Instituto Tecnológico de Co Ingeniería Bioquímica 5 Hibridación y Blotting de
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Instituto Tecnológico de ColimaIngeniería Bioquímica
1-5 Hibridación y Blotting de AN
Híbrido: Cruce de 2 especies distintas.
En Biología Molecular:
Proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con
secuencia de bases complementarias en una única molécula de doble cadena, que
toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el
interior.
Dichas cadenas pueden ser de DNA/DNA ó DNA/RNA.
En ambos casos, se utiliza una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-
químico (radiactiva o fluorescente). Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos
conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de
cadena sencilla de secuencia parecida.
Protocolo General:
1. La hélice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso físico (calor) o
químico (con una base fuerte).
2. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.
3. Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de
cadenas simples.
4. La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van
emparejando por las zonas complementarias (más estables termodinámicamente) y se
va formando una nueva molécula ”híbrida”.
Blot= Mancha.
Proceso en el cual se hibridan 2 fragmentos de DNA.
El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por
electroforesis.
Los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso
químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas.
El ADN inserto en el gel es transferido a una membrana de nitrocelulosa.
Dicha membrana se incuba durante un tiempo con la sonda marcada para hibridar a
las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy
parecida).
La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar mediante
una radiografía para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz,
para el caso de sondas fluorescentes.
Southern Blot
Gel de electroforesisRadiografía de la
membrana hibridada
Digestión con EcoRI de 14 colonias que son probables portadoras de un gen de interés. Sólo 6 de las 14
confirmaron ser positivas después de realizar el Southern Blot.
Northern BlotSe utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se
usa como sonda.
El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en
gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado
desnaturalizado.
El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern.
El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios
de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero
en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.
Hibridación in situ: FISH
Las sondas (fluorescentes) se hibridan directamente sobre material orgánico. Usada
en conjunto con técnicas de microscopía.
FISH (Fluorescent in situ Hybridization). Se usa para identificar regiones específicas
de ADN en los cromosomas (detección de anomalías congénitas, por ejemplo).
Protocolo general:
1. Se genera la sonda fluorescente basándose en la secuencia de interés.
2. Se hibrida con los cromosomas (fijos en un portaobjetos y desnaturalizados).
3. Se examina la muestra al microscopio con luz fluorescente. Si hay señales
fluorescentes, la sonda hibridó en la región blanco.
Detección de la replicación de un vector adenoviral en células humanas por FISH. Para lograr
mayor contraste, los núcleos se tiñeron con yoduro de propidio (rojo).
Western Blot: Blotting sin AN
Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra
determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular).
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que
se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc.
Las proteínas se transfieren a una membrana adsorbente (nitrocelulosa) para poder
buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.
Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad
enzimática, fluorescencia entre otros métodos.
De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su
cantidad relativa respecto a otras proteínas.
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