticos. Das 38 plantas avaliadas por critérios tais como teor de saponinas e seus respectivos índices de emulsificação, tensão superficial, atividade antimicrobiana, além da sua sustentabilidade, duas foram escolhidas: juá e sisal. Com isso, foi realizada a caracterização destas saponinas, determinando suas concentrações micelares críticas (CMCs), 1,11 e 0,54 g/L, respectivamente, e avaliando a sua variação pela influência de pH, temperatura e concentração de NaCl; atividade antioxidante, complexação com colesterol e composição das saponinas por espectrometria de massas. Foram testados métodos de extração com etanol 30%, líquidos iônicos, solventes eutéticos, além da extração micelar com Triton X-100 e com auxilio de ultrassom. Destes métodos, a extração micelar tendo como condições em relação as saponinas de juá: 38,8ºC; 1 h; 0,272 (relação juá/solvente), 300 rpm, 15% Triton; e em relação as saponinas de sisal: 50ºC; 4 h; 0,166 (relação sisal/solvente), 200 rpm, 7,5% Triton, obteve recuperações de 90,8 e 98,4%, respectivamente, sendo o método escolhido para concentração por ponto de névoa. A extração orbital simples, com mais 2 reextrações, em condições similares, foi mantida para estudo dos métodos de concentração por coluna de espuma e separação por membranas. Dentre os métodos de concentração estudados, o de ponto de névoa obteve a maior seletividade, com uso de carbonato de sódio 20% para a separação bifásica, e Amberlite FPX-66 em condições diferentes para as saponinas de juá (46,8ºC e 25,1%) e de sisal (40,8ºC e 25,4%) durante 30 min para remoção do Triton, tendo como fatores de concentração 10,6 e 6,6, respectivamente. Com os testes de alteração de atividade enzimática, hidrólise s síntese, as saponinas podem ser aplicadas em alimentos ricos em proteínas, favorecendo a produção de hidrolisados protéicos; aditivo para hidrólise de materiais amiláceos; auxiliar na síntese de ésteres de cadeia curta; fármacos antiobesidade e ativos cosméticos antiaging.
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Abstract of the research proposition presented to the Escola de Química of the Universidade Federal do Rio de Janeiro (EQ/UFRJ) as one of the requirements to fulfill the Qualifying Examination for the Doctorate. RIBEIRO, Bernardo Dias. Estratégias de Processamento Verde de Saponinas da Biodiversidade Brasileira. Rio de Janeiro, 2012. Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Saponins, glycosides largely distributed in nature, include a diverse group of compounds characterized by their structure with a steroidal or triterpenic aglicone and one or more sugar molecules bound to the aglycone through glycosydic linkages. This structural diversity is reflected by their physicochemical (foaming, emulsification, solubilization, sweetening, bitterness) and biological properties (hemolytic, antimicrobial, molluscacide, insecticide, ictyocide), which are explored in many applications in food, cosmetic and pharmaceutical industries and also in soil bioremediation. Some plants, as Quillaja saponaria and Yucca schidigera, are commercially explored for saponin extraction and are used in emulsification of beverages or in steroidal drugs synthesis. However, both are not Brazilian species: the Quillaja saponaria is from Chile and the Yucca schidigera, from Mexico. The aims of this thesis consist in the search of vegetable raw materials obtained from the Brazilian agrobiodiversity which have saponins with potential for economic explotation. Thus, two plants will be selected by comparison of their physicochemical and antimicrobial properties, and these will be characterizated and used as raw material for the study and development of green extraction and concentration methods of saponins. Afterly, tests for saponin application as enzymatic activator and/or inhibitor for use in food and cosmetics were carried out. From 38 plants evaluated by criteria such as saponins content and their corresponding emulsification index, surface tension, antimicrobial activity, besides of sustainability, two were chosen: juá and sisal. Then, the saponins were characterized, determining their critical micellar concentrations (CMCs), 1.11 and 0.54 g/L, respectively, and evaluating their variation due to influence of pH, temperature and NaCl concentration; besides their antioxidant activity, cholesterol complexation and saponin composition by mass spectrometry. Extraction methods were tested with ethanol 30%, ionic liquids, eutectic solvents, besides micellar extraction with Triton X-100 and assisted by ultrasound. From these methods, micellar extraction with conditions related to juá saponins: 38.8ºC; 1 h; 0.272 (juá/solvent), 300 rpm, 15% Triton; and related to sisal saponins: 50ºC; 4 h; 0.166 (sisal/solvent), 200 rpm, 7.5% Triton, had obtained recoveries of 90.8 and 98.4%, respectively, which it was chosen to continue in cloud point concentration. Orbital extraction, with two more reextractions in similar conditions, was maintained to the study of concentration methods foam cloumn and membrane separation. Between the concentration methods, cloud point concentration had the higher selectivity, with the use of sodium carbonate 20% for biphasic separation, and Amberlite FPX-66 in different conditions for juá (46.8ºC, 25.1%) and sisal (40.8ºC, 25.4%) saponins during 30 min for Triton removal, having as concentration factors 10.6 and 6.6, respectively. With tests of enzymatic activity modification, hydrolysis and synthesis, saponins can be applied in protein-rich food, favoring protein hydrolysates production; additive for hydrolysis of starchy materials; aid in the synthesis of short chain esters; antiobesity drugs and cosmectic antiaging active.
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LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Estrutura geral de surfactantes ................................................................................ 24 Figura 2 – Formas micelares (Rosen & Dahanayake, 2000) .................................................... 25 Figura 3 - Estruturas de agliconas de saponinas esteroidais (R = oses) (Vincken et al, 2007) 30 Figura 4 - Estruturas de agliconas de saponinas triterpênicas (Vincken et al, 2007) ............... 30 Figura 5 – Esquema geral da via do mevalonato (Dewick, 2009) ............................................ 33 Figura 6 – Biossíntese das agliconas triterpênicas e esteroidais. Enzimas: LS (lupeol sintase); β-AS (β-amirina sintase); α-AS (α-amirina sintase); DS (damarenediol sintase); CS (cucurbitadienol sintase); CyS (cicloartenol sintase); LaS (Lanosterol sintase); EHC (Esqualeno-hopeno ciclase); ED (esterol demetilases: esterol 14-demetilase, esterol ∆14-redutase e esterol C-4 demetilase) (Dewick, 2009) .................................................................. 34 Figura 7 – Orientações possíveis de saponinas na interface água-ar (Stanimirova et al, 2011) .................................................................................................................................................. 36 Figura 8 – Esquema das alteraçãoes na membrana celular promovido pela interação saponina-colesterol (Augustin et al, 2011) .............................................................................................. 37 Figura 9 – Saponinas de raízes: (A) Ácido glicirrizínico, (B) Periandrina I, (C) Ginsenosídeo Rb1, (D) Fafosídeo B, (E) Betavulgarosídeo III ...................................................................... 46 Figura 10 - Saponinas de bulbos e tubérculo: (A) Erubosídeo B (Alho); (B) Aliospirosídeo D (Cebola), (C) Saponina esteroidal de alho poró, (D) Saponina esteroidal de lírio; (E) Dioscina. .................................................................................................................................................. 48 Figura 11 – Saponinas de cascas de tronco: (A) Saponina geral de quilaia (R pode ser xilose, ramnose ou apiose); (B) Jujubosídeo sulfatado; (C) Saponina 1 de unha-de-gato ................... 50 Figura 12 – Saponinas de folhas: (A) Asiaticosídeo; (B) Hederasaponina C; (C) Teasaponina B1; (D) Matesaponina 1; (E) Dongnosídeo E; (F) Quadrangulosídeo ..................................... 52 Figura 13 – Saponinas de flores: (A) Heliantosídeo 5, (B) Calendasaponina A ...................... 53 Figura 14 – Saponinas de frutos: (A) Terrestrosina J, (B) CAY-1, (C) Melongosídeo O, (D) Luciosídeo N ............................................................................................................................ 55 Figura 15 – Saponinas de sementes: (A) Escina II; (B) Amaranthus-saponina I; (C) Saponina triterpênica de quinoa; (D) Avenacosídeo B; (E) Pulsatilla saponina D (Guaraná); (F) Soyasaponina αg (encontrada em soja, grão-de-bico, ervilha, amendoim e lentilha); (G) Azukisaponina VI; (H) Phaseolosídeo I. .................................................................................. 57 Figura 16 – Interface entre solução com bolhas e espuma em uma coluna de espuma ............ 67 Figura 17 – Preparo do extrato rico em saponinas ................................................................... 70 Figura 18 – Determinação de CMC dos extratos ricos em saponinas através do tensiômetro . 93 Figura 19 – Determinação de CMC dos extratos ricos em saponinas pelo método turbidimétrico ........................................................................................................................... 93 Figura 20 - Curvas de contorno fixadas no ponto médio: efeitos de pH, temperatura e concentração salina sobre o CMC das saponinas de juá .......................................................... 96 Figura 21 - Curvas de contorno fixadas no ponto médio: efeitos de pH, temperatura e concentração salina sobre o CMC das saponinas de sisal ........................................................ 98 Figura 22 – Saponinas do juá (Tabela 19) .............................................................................. 103 Figura 23 – Saponinas do sisal (Tabela 19) ............................................................................ 104 Figura 24 – Espectro de massas da diosgenina....................................................................... 105 Figura 25 – Espectro de massa das saponinas do juá ............................................................. 106 Figura 26 - Espectro de massa das saponinas do sisal ............................................................ 107 Figura 27 – Avaliação das proporções entre água e etanol na extração das saponinas do juá. Parâmetros fixos deste ensaio de extração: Relação matéria-prima/solvente de 1/5 (0,2); 50ºC; 200 rpm; 4 horas. .................................................................................................................... 108
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Figura 28 – Avaliação das proporções entre água e etanol na extração das saponinas do resíduo mucilaginoso de sisal. Parâmetros fixos deste ensaio de extração: Relação matéria-prima/solvente de 1/5 (0,2); 50ºC; 200 rpm; 4 horas. ............................................................ 108 Figura 29 – Superfícies de resposta fixadas no ponto ótimo: efeitos de temperatura, relação juá/solvente e velocidade de agitação sobre a extração das saponinas de juá ........................ 110 Figura 30 – Avaliação da cinética de extração de saponinas do juá....................................... 111 Figura 31 – Avaliação da cinética de extração de saponinas do sisal .................................... 112 Figura 32 – Avaliação do número de reextrações de saponinas do juá e do sisal .................. 113 Figura 33 – Diagramas de Pareto do planejamento de mistura para extração de saponinas de juá. (A) Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos) ................................................................................................................................ 116 Figura 34 – Curvas de contorno do planejamento de mistura para extração de saponinas de juá. (A) Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos) ................................................................................................................................ 116 Figura 35 - Diagramas de Pareto do planejamento de mistura para extração de saponinas de sisal. (A) Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos) ................................................................................................................................ 117 Figura 36 - Curvas de contorno do planejamento de mistura para extração de saponinas de sisal. (A) Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos) ................................................................................................................................ 117 Figura 37 – Cinética de extração de saponinas por solventes eutéticos. (A) Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos) ........................ 118 Figura 38 – Influência da relação matéria-prima/solvente na extração de saponinas ............ 119 Figura 39 - Influência da temperatura na extração de saponinas ........................................... 119 Figura 40 – Comparação dos métodos de extração em relação à recuperação de saponinas do juá ........................................................................................................................................... 120 Figura 41 - Comparação dos métodos de extração em relação à recuperação de (a) fenóis e (b) açúcares redutores................................................................................................................... 121 Figura 42 – Avaliação da variação da concentração de Triton X-100 sobre a recuperação de saponinas de juá ...................................................................................................................... 122 Figura 43 – Comparação dos métodos de extração em relação à recuperação de saponinas do sisal ......................................................................................................................................... 122 Figura 44 – Avaliação da variação da concentração de Triton X-100 sobre a recuperação de saponinas de sisal ................................................................................................................... 123 Figura 45 – Avaliação da capacidade de remoção de Triton X-100 dos extratos concentrados de sisal por adsorventes. (A) Sisal, (B) Juá ............................................................................ 126 Figura 46 – Otimização da remoção de TritonX-100 das fases supramoleculares de sisal (A) e juá (B) ..................................................................................................................................... 127 Figura 47 - Cinética de adsorção de Triton X-100 nas fases supramolculares de sisal (A) e juá (B) ........................................................................................................................................... 127 Figura 48 – Otimização dos parâmetros da concentração de saponinas de juá por coluna de espuma .................................................................................................................................... 131 Figura 49 – Otimização dos parâmetros da concentração de saponinas de sisal por coluna de espuma .................................................................................................................................... 133 Figura 50 – Avaliação da vazão para concentração de saponinas de juá (A) e sisal (B) por coluna de espuma.................................................................................................................... 134 Figura 51 - Avaliação de pH para concentração de saponinas de juá (A) e sisal (B) por coluna de espuma ............................................................................................................................... 135 Figura 52 - Avaliação da presença de anéis de Raschig para concentração de saponinas de juá (A) e sisal (B) por coluna de espuma ..................................................................................... 135
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Figura 53 – Operação de coluna da espuma. (A) Formação da espuma, (B) Coleta, (C) Início de instabilidade da espuma e (D) Fim do processo ................................................................ 136 Figura 54 – Cinética de concentração de saponinas de juá por coluna de espuma (A) utilizando um gradiente de vazão de ar (B) ............................................................................ 137 Figura 55 - Cinética de concentração de saponinas de sisal por coluna de espuma (A) utilizando um gradiente de vazão de ar (B) ............................................................................ 137 Figura 56 – Operação de um sistema de ultrafiltração em escala de bancada........................ 138 Figura 57 – Cinética de concentração de saponinas por ultrafiltração ................................... 139 Figura 58 – Alteração da atividade amilásica da pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5% ..................................................... 141 Figura 59 - Alteração da atividade proteásica da pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5% .................................... 142 Figura 60 - Alteração da atividade lipásica da pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5% ..................................................... 142 Figura 61 - Alteração da atividade da colagenase por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5% ...................................................................... 144 Figura 62 – Alteração da atividade amilásica (A), proteásica (B) e lipásica (C) da pancreatina por diferentes teores de diosgenina e das agliconas de juá e de sisal. Concentração enzimática: 0,5% ........................................................................................................................................ 145 Figura 63 - Alteração da atividade da colagenase por diferentes teores de diosgenina e das agliconas de juá e de sisal. Concentração enzimática: 0,5% .................................................. 146 Figura 64 – Hidrólise de materiais protéicos por pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5% .................................... 147 Figura 65 - Hidrólise de materiais protéicos por papaína por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5% .......................................................... 147 Figura 66 - Hidrólise de gelatina por colagenase spor diferentes teores de saponinas de juá e de sisal. Concentração enzimática: 0,5%................................................................................ 148 Figura 67 - Hidrólise de matérias amiláceos por pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5% ..................................................... 149 Figura 68 - Hidrólise de matérias amiláceos por Stargen por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5% .......................................................... 150 Figura 69 - Hidrólise de materiais lipidicos por pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá e de sisal. Concentração enzimática: 0,5% .................................................................. 151 Figura 70 - Hidrólise de materiais lipidicos por Lipozyme CALB por diferentes teores de saponinas de juá e de sisal. Concentração enzimática: 0,5% ................................................. 151 Figura 71 – Síntese enzimática de acetato de butila (A) e estearato de etila (B) por diferentes teores de saponinas de juá e de sisal. Concentração enzimática: 0,5% .................................. 152 Figura 72 – Extratos metanólicos das plantas utilizadas nesta tese ........................................ 182 Figura 73 - Atividade antimicrobiana por difusão em ágar. Resultados positivos, 17: Juá e 47: Alho ........................................................................................................................................ 183 Figura 74 – MS/MS de alguns picos relativos as saponinas do sisal ..................................... 184 Figura 75 – MS/MS de alguns picos relativos as saponinas do juá ........................................ 185 Figura 76 – Extração de saponinas de sisal (A) e de juá (B) utilizando líquidos iônicos e análogos contendo ChCl/aditivo 1/2 molar, e co-solventes sendo a esquerda água e a direita etanol 30% .............................................................................................................................. 186 Figura 77 – Exemplos da aplicação de diferentes sais para concentração de saponinas de sisal (A) e de juá (B) por ponto de névoa. (1) citrato de sódio, (2) Na2CO3, (3) NaHCO3, (4) NaNO3, (5) (NH4)2SO4 ........................................................................................................... 187 Figura 78 – Interação das saponinas com lipase (seta vermelha) ........................................... 187
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LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Distribuição de saponinas em algumas espécies vegetais ...................................... 31 Tabela 2 – Concentração inibitória mínima (CIM) de possíveis saponinas presentes em extratos vegetais ....................................................................................................................... 39 Tabela 3 – Exemplos de metabólitos extraídos por líquidos iônicos ....................................... 63 Tabela 4 – Plantas utilizadas para o estudo de saponinas......................................................... 68 Tabela 5 – Análise da variação de CMC utilizando planejamento composto central .............. 78 Tabela 6 – Otimização da extração de saponinas do juá utilizando planejamento composto central .. 81 Tabela 7 – Planejamento de misturas de extração de saponinas por líquidos iônicos ou análogos..... 82 Tabela 8 – Otimização da adsorção de Triton dos extratos concentrados utilizando planejamento composto central ................................................................................................ 84 Tabela 9 – Planejamento composto central exploratório da concentração de saponinas por coluna de espuma...................................................................................................................... 85 Tabela 10 - Planejamento composto central da concentração de saponinas por coluna de espuma.... 85 Tabela 11 – Comparação do teor e atividade surfactante das saponinas das matérias-primas utilizadas ................................................................................................................................... 89 Tabela 12 – Atividade antimicrobiana dos extratos por difusão em ágar ................................ 91 Tabela 13 – Comparação dos CMC dos extratos ricos em saponinas obtidos por dois métodos distintos ..................................................................................................................................... 94 Tabela 14 – Resultados da análise da variação de CMC e tensão crítica dos extratos de juá e sisal utilizando planejamento composto central descrito na Tabela 5 ...................................... 94 Tabela 15 - ANOVAs com modelo completo e ajustado para variação do CMC do extrato de juá ... 95 Tabela 16 - ANOVAs com modelo completo e ajustado para variação do CMC do extrato de sisal . 97 Tabela 17 – Atividade Antioxidante dos extratos de juá e de sisal .......................................... 99 Tabela 18 – Concentração inibitória mínima das saponinas de juá e de sisal ........................ 101 Tabela 19 – Dados de m/z de saponinas de juá e de sisal ...................................................... 102 Tabela 20 – Comparação dos rendimentos (saponinas, fenóis e açúcar redutores totais) da extração de saponinas de juá e de sisal utilizando planejamento composto central ............... 109 Tabela 21 - ANOVA com modelo ajustado para extração de saponinas do juá .................... 109 Tabela 22 - ANOVA com modelo ajustado para extração de saponinas do sisal .................. 111 Tabela 23 – Comparação dos métodos de extração orbital simples e Soxhlet das saponinas de juá e de sisal ............................................................................................................................ 112 Tabela 24 - Comparação do poder extrativo de líquidos iônicos e análogos em relação a saponinas ................................................................................................................................ 114 Tabela 25 – Resumo da comparação dos métodos de extração das saponinas....................... 123 Tabela 26 – Avaliação de sais na pré-concentração por ponto de névoa de saponinas de juá e de sisal .................................................................................................................................... 124 Tabela 27 – Avaliação da concentração de carbonato de sódio na pré-concentração por ponto de névoa de saponinas de juá e de sisal .................................................................................. 125 Tabela 28 – Comparação dos rendimentos (saponinas, fenóis e açúcar redutores totais) da extração de saponinas de juá e de sisal utilizando planejamento composto central ............... 127 Tabela 29 – Avaliação do reciclo de adsorvente para remoção de Triton X-100 .................. 128 Tabela 30 – Avaliação de alternativas ao Triton X-100 para separação bifásica aquosa de saponinas ................................................................................................................................ 129 Tabela 31 – Resultados do planejamento exploratório para concentração de saponinas por coluna de espuma.................................................................................................................... 130 Tabela 32 – Comparação dos métodos de concentração de saponinas ................................... 139 Tabela 33 – Atividade enzimática da pancreatina e da colagenase sem adição de saponinas 140
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ABTS Ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) Ac Anion Acetato Amim Cátion 1-Alil-3-metilimidazolio APL Anteprojeto de Lei α-AS α-Amirina sintase β-AS β-Amirina sintase ATCC American Type Culture Collection ATP Trifosfato de Adenosina BHI Brain Heart Infusion CBM Concentração Bactericida Mínima CDB Convenção sobre Diversidade Biológica CFM Concentração Fungicida Mínima CGEN Conselho de Gestão do Patrimônio Genético ChCl Cloreto de Colina CII Concentração Inibitória Infinita CIM Concentração Inibitória Mínima CIMA Centros Irradiadores de Manejo da Agrobiodiversidade CLM Concentração Letal Mínima CLSI/NCCLS Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards
CMC Concentração Micelar Crítica Cnmim Cátion 1-alquil-3-metilimidazólio CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CONABIO Comissão Nacional de Biodiversidade CS Cucurbitadienol sintase CyS Cicloartenol sintase DBU 1,8-diazabicicloundec-7-eno dca Anion dicianamida DDMP 2,3-diidro-2,5-dihidroxi-6-metil-4H-piran-4-ona DIMCARB N,N-dimetilamonio N’,N’-dimetilcarbamato DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico DPPH 1,1-difenil-2-picril hidrazil DS Damarenediol sintase EAM Extração assistida por microondas ED Esterol demetilases ED50 Dose efetiva EE Esqualeno epoxidase EGCG Epigalocatequina galato EHC Esqualeno-hopeno ciclase ELP Extração líquida pressurizada Embrapa Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária ER Efetividade Relativa ESI Ionização por Eletrospray Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz FPP Pirofosfato de farnesila Γmax Densidade superficial máxima GC-MS Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas GGPP Pirofosfato de geranilgeranila HPLC High Pressure Liquid Chromatography IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis IBD Instituto Biodinâmico ICMBio Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
xiii
Imaflora Instituto de Manejo e Certificação Florestal e Agrícola INCRA Instituto Nacional de Colonização e Reforma Agrária IPP Isopentenila difosfato L.A. Lírio híbrido das espécies longiflorum e asiático LaS Lanosterol sintase LI Líquidos iônicos LS Lupeol sintase MEP Metileritritol fosfato MMA Ministério do Meio Ambiente MOPS Ácido 3-[N-morfolino]propanosulfônico NTf2 Anion bis(trifluorometilsulfonil)imida PEP Fosfoenolpiruvato PEG Polietilenoglicol PPBio Programa de Pesquisa em Biodiversidade PROBIO Projeto de Conservação e Utilização Sustentável da Biodiversidade Brasileira PROBIO II Projeto Nacional de Ações Integradas Público-Privadas para Biodiversidade PUC Pontifícia Universidade Católica PVPP Polivinilpirrolidona insolúvel Span 20 Monolaurato de sorbitana TPP Tiamina difosfato Triton X-100 Etoxilato de octilfenol Tween 80 Polioxietileno monooleato de sorbitana UDP Uridina-5’-difosfato UFC Universidade Federal do Ceará UFC2 Unidade Formadora de Colônia UFSC Universidade Federal de Santa Catarina Unicamp Universidade Estadual de Campinas Unifesp Universidade Federal de São Paulo UNIFOR Universidade de Fortaleza UV-VIS Ultravioleta-visível
2.1.3.2) Naturais ...................................................................................................................................... 28 2.1.3.2.1) De origem microbiana ........................................................................................................ 28 2.1.3.2.2) De origem vegetal .............................................................................................................. 28
3.3.1) Teor de Saponinas Totais .................................................................................................................. 69 3.3.2) Teor de Compostos Fenólicos Totais (ou Fenóis Totais) .................................................................. 71 3.3.3) Teor de Açúcares Redutores Totais ................................................................................................... 71 3.3.4) Índice de Emulsificação ..................................................................................................................... 71 3.3.5) Tensão Superficial ............................................................................................................................. 72 3.3.6) Atividade Antimicrobiana .................................................................................................................. 72 3.3.7) Concentração Micelar Crítica (CMC) .............................................................................................. 72 3.3.8) Atividade Antioxidante....................................................................................................................... 72 3.3.9) Determinação do Colesterol .............................................................................................................. 73 3.3.10) Determinação de Triton X-100 ........................................................................................................ 73 3.3.11) Produção de Agliconas por Hidrólise Ácida ................................................................................... 73 3.3.12) Atividade Enzimática ....................................................................................................................... 74 3.3.13) Determinação do Grau de Hidrólise (e Síntese) .............................................................................. 75
3.4) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ............................................................................. 77 3.4.1) Screening de matérias-primas ........................................................................................................... 77 3.4.2) Caracterização das Saponinas .......................................................................................................... 78 3.4.3) Extração das Saponinas .................................................................................................................... 80 3.4.4) Concentração das Saponinas ............................................................................................................ 83
3.4.4.1) Pré-concentração por Ponto de Névoa ....................................................................................... 83 3.4.4.2) Coluna de Espuma ..................................................................................................................... 84 3.4.4.3) Separação por Membranas ......................................................................................................... 86
3.4.5) Aplicação das Saponinas ................................................................................................................... 86 3.4.5.1) Alteração de Atividade Enzimática ............................................................................................ 86 3.4.5.2) Hidrólise e/ou Síntese enzimática .............................................................................................. 87
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................... 88 4.1) SCREENING DE MATÉRIAS-PRIMAS ............................................................................. 88
4.1.2) Seleção preliminar dos extratos ........................................................................................................ 88 4.1.3) Atividade Antimicrobiana .................................................................................................................. 90 4.1.4) Seleção Final ..................................................................................................................................... 92
4.3) EXTRAÇÃO DE SAPONINAS ............................................................................................ 107 4.3.1) Extração com solventes orgânicos verdes ....................................................................................... 107
4.3.1.1) Avaliação da Composição do Solvente .................................................................................... 107 4.3.1.2) Otimização da Extração por Planejamento Composto Central ................................................ 108 4.3.1.3) Cinética da Extração ................................................................................................................ 111
4.3.2) Extração com líquidos iônicos e análogos ...................................................................................... 113 4.3.2.1) Seleção dos líquidos iônicos e análogos .................................................................................. 113 4.3.2.2) Planejamento de misturas ........................................................................................................ 115 4.3.2.3) Otimização Seqüencial da Extração ......................................................................................... 118
4.3.3) Comparação dos Métodos de Extração ........................................................................................... 120 4.3.3.1) Juá ............................................................................................................................................ 120 4.3.3.2) Resíduo Mucilaginoso de Sisal ................................................................................................ 122 4.3.3.3) Resumo .................................................................................................................................... 123
4.4) CONCENTRAÇÃO DE SAPONINAS ................................................................................ 124 4.4.1) Pré-concentração por Ponto de Névoa............................................................................................ 124
4.4.1.1) Screening dos Sais ................................................................................................................... 124 4.4.1.2) Remoção do Triton .................................................................................................................. 125 4.4.1.3) Alternativas ao Triton .............................................................................................................. 128
4.4.2) Coluna de Espuma ........................................................................................................................... 129 4.4.3) Separação por Membranas.............................................................................................................. 138 4.4.4) Resumo ............................................................................................................................................ 139
xvi
4.5) APLICAÇÕES DAS SAPONINAS ...................................................................................... 140 4.5.1) Alteração da Atividade Enzimática por Saponinas ......................................................................... 140 4.5.2) Alteração da Atividade Enzimática por Agliconas .......................................................................... 144 4.5.3) Hidrólise enzimática ........................................................................................................................ 146 4.5.4) Síntese enzimática ............................................................................................................................ 151
Juá (Zizyphus joazeiro) Rhamnaceae Triterpênica Higuchi et al, 1984 Espada-de-são-jorge
(Sansevieria trifasciata) Ruscaceae Esteroidal Mimaki et al, 1996
Castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum)
Sapindaceae Triterpênica Yoshikawa et al, 1996b
Cipó-timbó (Serjania lethalis) Sapindaceae Triterpênica Teixeira et al, 1984 Salsaparrilha (Smilax officinalis) Smilacaceae Esteroidal Bernardo et al, 1996 Berinjela (Solanum melongena) Solanaceae Esteroidal Kintia & Shvets, 1985a Pimenta (Capsicum frutescens) Solanaceae Esteroidal De Lucca et al, 2006
Chá (Camellia sinensis) Theaceae Triterpênica Sagesaka et al, 1994
Batata doce (Ipomoea batatas) Convolvulaceae Triterpênica Dini et al, 2009
O conteúdo de saponinas nas plantas pode variar com a parte vegetal examinada, e
com fatores ambientais e agronômicos, como disponibilidade de nutrientes e água, e
necessidade de proteção contra herbívoros e patógenos (Augustin et al, 2011). Shi e
colaboradores (2007) exemplificaram isso ao investigar a presença de ginsenosídeos em
raízes, folhas e caule de Panax ginseng em idades diferentes, resultando uma maior produção
destes nas raízes com um ano de crescimento.
32
As saponinas também podem ser categorizadas de acordo com o número de
glicosilações na sua estrutura como mono-, di- ou tridesmosídicas. Saponinas
monodesmosídicas têm uma única glicosilação na aglicona, sendo geralmente ligada ao
carbono 3 (C3). Já as saponinas bidesmosídicas apresentam, além da ligação via éter em C3,
há também uma ligação via éster em C28 (aglicona triterpênica) ou uma ligação via éter em
C26 (aglicona furostanólica). Os monossacarídeos mais comuns incluem: D-glicose, D-
galactose, ácido D-glucurônico, ácido D-galacturônico, L-ramnose, L-arabinose, D-xilose e
D-fucose. As glicosilações podem ocorrer com apenas um monossacarídeo ou até com um
oligossacarídeo com 8 oses, distintas ou não, sendo o mais comum a presença de
trissacarídeos (Sparg et al, 2004; Vincken et al, 2007).
2.2.2) Biossíntese
Os precursores dos metabólitos especiais presentes nos vegetais são intermediários no
metabolismo primário, que se inicia a partir da fotossíntese, onde a glicose é gerada para
depois ser consumida na respiração e produzir água e CO2, sendo que esta ocorre em 3 etapas:
glicólise, ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa (Berg et al, 2004). Da glicólise, surge
o fosfoenolpiruvato (PEP), que ao reagir com a eritrose-4-fosfato deriva a via do ácido
chiquímico, precursora de aromáticos como alcalóides, aminoácidos e ácidos fenólicos; o
acetil-CoA, que gera duas vias: malonato, produzindo policetídeos e lipídeos; e mevalonato,
formando triterpenos, esteróis e saponinas (Figura 5). Intermediários das vias especiais
também podem se unir, criando uma biossíntese mista, como os flavonóides e tocoferóis
(Torssell, 1997). Há também outra via produtora de terpenóides, presente em vegetais, algas e
bactérias, chamada via do metileritritol fosfato (MEP), que tem como precursores o ácido
pirúvico e gliceraldeído fosfato cuja reação é mediada pela tiamina difosfato (TPP), gerando
muito mais isopentenila difosfato (IPP) do que a via do mevalonato. Na planta, estas vias
ocorrem em locais diferentes: a via do mevalonato, no citosol; e a via do MEP, nos
cloroplastos (Kalinowska et al, 2005; Dewick, 2009; Augustin et al, 2011; Osbourn et al,
2011).
33
Figura 5 – Esquema geral da via do mevalonato (Dewick, 2009)
O principal precursor dos triterpenos e esteróis é o esqualeno, que se oxida através da
esqualeno epoxidase (EE), gerando o 2,3-óxido de esqualeno que, por sua vez, por ciclizações
e rearranjos através das oxidoesqualeno ciclases, produz dois cátions: dammarenila (forma as
principais agliconas triterpênicas) e protosterila (nas plantas através do cicloartanos gera as
agliconas esteroidais). A biossíntese destas agliconas pode ser melhor visualizada na Figura 6
(Haralampidis et al, 2002; Xu et al, 2004; Philips et al,2006; Vincken et al,2007; Dewick,
2009).
Depois da formação das agliconas, várias modificações podem ocorrer através de
enzimas do citocromo P450, com hidroxilação e carboxilação, ou através de aciltransferases,
com a inserção de grupos N-metila antranilatos, benzoíla ou DDMP, antes da glicosilação
para geração das saponinas, que é promovida de forma seqüencial onde as glicosiltransferases
com auxílio da UDP (uridina-5’-difosfato) inserem o monossacarídeo primeiro no C-3, e
depois podem continuar aumentando a cadeia ou glicosilar em outra posição (Haralampidis et
34
al, 2002; Kalinowska et al, 2005; Augustin et al, 2011; Osbourn et al, 2011). A glicosilação
geralmente está associada a modulação da estabilidade do metabólito, atividade biológica,
solubilidade, e sinalização para acúmulo ou transporte celular (Augustin et al, 2011)
O
EENADPHFAD
O2
Esqualeno
2,3-óxido de esqualeno
HO
H
H
HO
H
H
H
H
H
H
CiclizaçãoRearranjo
cátion protosterila
cátion damarenila
HO
H
H
H
cátion bacarenila
migração alquila LS
β-AS
HO
H
H
H
cátion lupanila
LS
β-AS
DSH2O
Damaranos
H LS Lupanos
H+
HO
H
H
H
cátion oleanila
H
migração alquila β-AS
Oleananos
H+
β-ASmigração hidreto
migração metila
HO
H
H
H
cátion taraxasterila
H
H
Ursanos
H+
α-ASmigração hidreto
H+
Taraxasteranos
LaS
CyS
CS Cucurbitanos
Lanostanos
migração hidreto, metila
CH3
Cicloartanos
H+
migração metilaTirucalanos
H
H
H
cátion hopanila
H
H
EHC
EHCHopanos
HO colesterol
H
H
H
ED
3 CH3 Esteróis
2 H+
Hidroxilações
migração hidreto, metila
migração hidreto, metila
Figura 6 – Biossíntese das agliconas triterpênicas e esteroidais. Enzimas: LS (lupeol sintase); β-AS (β-amirina sintase); α-AS (α-amirina sintase); DS (damarenediol sintase); CS (cucurbitadienol sintase); CyS (cicloartenol sintase); LaS (Lanosterol sintase); EHC (Esqualeno-hopeno ciclase); ED (esterol demetilases: esterol 14-demetilase, esterol ∆14-redutase e esterol C-4 demetilase) (Dewick, 2009)
35
2.2.3) Propriedades
2.2.3.1) Propriedades micelares As propriedades micelares das saponinas, como CMC, densidade superficial máxima e
número de agregação (número de monômeros em uma micela), são muito importantes para
aplicações como surfactantes e espumógenos. Estas são influenciadas por variáveis como
temperatura, concentração salina, pH da fase aquosa, concentração e tipo de solvente (etanol,
metanol). Além disso, as micelas formadas em soluções aquosas podem variar em tamanho e
forma em função do tipo de saponina (Mitra & Dungan, 1997; 2000).
Como exemplos, a CMC de uma solução neutra de quilaia (Quillaja saponaria; Mitra &
Dungan, 1997) varia entre 0,5 – 0,77 g/L, a 25ºC, mas a 52ºC esta aumenta para 0,8 – 1,07 g/L.
Quando há variação de pH, a CMC varia entre 1,0 – 1,3 g/L a pH 8,8 e entre 0,1 – 0,2 g/L a pH
3,0, sendo este último resultado similar à variação encontrada quando a concentração de NaCl na
solução neutra de quilaia está em 1,0M. Decroos e colaboradores (2007) observaram que três
fatores estruturais influenciam a CMC, alterando a área hidrofóbica disponível: o número de
cadeias de oses (monodesmosídeos apresentam menor CMC que os bidesmosídeos); conjugação
com grupos substitutos (presença do grupo DDMP aumenta a CMC) e presença de grupos acetila
(também diminui mais a CMC que saponinas não-acetiladas). Pekdemir e colaboradores (1999)
relataram a ação de alguns eletrólitos sobre o CMC da β-escina da castanha da índia, tendo o valor
inicial de 0,78 mM alterado para 1,69, 2,20 e 0,47 mM quando na presença de solução de 3 M de
uréia, 3 M de glicose e água do mar, respectivamente. Estes autores também dissertam sobre o
efeito de alcoóis com vários tamanhos de cadeia sobre a tensão superficial das saponinas, onde
cadeias maiores geram uma menor tensão superficial, devido a uma maior interação com o grupo
hidrofóbico da saponina, promovendo uma maior adorção desta na interface água-ar.
Mitra e Dungan (1997) também determinaram Γmax das saponinas da quilaia como 0,2
mmol/cm², resultando numa área ocupada por molécula na interface de 83 Ǻ², que é próximo do
dobro da área encontrada para um surfactante não-iônico típico como C15E8 (octaetoxilato de
pentadecila), 45,2 Ǻ², a 298 K. Stanimirova e colegas (2011) relataram um valor um pouco
superior de 113 ± 4 Ǻ² de área ocupada por molécula de saponina de quilaia na interface, muito
provavelmente devido a diferentes fontes de quilaia, que a partir do processamento, pode ter
gerado alguma modificação estrutural nas saponinas. Devido a esse valor de área encontrado, os
autores verificaram através de modelagem molecular que a orientação lay-on (todos os grupos
hidrofílicos imersos em água) das saponinas na interface água-ar seria mais indicada do que a
orientação end-on (apenas um grupo hidrofílico imerso em água), que teria uma área de 30 Ǻ²
(Figura 7).
36
Figura 7 – Orientações possíveis de saponinas na interface água-ar (Stanimirova et al, 2011) A solubilização micelar de compostos com baixa ou nenhuma solubilidade em água
também é possibilitada pelas saponinas. Isso permite seu uso em processos de lavagem e
biorremediação de poluentes como a solubilização de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
(Güçlü-Üstündag & Mazza, 2007), fenantreno (Zhou et al, 2011), hexaclorobenzeno
(Kommalapati et al, 1997), naftaleno (Roy et al, 1997), petróleo (Urum & Pekdemir, 2004;
Pekdemir et al, 2005) e no estímulo a bactérias na biodegradação de hidrocarbonetos alifáticos
(Kaczorek et al, 2008), e no aumento da biodisponibilidade de fármacos hidrofóbicos, como
carbamazepina e flurbiprofeno (Peixoto et al, 2011), progesterona, alfa-tocoferol (Sasaki et al,
1988) e quercetina (Güçlü-Üstündag & Mazza, 2007), além de aumentar a solubilização de outras
saponinas, como as monodesmosídicas (Morita et al, 1986; Sasaki et al, 1988).
2.2.3.2) Interações com Esteróis As saponinas são conhecidas por interagirem com esteróis formando complexos com
ergosterol, colesterol e fitoesteróis. Esta interação é base de uma gama variada de atividades
biológicas e farmacológicas associadas a aspectos estruturais (tipos de agliconas e cadeias de
monossacarídeos), como atividade hemolítica, atividade antifúngica, antiprotozoário e
Outro bulbo que possui saponinas (entre 0,01 e 0,03%, Figura 10D) é o lírio,
pertencente ao gênero Lilium (Família Liliaceae) com mais de 100 espécies, sendo 4
variedades híbridas comuns no Brasil: longiflorum, asiáticos, orientais e L.A. (híbrido de
longiflorum e de asiático). Em seu bulbo, também há flavonóides, alcalóides, fitoesteróis e
esteróides. Poucos dados sobre a produção de lírio estão relatados na literatura, mas como as
flores de lírio são a terceira na preferência em vendas, e a produção de flores de corte e
plantas ornamentais no Brasil se manteve em 50 mil toneladas em 2007, pode-se imaginar que
a quantidade produzida seja significativa. Em relação à produção de bulbos, há um relato da
produção de 11,5 milhões de bulbos comercializados nos Estados Unidos e Canadá em 1996.
No Brasil, a produção de bulbos e flores de lírios ocorre principalmente em Holambra (SP)
(Mimaki & Sashida, 1990; Mimaki et al, 1999; Erdogan et al, 2001; Caixeta-Filho et al, 2002;
Fráguas et al, 2002; Eisenreichová et al, 2004; Junqueira & Peetz, 2008; http://aggie-
horticulture.tamu.edu/, 2010).
48
Já os tubérculos do gênero Dioscorea (Família Dioscoreaceae), com mais de 600
espécies espalhadas pelo mundo, são bem conhecidos por possuir grande quantidade de
amido, mas sempre houve muito desentendimento em torno do seu nome comum, cará e
inhame, devido à semelhança com a espécie Colocasia esculenta (Família Araceae). Por isso,
em 1999 foi proposta a padronização da nomenclatura onde inhame seriam as espécies
relacionadas ao gênero Dioscorea, e taro seria o nome vulgar da espécie Colocasia esculenta.
As espécies comercializadas no Brasil são inhame ou cará (D. alata), cará-doce (D. trifida),
cará-da-costa (D. cayennensis), cará-de-rama ou cará-do-ar (D. bulbifera) e cará-barbado ou
caratinga (D. dodecaneura). Além de amido, seus tubérculos possuem saponinas (variando de
0,08 a 5%, Figura 10E), proteínas, flavonóides, ácidos fenólicos, tocoferóis, cromenos,
coenzima Q e mucilagem. A produção mundial de inhame é de 48,7 milhões ton, e no Brasil
de 232 mil ton (Mascarenhas & Resende, 2002; Pedralli et al, 2002; Sautour et al, 2006;
Cheng et al, 2007; Huang et al, 2007; Lin & Yang, 2008; http://faostat.fao.org/, 2010).
Figura 10 - Saponinas de bulbos e tubérculo: (A) Erubosídeo B (Alho); (B) Aliospirosídeo D (Cebola), (C) Saponina esteroidal de alho poró, (D) Saponina esteroidal de lírio; (E) Dioscina.
49
As propriedades espumógenas das cascas de Quillaja saponaria (Família
Quillajaceae) foram observadas pelos índios Mapuches do Chile desde tempos antigos,
utilizando-as para lavagem de roupas e cabelo. Essas propriedades estão associadas
diretamente com as saponinas (entre 5 e 20%, Figura 11A), presentes na casca, que também
possui taninos, proteínas, oxalato de cálcio e açúcares. De 20 mil toneladas de árvores
cortadas anualmente para extração, apenas 11% do peso obtido da biomassa, que representam
a casca, são usados. Por isso alguns estudos estão sendo feitos para que se utilize a árvore
inteira para extração de saponinas. Dois tipos de extrato de quilaia são oferecidos no mercado:
o Tipo 1, que possui 20-26% de saponinas e o Tipo 2, que alcança 70-95% de saponinas
devido ao processo de concentração por ultrafiltração. Suas principais utilizações são em
dentifrícios, bebidas e adjuvantes em vacinas (San Martín & Briones, 1999; Copaja et al,
2003; Resnick, 2004).
O juá (Ziziphus joazeiro, Família Rhamnaceae) ocorre no Brasil desde o Ceará até
Mato Grosso do Sul, sendo muito importante para o Sertão Nordestino, que utiliza suas folhas
para alimentação do gado, seus frutos como alimento e suas cascas como detergente,
dentifrício e fitoterápico. A sua produção se dá de forma exclusivamente extrativista. O
gênero Ziziphus possui mais de 30 espécies, sendo que além do juá, mais 4 são encontradas no
Brasil: Z. cinnamomum, Z. cotinifolia, Z. platyphylla e Z. undulata. Além das saponinas
(jujubosídeos, entre 2 a 10%, Figura 11B), são encontrados nas suas cascas triterpenos,
estearato de glicerila, alcalóides (amphibinas) e cafeína (Higuchi et al, 1984; Barbosa-Filho et
al, 1985; Barbosa-Filho, 1997; Schühly et al, 2000; Carvalho et al, 2007;
http://www.cnip.org.br/, 2010).
O gênero Uncaria (Família Rubiaceae) é representado por 60 espécies de lianas, sendo
que na Amazônia e na América Central duas espécies chamadas de unha-de-gato são mais
comuns: U. tomentosa e U. guianensis. No Brasil, sua produção é por sistema de coleta,
enquanto no Peru já há o cultivo com produção anual de 700 toneladas. Seu principal uso é
como fitoterápico, apesar de estudos recentes terem verificado sua ação larvicida. Suas cascas
apresentam saponinas (cerca de 0,6%, Figura 11C), flavonóides, alcalóides oxindólicos,
triterpenos, taninos e fitoesteróis (Cerri et al, 1988; Elliot, 2000; Miranda et al, 2001; Valente
et al, 2006, 2009).
50
Figura 11 – Saponinas de cascas de tronco: (A) Saponina geral de quilaia (R pode ser xilose, ramnose ou apiose); (B) Jujubosídeo sulfatado; (C) Saponina 1 de unha-de-gato
2.3.3) Folhas
Centella asiatica, é uma erva da família Araliaceae, e é oriunda de regiões quentes de
ambos os hemisférios, sendo abundante em áreas pantanosas da Índia, Iran e Paquistão. A
centela possui diferentes variedades em relação à origem geográfica que estão correlacionadas
com a morfologia foliar e sua composição química: C. asiatica var. typica (Ásia tropical e
Madasgacar), C. asiatica var. abyssinica (África tropical e equatorial) e C. asiatica var.
floridana (Sul dos Estados Unidos até Argentina e Oceania). Não foram encontrados relatos
econômicos sobre esta planta, levantando-se a hipótese, portanto, que sua produção seja por
coleta. As partes aéreas da planta contêm saponinas (asiaticosídeo e madecassosídeo, 3 a
12%, Figura 12A), triterpenos, flavonóides, fitoesteróis, óleo essencial, clorofila, lipídeos e
poliacetilenos. Seu uso é como fitoterápico (Inamdar et al. 1996; Bajaj, 1998; Yu et al, 2007;
Zheng & Qin, 2007; Subban et al, 2008; Rafamantanana et al, 2009).
51
O gênero Hedera (Família Araliaceae) consiste de 15 espécies distribuídas pela Europa,
Norte da África, Macaronésia e Ásia. A hera (Hedera helix) possui 3 subespécies: H. helix subsp.
helix (Norte, Oeste e Centro da Europa), H. helix subsp. poetarum (Sul da Europa e da Ásia) e H.
helix subsp. rhizomatifera (Sul da Espanha), com mais de 100 cultivares. Sua produção é pequena
com apenas 26 ton. Sua utilização é como planta ornamental e fitoterápico (com restrições devido
a sua toxidez). Suas folhas possuem saponinas (entre 4 e 6%, Figura 12B), triterpenos, óleo
essencial, ácido abscisico, flavonóides, ácidos fenólicos, clorofila, emetina e falcarinol (Elias et
al, 1991; Bedir et al, 2000; Ackerfiled & Wen, 2002; Medeiros et al, 2002; Censkowsky et al,
2007; Pennisi et al, 2009).
As folhas de chá (Camellia sinensis, Família Theaceae) são consumidas há mais de 5000
anos na China. É a segunda bebida mais popular do mundo, sendo produzidos 4,5 milhões de
toneladas por ano, e apenas 0,4% da produção no Brasil. O chá possui duas variedades: assamica
e sinensis, e pode ter diferentes processamentos gerando produtos como chá verde, preto, oolong,
vermelho, branco e amarelo. Em suas folhas se encontram flavonóides, metilxantinas, óleo
essencial, aminoácidos, polissacarídeos, clorofila, saponinas (entre 0,25 e 0,3%, Figura 12C) e
triterpenos (Sagesaka et al, 1994; Wang et al, 2000; Kobayashi et al, 2006; Lima et al, 2009;
Sharangi, 2009; http://faostat.fao.org/, 2010).
A erva-mate (Ilex paraguariensis, Família Aquifoliaceae) é originária da Região Sul do
Brasil, que, em conjunto com Argentina, Uruguai e Paraguai produzem mais de 760 mil toneladas
por ano. Aproximadamente 30% da população destes países consomem mais de 1 litro da bebida
de erva-mate todo dia. Suas folhas possuem saponinas (entre 0,7 e 1%, Figura 12D),
metilxantinas, ácidos fenólicos, flavonóides e clorofila (Gosmann et al, 1995; Gnoatto et al, 2005;
Heck & De Mejia, 2007; Efing, 2008; Sugimoto et al, 2009; http://faostat.fao.org/, 2010).
O sisal (Agave sisalana, Família Asparagaceae) é a principal fibra dura produzida no
mundo, correspondendo a 70% da produção comercial de fibras. No Brasil, o cultivo do sisal se
concentra na região Nordeste, alcançando mais de 350 mil toneladas/ano através de pequenos
produtores, com predomínio do trabalho familiar. Apesar da sua boa adaptação ao país, o sisal não
é nativo, e sim originário do México, tendo sido introduzido no Brasil em 1903. Das suas folhas
são extraídas as fibras longas, que só representam 3 a 5% do seu peso. Os 95 a 97% restantes
constituem os chamados resíduos do beneficiamento (“suco do sisal”), que são aproveitados como
adubo orgânico, ração animal, bioinseticida e intermediário de síntese de drogas esteroidais pela
indústria farmacêutica.
52
Isso ocorre por que o suco do sisal, que tem saponinas esteroidais (0,21 – 1,25%,
Figura 12E), sofre uma fermentação anaeróbica, iniciada 2 dias após a extração, gerando as
sapogeninas, hecogeninas e tigogenina. Outros constituintes também estão presentes neste
resíduo do sisal, como isoflavonóides, hemiceluloses e ramnogalacturonana (Ding et al, 1989,
1993; Stewart et al, 1997; Oashi, 1999; Pizarro et al, 1999; Zou et al, 2006; Chen et al, 2009;
Martin et al, 2009; Narváez-Zapata & Sanchez-Teyer, 2009; Debnath et al, 2010).
Das 485 espécies do gênero Passiflora, de 150 a 200 são nativas do Brasil, que é o
maior produtor mundial da fruta com 920 mil toneladas/ano. As espécies mais
comercializadas no Brasil são a P. edulis (maracujá-azedo) e P. alata (maracujá-doce). Suas
folhas apresentam saponinas (0,1-0,8%, Figura 12F), fitoesterol, flavonóides, alcalóides
indólicos e maltol (Soulimani et al, 1997; Reginatto et al, 2001, 2004; Müller et al, 2005;
Recentemente, novos LI e análogos estão sendo sintetizados com intuito de serem mais
funcionais e biodegradáveis, além de menos onerosos, surgindo então os líquidos iônicos
biocompatíveis, com cátions colinio (Ch), efedrínio e oxazolinio, e ânions derivados de
aminoácidos, ácidos orgânicos e ácidos graxos (Fukaya et al, 2007; Imperato et al, 2007; Pernak
64
et al, 2007); os solventes eutéticos (deep eutectic solvents), que se formam a partir da mistura de
duas substâncias, que apresenta um ponto de fusão menor que as substancias sozinhas, tendo
como exemplo a mistura molar 1/2 cloreto de colina (ChCl) e uréia (Abbott et al, 2003), ou de
ChCl e glicerol (Shahbaz et al, 2011); e os líquidos iônicos reversíveis (switchable), que se
formam com o borbulhamento de CO2 em um líquido (ou mistura) neutro, sendo reversível com
aquecimento ou passagem de N2 ou argônio no LI, um exemplo a formação do DIMCARB (N,N-
dimetilamonio N’,N’-dimetilcarbamato) pela passagem de CO2 em dietilamina, ou então a mistura
de um derivado de amidina, como o DBU (1,8-diazabicicloundec-7-eno) e um álcool, como
butanol ou hexanol (Blasucci et al, 2010; Hart et al, 2010; Olivier-Bourbigou et al, 2010). Até
agora, nenhum trabalho sobre extração de saponinas de matrizes vegetais por líquidos iônicos
como solventes ou co-solventes foi publicado.
2.5) MÉTODOS DE CONCENTRAÇÃO
Uma terceira etapa é a concentração das saponinas através da partição destas entre
extratos aquosos (com álcoois já removidos por evaporação) e n-butanol. Etapas adicionais
podem ser realizadas, como a precipitação por solventes, a formação de complexos, a
adsorção em resinas macroporosas (Jia & Lu, 2008) ou em sílicas baseadas em líquidos
iônicos (Tian et al, 2009), a separação por membranas, a pré-concentração por ponto de névoa
(Quina & Hinze, 1999), a separação bifásica aquosa e/ou o fracionamento por coluna de
espuma. Posteriormente, pode-se realizar a purificação de cada saponina através de métodos
cromatográficos, sendo que estes, na sua maioria, ainda estão limitados a escala analítica
(Hostettmann & Marston, 2005; Güçlü-Üstündag & Mazza, 2007). Exceções são os estudo de
Du & Gao (2006), Decroos et al (2007) e Qi et al (2010) que utilizaram cromatografia
preparativa para a purificação destes compostos.
A precipitação de saponinas pode ocorrer tanto em soluções etanólicas pela adição de
acetona ou éter etílico quanto em soluções aquosas pelo uso de acetato de chumbo ou
hidróxido de bário (Oleszek, 2000; Dobbins, 2002). Já os complexos são formados na
presença de colesterol (Micich et al, 1992; Hwang & Damodaran, 1994) e de beta-
ciclodextrina (Lee et al, 2006; Brewster & Loftsson, 2007). Estratégias indiretas de
concentração também já foram realizadas como a utilização de PVPP (polivinilpirrolidona,
Sagesaka et al, 1994) e a lavagem da fração butanólica com uma solução 1% p/v de NaOH
(Gosmann et al, 1995) para remoção de compostos fenólicos.
65
2.5.1) Separação por Membranas
Os processos de separação por membranas, como microfiltração, diafiltração,
ultrafiltração e nanofiltração são baseados na permeabilidade seletiva da membrana em relação ao
tamanho do metabólito, que pode variar de 1 nm até 10 µm, ou então com massas molares entre
0,1 a 100 kDa, tendo como força-motriz a pressão de 1 a 35 bar (Kumar, 2007; Li & Chase,
2010).
Muir e colaboradores (2002) elaboraram uma patente para concentração de saponinas de
quinoa testando processos de ultra- e nanofiltração, alcançando os melhores resultados com
membranas de 0,3 kDa, recuperando 99% das saponinas no retentado. Yapo e colaboradores
(2007) utilizaram membranas com massa molar de corte de 10 kDa em soluções ricas em pectina
de beterraba para separar as saponinas no permeado, possivelmente devido a baixa concentração
destas, pois San Martín e Briones (1999) afirmam que maiores concentrações saponinas
possibilitam a geração de micelas, que poderiam ser retidas por membranas de ultrafiltração de
10-30 kDa. Similarmente, alguns autores como Marciani et al (2000), Kamstrup et al (2000), San
Martín et al (2008), e Stuardo & San Martín (2008) utilizam o sistema de ultrafiltração com
membranas de 10 kDa para concentração das saponinas de quilaia e de quinoa. Apenas Kim e
colaboradores (2003) realizaram uma etapa de ultrafiltração (100 kDa) e uma de diafiltração (20
kDa) na concentração de saponinas de quilaia e Yucca shidigera , sendo a primeira para remoção
de proteínas e polissacarídeos, e a segunda etapa para remoção de polifenóis, sais e açúcares.
2.5.2) Separação por Sistemas Aquosos Bifásicos
A pré-concentração por ponto de névoa é a etapa posterior à extração micelar, onde o
aumento de temperatura (no caso de surfactantes não-iônicos) favorece a separação das micelas da
solução formando duas fases, uma rica em surfactante (fase supramolecular) e outra rica em sal
(fase salina), podendo ser necessário a adição de sal para induzir a separação. Caso a fase micelar
se torne muito viscosa, podem ser empregados agentes de diluição como água, metanol, etanol e
acetonitrila para facilitar sua manipulação (Quina & Hinze, 1999; Ballesteros-Gómez et al, 2010).
Fang e colaboradores (2000) observaram que com adição de 0,5% p/v de sulfato de sódio a
eficiência de extração de ginsenosídeos alcançava a 100%, obtendo uma material 7 vezes mais
concentrado, enquanto que o ponto de névoa induzido apenas por temperatura só conseguia uma
eficiência próxima dos 80% e uma concentração apenas 2 vezes maior do que o material inicial.
Já Sun e colaboradores (2007b) utilizaram cloreto de sódio (20% p/v) para auxiliar no ponto de
névoa, concentrando 13,2 vezes e recuperando 98% do ácido glicirrízico. Enquanto Choi e
colaboradores (2003) adicionaram sulfato de amônio (40% p/v) ao extrato de ginseng e obtiveram
um fator de concentração de 35 vezes.
66
A separação em sistema bifásico aquoso ocorre similarmente à extração líquido-líquido. O
sistema é geralmente composto por polímeros e sal, ou dois polímeros incompatíveis
(polietilenoglicol e dextrana), sendo que a partição das moléculas vai depender das suas
propriedades físico-químicas, como hidrofobicidade e carga, e da composição do sistema, como o
tipo e a concentração do polímero e/ou do sal (Hatti-Kaul, 2000). Han e colaboradores (2008)
reportaram o uso de sistema bifásico aquoso (adição de 1,12 g de PEG 4000, 1,2 g de K2HPO4 em
0,2 mL de etanol a 12 mL de extrato aquoso de Momordica charantia) onde depois de
homogeneizada e centrifugada, a fase salina foi lavada com etanol 95% por três vezes. As fases
alcoólicas foram reunidas e mantidas em repouso a 4ºC para precipitação de sal residual, sendo
centrifugada e evaporada para isolamento das saponinas. Infelizmente, neste trabalho não há
relato sobre fator de concentração nem da recuperação das saponinas.
Outras possibilidades de sistemas baseados em partição são: (i) o sistema líquido trifásico,
em que se utiliza uma fase orgânica, um polímero, sal inorgânico e água, como Shen et al (2007),
que separou ácido glicirrízico testando sistemas usando 2-etil hexanol, tributilfosfato e óxidos de
trialquilfosfinas como fase orgânica, polietileno glicol e sulfato de amônio, (ii) ou então como Liu
et al (2010b) que separou saponinas esteroidais utilizando éter de petróleo como fase orgânica,
etanol 30% e sulfato de amônio; e (iii) o sistema bifásico sem adição de PEG, apenas alcoóis e
sais, como descrito por Tianwei et al (2002), que utiliza sistemas com 60% etanol ou 2-propanol e
15% sulfato de amônio ou fosfato monobásico de potássio alcançando a recuperação de 92% de
glicirrizina na fase superior etanólica.
2.5.3) Fracionamento por Coluna de Espuma
A espuma consiste em um grande número de pequenas bolhas dispersas em uma fase
líquida contínua, separadas por uma fina película. Sua estabilidade depende principalmente da
resistência a perda (drenagem) do solvente do filme líquido que envolve o gás (Costa, 1999).
Assim, o uso de coluna de espuma (Figura 16) tem como premissa a concentração de soluções por
adsorção preferencial em uma interface gás-líquido criada por aspersão de ar ou gás inerte pela
solução, formando uma espuma estável rica no surfactante (Grieves, 1975; Singh & Rizvi, 1995).
Costa (1999) conseguiu concentrar em até 10 vezes as saponinas de quilaia, utilizando
uma coluna de 175 cm de altura e 2,5 cm de diâmetro interno com uma vazão de ar comprimido
de 22,60 mL/min, passando por uma solução com concentração de 80 mg/L de saponinas a pH 3
durante 3,5h. Yan e colaboradores (2011) realizaram a separação das saponinas do chá por este
método só que em 2 etapas: a primeira com vazão de ar de 150 mL/min e 65ºC obtendo uma
67
maior concentração (3,47), e na outra etapa, eles aumentaram a vazão para 200 mL/min e 30ºC,
uma maior recuperação das saponinas (65,2%). Thompson (2004) e Backleh-Sohrt et al (2005)
demonstraram que o uso da coluna de espuma com auxílio de saponinas também pode ser
interessante para concentração de outras moléculas, como catequinas, ésteres de faradiol,
carotenóides, cafeína, alcalóides indólicos e canabinóides.
Figura 16 – Interface entre solução com bolhas e espuma em uma coluna de espuma
Utilizando esta propriedade espumógena das saponinas, uma nova abordagem tem sido
utilizada, a microespuma (colloidal gas aphrons), gerada a partir de intensa agitação (5 a 10 mil
rpm), composta normalmente de 65% gás e com diâmetro das bolhas entre 25 e 300 µm, e que
tem sido utilizado como um novo solvente verde (Save & Pangarkar, 1994; Jauregi & Varley,
1999). As saponinas proporcionam uma microespuma mais estável (10 min) do que as geradas por
outros surfactantes (4-5 min) (Kommalapati et al, 1996). A microespuma já foi utilizada para
recuperação de proteínas e carotenóides (Jauregi et al, 1997; Alves et al, 2006), e até mesmo
como carreador de oxigênio em cultivos de bactérias (Park et al, 2009).
68
CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1) MATERIAIS Ao todo 38 plantas, sob formas variadas, foram adquiridas no comércio de acordo com
a Tabela 4, e tiveram suas identidades certificadas pela Profª Ana Cláudia Vieira, do
Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da UFRJ, através de exame
microscópico das plantas, para assim poderem ser utilizadas no preparo de extratos.
Tabela 4 – Plantas utilizadas para o estudo de saponinas
Nome vulgar Nome científico Parte utilizada Estado na compra Local de obtenção
Alcaçuz Glycyrrhiza glabra L. raiz pó Mercado local Alho Allium sativum L. bulbo inteiro Comércio popular
Alho porro Allium porrum L. bulbo (talos) inteiro Comércio popular Amaranto Amaranthus cruentus L. semente inteiro Embrapa Amendoim Arachis hypogaea L. semente inteiro Mercado local
Aveia Avena sativa L. semente flocos Comércio popular Berinjela Solanum melongena L. fruto + semente inteiro Comércio popular
Beterraba (f) Beta vulgaris L. folha inteiro Comércio popular Beterraba (t) Beta vulgaris L. tubérculo inteiro Comércio popular
Bucha Luffa cylindrica M. Roem. fruto inteiro Fazenda (MG) Calêndula Calendula officinalis L. flores inteiro Mercado local
Cará Dioscorea alata L. tubérculo inteiro Comércio popular Castanha-da-
índia Aesculus hippocastanum L. semente inteiro Mercado local
Cebola Allium cepa L. bulbo inteiro Comércio popular Centella Centella asiatica (L.) Urb partes aéreas pedaços Mercado local
Chá verde Camellia sinensis (L.) Kuntze folhas pedaços Mercado local Ervilha Pisum sativum L. semente inteiro Mercado local Fáfia Pfaffia paniculata Kuntze. raiz rasurado e pó Mercado local
¹ Método pelo tensiômetro; ² Método turbidimétrico
Os resultados da influência de fatores como pH, temperatura e concentração salina sobre a
CMC podem ser visualizados na Tabela 14. Para cada CMC calculada pelo método
turbidimétrico, foi medida a tensão superficial relacionada (tensão crítica) ao CMC e às suas
variações de ± 20%. Assim o extrato de sisal teve uma variação de CMC entre 0,15 a 0,45 g/L,
com tensões críticas de 33,57 a 45,13 mN/m, enquanto a CMC do extrato de juá flutuou entre 0,08
e 0,55 g/L e a tensão correlacionada entre 33,94 e 46,52 mN/m.
Para melhor avaliar a influência dos três fatores citados e suas interações sobre a CMC dos
extratos de juá e sisal no planejamento experimental composto central, foi necessária a utilização
de ferramentas estatísticas fornecidas pelo programa STATISTICA 6.0.
Tabela 14 – Resultados da análise da variação de CMC e tensão crítica dos extratos de juá e sisal utilizando planejamento composto central descrito na Tabela 5
Sisal (11) Cantalasaponina 1 773,9 Chen et al, 2010 Sisal (12) Poliantosídeo E 1542,6 Chen et al, 2010
Figura 22 – Saponinas do juá (Tabela 19)
104
Figura 23 – Saponinas do sisal (Tabela 19)
105
A partir do íon molecular (M), foram simuladas todas as possíveis degradações das
saponinas, removendo os açúcares um por um, até sobrar a aglicona, que neste trabalho, foi
tomada como exemplo e padrão a diosgenina (Figura 24).
Figura 24 – Espectro de massas da diosgenina
Para melhor compreensão, foram gerados espectros de massas tanto no modo positivo
como no negativo. Durante a ionização por “electrospray”, três tipos de íons podem ser
gerados: íons moleculares (M+•) ou (M–•), a partir de reações redox; moléculas
protonadas/desprotonadas (íons quasi-moleculares, [M+H]+ ou [M-H]-), a partir de reações
ácido/base; e moléculas cationizadas ou anionizadas ([M+Na]+, [M+K] +, ou [M+Cl]-), por
coordenação com os íons (Crotti et al, 2006). Assim, dados de m/z que apresentarem uma
variação de 1, 23, 32 e 39 pode resultar da presença de H, Na, CH3OH e K, respectivamente.
Os espectros de massa no modo negativo das saponinas do juá são vistos na Figura 25.
No ESI (-), a faixa de m/z 470 até 510 indicaria a hidrólise da saponinas, formando as
agliconas, e m/z 560 até 940 seria a hidrólise parcial das saponinas. Assim, foi verificado o
pico m/z 455,35 pode representar a ebelin lactona, um derivado da hidrólise ácida da
jujubogenina, e o pico m/z 471,35 foi identificado como a jujubogenina. Os demais picos
estão todos na região acima de m/z 900 apontando para picos de saponinas, onde entre m/z
900 e 1100 podem estar as saponinas descritas na literatura, como o pico m/z 977,44, a
saponina 2 do juá, m/z 1077,42, a saponina 6 do juá, e m/z 1093,54, saponina 5 do juá; e
acima de m/z 1100 são saponinas ainda desconhecidas.
Alguns picos foram selecionados para investigação da estrutura por MS/MS (ver
Anexo, Figura 74): m/z 991, possivelmente presença de uma pentose e de um grupo sulfato;
106
m/z 1009, pelo menos uma pentose; m/z 1139, uma hexose, uma ramnose e um grupo sulfato;
m/z 1167, uma ramnose e um grupo sulfato; m/z 1193, uma ramnose, pentose e um grupo
sulfato.
Figura 25 – Espectro de massa das saponinas do juá
Já no espectro de massa no modo negativo das saponinas de sisal (Figura 26), como há
uma variedade de massas molares, as faixas de m/z são mais relativas, limitando apenas uma
faixa inicial de m/z 400 até 440 indicando a geração das agliconas. Assim, foi verificado o
pico m/z 771,42 como a saponina 11 do sisal (cantalasaponina 1); pico m/z 1047,50, pode ser
associada a saponina 9 do sisal; pico m/z 1179,54, seria o dongnosídeo C; pico m/z 1193,56,
pode ser identificado como o dongnosídeo A, sem xilose; pico m/z 1209,56, seria o
dongnosídeo B; e pico m/z 1325,60 relativo a saponina 8 de sisal.
Alguns picos também foram selecionados para investigação da estrutura por MS/MS
(ver Anexo, Figura 75), como m/z 771, 1047, 1193 e 1325, mas estes já foram
correlacionados com os dados da literatura.
107
Figura 26 - Espectro de massa das saponinas do sisal
4.3) EXTRAÇÃO DE SAPONINAS
4.3.1) Extração com solventes orgânicos verdes Como nesta etapa, a matéria-prima relacionada ao sisal foi substituída (do sisal inteiro
cominuído para o resíduo mucilaginoso de sisal), foi determinado o teor de água e de
saponinas neste resíduo e também no resíduo líquido de sisal, resultando em valores de 89,42
e 91,50% de água, e 0,92 e 2,44% de saponinas, respectivamente.
4.3.1.1) Avaliação da Composição do Solvente Para extração das saponinas do juá e do sisal foram utilizados água e etanol 95%
como solventes verdes, variando a proporção entre estes de 0 a 100% v/v etanol, como é
mostrado pela Figura 27 e 28, e avaliando o teor de saponinas e fenóis totais obtidos.
A maioria dos trabalhos utiliza uma faixa de 40 a 80% de etanol para extração de
saponinas, valores próximos ao encontrado neste trabalho, que variam de 25 a 85% de etanol,
no caso do juá. Já para o resíduo mucilaginoso de sisal, muito das saponinas permaneceram
no resíduo líquido de sisal, gerando um perfil diferente com maior extração de saponinaas em
30% de etanol e na faixa de 80 a 100% de etanol. A proporção escolhida nos dois casos foi de
30% de etanol, já que possui maior quantidade de água, o que favorece uma menor extração
de fenóis e gera um menor custo com o solvente.
108
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 5 10 15 20 25 30 40 50 60 70 75 80 85 90 95 100
% Etanol
Ren
dim
ento
(%)
SaponinasFenóis
Figura 27 – Avaliação das proporções entre água e etanol na extração das saponinas do juá. Parâmetros
fixos deste ensaio de extração: Relação matéria-prima/solvente de 1/5 (0,2); 50ºC; 200 rpm; 4 horas.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 5 10 15 20 25 30 40 50 60 70 75 80 85 90 95 100
% Etanol
Ren
dim
ento
(%
)
SaponinasFenóis
Figura 28 – Avaliação das proporções entre água e etanol na extração das saponinas do resíduo
mucilaginoso de sisal. Parâmetros fixos deste ensaio de extração: Relação matéria-prima/solvente de 1/5 (0,2); 50ºC; 200 rpm; 4 horas.
4.3.1.2) Otimização da Extração por Planejamento Composto Central Com a composição do solvente já escolhida, foi feito um planejamento experimental
composto central para otimizar o rendimento na extração de saponinas do juá, avaliando
parâmetros como temperatura (ºC), velocidade de agitação (rpm) e relação juá/solvente, com
resultados visualizados na Tabela 20. Outras análises como fenóis e açúcares redutores totais
foram realizadas para percepção se os parâmetros avaliados influenciam em uma maior
extração de compostos fenólicos e se há degradação das saponinas.
Neste caso também foi necessária a utilização de ferramentas estatísticas fornecidas
pelo programa STATISTICA 6.0, gerando uma tabela ANOVA que foi ajustada com a
retirada de termos não estatisticamente significativos (Tabelas 20 e 21), que neste caso são os
termos com p-valor acima de 0,05.
109
Tabela 20 – Comparação dos rendimentos (saponinas, fenóis e açúcar redutores totais) da extração de saponinas de juá e de sisal utilizando planejamento composto central
Os LI e análogos derivados de ácidos orgânicos hidroxilados e dicarboxilados
apresentaram resultados de recuperação de saponinas e seletividade similares ao dos solventes
orgânicos, com exceção do ChOx, provavelmente pela maior viscosidade destes solventes. Em
relação aos solventes eutéticos clássicos (ChCl/Uréia, ChCl/Glicerol e ChCl/Etileno Glicol),
vários apresentaram resultados com recuperação de saponinas acima de 60%, e seletividade alta,
com destaque para ChCl/Uréia.
No caso do juá, o solvente com maior poder extrativo foi salicilato de colina (ChSal) em
água com uma recuperação de 73,23% de saponinas, mas algumas saponinas podem ter sido
degradadas (99,80% de açúcares redutores), seletividade similar a da água, e um custo elevado. O
mais seletivo foi o acetato de colina (ChAc), obtendo uma relação saponina/fenóis 2,5 vezes
superior ao dos solventes orgânicos, sem nenhuma degradação aparente das saponinas, mas com
uma recuperação de saponinas apenas 15% superior, e com um custo maior que o ChSal. Assim, o
solvente escolhido foi o eutético ChCl/HAc 1/2 em 30% etanol, pois apresentou respostas
intermediárias com 48% a mais de recuperação de saponinas, seletividade superior (1,65 vezes),
praticamente sem degradação das saponinas, e com o custo mais baixo dentre todos os solventes.
No caso do sisal, o solvente com maior poder extrativo foi o eutético ChCl/Uréia 1/2
em água com uma recuperação de 74,87% de saponinas, praticamente sem degradação das
mesmas, seletividade 2,5 vezes superior a da água, e um custo menor que dos LIs. O mais
seletivo foi o cloreto de colina (ChCl), obtendo uma relação saponina/fenóis de 5,86, sem
nenhuma degradação aparente das saponinas, mas com uma recuperação de saponinas cerca
de 30% inferior a dos solventes orgânicos, e com um custo maior que o ChCl/Uréia. Assim, o
solvente escolhido foi o eutético ChCl/HProp 1/2 em 30% etanol, pois apresentou respostas
intermediárias com 75% a mais de recuperação de saponinas, seletividade superior 1,48 vezes,
sem degradação das saponinas, e com o custo baixo.
4.3.2.2) Planejamento de misturas Como foi visto na Tabela 24, o uso de etanol pode influenciar na extração das
saponinas, tanto que os solventes eutéticos escolhidos obtiveram melhores resultados na sua
presença. Por isso, foi avaliado através do planejamento de misturas qual seria a melhor
proporção entre água, etanol e solvente eutético para uma maior recuperação de saponinas e
seletividade, com baixo custo. Similarmente a extração com solventes orgânicos verdes, foi
necessária o uso das ferramentas estatísticas do programa STATISTICA 6.0, removendo
termos não estatisticamente significativos (p-valor acima de 0,05) para melhor ajuste do R².
116
Para o juá, foi utilizado um modelo cúbico completo, com termos de interação tripla
(ABC) e interação relativa entre etanol e eutético removidos (BC(B-C)), obtendo R² iguais a
0,8909 e 0,9851 para as variáveis de recuperação de saponinas e seletividade,
respectivamente. Na Figura 33, pode ser observado através dos diagramas de Pareto quais
parâmetros e interações tem efeitos sinérgicos e positivos nas variáveis de resposta, onde o
solvente eutético, água e etanol tem efeito positivo na recuperação de saponinas e na
seletividade. Na Figura 34, observa-se a variação da composição da mistura de solventes para
maximizar as variáveis de resposta. O valor ótimo da composição da mistura, incluindo a
minimização do custo, foi 81% do eutético ChCl/HAc 1/2 e 19% água.
Figura 33 – Diagramas de Pareto do planejamento de mistura para extração de saponinas de juá. (A)
Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos)
Figura 34 – Curvas de contorno do planejamento de mistura para extração de saponinas de juá. (A)
Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos)
(A) (B)
(A) (B)
117
Para o sisal, também foi utilizado um modelo cúbico completo, mas com termos de
interação relativa entre etanol e eutético (BC(B-C)), e água e eutético (AC(A-C)) removidos,
obtendo R² iguais a 0,881 e 0,9483 para as variáveis de recuperação de saponinas e
seletividade, respectivamente. Na Figura 35, são apresentados nos diagramas de Pareto quais
parâmetros e interações tem efeitos sinérgicos e positivos nas variáveis de resposta, onde o
solvente eutético, água e etanol tem efeito positivo na recuperação de saponinas e na
seletividade. Na Figura 36, a variação da composição da mistura de solventes é analisada de
forma a maximizar as variáveis de resposta, sendo que em concentrações altas de eutético, a
seletividade é alta, e em concentração entre 50 a 75% de etanol a recuperação é alta. Assim, o
valor ótimo da composição da mistura foi 58% do eutético ChCl/HProp 1/2 e 42% etanol.
Figura 35 - Diagramas de Pareto do planejamento de mistura para extração de saponinas de sisal. (A) Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos)
Figura 36 - Curvas de contorno do planejamento de mistura para extração de saponinas de sisal. (A) Recuperação de Saponinas (%), (B) Seletividade (Relação Saponinas/Compostos fenólicos)
(A) (B)
(A) (B)
118
4.3.2.3) Otimização Seqüencial da Extração Com a composição da mistura de solventes definida, foi inicialmente verificado se a
difusão de saponinas para o meio extrator poderia ser realizada em tempos menores que 24 h,
mantendo uma recuperação de saponinas e seletividade altas. Nas Figuras 37A e B, pode ser
verificado que em 1,5 h de extração foi obtida uma recuperação de saponinas de 58 e 61% do sisal
e do juá, respectivamente, com uma seletividade de 7,36 e 9,30. Para as saponinas do juá, o
máximo de recuperação ocorre em 24 h, mas com menor seletividade (3,10), sendo mantido 1,5 h.
0102030405060708090
100
0.25 0.5 0.75 1 1.5 2 2.5 3 4 5 6 8 24tempo (h)
Sap
oninas
(%
)
Sisal
Juá
0
2
4
6
8
10
0.25 0.5 0.75 1 1.5 2 2.5 3 4 5 6 8 24tempo (h)
Sap
/Fen
Sisal
Juá
Figura 37 – Cinética de extração de saponinas por solventes eutéticos. (A) Recuperação de Saponinas (%),
Fang et al (2000) relataram que com adição de 3% p/v de sulfato de sódio a
recuperação de ginsenosídeos alcançou 100%, com fator de pré-concentração (α) de 7, e uma
razão volumar (V) de 0,16, enquanto sem adição do sal, o rendimento foi próximo de 80%,
com α de 2 e V, 0,72. Sun e colaboradores (2008) usaram NaCl (20% p/v) obtendo 98% de
recuperação de ácido glicirrízico e α de 13.2. Choi et al (2003) adicionaram sulfato de amônio
(40% p/v) ao extrato de ginseng e conseguiram um fator de pré-concentração de 35.
4.4.1.2) Remoção do Triton Em várias aplicações, os surfactantes podem ser removidos da fase supramolecular (ou
da fase rica em surfactante) por diálise ou adsorção hidrofóbica com resinas de poliestireno
como Bio-Beads SM2, Amberlite XAD-2, sílica gel, hidroxiapatita ou Florisil (Quina &
Hinze, 1999; Fang et al, 2000). Nas Figuras 45 A e B, foram avaliadas as remoções de Triton
X-100, saponinas e compostos fenólicos da fase supramolecular utilizando alguns
adsorventes. Amberlite FPX-66 obteve a maior remoção de Triton X-100 e compostos
fenólicos, e a menor remoção de saponinas. Isto ocorreu devido a sua estrutura macroreticular
com alta área superficial (> 700 m²/g) o qual permitiu a adsorção de surfactantes e compostos
fenólicos, justificando sua aplicação comum na remoção de pigmentos em sucos. Há poucos
trabalhos na literatura sobre a remoção de Triton X-100 por Amberlite como o de Trescec et
al (1999) que relataram que a Amberlite XAD-7 conseguiu remover entre 94 e 99% do Triton
X-100 de uma solução de imunoglobulinas, e Cheetham (1979), que fez uma comparação
entre Amberlite XAD-1, -2, -4 e -7, obtendo para o Amberlite XAD-2 uma remoção de 0,26 g
de Triton X-100 a cada grama de adsorvente utilizado.
126
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
Amberlite FPX-66 Amberlite XAD-2 Silica gel 60
Rem
oção
(%
)Triton
Saponinas
Fenóis
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
Amberlite FPX-66 Amberlite XAD-2 Silica gel 60
Rem
oção
(%
)
Triton
Saponinas
Fenóis
Figura 45 – Avaliação da capacidade de remoção de Triton X-100 dos extratos concentrados de sisal por adsorventes. (A) Sisal, (B) Juá
Após a escolha do Amberlite FPX-66 como adsorvente, foi realizado um planejamento
composto central para maximizar a remoção do Triton X-100 e compostos fenólicos e
minimizar o de saponinas, avaliando a temperatura e concentração do adsorvente (Tabela 28).
Com STATISTICA 6.0, foi gerado as tabelas de ANOVA para cada variável de resposta,
sendo que para o sisal foram obtidos R² de 0.96, 0.94 e 0.84 , e para o juá, R² de 0.97, 0.95 e
0.82 referentes ao Triton X-100, saponinas e compostos fenólicos, respectivamente. Os
termos com maior impacto positivo na remoção destes compostos foi o termo linear da
concentração do adsorvente e o termo quadrático da temperatura para juá e sisal. As
condições foram obtidas utilizando a abordagem do desirability, sendo 40.8ºC e 25.4%
Amberlite FPX-66 para o sisal, e 46,8ºC e 25,1% para o juá (Figuras 46 A e B). Com estas
condições determinadas, foi realizada uma cinética de adsorção, alcançando um máximo de
remoção de Triton X-100 e compostos fenólicos e um mínimo para as saponinas em 30 min
(Figuras 47 A e B).
(A)
(B)
127
Tabela 28 – Comparação dos rendimentos (saponinas, fenóis e açúcar redutores totais) da extração de saponinas de juá e de sisal utilizando planejamento composto central
Figura 60 - Alteração da atividade lipásica da pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá (A) e
de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5%
(A)
(B)
(A)
(B)
143
No caso da atividade proteásica da pancreatina, tanto as saponinas de juá quanto as do
sisal, apresentaram efeito ativador bastante acentuado. A CMC parece apresentar um menor
efeito na ativação desta enzima. Outra opção seria que uma interação entre a azocaseína e as
saponinas teria facilitado a ação proteolítica, como Shimoyamada et al (2000) informaram
sobre as proteínas do soro de leite que se tornaram mais sensíveis a ação da tripsina e
quimotripsina na presença de soyasaponinas.
A ação da CMC das saponinas de juá e de sisal ficou realmente evidenciada na
atividade lipásica da pancreatina. Acima da CMC, ocorre a inibição quase completa, quanto
maior a concentração de saponina. Já abaixo da CMC, principalmente com uma concentração
de 0,001% de saponinas, ocorre ativação, sendo este efeito diminuído com o aumento da
concentração de substrato. A interação das micelas com a enzima parece alterar muito a sua
conformação, prejudicando sua atividade (ver Anexo, Figura 78).
Assim, a aplicação de saponinas em alimentos ricos em proteínas, utilizados como
suplementos para aumento de massa muscular em exercícios físicos, poderiam ser
interessantes já que promoveriam uma hidrólise mais rápida e gerando mais peptídeos e
aminoácidos para serem absorvidos. Outra possível aplicação das saponinas seria como
fármacos anti-obesidade, já que podem inibir a ação amilásica e lipásica com concentrações
entre 0,1 e 0,5%, evitando que lipídeos e matérias amiláceos sejam hidrolisados e absorvidos,
diminuindo o acúmulo de gordura e aumento da concentração de glicose no sangue. Segundo
Birari e Bhutani (2007), há um mercado crescente para este tipo de medicamento, calculado
em US$ 4 bilhões, principalmente com as várias contra-indicações dos fármacos sintéticos.
A Figura 61 mostra que a aplicação de saponinas como ativo cosmético pode ser
possível já que os resultados apresentaram inibição (máximo de 40%) em concentrações de 1
e 2,5 g/L de azocaseína. Neste caso, talvez ocorra uma competição entre a interação da
saponina com a azocaseína e desta com a colagenase. Outra opção seria atuação das saponinas
sobre o mecanismo de ação da colagenase, que é uma metaloprotease, um pouco diferente das
proteases pancreáticas (proteases serínicas), e que na verdade a interação das saponinas seja
relacionado ao zinco presente na colagenase.
144
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0.25 0.5 1 2.5Concentração Azocaseína (g/L)
Ativ
idad
e E
nzim
átic
a R
elat
iva
(%) 0.001
0.005
0.01
0.1
0.5
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0.25 0.5 1 2.5Concentração Azocaseína (g/L)
Ativ
idad
e E
nzim
átic
a R
elat
iva
(%) 0.001
0.005
0.01
0.1
0.5
Figura 61 - Alteração da atividade da colagenase por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal
(B). Concentração enzimática: 0,5%
4.5.2) Alteração da Atividade Enzimática por Agliconas Como a ação da pancreatina sobre os alimentos só ocorre após a passagem deste pelo
estômago em ambiente ácido, que pode proporcionar a hidrólise das saponinas, foram feitos
testes em concentrações fixas dos substratos (amido, 0,1%; azocaseína, 0,025%; p-NFL,
0,504 mM) com diosgenina e agliconas de juá e de sisal (Figura 62).
Comparando as saponinas com as agliconas, a ação sobre pancreatina foi distinta.
Sobre a atividade amilásica a inibição só ocorre nas concentrações de 0,1 e 0,5%, tendo
ativação nas concentrações menores, independente da aglicona utilizada. A alteração da
conformação da enzima pela aglicona deve ser o efeito mais provável. Uma total inversão de
atuação ocorre com atividade proteásica quando as saponinas são hidrolisadas, sendo a
inibição proporcional a quantidade de agliconas. No caso da atividade lipásica, só ocorre
inibição com 0,5% de diosgenina e de aglicona do juá.
(A)
(B)
145
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
Diosgenina Juá Sisal
Ativ
idad
e E
nzim
átic
a R
elat
iva
(%)
0.001
0.005
0.01
0.1
0.5
-100
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
Diosgenina Juá Sisal
Ativ
idad
e E
nzim
átic
a R
elat
iva
(%)
0.001
0.005
0.01
0.1
0.5
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Diosgenina Juá Sisal
Ativ
idad
e E
nzim
átic
a R
elat
iva
(%)
0.001
0.005
0.01
0.1
0.5
Figura 62 – Alteração da atividade amilásica (A), proteásica (B) e lipásica (C) da pancreatina por diferentes teores de diosgenina e das agliconas de juá e de sisal. Concentração enzimática: 0,5%
No caso da colagenase, este procedimento foi testado simulando formulações com prazo
longo de validade, em que o ambiente aquoso levemente ácido também pudessem levar a hidrólise
de saponinas. As saponinas apresentavam ação ativadora nesta concentração de substrato,
fenômeno que é inverso em concentrações maiores de agliconas (Figura 63).
(B)
(A)
(C)
146
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Diosgenina Juá Sisal
Ativ
idad
e E
nzim
átic
a R
elat
iva
(%)
0.001
0.005
0.01
0.1
0.5
Figura 63 - Alteração da atividade da colagenase por diferentes teores de diosgenina e das agliconas de juá
e de sisal. Concentração enzimática: 0,5%
4.5.3) Hidrólise enzimática Como as enzimas podem ser ativadas ou inibidas pelas saponinas, para se ter uma idéia
mais clara da sua ação na digestão, foram testados vários substratos diferentes, amiláceos,
protéicos e lipídicos, para verificar se a hidrólise destes ocorreria ou não pela pancreatina (Figura
64, 67 e 69). Além disso, foram testadas enzimas comerciais (Papaína, Figura 65; Stargen, Figura
68; e Lipozyme CALB, Figura 70) para verificar se o perfil dos resultados de hidrólise seriam
mantidos. No caso da colagenase, foi utilizada gelatina como fonte de colágeno a ser testada a
inibição pelas saponinas (Figura 66).
As proteínas podem ser classificadas de acordo com a sua solubilidade: albuminas,
solúveis em água; globulinas em soluções salinas; glutelinas em soluções diluídas ácidas e/ou
alcalinas; e prolaminas em soluções alcoólicas (Yada, 2004). Os vários substratos utilizados como
fontes protéicas tem composições distintas que podem influenciar na ação da enzima, e em uma
possível ativação ou inibição pelas saponinas. No leite, há caseínas, β-lactoglobulina e α-
lactoalbumina; na carne, proteínas miofibrilares, sarcoplasmáticas e do estroma; ovalbuminas e
ovoglobulinas na clara do ovo, e fosvitina e lipovitelinas na gema; β-conglicinina e glicinina na
soja, e outras globulinas no feijão; gliadinas e glutelinas no trigo, além do colágeno presente na
gelatina (Yada, 2004; Mine, 2008).
Ambas as saponinas apresentaram ação similar sobre a pancreatina na hidrólise destes
substratos: inibição em relação as proteínas da carne, leite e gema; ativação sobre feijão, farinha
de trigo e gelatina; e sem interferências substanciais na atividade em relação a clara do ovo e a
soja. Estes resultados são um pouco diferentes dos obtidos com a azocaseína, mas deve-se
perceber que a concentração neste caso (200 g/L) é superior aos anteriormente testados. Além
disso, só as fontes protéicas com presença de colesterol foram que apresentaram inibição,
indicando que uma possível interação entre saponinas e colesterol tenha sido formada, e afetado a
interação destas com a proteína ou com a pancreatina.
147
0
20
40
60
80
100
Carne Leite ClaraOvo
GemaOvo
Feijão Soja Gelatina FarinhaTrigo
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
0
20
40
60
80
100
Carne Leite ClaraOvo
GemaOvo
Feijão Soja Gelatina FarinhaTrigo
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
Figura 64 – Hidrólise de materiais protéicos por pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de
sisal (B). Concentração enzimática: 0,5%
0
20
40
60
80
100
Carne Leite ClaraOvo
GemaOvo
Feijão Soja Gelatina FarinhaTrigo
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
0
20
40
60
80
100
Carne Leite ClaraOvo
GemaOvo
Feijão Soja Gelatina FarinhaTrigo
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
Figura 65 - Hidrólise de materiais protéicos por papaína por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal
(B). Concentração enzimática: 0,5%
(A)
(B)
(A)
(B)
148
No caso da papaína, uma cisteinoprotease, que normalmente é utilizada como
amaciante de carnes, esta apresentou resultados diferentes da pancreatina, onde as saponinas
de juá interferiram pouco em sua ação proteolítica, apresentando ativação com 0,005% de
saponinas sobre gema, feijão e soja; e as saponinas de sisal, apresentaram inibição sobre clara,
soja e gelatina, ativação sobre leite, gema e feijão e uma inibição parcial sobre carne e farinha
de trigo, pois também apresentaram ativação em 0,01 e 0,005%, respectivamente. Há uma
possibilidade de que a interação das saponinas de sisal com as proteínas dos substratos e com
a papaína possa estar alterando sua conformação estrutural e interferindo na sua ação positiva
e/ou negativamente.
Assim, o uso de alimentos de ricos em proteínas e sem colesterol seriam os mais
indicados para serem associados com a ingestão de saponinas. O uso da papaína com
saponinas como amaciante de carnes não seria prejudicado em concentrações de 0,01%. As
saponinas também poderiam favorecer a produção enzimática de hidrolisados protéicos, que
seriam utilizados como suplementos alimentares, produtos hipoalergênicos e meios de cultura
para microorganismos, células vegetais e animais (Pasupuleti & Demain, 2010).
A inibição da colagenase utilizando a gelatina como substrato confirma a possibilidade
do seu uso como ativo cosmético com funcionalidade antiaging.
0
20
40
60
80
100
Sisal Juá
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
Figura 66 - Hidrólise de gelatina por colagenase spor diferentes teores de saponinas de juá e de sisal.
Concentração enzimática: 0,5%
149
O amido é constituído de amilose (α-1,4-glucana linear) e de amilopectina (α-1,4-glucana
com ramificações em α-1,6) em proporções variáveis (21-26% de amilose e 74-79% de
amilopectina) nas fontes amiláceas e influenciam muito nas propriedades dos grânulos de amido,
como cristalinidade e morfologia. Em base seca, o milho possui em média 72,4% de amido, com
grânulo tipo A; mandioca (granulo tipo B) e arroz (granulo tipo) A tem 85% de amido, com 17%
de amilose e 83% de amilopectina; batata (granulo tipo B) com 76,6% de amido; e o trigo possui
63% de amido, granulo tipo A (BeMiller & Whistler, 2009).
A atividade amilásica da pancreatina sobre amido, mandioca e arroz com adição das
saponinas de juá e de sisal apresentaram o mesmo perfil de resultados, tendo um máximo em
0,001% com arroz, 0,005% com mandioca e 0,01% com amido, ocorrendo inibição após estas
concentrações. Um possível motivo deste resultado seria maior concentração de amilopectina, que
poderia promover uma interação com saponinas e alterar formação de micelas. Nos outros
substratos amiláceos, as saponinas de juá influenciaram a inibição da hidrólise de milho, a
ativação da hidrólise de batata na concentração até 0,005%, mas com uma forte inibição após este
valor, e uma leve ativação na hidrólise de trigo com 0,001%, e depois uma tendência inibidora.
Porém, na presença das saponinas de sisal, geraram um ativação na hidrólise de milho, inibição no
caso da batata e do trigo.
0
20
40
60
80
100
Milho Mandioca Batata Arroz Amido FarinhaTrigo
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
0
20
40
60
80
100
Milho Mandioca Batata Arroz Amido FarinhaTrigo
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
Figura 67 - Hidrólise de matérias amiláceos por pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5%
(A)
(B)
150
0
20
40
60
80
100
Milho Mandioca Batata Arroz Amido FarinhaTrigo
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
0
20
40
60
80
100
Milho Mandioca Batata Arroz Amido FarinhaTrigo
Hid
rólis
e (%
)
0
0.001
0.005
0.01
Figura 68 - Hidrólise de matérias amiláceos por Stargen por diferentes teores de saponinas de juá (A) e de sisal (B). Concentração enzimática: 0,5%
Já com adição de saponinas na hidrólise destes materiais amiláceos com Stargen
praticamente todos apresentaram ativação, exceto o milho que apresentou um máximo de
ativação em 0,001% e inibição com 0,01%. Estes resultados poderiam ser explicados com
uma interação das saponinas com a amilase, levando a uma conformação mais propícia a
hidrólise dos materiais.
Assim, a utilização das saponinas em concentrações de 0,001% não interferem na
digestão destes alimentos. Já em concentrações acima de 0,01%, estas poderiam auxiliar como
um fármaco antiobesidade, pela diminuição da disponibilização de glicose. As saponinas
também podem ser utilizadas como aditivo na hidrólise do amido, já que a glicose produzida
tem um mercado extenso em biorrefinarias para produção de etanol, ácidos orgânicos e outros
produtos de origem biotecnológica (Kamm et al, 2006).
Mesmo considerando o baixo grau de hidrólise destes materiais hidrofóbicos, foi
verificado que ação das saponinas de sisal tanto sobre a pancreatina como sobre a Lipozyme
CALB foi inibitória. Já as saponinas de juá até apresentaram uma leve ativação na pancreatina
(B)
(A)
151
sobre a hidrólise de óleo de soja e manteiga, e inibição em azeite, mas com a Lipozyme
CALB, a inibição ocorreu em óleo de soja, uma leve ativação com manteiga e sem
interferências sobre o azeite. Por ser uma fonte de origem animal, a interação das saponinas
com o colesterol pode ter favorecido a hidrólise da manteiga, já com o azeite e óleo de soja, a
interação das saponinas com a lipase pode ter sido mais importante. Assim, o uso de sisal
como fármaco anti-obesidade pode ser uma oportunidade a ser investigada.
0
2
4
6
8
10
Azeite + Sisal Óleo Soja +Sisal
Manteiga +Sisal
Azeite + Juá Óleo Soja +Juá
Manteiga +Juá
Hid
rólis
e (%
)
0 0.001
0.005 0.01
Figura 69 - Hidrólise de materiais lipidicos por pancreatina por diferentes teores de saponinas de juá e de
sisal. Concentração enzimática: 0,5%
0
2
4
6
8
10
Azeite + Sisal Óleo Soja +Sisal
Manteiga +Sisal
Azeite + Juá Óleo Soja +Juá
Manteiga +Juá
Hid
rólis
e (%
)
0 0.001
0.005 0.01
Figura 70 - Hidrólise de materiais lipidicos por Lipozyme CALB por diferentes teores de saponinas de juá
e de sisal. Concentração enzimática: 0,5%
4.5.4) Síntese enzimática Outra opção para o uso das saponinas seria no aumento do rendimento de síntese
enzimática de alguns compostos, tendo como exemplos um éster de cadeia curta, como o
acetato de butila (Figura 71A), que pode ser utilizado como solvente e flavorizante, e um éster
de cadeia longa, como o estearato de etila (Figura 71B), que é um dos componentes do
biodiesel.
152
Para produção de acetato de butila, as saponinas promoveram um aumento substancial
no rendimento da síntese quando a enzima Lipozyme TL foi utilizada, mas sem interferências
no caso da enzima Novozym 435. Por outro lado, na síntese de estearato de etila, as saponinas
causaram a inibição de ambas as lipases, mas houve dificuldade na transferência de massa na
reação provavelmente pela ausência de um solvente como hexano ou heptano, que poderia ter
auxiliado na dissolução dos materiais (ácido esteárico e etanol) e promovido uma maior área
interfacial para atuação das lipases. Assim, as saponinas poderiam ser utilizadas para auxiliar
síntese de ésteres de cadeia curta com Lipozyme TL.
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GLOSSÁRIO Adjuvantes: compostos que auxiliam os antígenos aumentando de maneira especifica a resposta
imune humoral e/ou celular contra os mesmos (Bernardo, 1998). Biopirataria: prática ilegal de exploração, manipulação, exportação e comercialização de recursos
biológicos de um país a outro (http://www.conexaoprofessor.rj.gov.br/, 2009). Bioprospecção: atividades que acessam recurso genético, seus derivados ou conhecimento tradicional
associado, descritas em projeto cujo objetivo preveja aplicações de interesse econômico (http://www.planalto.gov.br/, 2009).
Constante dielétrica: habilidade de um material de armazenar energia potencial elétrica sob a
influência de um campo elétrico. Quanto maior a constante dielétrica, mais o solvente converte as microondas em energia térmica (Lidström et al, 2001).
Convenção para Diversidade Biológica: foi lançada no Brasil durante a realização da Conferência
das Nações Unidas sobre Meio Ambiente e Desenvolvimento em junho de 1992. Considerada o marco referencial para as ações relativas à biodiversidade planetária, tem como objetivos a conservação e a utilização sustentável da biodiversidade e a repartição justa e eqüitativa dos benefícios decorrentes de sua utilização, bem como dos conhecimentos tradicionais a eles associados (Rodrigues, 2009).
Manejo Sustentável de Recursos Naturais: É um planejamento que busca o aproveitamento
econômico simultâneo à preservação dos recursos florestais e aquáticos, visando à perpetuação da sua cobertura vegetal, à conservação da biodiversidade e ao desenvolvimento social. Para realizar o manejo dos recursos naturais é preciso ter autorização do órgão competente, ou seja, do IBAMA (Benatti et al, 2003).
Produção mais limpa: aplicação continua de uma estratégia ambiental integrada e preventiva a
processos e produtos para redução de riscos a população e ao meio ambiente. Em relação aos processos, é associada a conservação de matérias-primas, e a redução da qualidade e toxidez e todas as emissões e resíduos antes que deixem o processo. Em relação aos produtos, a estratégia é focada na redução de impactos durante o ciclo de vida deste, desde a extração da matéria prima até a sua disposição final (Clark & Macquarrie, 2002).
Rasurado: Material que foi submetido à fragmentação por meio de ralador, lima ou raspador
(http://michaelis.uol.com.br/, 2010).
181
PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos já submetidos: - RIBEIRO, B.D.; BARRETO, D.W.; COELHO, M.A.Z.; Use of micellar extraction and cloud point preconcentration for valorization of saponins from sisal (Agave sisalana) waste. Waste and Biomass Valorization.
Artigos a serem submetidos: - RIBEIRO, B.D.; BARRETO, D.W.; COELHO, M.A.Z.; Application of Foam Column as Green Technology for Concentration of Saponins from Sisal (Agave sisalana) and Juá (Ziziphus joazeiro). Brazilian Journal of Chemical Engineering. - RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; REBELO, L.P.N.; MARRUCHO, I.M.; Use of Ionic Liquids for Extraction of Saponins from Mate (Ilex paraguariensis) and Tea (Camellia sinensis). Separation and Purification Technology. Trabalhos apresentados: - RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; FREITAS, S.P.; BARRETO, D.W.; Searching for potential plant extracts as natural surfactants. 2nd Brazilian Conference on Natural Products and XXVIII Annual Meeting on Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology, 09 a 12 de novembro de 2009. - RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; BARRETO, D.W.; Avaliação das propriedades micelares das saponinas de juá (Ziziphus joazeiro) utilizando planejamento experimental. XXII Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 07 a 10 de novembro de 2010. - RIBEIRO, B.D.; BARRETO, D.W.; COELHO, M.A.Z.; Comparação dos métodos de extração de saponinas do juá (Ziziphus joazeiro). XXII Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 07 a 10 de novembro de 2010. - SANTOS, R.S.; RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; Avaliação do efeito inibidor de saponinas do juá (Ziziphus joazeiro) sobre lipases. XXII Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 07 a 10 de novembro de 2010. - RIBEIRO, B.D.; SANTOS, R.S.; SOUSA, Y.A.V.; COELHO, M.A.Z.; Effect of Saponins from Agave sisalana and Ziziphus joazeiro on Digestive Enzymes. 10th International Symposium on Biocatalysis (Giardini Naxos, Itália), 02 a 06 de outubro de 2011. Trabalhos a serem apresentados: - RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; MARRUCHO, I.M.; Use of biocompatible ionic liquids for extraction of saponins from Agave sisalana. XVI World Congress of Food Science and Technology, 5 a 9 de agosto de 2012. - SOUSA, Y.A.V.; RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; Modification of Enzymatic Activity of Proteases by saponins from Ziziphus joazeiro and Agave sisalana. XVI World Congress of Food Science and Technology, 5 a 9 de agosto de 2012. - RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; MARRUCHO, I.M.; Extraction of saponins from Ziziphus joazeiro with cholinium-based ionic liquids and analogues. 4th International IUPAC Conference on Green Chemistry, 25 a 29 de agosto de 2012. - RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; REBELO, L.P.N.; MARRUCHO, I.M.; Extraction of saponins from green tea (Camellia sinensis) using ionic liquids. 4th International IUPAC Conference on Green Chemistry, 25 a 29 de agosto de 2012. - RIBEIRO, B.D.; BARRETO, D.W.; COELHO, M.A.Z.; Uso de coluna de espuma para concentração das saponinas de juá (Ziziphus joazeiro). XIX Congresso Brasileiro de Engenharia Química, 09 a 12 de setembro de 2012. - RIBEIRO, B.D.; BARRETO, D.W.; COELHO, M.A.Z.; Pré-concentração por ponto de névoa das saponinas do resíduo mucilaginoso de sisal (Agave sisalana). XIX Congresso Brasileiro de Engenharia Química, 09 a 12 de setembro de 2012. - RIBEIRO, B.D.; COELHO, M.A.Z.; REBELO, L.P.N.; MARRUCHO, I.M.; Uso de líquidos iônicos para extração de saponinas de mate (Ilex paraguariensis). XIX Congresso Brasileiro de Engenharia Química, 09 a 12 de setembro de 2012.
182
ANEXO
Figura 72 – Extratos metanólicos das plantas utilizadas nesta tese
183
Figura 73 - Atividade antimicrobiana por difusão em ágar. Resultados positivos, 17: Juá e 47: Alho
184
Figura 74 – MS/MS de alguns picos relativos as saponinas do sisal
185
Figura 75 – MS/MS de alguns picos relativos as saponinas do juá
186
Figura 76 – Extração de saponinas de sisal (A) e de juá (B) utilizando líquidos iônicos e análogos contendo
ChCl/aditivo 1/2 molar, e co-solventes sendo a esquerda água e a direita etanol 30%
187
Figura 77 – Exemplos da aplicação de diferentes sais para concentração de saponinas de sisal (A) e de juá
(B) por ponto de névoa. (1) citrato de sódio, (2) Na2CO3, (3) NaHCO3, (4) NaNO3, (5) (NH4)2SO4
Figura 78 – Interação das saponinas com lipase (seta vermelha)