3 Korean BioChip Society 유전영동 (dielectrophoresis) 을 이용한 미세유체제어 기술 박제균 한국과학기술원 바이오시스템학과 1. 개요 최근 나노기술과 MEMS 기술의 발전으로 이를 생명공학 및 의료공학 분야 에 적용하고자 하는 노력이 활발히 이루어지고 있다 [1, 2]. 의료분야에서의 MEMS 기술 응용은 이미 미세 수술기구 및 초소형 내시경, DDS (drug delivery system) 로 활용하기 위한 미세캡슐, 체내 삽입형 바이오센서 개발 로 이어지고 있고 , 생명공학 응용분야로는 시스템 생물학의 주요 수단 (tool)으 로서 유전자와 단백질을 스크리닝하거나 진단 할 수 있는 DNA 칩과 단백질 칩 , 그리고 실험실에서 사용하는 생화학반응용 랩온어칩 (lab-on-a-chip) 등이 대표적이다 . 특히 , 이러한 나노 /마이크로 칩 기술에 있어서 수 나노리터에 해 당하는 적은 양의 생체시료를 단위 소자 상에서 다루기 위한 미세유체공학 (micro/nanofluidics)이 주요한 요소기술로서 인식되고 있다 [3]. 미세유체공학 분야는 미세종합분석시스템 (micro total analysis system) 즉 , µ-TAS 분야 또는 랩온어칩의 상용화에 기초가 되는 기반, 핵심기술을 연구, 개발하는 분야이다 [4]. 여기서 µ-TAS는 여러 실험 단계와 반응을 거치는 화 학 및 생물학 실험과 분석이 한 실험대 위에 놓인 한 유니트에서 종합적으로 구현되는 시스템을 의미한다. 이러한 µ-TAS는 시료 채취 영역, 미세유체회 로, 검출기 및 이들을 제어할 수 있는 제어부 (controller)로 구성될 수 있다. 한편 랩온어칩이란 “칩 위의 연구실 ”이란 의미를 갖는 것으로 µ-TAS 개념과 기능을 작은 칩 (chip) 상에서 구현한 것이다 . 따라서 랩온어칩을 개발하기 위 해서는 플라스틱이나 유리, 실리콘 등의 표면에 용액이 흐를 수 있는 미세채 널로 회로를 만들어 시료의 전처리, 분리, 희석, 혼합, 생화학반응, 검출 등을 하나의 칩에 소형화 , 집적화 시킬 수 있어야 한다 . 현재까지 이러한 모든 기능 이 통합된 랩온어칩 개발 보다는 몇 가지 기능을 수행할 수 있는 랩온어칩 , 정 확한 의미로는 특정기능을 수행하는 바이오유체소자 (bio-fluidic device) 분야 의 개발이 활발한 실정이다. 이 경우 바이오유체를 이송시킬 수 있는 미세유 체공학의 역할은 매우 중요하다 . 본 고에서는 시료 전처리의 중요성이 더해지는 바이오센서 , 바이오칩 , 랩온 어칩(lab-on-a-chip) 분야에 널리 적용되고 있는 유전영동(dielectrophoresis) 에 의한 미세유체공학 응용에 대해서 논하고자 한다 . 그림 1은 유전영동을 이 용한 소자의 대표적인응용분야를 보여주고 있다. 유전영동을 이용한 생물학 적 입자 분리 및 분석을 위한 마이크로플루이딕 시스템 (microfluidic system) 은 시료의 전처리가 필요 없고, 빠른 시간 안에 분석 및 측정할 수 있으며 자 동화에 용이하다는 점 등 기존의 생화학 실험실에서 수행되는 방법들에 비해 많은 장점을 제공한다 . 2. 유전영동 (dielectrophoresis) 의 원리 극성이 없는 입자가 불균일한 교류 전기장에 노출되었을 때 쌍극성 (dipole) 이 입자에 유도되며 , 유도된 극성의 크기와 방향은 인가된 전기장의 주파수와 전도도(conductivity, σ) 및 유전율 (permittivity, ε)과 같은 유전특성 (dielectric properties)에 따라 달라진다 [5, 6]. 이때 입자가 놓인 주변 환경에 따라 입자의 극성이 결정되기 때문에 입자는 전기장의 구배가 큰 쪽 또는 작 은 쪽으로 힘을 받게 된다 (그림 2). 이러한 현상을 각각 양(positive)과음 (negative)의 유전영동 (dielectrophoresis, DEP) 이라고 한다 . DEP를 이론적으로 살펴보면, 반경 r인 입자가 전기장 Erms, (전기장의 rms 값)이 인가된 매질에 놓여서 받게 되는 DEP force, F는 다음과 같은 식으로 나타낼 수 있다 . 이때 ε0 는 진공상태하에서의 유전상수, fCM 은 Clausius-Mossotti (CM) factor로서 다음과 같이 정의 된다 . 특별기고1 [그림 1] 유전영동을 이용한 DEP 소자의 응용 분야 [그림 2] 유전영동 (dielectrophoresis). 전기장의 구배가 균일한 왼쪽 그림과 달리 불균일 한 전기장하에서는 입자가 한쪽 방향으로 힘을 받게 된다 .
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3 Korean BioChip Society
유유전전 동동(dielectrophoresis)을을
이이용용한한미미세세유유체체제제어어기기술술
박제균한국과학기술원바이오시스템학과
1. 개개요요최근나노기술과 MEMS 기술의발전으로이를생명공학및의료공학분야
에적용하고자하는노력이활발히이루어지고있다 [1, 2]. 의료분야에서의MEMS 기술 응용은 이미 미세 수술기구 및 초소형 내시경, DDS (drugdelivery system) 로활용하기위한미세캡슐, 체내삽입형바이오센서개발로이어지고있고, 생명공학응용분야로는시스템생물학의주요수단(tool)으로서유전자와단백질을스크리닝하거나진단할수있는 DNA 칩과단백질칩, 그리고실험실에서사용하는생화학반응용랩온어칩(lab-on-a-chip) 등이대표적이다. 특히, 이러한나노/마이크로칩기술에있어서수나노리터에해당하는적은양의생체시료를단위소자상에서다루기위한미세유체공학(micro/nanofluidics)이주요한요소기술로서인식되고있다 [3].미세유체공학분야는미세종합분석시스템 (micro total analysis system) 즉,
µ-TAS 분야또는랩온어칩의상용화에기초가되는기반, 핵심기술을연구,개발하는분야이다 [4]. 여기서 µ-TAS는여러실험단계와반응을거치는화학및생물학실험과분석이한실험대위에놓인한유니트에서종합적으로구현되는시스템을의미한다. 이러한 µ-TAS는시료채취 역, 미세유체회로, 검출기및이들을제어할수있는제어부 (controller)로구성될수있다.한편랩온어칩이란 “칩위의연구실”이란의미를갖는것으로 µ-TAS 개념과기능을작은칩(chip) 상에서구현한것이다. 따라서랩온어칩을개발하기위해서는플라스틱이나유리, 실리콘등의표면에용액이흐를수있는미세채널로회로를만들어시료의전처리, 분리, 희석, 혼합, 생화학반응, 검출등을
하나의칩에소형화, 집적화시킬수있어야한다. 현재까지이러한모든기능이통합된랩온어칩개발보다는몇가지기능을수행할수있는랩온어칩, 정확한의미로는특정기능을수행하는바이오유체소자(bio-fluidic device) 분야의개발이활발한실정이다. 이경우바이오유체를이송시킬수있는미세유체공학의역할은매우중요하다.본고에서는시료전처리의중요성이더해지는바이오센서, 바이오칩, 랩온
어칩(lab-on-a-chip) 분야에널리적용되고있는유전 동(dielectrophoresis)에의한미세유체공학응용에대해서논하고자한다. 그림 1은유전 동을이용한소자의대표적인응용분야를보여주고있다. 유전 동을이용한생물학적입자분리및분석을위한마이크로플루이딕시스템 (microfluidic system)은시료의전처리가필요없고, 빠른시간안에분석및측정할수있으며자동화에용이하다는점등기존의생화학실험실에서수행되는방법들에비해많은장점을제공한다.
2. 유유전전 동동 (dielectrophoresis)의의원원리리극성이없는입자가불균일한교류전기장에노출되었을때쌍극성(dipole)
이입자에유도되며, 유도된극성의크기와방향은인가된전기장의주파수와전도도(conductivity, σ) 및 유전율 (permittivity, ε)과 같은 유전특성(dielectric properties)에따라달라진다 [5, 6]. 이때입자가놓인주변환경에따라입자의극성이결정되기때문에입자는전기장의구배가큰쪽또는작은쪽으로힘을받게된다 (그림 2). 이러한현상을각각양(positive)과음(negative)의유전 동 (dielectrophoresis, DEP) 이라고한다.
DEP를이론적으로살펴보면, 반경 r인입자가전기장 Erms, (전기장의 rms값)이인가된매질에놓여서받게되는 DEP force, F는다음과같은식으로나타낼수있다.
이때 ε0 는 진공상태하에서의 유전상수, fCM 은 Clausius-Mossotti (CM)factor로서다음과같이정의된다.
특 별 기 고 1
[그림 1] 유전 동을이용한 DEP 소자의응용분야
[그림 2] 유전 동 (dielectrophoresis). 전기장의구배가균일한왼쪽그림과달리불균일한전기장하에서는입자가한쪽방향으로힘을받게된다.
한국바이오칩학회 4
εp*와 εm* 은 입자와 외부 매질이 받게 되는 상대 복합유전율 [7]이며,Re[fCM] 은 fCM의실수부값을의미한다. 입자에미치는유전상수값이매질보다클경우, 즉 Re[fCM]>0 인경우는 DEP 는양의 DEP 라부르게되고입자는전기장의구배가큰쪽으로움직이게된다. 반면매질보다작게될경우(Re[fCM]<0)에는반대로전기장의구배가작은쪽으로움직이게되는데이를음의DEP 라고한다. 따라서분리하고자하는입자간양과음의DEP 차이를이용하면원하는입자를분리이동할수있다. 만일동일한조건이라면입자를크기별로분리해낼수도있다. 식에서와같이 DEP의세기는입자반경의세제곱에비례하므로입자및세포의크기차이가많이날경우동일한DEP 조건에서입자별로받게되는DEP force가달라질수있기때문이다.
3. 유유전전 동동에에의의한한세세포포의의흡흡착착및및분분리리주파수범위 5-200 kHz 내에서세포의유전특성은세포막의형상과세포내
부의 전도도와 세포 크기 등에 의해 향 받게 되는 Maxwell-Wagnerpolarization에지배를받는다 [8]. 따라서세포마다 DEP 특성이차이가나는현상을이용하게되면세포를조작또는분리하는데사용할수있다. 비슷한크기의세포중에서원하는세포를특정세포군으로부터분리하고자한다면반드시DEP가인가된특정주파수조건에서분리하고자하는세포의유전특성이달라지는지를확인해야한다. 일반적으로주파수변화에따른세포의유전특성은 “electrorotation” (4개의인접한전극중앙에위치한입자는각전극으로부터유도되는위상차를갖는교류전압에의해쌍극성의위상차가생겨입자가회전하게되는현상) 방법에의해측정가능하다 [9]. 그러나아직도세포의이러한물리적특성에대한자료는많이알려져있지않은실정이다.
DEP 특성은세포구조및세포막을경계로내, 외부간의환경적차이에크게달라진다 (그림 3). 이때세포간 역을결정짓는세포의플라즈마멤브레인(plasma membrane)이세포의 DEP 특성변화에중요한 향을끼치게된다. 세포막의막두께, 유효면적, 유전상수, 전기전도도등에따라세포막에서의복합유전율이달라지기때문이다. 세포막은단백질등이포함된매우얇은두층의지질(liplid)로되어있고, 일반적으로전도도 10-7 S/m 정도로절연성을보인다. 반면세포내부는전하를갖는분자가많고, 전도도가 1 S/m 에이를정도로크다. 그러나세포가죽게되면 이러한세포막은그투과성의기능을잃게되므로전도도가 104 배정도증가하게된다. 이와같이활성을잃은세포는유전특성에큰차이를가져오게되기때문에 DEP 특성의변화를이용하여죽은세포및활성이낮은세포등을정상세포로부터분리해낼수
있게된다. 지금까지죽은세포 [10], 백혈구세포 (leukemia cells)의분리[11], 혈액에서박테리아의분리 [12], 그램양성세균의분리 [13] 등이보고된바있다.
4. 입입자자및및세세포포분분리리용용DEP 소소자자마이크로채널내에서세포를분리하는방법의일반적예는다음과같다.
IDA (interdigitated electrode) 형태로배열시킨 DEP 용전극상부에마이크로채널을형성시키고세포혼합물을채널내부로통과시키게되면전극에의한생성되는 DEP force에의해양의 DEP를보이는세포는전극상부에 trap이되고, 음의 DEP를보이는세포의경우는유체흐름에따라채널출구로빠져나가게된다. trap 되어있는세포는 DEP 전압을제거하면채널출구에서수확할수있다. 이러한분리과정은비연속적으로세포혼합물에서세포를분리할수있으나 throughput을높이기위해서는전극면적을증가시켜야하는단점이있다. 주로양의유전 동력을이용하여입자를분리하는기존의분리방법은전극과미세입자간의불특정한흡착현상이발생한다는단점을갖는다. 게다가이러한방법의대부분은미세입자를불연속적으로분리하기때문에많은수의미세입자를분리하기어렵다는한계를갖고있다. 이상의경우와다르게분리하고자하는입자의유전특성이크게차이나지않을경우, 즉동물세포에서와같이DEP crossover frequencies 가매우비슷할경우는매우약한 DEP를갖게된다. 따라서이러한문제점을극복하고자 DEP분리 효율을 증진시키기 위한 방안의 하나로서 DEP-FFF (field flowfractionation) 방법이고안된바있다.
그림 4 에서와같이 DEP-FFF 방법은채널바닥면에있는전극과입자간에생기는DEP force 외에도입자무게에비례하는침강력(sedimentation force,Fgrav)과유속에비례하는 drag force 에의해입자가채널내에서평형을이루게되는현상을이용한다 [15]. 즉, 마이크로채널내에서유속이층류(laminarflow)를 형성하게 되므로 입자별로 침강력에 상응하는 DEP 상승력(levitation force, FDEPZ)을받아채널수직방향으로서로다른위치에존재하게된다. 이때입자들의유속은채널중앙부에서가장빠르게되므로 (Vfff2 >>VFFF1) 입자의종류별로분리수확할수있게된다. DEP-FFF 방법은입자를별도의수식과정이필요없는비침습식 (noninvasive technique)방법임과동시에반드시양의 DEP를이용할필요가없고, 단순히세포의물리적특성과인가전압조건하에서기존 flow cytometry와다르게여러종류의세포를빠르고 (1-2분이내) 연속적으로분리할수있다는장점이있다 [16].최근본연구팀은그림 5A에서와같은사다리꼴전극에미세입자가노출되[그림 3] DEP에 향을주는세포의커페시턴스및저항성분 [14]
[그림 4] 마이크로채널내에서의 DEP Field Flow Fractionation 방법의모식도
5 Korean BioChip Society
었을때그입자가받는물리력이비선형적인전기장에의해유발되는유전동에의한속도와유압차에의해발생하는유체력에의한속도에의해그운동이결정됨을보여준바있다 [17]. 사다리꼴전극은전극의긴변의모서리에서강한전기장을갖는반면짧은변에서는약한전기장의세기를갖게된다. 이러한전기장세기의기울기는음의유전 동력을갖는생화학적입자가미세유체채널내에서사다리꼴의긴변에서짧은변으로이동하게끔한다 (그림 5B). 이때, 유전 동력에의해발생하는입자의이동속도는입자의크기와fcm의절대크기에비례하므로유전적차이를갖는생화학적입자를분리및분석할수있다.
5. Programmable manipulation 및및랩랩온온어어칩칩응응용용프로그램화할수있는유전 동을구현하기위해서는DEP 용전극의이차
원배열이매우중요하다. Silicon Biosystems 회사는CMOS (complementarymetal-oxide-semiconductor) 회로를이용한 DEP 전극어레이 (320 x 320)칩을이용하여세포와마이크로비드 (microbead)들을 dielectrophoretic cage안에위치시켜서전기적으로세포또는마이크로비드의위치를조절할수있는기술을개발한바있다 [18]. 이런기술을이용하면마이크로비드에항체나세포에 향을줄수있는호르몬과같은물질을붙여서세포와미지의물질간의상호작용에대한연구도할수있다. 이기술은전극과의접촉없이또한채널이없는상태에서도전기적변화에의해세포와마이크로비드의움직임을조작할수있는장점이있다. 이미알고있는세포와미지의물질이붙어있는마이크로비드와상호작용을관찰하는신약물질선별과정과반대로미지의세포와이미기능을알고있는물질이붙어있는마이크로비드와의상호작용등을관찰하는진단에사용이가능할것으로기대된다 [그림 6].
이와같은 DEP 전극어레이에의한입자조작기술은프로그램에의해특정전극부분에만선택적으로DEP를유발할수있어입자를개별적, 선택적으로조절하고, 움직일수있는장점이있다. 또한동시에여러입자의조작도가능하다. 그러나궁극적으로는미리제작된전극어레이의해상도에 DEP 기능이의존하므로고해상도의CMOS 칩이필요한단점이있다.미리제작된전극대신 optoelectronic tweezers (OET)를사용하게되면좀
더진일보시킨프로그램화할수있는유전 동을구현할수있다. Chiou 등[19]은 photoconductive layer상에 digital micro-mirror device (DMD)에서유발되는광신호로서가상전극 (virtual electrodes)을형성시켜 OET에의한DEP를실험적으로보여주었다 (그림 7A). 즉, 빛을받은 역은전도도가증가하고, 빛을받지않는부분과비교할때, 전도도가뚜렷이차이나는가상전극이형성된다. 이러한방법은특히시료처리를위한 OET 부분만을일회용카트리지형태로사용할수있도록고안할수있기때문에의료용으로도유리할수있다. 그러나DMD를사용하는이유로아직은렌즈를포함하여광focusing을위한값비싼광학구조물을반드시사용해야만하는단점이있다.
최근본연구팀 [20]에서는휴대성이떨어지는 DMD 대신에 liquid crystaldisplay (LCD)위에직접접촉시킨 OET를사용하여미소물체를조작하는“Lab-on-a-Display” 라는기술을실현시킨바있다 (그림 7B). DMD 보다는약한광을이용하기때문에LCD의경우는 light source, 흑백또는칼라LCD종류, 인가전압, 미세입자의크기등이 DEP에 향을주었다. 그림 8은 LCD위에서조작되고있는직경 45 ㎛인폴리스티렌마이크로비드의시간에따른 상변화를보여주고있다. 그림에서와같이밝은이미지부분 (실제 redcolor)은 LCD에의한빛이 OET 층을통과하여가상의전극이만들어진상태이다. 경계부분에서받는음의 DEP force 에의해마이크로비드가 60초에걸쳐 1.8 mm× 2.4 mm 크기의 “I” 라는이미지를만들고있음을보여준다. 만들어진비드에의한형태는 LCD 신호를 off 해도그대로 유지됨을 알 수 있다 (65초).
[그림 6] 세포생물학및비드기반분석에사용될수있는 DEP 랩온어칩기술의개념도 [14]
[그림 7] Optoelectronic tweezers (OET)를사용한 DEP 조작방법의예. Programmablelight source 로서 (A) Digital micro-mirror device (DMD)를 (B) liquid crystaldisplay (LCD)를각각채용함.
[그림 5] 사다리꼴 전극을 이용한 유전 동 분리소자의 개념도 (A)와 이를 이용한 입자의분리실험결과 (B)
[그림 8] LCD 위에서 조작되고 있는 직경 45 ㎛인폴리스티렌마이크로비드의시간에따른 상변화
한국바이오칩학회 6
6. 결결론론이상에서유전 동에의한입자및세포의분리기술및이를이용한유전동분리소자등랩온어칩응용예를기술해보았다. 무엇보다유전 동기
술은시료를화학적으로수식할필요가없어세포를포함한생화학적시료의분리및조작에매우유리하다. 다만아직은세포종류별로 DEP 특성이어떻게다른지에대한연구가많이되어있지않아세포의크기별분류나그응용이제한되고있는실정이다. 또한, 유전 동을유발하기위해정확한유체조절이필요하다는점등은유전 동을이용한소자의실용화에큰해결점으로남아있다. 따라서다양한물리, 화학적 force를접목시킨유전 동의변형된형태의 개발도 요구된다. 이런 점에서 유속을 조절할 필요가 없는optoelectronic tweezers 에의한 programmable manipulation은본문에서예시된바와같은적절한응용분야를창출해낸다면앞으로그응용성이더욱커질것으로기대된다.
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