26/01/2017 1 HLA et greffe d’organe : Groupage, anticorps et crossmatch JL TAUPIN INSERM U1160 - Centre Hayem Lab of Immunology and Histocompatibility Hôpital Saint-Louis APHP University Paris-Diderot Découverte du HLA Leuco-agglutination MAC = HLA-A2
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HLA et greffe d’organe : Groupage, anticorps et crossmatch · HLA et greffe d’organe : Groupage, anticorps et crossmatch JL TAUPIN INSERM U1160 -Centre Hayem Labof Immunologyand
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26/01/2017
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HLA et greffe d’organe :
Groupage, anticorps et crossmatch
JL TAUPIN
INSERM U1160 - Centre Hayem
Lab of Immunology and Histocompatibility
Hôpital Saint-Louis APHP
University Paris-Diderot
Découverte du HLA
Leuco-agglutination
MAC = HLA-A2
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Gènes et protéines du HLA
Polygénisme du système HLA
systèmepolygénique
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3
CO
L11A
2
DP
B2
DP
A2
DP
B1
DP
A1
DM
AD
MB
LMP
2
TAP
1
TAP
2
DQ
B3
DQ
A1
DR
B1
DR
B2,
6 o
u 7
DR
B3,
4, 5
ou
rien
DR
B8
ou r
ien
100 kb
centromère télomère
DP DM DQ DR
CO
L11A
2
DP
B2
DP
A2
DP
B1
DP
A1
DM
AD
MB
LMP
2
TAP
1
TAP
2
DQ
B2
DQ
A1
DR
B1
DR
B2,
6 o
u 7
DR
B3,
4, 5
ou
rien
DR
B8
ou r
ien
100 kb
centromère télomère
les gènes ne sont pas représentés à l’échelle, seules les distances les séparant le sont.
en noir: gènes HLA II exprimésen hachuré: pseudogènes HLAen blanc: gènes associés au HLA
DP DM DQ DR
Organisation de la région HLA de classe II
DQ
A2
DQ
B3
DO
B
DO
A
en noir: gènes exprimésen hachuré: pseudogènespour tous les haplotypes, l’allèle DRA exprimé est l’allèle DRA*0101 (il en existe un second, rare)
Structure tridimensionnelle des molécules HLA de cl asse I
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Molécule HLA de classe I présentant un peptide
sillon profond aux extrémités ferméespeptide court (8 à 12 acides aminés)
Molécule HLA de classe II présentant un peptide
sillon aux extrémités ouvertes : le peptide peut dé passerpeptide long (16 à 25 acides aminés)
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liaison avec le TCR
209 (>5.1011) peptides de 9 AAdans la nature
Présentation et reconnaissance
(Garboczi et al, Nature 1996)
liaison avec la moléculeHLA de classe I
le polymorphisme est principalement localisédans la région qui forme la poche
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La fréquence des LyT alloréactifs
• 1 LyT sur 10 5 à 106 reconnaît un peptide viral en l’absencede tout contact antérieur
• mais 1 à 10% des LyT circulants sont alloréactifs, chez unindividu qui n’a jamais été en contact avec un all o-antigène
Pourquoi ?????
Les CMH du Soi et du non-Soiexposent
des surfaces très proches
Le TCR peut donc reconnaîtrele CMH allogénique(sauf exception ?)
Le répertoire de peptidesprésenté par le CMH allo
est différent
Les peptides présents chez le Soi(mais non présentables par le Soi)sont considérés comme étrangers
l’alloréactivité est donc une conséquence directede la réactivité croisée du TCR
… parce que la présentation et la reconnaissancede l’antigène sont des mécanismes très subtils
Limitation possible à considérer : les contraintes potentiellement imposées par leco-récepteur CD4 ou CD8 dans l’orientation du TCR et du pCMH dans le complexe
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Le polymorphisme du HLA
Nomenclature du système HLA
Historique de la classification
Notion de « super-type »Notion de « sous-type » ou spécificitéNotion d’allèle
(Cesbron-Gautier et al, EMC, hématologie, 2007)
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Hülsmeyer et al. J Biol Chem 2005, 280 : 2972-80
Un anticorps est beaucoup plus gros qu’une molécule HLA
Un anticorps ne « voit » que lesvariations de surface de la moléculeHLA et pas la région la plus variable, l’intérieur de la poche
Le polymorphisme HLA
Octobre 2015:>10500 allèles de classe I>3000 allèles de classe IIno
mbr
e d’
allè
les
conn
us
année
systèmepolyallélique
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Classe I
Octobre 2015 :>7300 protéines de classe I>2500 protéines de classe II
Le répertoire peptidiqueprésentable varie avecla composition de la poche
Le polymorphisme HLAno
mbr
e d’
allè
les
conn
us
année
nombre d’allèles HLA connus (au 01/10/2015)
HLA Class I Alleles 10297 HLA Class II Alleles 3543 HLA Alleles 13840
Gene A B C E F GAlleles 3285 4077 2801 18 22 51 Proteins 2313 3011 1985 7 4 17 Nulls 153 128 93 1 0 2
locus:gène codant pour la molécule A gène codant pour la chaîne ββββ de lapremière molécule DR
série allélique qui correspondà une spécificité sérologique,
ici A2 et DR1
numéro de l’allèledans la série allélique
Allèles particuliers:
HLA-A*02:01N : indique un allèle nul (non exprimé à la surface cellulaire: non produit ou soluble)HLA-A*02:01:02 : indique un allèle qui diffère de HLA-A*0201 par une mutation synonymeHLA-A*02:01:01:02 : indique un allèle qui contient une mutation en dehors de la région codanteHLA-A*02:01:01:02L : indique un allèle peu exprimé (« low ») qui contient une mutation en dehors de la région codante
HLA-A*02:01S : indique un allèle produit uniquement sous une forme sécrétée
HLA-A*02:01Q : indique un allèle dont le niveau d’expression est encore à confirmer (« questionable »)
mais tous les allèles ne sont pas présentsà la même fréquence dans la population
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Expressionco-dominante
une cellule « normale :classe I seulementdonc 2 molécules A + 2 B + 2 C
une cellule présentatrice de l’antigène :classe Iet deux molécules DR (gène DRB1)et 0 à 2 autres molécules DR (gènes DRB3/4/5)et 4 DQ et 4 DP
car : DQA et DQB polymorphesDPA et DPB polymorphes(mais DRA monomorphe)
le polymorphisme d’expression en classe II est > à la classe I
Combien de molécules HLA différentesune cellule exprime-t-elle ?
“Seen” byA2,A68;B27,B44
“Seen” byA2,A24;B7,B8
“Seen” byA2,A68;B35,B44
Polymorphic Residues on B51
Structural Basis of a HLA-B51 Mismatch(for antibodies)
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Groupage HLA
Groupage HLA de basse résolution: groupage génériqu e
Groupage HLA de haute résolution: groupage alléliqu e
= identifier les allèles à la base près���� biologie moléculaire (ex: A*02:01, DRB1*04:01)
PCR-SSPséquençage classique et NGS
Entre les deux: résolution intermédiaire���� biologie moléculaire sauf NGS
(ex: A*02:01/05/10, DRB1*04:01/09)
Groupage HLA
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1- Typage HLA par lymphocytotoxicité dépendante du Complément
molécule HLAreconnue
C’
Bromured’éthidium (rouge)
molécule HLAnon reconnue
C’
Acridineorange (vert)
Classe I
Classe II
les plaques de typages en « LCT » :
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Modification avec biotinylation d’une des amorces d e la PCR
2- Typage HLA en PCR-SSO-Reverse type « innolipa »
SSP = Sequence-Specific Primer
en 1992
une PCR par allèle ou par groupe d’allèlesavec une ou deux amorce(s) spécifique(s)
dépôt
ADN génomique
contrôle interne
bande spécifique
3- Typage HLA en PCR-SSP
� analyse du profil de bandes
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4- Typage HLA par NGS ( Next Generation Sequencing )
Principe général
- séquençage par synthèse après immobilisation de la matrice
Rizzo et alCancer Res Prev Rev2012
- multiplexage : plusieurs patients mélangés, indexation des amorces PCR
Amplification HLA par PCR « long range » > 5 kb
Alignement des « reads » pour définir la « couverture » de la région étudiéeet en déduire la séquence sans ambiguïté
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Anticorps anti-HLA et Crossmatch
la page « CRISTAL-immunologie » d’un patient en attente
TGI : nb de donneursincompatibles (=présenced’un Ac) sur5 ans en France
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1- Origine des anticorps anti-HLA
1- ne sont normalement pas présents sans évènementimmunisant allogénique
= anticorps immuns
2- causes:transfusions de culots globulaires
contaminants leucocytairesAc anti-classe I et/ou II
transfusions plaquettairesAc anti-classe I
grossesse10% après une grossesse, 60% après 3Ac anti-classe I et/ou II
transplantation antérieureAc anti-classe I et/ou II
2- Effets pathogènes
� Ac d’isotype IgG, IgA et/ou IgM
� les IgM ne sont pas en général pas pathogènes ; IgA ?
� impliqués dans:rejet hyperaigu :
Ac circulants préexistantsdans les minutes suivant la greffe
rejet aigurejet chronique
� mécanismes:activation du Complémentmobilisation des cellules phagocytaires
destruction cellulaire, inflammation
prolifération endothélium (rejet chronique)
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1969 : l’immunisation anti-donneur impose de procéd erà un crossmatch avant toute transplantation pour év iterle rejet hyperaigu (Patel et Terasaki, NEJM, 1969, 280: 735)
���� DSA pour « Donor Specific Antibody »
En 40 ans, l’identification du donneur compatible a évolué ++ :- meilleure sensibilité du crossmatch
- tests de recherche/identification des anticorpsLCT < ELISA < Luminex
amélioration de sensibilitéspécificitérésolution
La dernière idée à la mode, très « XXI e siècle » := le crossmatch virtuel
sérum non traité = IgG et IgMsérum traité DTT = IgG
= technique de référence (LCT type « NIH »)(Patel et Terasaki, NEJM, 1969, 280: 735)
résultat en score : 1, 2, 4, 6, 8
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Mise en évidence de rejets rapides à XM négatif
besoin de techniques plus sensibles
- XM LCT avec lavage (1970)(Amos et al, Transplantation 1970, 7: 220)
- XM LCT sur LyT sensibilisé à l’anti-globuline (1972)(Johnson et al, Tissue Antigens, 1972, 2: 215)
- XM LCT sur LyB sensibilisé à l’anti-globuline (1984)(Gebel et al, Tissue Antigens, 1984, 23: 135)
- XM en cytométrie en flux (1983)(Garavoy et al, Transplant Proc, 1983, 15: 1939)
sensibilité(/ LCT)
1
X 10-30
X 100-300
2- Microlymphocytotoxicité sensibilisée (LCT-AGH)
HLA-B 1HLA-B 2
HLA-Cw 1HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
C ’
sérum à tester (Ac)
cellule cible(donneur de phénotype HLA connu)
� principe
Antiglobuline (anti-IgG humaine polyclonale)
C ’
En plus :
- isotypes n’activant pas le Complément- anticorps en trop faible concentration
(système d’amplification du signal)
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3- Cytométrie en flux (CMF)
HLA
cellule cible(donneur de phénotype HLA connu)
sérum à tester (Ac)
Antiglobuline fluorescente (anti-IgG ou IgM humaine polyclonale)
Anti-CD3 (LyT) ou CD19 (LyB)
Anti-CD45 (leucocytes)
amplification du signal ++++
+/- pré-traitement Pronase (digère les RFc des LyB)
2- évolution des techniquesd’identification des anticorps anti-HLA
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1- microlymphocytotoxicité (LCT)
HLA-B 1HLA-B 2
HLA-Cw 1
HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
C ’
identifier la(es) molécule(s)HLA reconnue(s)
sérum à tester (Ac)
cellule cible(phénotype HLA connu)
panel de 30 à 60 cellulesrecouvrant les spécificités HLA
rencontrées localementprivilégiant les associations HLA rares
estimer le degré d’immunisationvis à vis de la population générale
panel représentatif de la répartition HLAcalcul du PRA % (panel reactive antibody)
hyperimmunisé: PRA>80%
sérum non traité = IgG et IgMsérum traité DTT = IgG
2- microlymphocytotoxicité sensibilisée (LCT-AGH)
HLA-B 1HLA-B 2
HLA-Cw 1HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
C ’
sérum à tester (Ac)
cellule cible(phénotype HLA connu)
� principe
Antiglobuline (anti-IgG humaine)
Comme avec la LCT-NIH, pour identifier les anti-classe II sur LyB,il faut au préalable adsorber les anti-classe I sur pools de plaquettes(très lourd !!!!)
C ’
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3- ELISA et Luminex sur panel
HLA-B 1
HLA-B 2
HLA-Cw 1
HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
cellule de phénotype HLA connu
purification des molécules HLA
Principe de l’ELISA Principe du Luminex
sérum à tester (Ac)
coloration
Ac anti-IgG humaines
fluorescence
� principe1 cellule par puits/bille
Appareil Luminex
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� modalités d’application
Screening ou dépistage : réponse + ou –tous les antigènes mélangésséparément classe I et classe II
Identification sur panel : 50 à 60 billes ou puits en classe Ienviron 30 en classe IIcorrespond au panel LCT1 « cellule » par bille ou puitscalcul d’un PRAsensibilité > au dépistage
Identification sur antigènes séparés : « single antigen »sensibilité > au panelpas de PRA
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Mr MAR Groupe : A3 A30 B35 B391er rein : A1 A2 B35 en 1982
A2
A28
score 8score 6
sc. 4
sérum du 30/11/04
en panel luminex :
PRA = 22/56 = 40%
4- Techniques de haute résolution ou « single antigen »� principe
HLA-B 1
HLA-B 2
HLA-Cw 1
HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
cellule de phénotype HLA connu
purification séparée des molécules HLA(ou molécules recombinantes)
Principe de l’ELISA Principe du Luminex
sérum à tester (Ac)
coloration
Ac anti-IgG humaines
fluorescence
1 antigène par puits/bille
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� modalités d’application
Application récente :
apparition en France en 2000 en classe I en ELISAen 2004 en classe I en Luminexen 2005 en classe II en Luminex
Développement progressif :
gamme Luminex complète en classe I et II depuis fin 2007 seulementA, B et Cw en classe IDR, DQ et DP en classe IIchaîne α et β pour DQavec les allèles qui couvrent > 95% de la pop.
C1q+ serum DSA is close to, but does not reach significance
Only one study, two different SAFB kits from different vendors
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Ciurea et al, BBMT 2015
Le test C1q détecte les DSA cliniquement actifs en greffe de CSH aussi
n=73 sera
single antigen revealedfor IgG or C1q
Ab strength very stronglycorrelates with IgG MFI :
C1q+ Threshold = 14000
C1q assay and antibody strength
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Guidicelli/Guerville et al
Les DSA C1q- seraient aussi délétères que
les DSA C1q+ mais à plus long terme
2013
very often >1 isotype
almost always IgG1 (+/- IgG3)
IgG subclasses for anti-HLA antibodies
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IgG subclasses for anti-HLA antibodies
Lefaucheur et al,
5/104 n’ontni G1 ni G3
iDSA préformé chez 78% des patientsiDSA défini par la MFI la plus forteen test pan-IgG � sous-classe iDSA
C1q iDSA
Correlations are antigen-dependent
Anticorps anti-HLAde classe I
dit « dénaturé »
(Visentin et al,Transplantation 2016)
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39% of sera
N DM
FI (
x10
-3)
0
5
10
15
20
not with every Ag
23% 22% 21
%
21
%
0% 0% 0% 1%
% are for D >1.2N, among
the n cases with MFI>1000
in non-denaturing
condition
Visentin et al, Transplantation 2014
N D
MF
I (x1
0-3
)
0
5
10
15
20
kind of targetHLA epitope
Native 100% acid-sensitive
Acid-denatured
Bead-denatured acid-resistantor
+/- +/- +/-
native or , but partlyacid-sensitiveor +
The reality couldbe more subtle…
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85% of
FCXM+
p<0.0001
21% of
FCXM+
threshold for positivity = 50 MCS
64 different donor cells
225 FCXM tests
1 class I Ag mismatch
with SAFB MFI>2000
anti-dHLA :
n=71 tests
for 12 A, 14 B and 1 Cw
with 39 serum samples
antianti--nHLA :nHLA :
n=154 tests
for 13 A, 21 B and 1 Cw
with 84 serum samples
A few examples
80 ERN = native
#5024 (66I+70Q)
= cryptic
161D = native
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A major gain in transplant access
for many patients with
« basal » cPRA below 60%
cPRA decreased for 96/323 patients
cPRA estimated after removal
of the Ab against denatured
Ag (D>1.2N)
5- les stratégies possibles au laboratoire HLA
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2- Anticorps en LCT et crossmatch en cytométrie
3- Anticorps en technique sensible et crossmatch en LCT
4- Le « tout Fluo » : anticorps et crossmatch en techn iques sensibles
1- Le « tout LCT » : anticorps et crossmatch
Peu de sélection immunologique D/RCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité comparable
Sélection immunologique D/R +++, mais au moment de l’urgenceIncohérence du raisonnement: sensibilité maximale au dernier moment
Sélection immunologique D/R +++, en amont de l’urgenceCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité maximale en amontMais crossmatch peu sensible
Sélection immunologique D/R +++, en amont et au moment de l’urgenceCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité comparable
5- Le « tout Fluo » sans crossmatch réel (crossmatch v irtuel)
Remplacer le crossmatch par un « single antigen » du sérum du jour
Conclusions
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single antigen, baselineTests XM CMF
Ag Bw6 nb donneurs résultat (x bt de fd)
B39 1 1,5 sur T et 3 sur B
1- Définir au cas par cas le seuil d’interdiction d’ un Ag HLA ?
DSA faible, crossmatch faible,… Mais s’il s’agit d’un donneur vivant ?
- définir le risque acceptable pour chaque patient immunisé :crossmatch sensible positif toléré ?anticorps faiblement positif non contre-indiqué ?
� à voir en fonction de l’accès à la greffe (FAG, TGI)
voir aussi Gebel et al, Am J Transplant 2003,3: 1488-500et Bray et al, Curr Op Organ Transplant 2009, 14: 392-7
- gestion au cas par cas au laboratoire HLA (CRISTAL)en accord avec l’équipe de greffe
2- stratifier le risque immunologique
(Taylor et al, Hum Immunol, 2009 ; 70: 563)
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non immunisé LCT négative
immunisation
XM
LCT positive (LyT ou totaux)
Force de l’Ac anti-HLA
pasde
greffe
greffe
Il y a 40 ans (Terasaki, NEJM 1969) :
Ac anti-HLA
XM
immunisation faible
non immunisé
immunisation moyenne
immunisation forte
Force de l’Ac anti-HLA
pasde
greffe
greffe sans
risque immuno
greffeà
risqueimmuno
Ag permis
XM LCTpositif
MFI 500
XM B CMF+
>250 MCS
XM B CMF+
<250 MCS
greffe avant le
résultat du XM
REIN:* désinterdire1) MFI <3000 pour TGI>60% inscrit >2 ans2) Ag <5000 5 ans pour HAP >5 ans3) Ag<1000 depuis>5 ans pour tous
*avec prozone, Ac non ABDRDQ, allèles...
Aujourd’hui :
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Ac anti-HLA
XM
immunisation faible
non immunisé
immunisation moyenne
immunisation forte
Force de l’Ac anti-HLA
pasde
greffe
greffe sans
risque immuno
greffeà
risqueimmuno
Ag permis
XM LCTpositif
MFI 500
XM B CMF+
>250 MCS
XM B CMF+
<250 MCS
greffe avant le
résultat du XM
REIN:* désinterdire1) MFI<3000 (dernier sérum) pour TGI>60% inscrit >2 ans2) MFI<5000 (dernier sérum) pour HAP >5 ans3) Ag<1000 depuis >5 ans pour tous immunisés
*prenant en compte prozone, Ac non ABDRDQ, allèles...
Aujourd’hui (ex CHU de Bordeaux):
- logiciel HLA Matchmaker et la notion d’éplet(travaux de René Duquesnoy)
pas de consensus entre les études surl’influence du nombre d’épitopes apportés au receveuret le risque de rejet
- autre approche (charge électrique, hydrophobicité….)