1 Cytogenetisk diagnostik 2005 (PCR, FISH, CGH) Thue Bryndorf Kromosomlaboratoriet Klinisk Genetisk Afdeling Hvorfor er vi der ? Dr. Lejeune Trisomi 21 (Downs Syndrom) Oplæg • Klassisk cytogenetik (kromosomer) • Nye metoder – Kromosom-PCR til hurtigt at diagnosticere de hyppigste fosterkromosomfejl – FISH og CGH til mere sensitiv kromosomdiagnostik
16
Embed
Hvorfor er vi der ? Cytogenetisk diagnostik 2005 (PCR ...old.fygo.dk/files/ukursus/Thue.pdf• Nakkefoldsscanning: Færre prøver. Flere abnorme. Mere nervøse gravide. • Sundhedsstyrelsen
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Cytogenetisk diagnostik 2005 (PCR, FISH, CGH)
Thue BryndorfKromosomlaboratoriet
Klinisk Genetisk Afdeling
Hvorfor er vi der ?
Dr. Lejeune
Trisomi 21 (Downs Syndrom)Oplæg
• Klassisk cytogenetik (kromosomer)• Nye metoder
– Kromosom-PCR til hurtigt at diagnosticere de hyppigste fosterkromosomfejl
– FISH og CGH til mere sensitiv kromosomdiagnostik
2
Prænatale prøvetyper
• Chorion villus biopsiFra 11u+0d
• AmniocenteseFra 15u+0d
Kromosomundersøgelse I
• Cirka 7.500/år i DK. ↓• Dyrkning af fostervands- eller chorion
villus celler i 10-12 dage• Standsning i delingsfase og herefter
– fremstilling af karyotype (d.v.s. samlet billede af alle fostrets kromosomer) og
– Kromosomoptælling• Svartid: 2-3 uger
Metafasekromosomer Karyotype
3
Kromosomundersøgelse II
• Hyppigste fund er NY-opståede sygdomme med ekstra eller manglende kromosomer (numeriske aneuploidier)
Prænatalt detekterede kromosomfejl i DK, 1993-2000
Kromosom 13, 18, 21, X og Y aneuploidier udgør 60-75% af alle prænatalt detekterede kromosomfejl, men 90-95% af alle de klinisk betydende kromosomfejl hos nyfødte
40 %Andre
16 %Kønskromosomfejl
44 %Trisomi 13, 18, 21 i alt
4 %Trisomi 13
10 %Trisomi 18
31 %Trisomi 21
Kromo-fejl i fostervandsprøver
Fra “Practical genetic counselling” af P. S. Harper, Oxford 1993.
0,739,647
0,737,746
0,716,245
0,705,044
0,614,543
0,583,742
0,582,941
0,582,340
0,571,839
0,551,538
0,521,238
0,501,036
0,450,935
Relativ andel af trisomi 21Alle kromosomfejl %Maternel alder
e Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr Asp Glu Tyr ArgT AAA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TAT GAT GAA TAT AGA
F508del
Kromosom-PCR
• Nakkefoldsscanning: Færre prøver. Flere abnorme. Mere nervøse gravide.
• Sundhedsstyrelsen 2004: Konsekvenserne ved de ofte betydelige ventetider ved kromosomdiagnostikken søges afbødet gennem anvendelse af analysemetoder med kort svartid.
Hvad er kromosom-PCR ?
• Kvantitativ PCR anvendes til at måle antallet af kromosomerne 13, 18, 21, X & Y
• Analysetid: 1½ døgn.• Svartid: 4-5 dage.
PCR – Nobelpris 1993
5
PCRPolymerase Chain Reaction
Redskab til kopiering af udvalgte DNA-segmenter 1.000.000 gange≥
• Resultatet af kromosom-PCR på din fostervandsprøve – den hurtige prænatale undersøgelse for kromosom 13, 18, 21 og kønskromosomerne – viser normale forhold.
• Det endelige resultat, som omfatter analyse af alle kromosomer, forventes inden for 3 uger og du modtager endnu et brev.
• Såfremt vi finder forhold, der fraviger det første resultat, bliver du kontaktet telefonisk.
Perspektiv
• Kromosom-PCR teknikken bliver allerede nu anvendt til andre analyser– udredning af mentalt retarderede børn– skal til at anvendes inden for udredning af
cancer og fostre med hjertefejl
Hvad er FISH ?
• DNA-baseret teknik• Specifik farvning af kromosomer eller dele
af kromosomer
7
FISH FISH
FISH
• Interfase-FISH– FISH på cellekerner
• Metafase-FISH– FISH på kromosompræparater
Interfase-FISH disomi
8
Interfase-FISH trisomi Interfase-FISH multicolor
Normal (18/21-hybridisering) Trisomi 21
Aneuploidi screening for 13, 16, 18, 21, og 22
Prober: gul, rød, mørkeblå, lyseblå og grøn fluorescens
Mor med balanceret 1;5 translokation
9
Balancerede translokationsbærere
• Risiko for ubalancerede fejl i kønsceller– Nedsat fertilitet– Spontane aborter– Misdannede/retarderede børn
Præimplantatorisk diagnostik (PGD)
PGD ubalanceret 1;5 translokation Metafase FISH
• Afklaring af indviklede karyotyper
10
Translokation (ekstra materiale på kr. 18) Metafase FISH (kr. 18 maleprobe)
Metafase FISH (kr. 11 maleprobe) Henvisning fra UL
• Hjertemisdannelse hos fostret (truncus arteriosus), obs. del 22q11
11
Mikrodeletioner
• 22q11 deletions-syndrom– Medfødte hjertefejl– Aplasi/hypoplasi af thyroidea/parathyroidea– Craniofaciale misdannelser
Undersøgelse for 22q11 deletion
- Deletion + Deletion (A1600-01)
Metafase FISHFordel
• Sikker identifikation af translokeret og ekstra eller manglende materiale
Metafase FISHUlemper
• Man skal have en mistanke om, hvilket materiale som er translokeret og/eller duplikeret
• Prober er dyre• Varierende probe signal kvalitet• Visse områder dækkes ikke af maleprober• Proberne er vanskelige at kombinere i stort
tal i samme reaktion
12
Perspektiv
• FISH teknikken finder ikke nye anvendelsesområder.
• Multi-PCR overtager – bortset fra ved præimplantatorisk diagnostik
CGH
CGH hybridisering på normale kromosomer CGH-analyse
13
CGH analyse af Tali, 3 år gammel pige
• Fysisk og mentalt retarderet • Mikrocefali• Bred og flad næse• Lavtsiddende ører• Tynd øverste læbe• Lang philtrum• Høj gane
Mor gravid (10 uger)Dim(21q22->ter) Enh(22q13->qterB4996-02, No. 36
Mor
CGH på foster
CGH på Tali
Dim(21q22->ter) Enh(22q13->qter)
Enh(21q22->qter) Dim(22q13->qter) CVS - foster
14
1Mb chip
3000 kloner med cirka 1 millionbasepars afstand470 særligt udvalgte kloner fra områder,som er involveret i mental retardering
Array-CGH
• Måske den endelige afløser for almindelig kromosomanalyse – evt. i kombination med kromosom-PCR
• En masse ”nye” syndromer vil blive defineret –ligesom det skete i 50-60’erne, da det blev muligt at lave almindelig kromosomanalyse.
• Vi skal være med til at definere, hvad der er normalt