Haziran 2012 Sayısı

BIOKURUMSALILAN.pdf 1 6/7/12 4:34 PM

indeks

04

10

20

22

23

24

Ailevi Akdeniz Ateşi

NanoCHIP® mikroarray teknolojisi kullanılarak yeni geliştirilen moleküler bazlı diagnostik görünteleme testinin nozokomiyal enfeksiyonlardan MRSA, VRE ve KPC’nin eşzamanlı teşhisi

MEFV mutasyonlarının saptanması için geliştirilmiş Elektronik Mikroarray-Temelli Tanı Testi

Mikroelektronik Dizin (Array) Teknolojisini kullanarak klinik olarak anlamlı tek nükleotit polimorfizm analizi

CYP2D6 genotipleme panelinin NanoChip Moleküler Biyoloji Çalışma istasyonunda validasyonu

“İKİ DÜŞÜN, BİR SÖYLE”Kalitatif Gerçek Zamanlı PZR Yöntemlerinin Verifikasyonu

3

Moleküler Biyolojinin diagnostik alanda kullanımı hiç şüphesiz laboratuvar tıbbının en hızlı büyüyen alanı olmuştur. DNA ve RNA’nın yapısal varyasyonlarının kronik hastalıkların gelişmesiyle olan ilişkisi aydınlandıkça bu alanın daha da gelişeceği görülmektedir.

Monogenik hastalıklardan sorumlu pek çok gen, başarıyla izole edilmiş ve klinik teşhis, taşıyıcıların tespiti veya hastalık geliştirmesi muhtemel kişilerin tanınması açısından kullanılmaktadır. Kardiyo-vasküler hastalıklar, astım, osteoporoz gibi kompleks hastalıkların tanısı ise bu hastalıklardaki risk faktörlerinin çevresel ve genetik olanlarının daha iyi ayrılması sonucu gerçekleşebilecektir.

Diagnostik Moleküler Biyoloji, Hematoloji, İmmünoloji ve Mikrobiyoloji gibi pek çok değişik alanda başarıyla kullanılmaktadır. Genetik hemokromatozis ve kistik fibrozis gibi genel popülasyonda nadir görülen genetik hastalıkların laboratuvar teşhisi yanında, moleküler testlerin pek çok değişik hastalığın tanı ve tedavisine katkısı olacağı, ancak bu katkının günümüzde kullanılan testlerin dışlanmasıyla değil birlikte kullanılmasıyla en üst düzeye ulaşacağı kesindir.

İlk kez 1993 yılında kimya dalında Nobel ödülünü alan Dr. Kary Banks Mullis’in polimeraz zincir reak-siyonunu (PCR) keşfetmesiyle 20.yy’da yeni bir sayfa açılmıştır. Bu keşfin sonucunda günümüzde moleküler mikrobiyoloji denen bir mikrobiyoloji alanı kurulmuştur. Bu alan prokaryotik ve ökaryo-tik mikroorganizmaların hayat döngüsü ile ilgili fizyolojik prensiplerin saptanmasını bir araç olarak kullanmaktadır. Gen regülasyonu, genetik transfer regülasyonu, makromoleküllerin sentezi, hücre-hücre iletişimi, patojenlik ve virülansın moleküler temelleri bu branşta önemli rol oynamaktadır.

Nükleik asit işaretleme, amplifikasyon gibi moleküler tekniklerin kullanımı, infektif patojen-lerin tanınması ve nozokomiyal izolatların ilişkilerini aydınlatmada kullanılmaktadır. Enfeksiyon hastalıklarında bu, çok daha düşük miktarlarda DNA ve/veya RNA’nın tespiti ile yavaş üreyen pato-jenlerin antibiyotiklere hassasiyetinin tespiti için geçecek zamanın ileri derecede azalması ve kültürü alınmayan organizmaların teşhisini sağlayacaktır.

Bu yeniliklerin topluma ulaşacak sağlık hizmetinin kalitesini etkilemesi, iki önemli gelişmeye bağlıdır; Bunlardan birincisi, Sağlık Bakanlığının bu yöntemlerin önemini ve sağlık hizmetine katkısını kavrayarak, bu yöntemlerin kullanılmasını fiyatlandırması, ikincisi ve daha önemlisi ise, Klinisyenlerin bu yöntemlerle ilgili bilgilerinin geliştirilmesi ve pekiştirilmesidir.

Bu sayımızda bu amaca hizmet etmeye çalışarak, moleküler biyolojik yöntemlerin anlaşılmasında ve kullanılmasında önemli sorulara cevap olabilecek yazılar bulacaksınız.

Saygılarımla,

Editör Prof. Dr. Kaya Emerk

Değerli Okurumuz;


Ailevi Akdeniz ateşi (AAA) sıklıkla Türk, Yahudi, Arap ve Ermeni’lerde görülen, kendi kendine düzelen kısa süreli ateş ve serozit ataklarıyla karakterize otozomal resesif bir hastalıktır (1). Ailevi Akdeniz ateşi hastalığı, tipik bir klinik tabloya sahip olması ve binlerce yıldır Anadolu, Kafkaslar ve Orta doğuda var olmasına karşın, ancak 1945 yılında S. Siegal’in yayınladığı 5 hastanın bulguları AAA’nın başlı başına bir hastalık olduğunu göstermiştir(2). 1972 yıllarında İsrail’li araştırmacılar hastalığın klinik özelliklerini (Tel Hashomer Kriterleri) ve kalıtım modelinin otozomal resesif olduğunu belirlediler (3). 1972 yılında Özkan ve Goldfinger hastalığın tedavisinde ilk kez kolşisin kullanımını önerdiler (4,5).

AAA Hastalığının Klinik Özellikleri

Hastalık tekrarlayan ateşli ve ağrılı ataklar ile karakterize olup, yüksek ateşe, periton, plevra ya da sinovyum seröz membranlarından birinde oluşan inflamasyonun neden olduğu ciddi karın, göğüs veya alt ekstremite ağrıları eşlik etmektedir (6). Semptomlar, hastaların %70’inde hayatın ilk on yılında, %90’ında ise, yaşamının ilk yirmi yılında ortaya çıkmaktadır (7). Erkek ve kadınların hastalıktan eşit oranda etkilediği belirtilmişse de, bazı çalışmalarda erkeklerde daha sıklıkla gözlendiği, ve bu oranın 1,5-2,0 :1.0 olduğu bildirilmiştir (7). Karın ağrısı semptomu, hastaların yaklaşık %95‘inde görülmekte olup, %50’sinde ise, ilk semptom olarak bildirilmektedir. Karın ağrısı yaklaşık 3-4 gün sürdükten sonra kendiliğinden kaybolmaktadır (8). Eklem ağrıları, genellikle akut tekrar-layan monoartrit şeklinde; ayak bileği, diz ve kalça eklemlerinde görülmektedir (8). Plevral göğüs ağrısı atakları, hastaların %25-50’sinde görülmekte ve genellikle tek taraflıdır (8).

Erizepel benzeri eritem, AAA hastalarında %3 ile %46 arasında görülen en karakteristik cilt lezyonudur. Lezyonlar; kızarık, ısı artışı olan, bacağın önünde veya, ayağın sırtında olup tek taraflı veya simetrik olabilmektedir (9).

AAA hastalığının, en ciddi komplikasyonu amiloid gelişimidir. Serum amiloid A (SAA) proteinin böbreklerde birikmesi sonucunda, hastalarda kronik böbrek yetmezliği gözlenmektedir. Böbreklerin dışında, kalp, böbrek üstü bezleri, karaciğer, tiroid ve ince bağırsaklarda da amiloid birikimi görülmektedir (10).

Semptomlar, hastaların %70’inde hayatın ilk on yılında, %90’ında ise, yaşamının ilk yirmi yılında ortaya çıkmaktadır.


HazırlayanProf. Dr. Engin YılmazHacettepe Üniversitesi, Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı

5

Tedavi

AAA hastalığının tedavisi için 1972 yılında, Goldfinger ve Özkan tarafından günlük kolşisin tedavisi önerildikten sonra 1974 yılında Zemer ve arkadaşları tarafından kolşisin tedavisinin, AAA ataklarını ve amiloidoz gelişimini önlediğinin gösterilmesi ile günümüze kadar kullanılan en yaygın tedavi olmuştur (11). Kolşisine cevap vermeyen hastalarda, interferon alfa veya TNF alfa inhibitörü olan etenersept de kullanılabilmektedir (12).

Prevelans

AAA, kalıtsal periyodik ateşli sendromlar arasında en çok görülen olup, dünya üzerinde 100.000’den fazla kişinin hayatını etkilemektedir. Özellikle Akdeniz bölgesinde yaşayan Türk, Musevi, Ermeni ve Arap popülasyonlarında yaygın olarak görülmektedir (13). Akdeniz bölgesinde yer almayan Japonya gibi bazı popülasyonlarda da AAA’ya rastlanıldığı rapor edilmiştir (14).

Musevi, Ermeni ve Arap popülasyonlarında hastalığın prevelansı 1/250-1/1000 olarak bildirilmiştir (15). Türkiye‘de yapılan bir epidemiyolojik çalışmaya göre hastalığın prevelansı 1/1073 olarak rapor edilmiştir (16). Ancak Anadolu’nun merkezinde prevelansı 1/395 olarak daha yüksek bir oranda bulunmaktadır (17).

Taşıyıcılık oranı, Türk ve Kuzey Afrika Musevi popülasyonunda 1/5 (18), Ermeni popülasyo-nunda 1/7, Ashkenazi Musevilerinde ise, 1/11 (19) olarak bildirilmiştir. Taşıyıcılık oranı hastalığın görüldüğü popülasyonlarda yüksek olup, bu durum hastalığa neden olan allellerin evrimsel süreçte korunmuş olabileceğini işaret etmektedir.

Etiyoloji

Pras ve akadaşları tarafından 1992 yılında yapılan bağlantı analizi çalışmaları sonu-cunda, AAA gen bölgesinin 16. kromozomun kısa kolunda 13.3 bandında (16p13.3) yer aldığı gösterilmiştir (20).

AAA geni, 1997 yılında iki farklı çalışma grubu tarafından aynı anda klonlanmıştır (21,22). MEFV (MEditerranean FeVer) adı verilen bu gen, 3505 nükleotid içermekte ve 10 ekzondan oluşmaktadır (Şekil 1). MEFV geni 781 aminoasitlik Pyrin proteinini kodlamaktadır.

Akdeniz bölgesinde yer almayan Japonya gibi bazı popülasyonlarda da AAA’ya rastlanıldığı rapor edilmiştir.

MEFV geninde bugüne kadar, AAA ile ilişkilendirilmiş 85 mutasyon tanımlanmıştır. Mutasyonların %80’inden fazlası 10. ekzonda yer almaktadır. Diğer mutasyonlar ise, 2., 3. ve 5. ekzonlarda bulunmaktadır (23). Bazı popülasyonlara ait MEFV gen mutasyonlarının oranları Tablo 1’de verilmiştir.

Tablo 1: AAA hastalarında MEFV gen mutasyonlarının popülasyonlara göre dağılımı (%) (N: Hasta sayısı)

MEFV Geninin İfadesi ve Patogenez

MEFV geninden, 86 kDa büyüklüğünde Pyrin proteini kodlanmaktadır. MEFV geni, nötrofillerde, eozinofillerde ve bazofillerde ifade edilmektedir. MEFV geninin ayrıca dendritik hücrelerde, deri ve sinovyal fibroblast primer hücre hatlarında da ifade edildiği bildirilmiştir (24).

Pyrin proteininin bu hücrelerdeki bazal seviyesi düşük olup, artışı inflamasyonun tetiklenmesi ile sağlanmaktadır. Ayrıca MEFV geninin ifadesi hücreden hücreye farklılık göstermektedir. GFP (Green Flourescent Protein) füzyonları kullanılarak birçok hücre hattında (cos-7, 293T, HeLa ve THP-1) yapılan çalışmalarda Pyrin’in, çoğunlukla

N M694V M680I V726A M694I E148Q

Türk 1090 51,4 14.4 8.6 1.7 3.5

Arap 239 20.0 7.0 14.0 12.0 6.0

Ermeni 3000 56.0 18.7 22.3 0.4 2.2

Musevi 651 65.0 1.0 3.0 0.0 5.0

İtalyan 71 16.0 14.0 6.0 10.0 14.0

İspanyol 50 37.0 0.0 1.0 12.5 16.0

Yunan 152 38.1 19.7 12.2 2.7 10.9

Şekil 1: MEFV geninin yapısı ve bazı mutasyonların lokalizasyonları.

7

sitoplazmada bulunduğu gösterilmişse de, Pyrin proteininin, monositlerde sitoplazmada, sinoviyal fibroblastlarda ve nötrofillerde ise, çekirdekte bulunması, hücre tipine göre farklı proteinler ile etkileşime girerek farklı işlevler üstlenebileceğini göstermektedir (25).

Pyrin proteinin işlevi tam olarak bilinmemesine rağmen, doğrudan veya dolaylı olarak infla-masyonu baskılayıcı bir işlevi olduğu düşünülmektedir (24).

Pyrin proteini, dört yapısal bölge içermektedir (24). Amino (N) ucu PYRIN (PYD) bölgesi, B- box zinc finger bölgesi (BB-ZF), Coiled coil bölgesi (CC), ve Karboksi (C) ucu B30.2 bölgesi.

Pyrin proteininin 92 amino asitlik PYRIN bölgesi apoptoz ve inflamasyondan sorumlu birçok proteinde de bulunmaktadır. Pyrin proteininin bu domaini, Apoptosis speck-like protein with CARD (ASC) proteininin pyrin bölgesi ile protein-protein ilişkisi kurmaktadır. ASC proteininin pyrin bölgesi apoptozisin tetiklenmesi ve NF-kB’nin aktive olmasında önemli bir işleve sahiptir (26).

Aktive olan NF-kB, apoptotik proteinlerden kaspaz 1 ve 5’in aktive olmasını sağlamaktadır. Kaspaz 1’in aktive olması inflamasyonun en önemli sitokinlerinden olan IL-1ß’nın ve apop-totik yolun aktif hale gelmesini sağlar. NF-kB, bu işlemler sırasında inflamasyonun tetiklen-mesini ve düzenlenmesine katkıda bulunmaktır (26).

MEFV genindeki mutasyonlar sonucunda, Pyrin proteininin ASC ile olan ilişkisi bozulmaktadır. Bu durum hem apoptotik yolun bloke edilmesine, hem de inflamasyonun baskılanamamasına neden olmaktadır.

PSTPIP1 (Proline Serine Threonine Phosphates-interacting Protein), Pyrin ile interak-siyona giren bir diğer proteindir (27). PSTPIP1 hücre iskeletinin düzenlenmesinde görevli bir proteindir. PSTPIP1 proteini, Pyrin proteininin B-box / coiled coil bölgesine bağlanmaktadır (27). Pyrin’in PSTPIP1 ve aktin ile olan birlikteliği, Pyrin proteininin hücre göçünde de rol alabileceğini göstermektedir.

Pyrin ile interaksiyona giren bir diğer protein ise, pro-apoptotik bir protein olan Siva’dır. Siva proteini Pyrin’in B30.2/SPYR/rfp bölgesine bağlanmaktadır. ASC ve Siva aracılı apop-totik sinyal yolağında, ASC ve Siva’nın birlikte olabilmesi için Pyrin’in köprü işlevi olduğu düşünülmektedir (28).

MEFV genindeki mutasyonlar sonucunda, Pyrin proteininin ASC ile olan ilişkisi bozulmaktadır.

1. Önen, F. Familial Mediterranean Fever ;Review Rheumatol 26: 489-496, 2006.

2. Siegal, S. Benign paroxysmal peritonitis, Ann Intern Med, 23:1-21, 1945.

3. Livneh, A., Langevitz, P., Zemer, D. Criteria fort he diagnosis of familial Mediterranean fever, Arthritis Rheum, 40(10):1879-1885, 1997.

4. Özkan, E., Okur, Ö., Ekmekci, A., Özcan, R., Tağ, T. A new approach to the tretment of periodic fever. Mad Bult İstanbul, 5:44-49, 1972.

5. Goldfinfer, S,E. Colchicine for familial Mediterranean fever, New Eng J Med, 287:1320-1321, 1972.

6. Livneh, A, Langevitz, P. Diagnostic and treatment concerms in familial Mediterranean fever, Bst Pract Res Clin Rheumatol,

14:477-498, 2000.

7. Savaş, C., Arslan, S., Ailevi Akdeniz ateşi, Hacettepe Tıp Dergisi, 29 (3), 32-39, 1998.

8. Yalçinkaya, F., Ozen, S., Ozçakar, Z.B., Aktay, N., Cakar, N., Düzova A., ve arkadaşları, A new set of criteria for the diagnosis of familial

Mediterranean fever in childhood, Rheumatology, 48(4):395-398, 2009.

Referanslar

Genotip-Fenotip İlişkisi

M694V mutasyonunun erken yaşlarda ortaya çıkan ve ağır seyreden bir fenotipe sebep olduğunu bildiren birçok çalışma olmasına rağmen, bu çalışmalara karşıt rapor-larda bulunmaktadır. M694V mutasyonunun Yahudi, Ermeni ve Arap hastalarında amiloidozis gelişme riskini arttırdığı rapor edilmişse de bir çok hastada, (Türk hasta-larda dahil) bu mutasyon ile amiloidozis gelişimi arasında bir ilişki saptanmamıştır (29).

Ayrıca, V726A mutasyonu taşıyan hastalarda, hastalık bulguları daha hafif görülürken, bu mutasyona sahip Türk hastaların bir kısmında amiloidozis geliştiği gösterilmiştir (30). Sonuç olarak, MEFV genindeki mutasyonların amiloidozis gelişiminin tek belirleyicisi olmadığı düşünülmektedir.

Amiloidozisin dışında ateş ve karın ağrısı gibi diğer klinik bulgular ile mutasyonlar arasında da anlamlı bir ilişki gösterilememiştir (29).

9

9. Majeed, H.A., Quabazard, Z., Hijazi, Z., Farwana, S., Harshani, F. The cutaneous manifestations in children with familial Mediterranean fever, a six year

study, Q J Med, 75:607-616, 1990.

10. Van der Hilst, J.C., Simon, A., Drenth, J.P. Hereditary periodic fever and reactive amyloidosis, Clin Exp Med, 5:87–98, 2005.

11. Zemer, D., Pars, M., Sohar E., Modan, M., Cabili, S., Gafni, J. Colchicine in the prevention and treatment of amyloidosis of familial Medi terranean fever,

N Eng J Med, 314:1001-1005, 1986.

12. Bodar, E.J., van der Hilst, J.C., Drenth, J.P. Effect of etanercept and anakima on inflammatory attacs in the hyper-Ig-D syndrome: introducting

a vaccination provocalion model, N Eng J Med, 63(7):260-264, 2005.

13. Yepiskoposyan, L., Harutyunyan, A.. Population genetics of familial Mediterranean fever: a review. Eur J Hum Genet, 15(9):911-916, 2007.

14. Tomiyama, N., Higashiuesato, Y., Oda, T., Baba, E., Harada, M., Azuma, M., ve arkadaşları, MEFV mutation analysis of familial Mediterranean fever in Japan,

Clin Exp Rheumatol, 26(1):13-17, 2008.

15. Rawashdeh, M.O., Majeed, H.A. Familial Mediterranean fever in Arab childeren: the high prevalence and gene frequency, Eur J Pediatr, 155:540-544, 1996.

16. Özen, S., Karaaslan, Y., Özdemir, O, Saatçi, U., Bakkaloğlu, A., Köroğlu, E., Tezcan S. Prevalance of juvenile chronic arthritis and familial mediterranean

fever in Turkey: a field study, J Rheumatol, 25:2445-2449,1998.

17. Önen, F., Sümer, H., Turkay, S., Akyürek, O., Tunca, M., Özdoğan, H. Increased frequency of familial Mediterranean fever in central Anatolia in Turkey, Clin

Exp Rheumatol, 4(suppl 4):31-33, 2004.

18. Yılmaz, E., Özen, S., Balcı, B., Düzova, A., Topaloğlu R., ve arkadaşları. Mutation frequency of familial Mediterranean fever and evidence for a high carrier

rate in the Turkish population, Eur J Hum Genet, 9:553-555, 2001.

19. Stoffman, N., Magal, N., Shohat, T., Lotan, R., Koman, S., Oron A., ve arkadaşları, Higher than expected carrier rates for familial Mediterranean fever in

various Jewish ethnic groups. Eur J Hum Genet, 8(4):307-310, 2000.

20. Pras, E., Aksentijevich,I., Gruberg, L., Balow, J.E., Prosen, L., Dean, M., ve arkadaşları. Mapping of a gene causing familial Mediterraean fever to the short

arm of chromosome16, N Eng J Med, 326:1507-1513, 1992.

21. French FMF Consertium. A Candidate Gene for Familial Mediterraean Fever, Nature Genetics, 17: 25-31, 1997.

22. International FMF Consertium. Ancient misssense mutations in a new number of the RoRet gene family cause familial Mediterraean fever,

Cell, 90:797-807, 1997.

23. http://fmf.igh.cnrs.fr/ISSAID/infevers

24. Centola, M., Wood, G., Frucht, D.M., Galon, J., Aringer, M., Farrell C., ve arkadaşları, The gene for familial Mediterranean fever, MEFV, is expressed in early

leukocyte development and is regulated in response to inflammatory mediators, Blood, 95(10):3223-3231, 2000.

25. Seshadri,S., Duncan, M,D., Hart, J.M., Gavrilin, M.A., Wewers, M.D. Pyrin levels in human monocytes and monocyte-derived macrophages regulate IL-1beta

processing and release,J Immunol, 179(2):1274-1281, 2007

26. Richards, N., Schaner, P., Diaz, A., Stuckey, J., Shelden, E., Wadhwa A., Gumucio D.L. Interaction between pyrin and the apoptotic speck protein (ASC)

modulates ASC-induced apoptosis, J Biol Chem, 276(42):39320-3939, 2001.

27. Shoham, N.G., Centola, M., Mansfield, E., Hull, K.M., Wood, G., Wise C.A., Kastner, D.L. Pyrin binds the PSTPIP1/CD2BP1 protein, defining familial

Mediterranean fever and PAPA syndrome as disorders in the same pathway, Proc Natl Acad Sci U S A,100(23):13501-1356, 2003.

28. Balci-Peynircioglu, B., Waite, A.L., Hu, C., Richards N., Staubach-Grosse, A., Yilmaz, E., Gumucio, D.L. Pyrin, product of the MEFV locus, interacts with the

proapoptotic protein, Siva, J Cell Physiol, 216(3):595-602, 2008.

29. Tunca, M., Akar, S., Önen, F., Özdoğan, H., Kasapçopur, O, Yalçınkaya, F., ve arkadaşları. Familial Mediterranean Fever (FMF) in Turkey ; result of a nation

wide multicenter study, Medicine, 84:1-11, 2005

30. Yalcınkaya, F., Akar, N., Mısırlıoglu, M. Familial Mediterranean fever: amiloidosis and the Val726Ala mutation, N Eng J Med, 338:993-994, 1998.

Özet

Amaçlar:Hastaneye yatırılmış hastalarda Metisilin Dirençli Stafilokok aureus (MRSA), Vankomisi-ne Dirençli Enterokok (VRE), Karbapenamaz Üreten K. pneumoniae (KP-KPC) kolonizas-yonu Hastane Kaynaklı Enfeksiyon (HKE)’ların başlıca sebebidir. HKE’lerin, hasta kabul sırasında veya öncesinde tarama yapılarak, ve hasta izolasyon ve idaresi ile büyük ölçü-de engellenebilir olduğu bir gerçektir. Savyon Diagnostics kısa zaman önce, MRSA, VRE ve KPC’yi aynı anda belirleyebilen, moleküler bazlı, direkt olarak değişik sürüntü çubuğu örnek tiplerinden detekte edilebilen yeni bir diagnostik görüntüleme testi geliştirmiştir. Bu test, Savyon Diagnostics tescilli NanoCHIP® moleküler elektronik mikroarray sistemi kullanılarak yapılmaktadır. Bu çalışmanın amacı çeşitli sürüntü çubuğu örneklerinden MRSA, VRE ve KPC’nin eşzamanlı teşhisi için NanoCHIP® teknolojisinin çok sayıda örneği görüntülemede kullanılmasını göstermektir.

Metotlar:Karakterize edilmiş çeşitli sürüntü çubuğu örneklerinden DNA izolasyonu yapılmıştır. Patojen ve antibiyotik direncine özgün genler mültipleks PCR ile çoğaltılmış ve NanoCHIP® sistemine tanıtılmıştır. Çoğaltılmış amplikonlar elektronik olarak NanoCHIP® kartuşunda bulunun belirli noktalara yönlendirilmiş ve spesifik yakalayıcı oligonükletidler tarafından ön aktivasyona tabi tutulmuştur. Deteksiyon, spesifik floresan raportör oligonükleotitler tarafından yapılmıştır. Her örneğin sonuç analizi orijinal örneklerin değişik labarotuvarlarda real-time PCR ile belirlenmiş özellikleri ile karşılaştırılmıştır.

Sonuçlar:NanoCHIP® sonuçları önceden test edilmiş örneklerin karakterizasyonuyla klinik hassasiyet ve spesifite açısından tamamen uyumludur. NanoCHIP® mültipleks analiz örneklerinde patojen ve antibiyotik direnci hakkında 1 iş günü içerisinde açık sonuçlar vermiştir. Patojen olmayan ama ilişkili mikroorganizmalar bazı özel koşullar sağlanarak tespit edilebilmiştir.

Tartışma: NanoCHIP®, MRSA, VRE ve KP-KPC kolonizasyonunun yüksek işlem hacimli taramasına uygun bir platformdur ve değişik sürüntü çubuğu örneklerinden teşhis için güvenilir bir sistem sunar. Bu teknoloji, özellikle oligonükleotid adreslemesi ve mültipleksleme

NanoCHIP® Mikroarray Teknolojisi Kullanılarak Yeni Geliştirilen Moleküler Bazlı Diagnostik Görünteleme Testinin Nozokomiyal Enfeksiyonlardan MRSA, VRE ve KPC’nin Eşzamanlı Teşhisi

Zvi Greenberg*, Vladimir Hurgin, Revital Sabban-Amin, Marcelo Fridlender, June Kopeowitz, Shimon Gross Savyon Diagnostics Ltd., Araştırma ve Geliştirme Departmanı, Ashdod, İsrail

11

özellikleriyle faaliyet süresini düşürmekte, laboratuvar iş akışı ve iş dönüş sürelerini kısaltmakta kayda değer avantajlar sağlarken, esnekliği arttırır ve maliyeti düşürür.

Giriş

Hastaneye kabul edilmiş hastalarda Metisilin Dirençli Stafilokok aureus (MRSA), Vankomisine Dirençli Enterokok (VRE), karbapenamaz üreten Klebsiella Pneumoniae (KP-KPC) kolonizasyonu Hastane Kaynaklı Enfeksiyon(HKE)’ların başlıca sebebidir. Artık HKE’ler hastalara kabul sırasında veya öncesinde tarama yapılarak ve hasta izolasyon ve idaresi ile büyük ölçüde engellenebilir. Savyon Diagnostics kısa zaman önce MRSA, VRE ve KPC’yi aynı anda belirleyebilen, moleküler bazlı, direkt olarak değişik sürüntü çubuğu örnek tiplerinden detekte edilebilen yeni bir diagnostik görüntüleme testi geliştirmiştir. Bu test, Savyon Diagnostics tescilli NanoCHIP® moleküler elektronik mikroarray sistemi kullanılarak yapılmaktadır. Bu sistem orta-yüksek hacimli örnek taramasını aynı gün içinde minimal faaliyet zamanı ile gerçekleştirir.

NanoCHIP®’in özellikleri şunlardır:• Örnekten sonuca otomatik test işlevi. Kültüre gerek kalmaz.• Değişkenlik: Kullanıcı tüm paneli test etmeyi seçebileceği gibi sadece MRSA,

VRE veya KP-KPC de seçebilir.• Dermal, nazofarenjeal veya perineum sürüntü çubuğu örnekleri, kültürle çoğal-

tılmış izolatlar, pozitif kan kültürleri ve yara, kanlı irin veya cerrahi sürüntü çu-bukları kullanılabilir.

• Laboratuvarda yapılan mikrobiyoloji işlemlerini çok aza indirger. Sadece pozitif çıkan örnekleri valide eder.

• Negatif örneklerde çalışılmaz. Bu da maliyeti ve iş dönüş süresini negatif örnek-ler için azaltır.

• DNA izolasyon problemi için çözüm sağlar. Kullanıcı otomatik ve manuel olarak valide edilmiş DNA izolasyon tekniklerini kullanabilir.

• Her çalışmada 96 örnek veya bir gün de 192 örnek test edilebilir.• Kısa yanıt süresi vardır. Örnekten sonuç elde etmek 8 saat alır.• CE-IVD (CE In vitro diagnostik)

AmaçBu çalışmanın amacı NanoCHIP® teknolojisinin çok sayıda örneğin taranmasında ve MRSA, VRE ve KPC’nin eş zamanlı tespitinde kullanılmasını göstermektir.

MetotlarKarakterize edilmiş çeşitli sürüntü çubuğu örneklerinden DNA izolasyonu yapılmıştır. Patojen ve antibiyotik direncine özgül genler mültipleks PCR ile çoğaltılmış ve Nano-CHIP® sistemine tanıtılmıştır. Çoğaltılmış amplikonlar elektronik olarak NanoCHIP® kartuşunda bulunun belirli noktalara yönlendirilmiş ve spesifik yakalayıcı oligonükletidler tarafından ön aktivasyona tabi tutulmuştur. Deteksiyon, spesifik floresan raportör oligonükleotitler tarafından yapılmıştır. Her örneğin sonuç analizi orijinal örneklerin değişik labarotuvarlarda real-time PCR ile belirlenmiş özellikleri ile karşılaştırılmıştır.

Örnek toplama DNA izolasyon~40 dakika

PCR plate,i hazırlama

~20 dakika

Çalışma süresi~5 saat

(30 örnek)

Kartuş ve reaktifyükleme~2 dakika

SonuçlarıKaydet,Gönder

Şekil 1. İş akışı

Cihaz(genel)

Çip(genel)

Test kiti(hastalıklara özel)

Sistem ve Çalışma Konsepti

NanoCHIP® sistemi, tek örnekte çoklu hedefler saptayabilen ve aynı elektronik mikroarray’de çoklu örnek çalışabilen otomatik mültipleks bir platformdur.

Üç ana hat şöyledir:

Şekil 2. NanoCHIP® Otomatik MDx Sistemi

13

Şekil 3. Konsept

Yakalayıcı molekül adreslemeBiyotinli yakalayıcı oligolar elektronik olarak pedlere adreslenir.

RaporlamaYeşil işaretli raportör A hedefi ile birebir eşleşirken kırmızı işaretli raportör B hedefi ile birebir eşleşir

Floroforproblar

Amplikon Adresleme PCR ürünü (amplikonlar) spesifik yakalayıcı oligolara bağlanır (hibritlenir)

DNAizolasyonu

Mültipleks DNAamplifikasyonu

Streptavidin kaplı ped

1

2

3

++ + + +

-

-

--

--

--

++ + + +


Biotinli

yakalayıcı oligo


Patojen

S. aureus

S. aureus

Metisilin Dirençli Bakteri

Gen

Spa & nuc

mecA

SCCmec MRSA konfirmasyonu

Bağıntı

Diğer Stafilokoktürlerinden ayırmak ve

saptamak

Metisilin direnci geni

MRSA

Vankomisin Dirençli Bakteri

Enterekokus

Van A/B

ddIEFM & ddIEFS

Vankomisin A/B resistansımarkörü

E.faecium ve E.faecalis için Enterokok markörü

VRE

K. pneumoniae

Karbapenamaz Üreten Bakteri

PhoE

blaKPC

K. pneumoniae markörü

Karbapenamaz markörü

KPC

Tablo 1. Enfeksiyon Kontrol Paneli

Yıkama- Raporlama Döngüleri

Raporlama Birinci Aşama

Yıkama Birinci DöngüTermal ayırma, raportörleri uzaklaştırırken amplikonları bir sonraki raporlama için oligolara bağlı bırakırlar

Raporlama İkinci AşamaYeşil işaretli raportör A hedefi ile birebir eşleşirken kırmızı işaretli raportör B hedefi ile birebir eşleşir

Üçüncü Yıkama ve Raporlama Aşamaları

4

5

6

3

NanoCHIP® MRSA, VRE ve KP-KPC kolonizasyonunun yüksek işlem hacimli taramasına uygun bir platform oluşturur ve değişik sürüntü çubuğu örneklerinden teşhis için güvenilir bir sistem sunar.

15

Bulgular

Tablo 2. NanoCHIP® Performansı-MRSA

Tablo 4. NanoCHIP® Performansı- KPC

-

--

-

-+

+

++

+

+--

MSCoN

MRCoN MRSA

Staph. spp.

Spa/nuc

mecA

SCCmec

MSSA

bla-KPCphoE

KPC-KpKp bla-KPC diğer

+ +- - -

- -+

MRSA

TP

87

1041

60

56

spa

nuc

mecA

SCCmec

FN

0

0

0

0

TN

122

104

147

149

FP

0

0

0

0

N

209

208

207

205

Hassasiyet (%)

100

100

100

100

Özgüllük (%)

100

100

100

100

Tablo 3. NanoCHIP® Performansı- VRE

ddl-efs

E. faecalisVRE VSE VRE VRE

E. faecalisdiğer

ddl-efsvanA

vanB

+ ++- -

-- -- -- -

+-

+/- +/- +/--/+ -/+ -/+

VRE

TP

47

43

19

Van A/B

ddlEFM

ddlEFM

FN

0

0

0

TN

127

165

108

FP

0

1

0

N

174

209

127

Hassasiyet (%)

100

100

100

Özgüllük (%)

100

99

100

KPC

TP

45

35

PhoE

blakpc

FN

0

0

TN

163

173

FP

0

1

N

208

208

Hassasiyet (%)

100

100

Özgüllük (%)

100

99

Sistemin verimliliği üç hedef organizmanın; MRSA, VRE ve KP-KPC, tespitinde kanıtlanmıştır.

Sonuçlar

• NanoCHIP® sonuçlarının şu an kullanılan metotlar ile tam uyum göstermesi sis-temin, MRSA ve MSSA’ye (metisiline duyarlı Stafilokok aureus), koagülaz pozitif ve negatif suşları, S. aureus ve diğer Stafilokok suşlarını birbirlerinden etkili bi-çimde ayırt edilebildiğini ve raporladığını gösterir.

• NanoCHIP® sonuçlarının şu an kullanılan metotlar ile tam uyum göstermesi sistemin VRE (hem VanA+, hem VanB+) ve VSE’yi(vankomisin duyarlı Entere-kok), ve diğer vankomisin dirençli enterokok olmayan bakterileri birbirlerinden etkili biçimde ayırt edilebildiğini ve raporladığını gösterir.

• NanoCHIP® sonuçlarının şu an kullanılan metotlar ile tam uyum göstermesi sistemin KPC pozitif ve negatif K.pneumoniae’yı ve diğer KPC üreten ama K. pneumoniae olmayan suşları birbirlerinden etkili biçimde ayırt edebildiğini ve raporladığını gösterir.

• Test, dermal, nazofarenjeal veya perineum sürüntü çubuğu örnekleri, kültürle çoğaltılmış izolatlar, pozitif kan kültürleri ve yara, kanlı irin veya cerrahi sürüntü çubukları kullanılarak uygulanabilir.

• İstenilen mükemmel hassasiyet ve özgüllük düzeyleri rutin laboratuvar iş akışı içinde arzu edilen zamanda elde edilip, örnekten sonuca aynı gün içinde ulaşılır.

Özet

• NanoCHIP® cihazı, test menüsündeki Enfeksiyon Kontrol Paneli (ICP) sayesin-de hastaneye yatırılmış hastaları taramak için uygun maliyetli bir sistem olması-nın yanısıra mükemmel performans göstermektedir.

• Sistemin verimliliği üç hedef organizmanın; MRSA, VRE ve KP-KPC, tespitinde kanıtlanmıştır.

• NanoCHIP®’in MRSA, VRE ve KP-KPC kolonizasyonunun yüksek işlem hacimli taramasına uygun bir platform oluşturur ve değişik sürüntü çubuğu örneklerin-den teşhis için güvenilir bir sistem sunar.

• NanoCHIP® teknolojisi, özellikle oligonükleotid adreslemesi ve mültipleksleme özellikleriyle faaliyet süresini düşürmede, laboratuvar iş akışı ve iş dönüş süre-lerini kısaltmada kayda değer avantajlar sağlarken, esnekliği arttırır ve maliyeti düşürür.

“Cepheid Xpert BCR-ABL testi Kronik Miyeloid Lösemi

hastalarını monitorizasyonunda çok önemli bir yere gelmiştir.

Artık her doktor, bu hastalığın en minimal seviyelerini bile

saptayabilecek- böylece tekrarlama riski olan KML hastalarını

en iyi şekilde kontrol edebilecektir.”Dr.Ellie Nacheva MD PhD FRCPathRoyal Free and University College Tıp Fakültesi Lösemi Sitogenetik Laboratuvarı Başkanı

İhtiyacımız olan nedir?Avrupa Kansere Karşı Programı ve ABD Ulusal Kapsamlı Kanser Ağı’nın güncel uygulama yönetmelikleri der ki: KML hastalarının ilk tetkiklerinde, rezidüal hastalık monitorizasyonunda ve tekrarlama riski olan hastaların belirlenmesinde RT PCR yöntemini benimseyen testler kullanılmalıdır.

Kullanılan yöntem yüksek hassasiyetli, doğru sonuç vermelidir: RT-PCR, BCR-ABL füzyon genini saptamada en doğru sonuçlar veren hassasiyeti FISH ve sitogenetikten daha yüksek olan yöntemdir. Ayrıca kemik iliği ve periferik kan örneklerinde ki sonuçların uyumlu olması hastalara uygulanması gerekli olan kemik iliği aspirasyonunu azaltır.

Uluslararası Standardizasyon: KML hastalarının takibinde uluslararası uyumluluk olmalı. BCR-ABL mRNA seviyelerinin takibi KML hastalarının monitorizasyonunda standart yöntem haline gelmiştir. Değişik laboratuvarlar ve doktorlar arasında uyum sağlanması, varyasyonların minimum olması esastır.

Çözüm GeneXpert BCR-ABL İzleme KitiPeriferik kan lenfositlerinde p210 BCR-ABL translokasyonunu izlemeye yardımcı Real Time revers transkriptaz PCR testidir. Mevcut testlerde var olmayan iki çok önemli özelliği; kısa örnek hazırlama süresi ve 2 saatten az sürede sonuç elde edilmesi

GeneXpert Sistemi Nükleik asit analizini entegre ve tamamen otomatik gerçekleştiren tek sistem; örnek hazırlama, RT-PCR amplifikasyonu ve deteksiyonu sistem içinde bir arada bulunmaktadır. Sistem 2 saatten az bir sürede hedef nükleik asit sekansını pürifiye eder, yoğunlaştırır, tanımlayarak tespit eder.

3 kısa ve basit adımda BCR-ABL ;

Sonuç ≈ 2 saatKartuş cihaza konduktan sonraki her adım GeneXpert tarafından otomatik olarak yapılır.

GeneXpert BCR-ABL/ABL İzleme Kiti (IS)Uluslararası birime (IS) uyumlu sonuçlar için, IS referans testi ile kıyaslanarak saptanmış kite özel bir çevirim katsayısı kullanır.

Uluslararası skalada sonuç üretmek klinisyenin hastasını daha iyi izlemesine ve major moleküler cevabın daha iyi değerlendirilmesine yol açar.

Detaylı bilgi için www.biodpc.com

Örnek

Negatif BCR-ABLDüşük BCR-ABLOrta BCR-ABL

Düşük BCR-ABL

Ortalama BCR-ABL/ABL yüzdesi

<%0.000157%0.00430%0.954%12.24

BCR-ABL/ABL std sapma yüzdesi

-%0.00477%0.397%5.03

Tekrarlanabilir Sonuçlar

Test Hassasiyet-4 farklı konsantrasyonlu toplam 240 örnekle üç farklı yerde yapılan kör çalışma sonuçları

Hassas ve KantitatifTest Sonuçları

Her iki yöntem ile de negatifLaboratuvarda geliştirilmiş yöntemle negatif GeneXper ile düşük pozitif

Her iki yöntem ile de düşük pozitifHer iki yöntem ile pozitif

KML örnek sayısı

142

%0.39715

Testin performansı iki farklı yerde KML hastalarından alınan 39 örnek ile gerçekleştirildi.

Örnekhazırlığı

Reaktifleriekleme

Cihaza yükleme

Her Lot da

Dünya Sağlık Örgütü

Standartlarına Uyum

KML’li hastaya daha iyi bir yaklaşım için standardize edilmiş hızlı test

Xpert® BCR-ABL İzleme KitiUluslararası Birimde sonuç için çevirim katsayılı

Xpert®

BCR-ABLMonitor

Giriş

Ailesel Akdeniz Ateşi tekrarlayan ateş ve serozit atakları ile tanımlanan, sıklıkla Seferad Yahudilerini, Arapları, Türkleri ve Ermenileri [Sohar ve ark., 1967; Livneh ve ark., 1997] etkileyen otozomal resesif bir hastalıktır (MIM#249100). Erken tanı hastalığın ana komp-likasyonu olan renal amiloidoz ve atakların oluşumunu engelleyen kolşisin tedavisine başlanması açısından önem arz eder [Cazeneuve ve ark., 1999]. Hastalığa sebep olan genin (MEFV) bulunması gereksiz invazif incelemeleri engelleyebilecek tanı değeri olan erken moleküler bir testin geliştirilmesine olanak tanımıştır. Bu gen 16. Kromozomun p13 bölgesinde yerleşiktir ve 10 ekson (şekil 1) içermektedir [Fransız FMF Konsorsiyu-mu, 1997; Uluslararası FMF Konsorsiyumu, 1997]. MEFV, fonksiyonu henüz tam olarak açıklanmamış ancak kalıtsal immün cevapta rolü olabilecek marenostrin/pyrin proteinini kodlamaktadır [Chae ve ark., 2003].

Bugüne kadar en sık görülenleri MEFV geninin 10. eksonu içinde yerleşik olan, toplam kırktan fazla moleküler defekt tanımlanmıştır. Bu mutasyonların dağılımları toplumlararası farklılık göstermekle beraber c.2080A>G (p.M694V), c.2177T>C (p.V726A), c.2082G>A (p.M694I), ve c.2040G>C veya c.2040G>A sonucu oluşan p.M680I, MEFV mutasyon-larının %65-85’ini oluşturmaktadır (tablo 1) [Touitouu, 2001;Kogan ve ark. 2001; Grate-au ve ark.,2000; Dode ve ark.,2000]. Bu mutasyonların saptanmasında kullanılabilecek metotlar arasında Denatüre Edici Gradyan Jel Elektroforezi (DGJE) ve ters-hibridizasyon

Şekil 1: MEFV geni ekson-intron organizasyonu, belli başlı mutasyonları ve ekson 10 amplikonu. MEFV genindeki başlıca sekiz mutasyon tüm gen yapısı üzerinde gösterilmektedir: 10 ekson kutu şeklinde gösterilmekte, 2,3,5 ve 10. eksondaki mutasyonlar da kutuların üzerinde belirtilmektedir. Ekson10 amplikon dizisi yanda gösterilirken, primer dizileri altı çizili olarak belirtilmektedir (ileri primer biyotinlenmiştir) [orijinal şekli www.interscience.wiley.com’da online/çevrimiçi nüshada bulabilirsiniz)

MEFV Mutasyonlarının Saptanması İçin Geliştirilmiş Elektronik Mikroarray-Temelli Tanı TestiStephane Moutereau, Remy Narwa, Catherine Matheron, Nathalie Vongmany, Emmanuelle

Simon and Michel Gossens

TACTGGGAGGTGGAGGTTGGAGACAAGACAGCATGGATCCTGGGAGCCTGCAAG

ACATCCATAAGCAGGAAAGGGAACATgACTCTGTCGCCAGAGAATGGCTACTGGGT

GGTGATAATGaTgAAGGAAAATGAGTACCAGGCGTCCAGCGTTCCCCCGACCCGCC

TGCTAATAAAGGAGCCTCCCAAGCGTGTGGGCATCTTCGTGGACTACAGAGtTGGA

AGCATCTCCTTTTACAATGTGACAGCCAGATCCCACATCTATACATTCGCCAGCTGCT

CTTTCTCTGGGCCCCTTCAACCTATCTTCAGCCCTGGGACAGgTGATGGAGGGAAG

AACACAGCTCCTCTGACTATCTGTCCAGTGGGTGGTCAGGGGCCTGACTGAATGCC

CAACACTGCATCTCTCTTCCTGCTTCTGGCCTTGTATC

E148Qc.442G>C

P3695c.1105C>T

F479Lc.1437C>G

M6801 c.2040G>C,AM694V c.2080A>GM6941 c.2082G>AV726A c.2177G>AV721H c.2282G>A

1 3 4 5 6 7 8 9 102

M694V M694I

R761H

biotin

21

temelli analizler kullanılmaktadır [Cazeneuve ve ark., 1999; Tchernitchko ve ark., 2003]. Yapı itibariyle ardarda oluşları ve belirgin bir miktarda zaman ve iş-yüküne gereksinimleri bu analizlerin kısıtlayıcı bir özelliğidir. Alternatif bir strateji arayışı içinde, yakın zamanda tanımlanan mikroarray-temelli (mikroarray-temelli), elektronik DNA analiz sisteminin etkinliğini değerlendirmeye çalışılmıştır [Erali ve ark., 2003; Santacrose ve ark., 2002; Sosnowski ve ark., 1997].

Bu sistem, Nanochip®Moleküler Biyoloji Çalışma istasyonu (Nanogen, www.nanogen.com), tescilli mikroçip kartuşlarını kullanan tamamıyla otomatik bir cihazdır. Bu kartuş-lar, 100 tane elektronik adreslenebilir nokta içermektedir. Bu noktalar arasından seçilen birinde/konumda pozitif yük uygulanarak negatif yüklü biyomoleküllerin hızlı bir şekilde bu bölge üzerine toplanmasını sağlamak mümkündür. Daha sonra hedefe gönderilen bu diziler floresan işaretli özel raportör oligonükleotitlere hibritlenerek bağlanır. Bu du-rum tam- eşleşmeyen raportör/hedef hibritlerin ısı denatürasyonu sonrasında mutant, heterozigot ve yabanıl (wild) tip örnekler arasında ayırım yapmaya izin verir. Bu tekno-lojinin en büyük avantajı analizlerin tasarımında yüksek esneklik sağlamasıdır. Bununla beraber birçok laboratuar için, analizlerin tasarımı ve sonrasında analizlerin uygulaması için gerekli olan çeşitli özel floresan işaretli oligonükleotit probun maliyeti kısıtlayıcı ola-caktır. Bu nedenle MEFV genindeki en sık görülen sekiz mutasyonu tespit etmeye yö-nelik tasarlanan DNA çip-temelli bir yöntem şekillendirilirken analizin kullanımına ilişkin masraflarını azaltmak için, Nanochip platformu kullanılarak ilgilenilen herhangi bir diziyi saptamaya uygun üniversal raporlayıcı bir sistem geliştirilmiştir. Bu yeni prosedürle elde edilen sonuçlar diğer alternatif genotipleme metotları ile karşılaştırılmış, klinik açıdan önemli diğer uygulamalarda kullanılabilecek protokoller sağlanmıştır. Ek olarak, bu ge-notipleme sisteminin yüksek işlem hacmi ile hassasiyeti (doğruluğu) SNP analizi başına düşük bir maliyet avantajı olacak şekilde birleştirdiği de gösterilmiştir.

Mutasyon Ekson Allel Sıklığı

c.2080A>G p.M694V 10 %72

c.2177G>A p.V726A 10 %39

c.2040G>C p.M680I 10 %31

c.2082G>A p.M694I 10 %1-2

c.442G>C p.E148Q 2 %2

c.1437C>G p.F479L 5 %2,5

c.2282G>A p.R761H 10 %1

c.1105C>T p.P369S 3 %1

Tek nükleotit polimorfizmler (single-nucleotde polymorphisms-SNPs) en sık görülen insan sekans(dizi) varyasyonlarıdır ve yaklaşık her 300-1000 nükleotitde bir görülmektedir (1-5). İnsan haplotip analizleri için kullanışlılardır ve belirlenmeleri yüksek işlem hacimli, otomatik genotiplemeye kolaylıkla uyarlanabilmektedir (6-10).

Mikroelektronik dizin teknolojisi son zamanlarda SNP analizlerinde kullanılmaya başlandı (11-15). Nanochip® Moleküler Biyoloji Çalışma İstasyonu ile, 10x10’luk mikroelektrod dizinlerinden meydana gelen tescilli bir kartuş üzerine hedeflenen oligomerler ve örnekler elektronik olarak bırakılır. Streptavidin içeren ince bir hidrojel tabaka çip yüzeyini kaplayarak, biyotinlenmiş PCR ürünlerinin (amplikonlarının) bağlanmasını sağlar. Her bir allel için Cy5 ve Cy3 işaretli oligonükleotid raportörler ve stabilizatörler (sabitleştiriciler) hibritlenir ve çip daha sonra yıkanarak görüntülenir. Raportörlerin floresan sinyal oranları belirli bir SNP için homozigot ve heterozigotlar arasında ayrım yapılmasına imkan tanır. Teknoloji gerek PCR ürünü/amplikon sonrası [genomik DNA’dan oluşturulan biyotinlenmiş tek-zincir PCR ürünü çipe bağlı) gerekse yakalama sonrası [SNP’in yakınındaki oligonükleotit çipe bağlı) formatlarını temin etmektedir.

Klinik laboratuvarlarda sıklıkla ölçülen SNP’ler için isteğe bağlı analiz tasarımı için yayınlanmış kapsamlı birkaç tane protokol bulunmaktadır. Bu raporda ele alınan SNP ve mutasyonlar koagulasyon bozuklukları, ß-talasemi ve faktör VII genindeki tümörigenezde rol alan SNP ve mutasyonları içermektedir. Polimorfik amino asit değişimi (R353Q) ve -323 (insCCTATAATCCT) dekanukleotitlik insersiyonunun(21) yanı sıra daha önce yayınlamış(20)

402(G/A), -401(G/T) ve -122(T/C) SNP’leri de factor VII (FVII) geninde lokalizedir. ß Globin geninde incelenen mutasyonlar IVS-I nt 1(G/A), IVS-I nt6 (T/C) ve IVS-II nt 1(G/A)’yı (22-24) içerirken, RET genindeki ise C634G, C634R, C634Y ve M918T (25-30) mutasyonlarını içer-mektedir. Bu analizlerin detayları klinik açıdan önemli diğer uygulamaların gelişmesine de kolaylık getirecek önerilerle beraber sunulmaktadır. Son olarak protokoller bu platform kullanılarak yapılacak diğer analizlere genellenebilecek, böylelikle klinik açıdan önemli diğer uygulamaların da gelişmesine kolaylık getirebilecek gözlemlerle sunulmaktadır.

Mikroelektronik Dizin (Array) Teknolojisini Kullanarak Klinik Olarak Anlamlı Tek Nükleotit Polimorfizm AnaliziRosa Santacroce, Antonia Ratti, Francesco Caroli, Barbara Foglieni, Alessandro Ferraris,

Laura Cremonesi, Maurizio Margaglione, Marco Seri, Roberto Ravazzolo, Gabriella

Restagno, Bruno Dallapiccola, Eric Rappaport, Eleanor S Pollak, Saul Surrey, Maurizio

Ferrari, Paolo Fortina

Bu raporda ele alınan SNP ve mutasyonlar koagulasyon bozuklukları, ß-talasemi ve faktör VII genindeki tümörigenezde rol alan SNP ve mutasyonları içermektedir.

23

Sitokrom P450 ailesindeki enzimler, Faz I ilaç-metabolize edici enzimler arasında en detaylı araştırılanlarıdır. CYP2C9, CYP2C19 ve CYP2D6 izoenzimleri insan hepatik faz I ilaç metabolizmasının ~%40’ından sorumludur (1). CYP2D6 tek başına reçete-lendirilen ilaçların %20-25’nin metabolizmasından sorumludur (2). CYP2D6, 497 ami-no asitten oluşan oldukça polimorfik bir enzimdir ve elliden fazla insan CYP2D64 alleli tanımlanmıştır (3). CYP2D6*3,*4, *5, *6, *7, *8, *11, *12, *13, *14, *15, *16, *18, *19, *20, *21, *38, *40, *42 ve *44 fonksiyonel olmayan alleler iken, *9, *10, *17, *36 ve *41 bildi-rilenlere göre azalmış, substrat-bağımlı etkinliğe sahip allelerdir (3,4). CYP2D6*3,*4 ve *5 alleleri için tarama yapıldığında, beyaz ırktaki yavaş metabolizörlerin en az %95’ini saptamaktadır (5,6) ve bu grup içerisinde en sık görüleni *4 allelidir (7).

Farmakogenetik testler, en uygun ilaç ve dozaj seçiminde, başarılı terapötik etki planlamasında ve yaygın yan etkilerin engellenmesinde yardımcı olabilmektedir (8). Gasche ve ark. Bilateral pnömoniye bağlı öksürük tedavisi için düşük dozda Kodein verilen bir hastada, yaşamı tehdit eden opioid zehirlenmesi bildirmişlerdir. Daha son-ra yapılan CYP2D6 genotiplemesi bu hastanın Kodein Ultra-hızlı metabolizör (UM) olduğunu ortaya çıkarmıştır (9).

Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), hasta klinik bakım kapsamına farmakogenomiğin de dahil olmasını teşvik etmektedir (10, 11). Farmakogenetik bilgi içeren etiketi değiştirilmiş ilaçlar arasında atomoxetine (Strattera®) (12), 6-mercaptopurine (Puirnethol®), azapthio-prine (Imuran®) ve irinotecan (Camptosar®) yer almaktadır.

Nanochip Moleküler Biyoloji Çalışma-istasyonunu (MBÇ) polimorfizmlerin, birden fazla örnekte eş zamanlı tespiti için piyasaya sürüldü (13-16). Roche ve Affymetrix, gen delesyon ve duplikasyonlarını içeren CYP2D6 genindeki bilinen 29 polimorfizmin yanı sıra CYP2C19 genindeki iki varyasyonu da içeren (17) Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi’nin onayladığı AmpliChip CYP450 testini pazara sundular. Günümüzde birtakım ticari genotipleme platformları bulunmasına rağmen Sitokrom 450 genotip analizini yapan iki veya daha fazla platformun direkt olarak karşılaştırmasını yapan yayın bildiğimiz kadarıyla bulunmamaktadır.

CYP2D6 Genotipleme Panelinin NanoChip Moleküler Biyoloji Çalışma İstasyonunda ValidasyonuLee HK, Lewis LD, Tsongalis GJ, Schur BC, Jannetto PJ,

Wong SH, Yeo KT.

Klinik laboratuvarlar, ticari olarak pazarlanan moleküler testleri değerlendirmiş olup medikal açıdan kullanışlı ve doğru olmaları konusunda FDA onay sürecine güvenmektedir. Bununla birlikte, FDA onay süreci, laboratuvarınızda tanıyla ilgili doğruluğun sağlanmasına yönelik ilk adımı oluşturmaktadır. Kurum içi verifikasyon süreci Klinik Laboratuvar İyileştirme Değişiklikleri (CLIA) düzenlemeleri5 uyarınca yönetilmekte ve laboratuvarın üretici tarafından iddia edilen performans özelliklerini tekrarlamasına yönelik çalışmalarla başlamaktadır4,5,9. FDA tarafından temize çıkarılmış bir tayinin bir laboratuvar tarafından yapılan verifikasyonu, modifiye bir test için gereken validasyon süreci için, testin tam olarak ürün kullanma talimatında olduğu gibi uygulanmasına kıyasla daha katıdır. Bir testin yayınlanmış üretici kılavuzuna göre yapılmaması halinde, örneğin numune taşıma matriksi kullanma talimatında belirtilenden farklıysa, daha kapsamlı bir validasyon (yalnızca verifikasyonla sınırlı olmayan) gerçekleştirilmeli ve sonrasında, onaylanmış olan protokollerden sapmanın ölçüsüne bağlı olarak söz konusu test “ürün bilgisi dışında kullanım” veya laboratuvar tarafından geliştirilen test (LDT) olarak değerlendirilmelidir. Bu durum kullanıcıyı tayinin validasyonunun tamamıyla ilgili yasal sorumlusu haline getirmektedir5. Bu makalede FDA tarafından temize çıkarılmış bir tayini laboratuvarınızda yürürlüğe koyma süreci üzerinde odaklanılmaktadır. Ticari bir testle ilgili olarak, bir laboratuvarın söz konusu teste dair performansı kapsamında belgelemesi gereken parametreler; doğruluk (analitik duyarlılık ve spesifisite), kesinlik (tekrarlanabilirlik), referans aralığı (kalitatif tayinler için) ve bildirilebilir aralık (kantitatif tayinler için) şeklindedir.

Kurum içi verifikasyon sürecinin ilk adımı, kullanma talimatında bildirilen referans aralık gereksinimine yönelik analitik duyarlılığın (sivri artış gösteren numuneler için % pozitif) ve belirleme limitinin (LOD) tekrarlanmasıdır. LOD hedef organizmanın saptanabilen en düşük yoğunluğudur. Bu yoğunluk istatistiksel olarak boş olandan farklı, tipik olarak analitik sinyalin analit yokluğunda oluşan sinyal olan “analitik gürültü”den güvenilir şekilde ayırt edilebildiği bölgede saptanan yoğunluktur2. %95 LOD hedef organizmanın %95 olasılıkla saptandığı yoğunluktur. Belirleme limitleri matriks, yöntem ve analite özgü sınırlardır. Bu değerlerin doğrulanması için iki yaygın yöntem vardır: tekrarlama testleri ve probit analizi.

1) TEKRARLAMA TESTLERİ:

Tekrarlama testlerinde, genetik hedefin çoklu bölüntüleri hazırlanıp test edilir. Gerçek zamanlı PZR öncesinde ekstraksiyon sürecinin uygunluğundan emin olunması için LOD belirlenirken numune olarak aynı matrikse katılmış bütün halindeki organizmaların

“İKİ DÜŞÜN, BİR SÖYLE”Kalitatif Gerçek Zamanlı PZR Yöntemlerinin VerifikasyonuDonna M. Wolk MHA, Ph.D., D(ABMM) \ Enfeksiyöz Hastalıklar Araştırma Birimi, BIO5

Enstitüsü, Arizona Üniversitesi, Tucson, AZ Arizona Sağlık Ağı Üniversitesi, Tucson, AZ

ve Daniel Olson, MPH Enfeksiyöz Hastalıklar Araştırma Birimi, BIO5 Enstitüsü, Arizona

Üniversitesi, Tucson, AZ

25

kullanılması en iyi yöntemdir. Söz konusu mikroorganizmanın üretilmesi zor veya imkansız olduğunda, bilinen bir organizma yüküne ait plazmit veya genomik DNA (Zeptometrix, Acrometrix, ATCC ve diğerleri gibi ticari kaynaklardan elde edilebilen) kullanılabilir. Birçok laboratuvarın matrikse katılmak üzere bakteri üretip sıvı bölüntüler oluşturabilmekle birlikte, viral DNA veya RNA almaları da gerekebilmektedir. Artış deneyleri için örnek matriksi hazırlamanın yollarından biri, yeterli hacimde negatif numunenin bir araya getirilmesiyle test için en az 20 tekrar örneğine ait bölüntü oluşturmaktır. Öncelikle, uygun yoğunlukta bir taze mikrobiyal süspansiyon hazırlanmalıdır. Log faz kültürleri, çok sayıda ölü bakterinin dahil edilmesinin önlenmesi için optimaldir. Süspansiyon negatif matrikse eklenip homojen şekilde karıştırıldığında, ürün kullanma talimatında belirtilen LOD düzeyinde organizma oluşturmalıdır. Daha sonra test edilmek üzere uygun sayıda örnek bölüntüsü oluşturulabilir (Tablo 1). Organizma konsantrasyonunun (cfu/ml) doğrudan tabaka sayımıyla doğrulanması iyi bir yaklaşımdır. %95 LOD ile ilgili doğru ölçümün belirlenmesi için optimal olan, >20 tekrar testi yapılmasıdır. 20 örnekten yalnızca birinin yalancı negatif olması halinde tayinin belirtilen %95 LOD düzeyi yeniden doğrulanmış olmaktadır. Yalancı negatiflik gözlenmemesi halinde %100 LOD belgelenebilir, böylece 2 negatif sonuç = %90 LOD vb. şeklindedir. Tayinin tekrarlama testlerinin birkaç günlük süre içinde birçok teknisyen tarafından yapılması düşünülebilir. Böylece, eğitim, tekrarlanabilirlik çalışmaları ve LOD verifikasyonu aynı anda yapılmış olacaktır.

2) PROBİT ANALİZİ:

“Olasılık birimleri”nin (veya “probitler”in) belirlendiği bu süreç, yalnızca ikili sonuçların verildiği kantitatif testler için gereklidir. Örnekler tekrarlama testlerine benzer şekilde hazırlanır, buradaki fark farklı yoğunlukta 3-4 hedefin bulunduğu standart bir eğrinin oluşturulma sürecinde olduğu gibi, organizma süspansiyonlarından çok sayıda dilüsyon (organizma sayısı/ml) hazırlanmasıdır. Probit orijinal olarak doz-yanıt değerlendirmesi için oluşturulduğundan, bu sürecin temeli de bir doz-yanıt eğrisi olarak düşünülebilir. Genel olarak, regresyon hattının eğrisini çarpıtacak olan %0 pozitif ve %100 pozitif yoğunluklardan kaçınılarak her bir yoğunluk için 3-12 tekrar hazırlanmaktadır. Süspansiyonlar düşük (3-4 x LOD), orta (5-6 x LOD) ve yüksek (7-8 x LOD) konsantrasyonda olabilmektedir. Bu sürecin uygunlanması kullanıcının grafik oluşturup %95 LOD hesaplaması yapmasını sağlamaktadır. Probit analizi saptanan pozitif

Kurum içi verifikasyon süreci Klinik Laboratuvar İyileştirme Değişiklikleri (CLIA) düzenlemeleri uyarınca yönetilmekte ve laboratuvarın üretici tarafından iddia edilen performans özelliklerini tekrarlamasına yönelik çalışmalarla başlamaktadır.

yanıtların oranını bir “olasılık birimi”ne (veya “probit”) dönüştürmektedir. Pozitif yanıt oranlarının dönüştürülmesi için bir tablo veya yazılım programı kullanılmakta, daha sonra yoğunluk logaritması karşısında (doz, x ekseni) grafik oluşturulmakta ve böylece farklı konsantrasyonlarla ilişkili pozitif yanıt olasılıkları bakımından bir seri elde edilmektedir. Gerçek zamanlı PZR tayininden elde edilen döngü eşik değerlerine erişim sağlanması halinde, tayin için bir kesme değerinin atanması; probit analizinden elde edilen %95 LOD değerine karşılık gelen yoğunlukla ilişkili Ct için gözlenen %95’lik güven aralığı (GA) temelinde olabilmektedir. LDT kullanıldığında tayin kesme değerinin klinik kılavuzlara uygun şekilde periyodik olarak yeniden valide edilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Yaygın olarak kullanılan ölçü, bunun altı ayda bir yapılmasıdır.

Sonraki adım, çapraz reaktivitenin değerlendirilmesi amacıyla, tayinin genetik açıdan benzer veya yakın ilişkili organizmalar karşısında sınanmasıyla spesifisitenin (negatif nu-muneler için % doğruluk) belirlenmesidir. Bu değerlendirme için örnek tipinde yaygın olarak bulunan organizmaları içeren sivri (artış gösteren) numuneler kullanılabilir. Buna tayinde hedef alınanlara genetik benzerlik gösteren organizmalar dahil edilmelidir. Tayin spesifisitesi, % uyum değerlendirmesi için kullanılan, bilinen çeşitli negatif hasta örnekler-inin kullanılmasıyla arttırılabilmektedir (bkz. aşağıdaki bölüm). Bu örneklerden elde edilen bulguların yeniden incelenmesi diğer izole mikroorganizmaların tanımlanmasını sağlayarak test sırasında ortaya çıkan, hedef olmayan mikroorganizmalarla çapraz reaksiyon olmadığı konusunda ilave kanıt oluşturabilecektir. Son olarak, primerlerin ve probların bilinmesi halinde (ticari tayinlerde yaygın olmayan bir durumdur) her türlü potansiyel çapraz reaktivite testinin yapılması amacıyla oligonükleotid sekanslarının bilinen tüm genetik sekanslarla karşılaştırılması için görsel spesifisite çalışmalarının (bilgisayar destekli teknoloji kullanılarak) yapılması akılcı bir yaklaşımdır. Bu süreç ti-cari tayinlerin üreticileri tarafından yapılmakta ve FDA klirens süreci sırasında kontrol edilmekte, böylece laboratuvarlar bu uygulamayı tekrarlamak zorunda kalmamaktadır. Bu yaklaşım potansiyel çapraz reaksiyonları tanımlayabilmekle birlikte, gelecekte primer ve problarla çapraz reaksiyon oluşması bakımından mikroorganizmaların evrimi veya yeni tanımlanan mikroorganizmaların ortaya çıkışı konusunda öngörü sağlamamaktadır. Bu nedenlerden ötürü, her türlü moleküler tayinin kullanım süresi boyunca spesifisite değerlendirmelerinin sürekli olarak yapılması esansiyeldir.

Verifikasyon sürecine sıklıkla paralel olan diğer bir adım ise önemli tayin parametreleriyle ilgili kabul edilebilir değer aralıklarının belirlenmesi amacıyla tayinin tekrarlanabilirliğinin (değişkenlik olarak da bilinir) belgelenmesidir. Kalitatif tayinlerde, pozitif ve negatif sonuçların zaman içinde farklı operatörlerle sergilediği güvenilirlik yeterli olmaktadır. Kantitatif tayinlerde, tayin içi değişkenlik (tayin kapsamında) LOD belirlenmesi için yapılan 12-20 tekrarın aynısı kullanılarak elde edilebilir. Hedef ve dahili kontrollerle ilgili ortalama Ct değerlerinin yanısıra standart sapma (SD), varyasyon katsayısı (% CV) ve diğer varyans ölçümleri hesaplanabilmektedir. Tekrarlanabilirlik çok sayıda analit yoğunluğunda tanımlanmalı (düşük, orta ve yüksek) ve teste çok sayıda operatör dahil edilmelidir. Yaygın kullanılan bir ölçüm olmakla birlikte, % CV organizma yoğunluğuna göre değişkenlik sergilediğinden ötürü değişkenlik için optimal bir ölçüm değildir; bu nedenle, % CV her bir yoğunluk için ayrı ayrı hesaplanmalıdır.

27

Tayinler arası değişkenlik, tayin içi değişkenlikteki varyans ölçümlerinin hesaplanmasıyla aynı şekilde belirlenmekte; ancak burada kullanılan veriler birkaç günlük sürede yapılan tekrarlama testlerinden elde edilenler olup, lottan lota olan performansın ve trend analizleriyle operatör yeterliğin izlenmesi için ortalama ile üç Standart Sapma (3SD) kullanılabilmektedir.

TekrarMikrobiyal Hedef Yoğunluğu (cfu/

mL)*

Gerçek Mikrop Yoğunluğu (cfu/

mL)*Saptanma (E/H)

1 100 101 E

2 100 101 E

3 100 99 H

4 100 103 E

5 100 100 E

6 100 102 E

7 100 99 E

8 100 101 E

9 100 101 E

10 100 103 E

11 100 98 E

12 100 104 E

13 100 103 E

14 100 105 E

15 100 100 E

16 100 98 E

17 100 100 E

18 100 100 E

19 100 97 E

20 100 102 E

100.85 Ort. cfu/mL

19/20 = %95 % pozitiflik

Tablo 1. %95 LOD belirlenmesine yönelik koloni sayım örnekleri, n =20. Tekrar örneği #3 negatif olan tek örnektir.

Not: N sayısının 10 tekrar olması halinde %90 LOD hesaplanacaktır.

Kalitatif tayinlerde, pozitif ve negatif sonuçların zaman içinde farklı operatörlerle sergilediği güvenilirlik yeterli olmaktadır.

Kontrol sınırları ortalama artı 3s ve ortalama eksi 3s olarak ayarlandığında Levey Jennings kartıyla birlikte yaygın olarak kontrol kuralını ifade etmektedir. Tek bir kontrol ölçümü ortalama artı 3s ve ortalama eksi 3s sınırını aştığında deneme reddedilmektedir.

Kontrol sınırları ortalama artı/eksi 3s olarak ayarlandığında Levey-Jennings kartıyla birlikte yaygın olarak kontrol kuralını ifade etmektedir. Orijinal Westgard çok kurallı QC prosedüründe, bu kural kontrol verilerinin sonraki reddetme kurallarıyla dikkatli şekilde denetlenmesini sağlamaya yönelik bir uyarı kuralı olarak kullanılmaktadır.

2 ardışık kontrol ölçümü aynı ortalama artı 2s veya aynı ortalama eksi 2s kontrol sınırını aştığında reddedilir.

Bir grupta 1 kontrol ölçümü ortalama artı 2s sınırını ve diğer bir ölçüm ise ortalama eksi 2s kontrol sınırını aştığında reddedilir.

4 ardışık kontrol ölçümü aynı ortalama artı 1s veya aynı ortalama eksi 1s kontrol sınırını aştığında reddedilir.

8 ardışık kontrol ölçümü ortalamanın bir tarafında denk geldiğinde reddedilir.

13s

12s

22s

R4s

41s

8xTablo 2. Westgard Kuralları (http://www.westgard.com/westgard-rules-and-multirules. htm#westgard) farklı karar kriterleri veya kontrol kurallarının

kısaltması için kullanılan bir stenograf notasyonudur, örn: 12s, 2s (2 SD) kontrol sınırlarını aşan 1 kontrol ölçümünü göstermektedir. Kontrol

sınırlarının gösterilmesi için altsimgeler kullanılmakta, kural kombinasyonları ise genellikle kontrol kuralları arasına bölme işareti (/) konarak

gösterilmektedir, örn: 13s/22s.

Şekil 1. Pozitif kontrol olarak S. aureus suşuna ait döngü eşik değerlerini gösteren Levey-Jennings Grafiği. Dışarıdaki kesikli çizgiler ortalama ile

3 Standart Sapmanın üst ve alt sınırlarını göstermekte, bunları ortalamaya yaklaşıldığında 2SD ve 1SD takip etmektedir.

34.5

34.0

33.5

33.0

32.5

32.0

31.5

31.0

30.5

30.0

0 5 10 15 20 25

Tekrar (Pozitif Kontrol)

Dön

gü E

şikd

eğer

i (C

t)

29

Alternatif olarak, trend analizi için %95 güven aralığı kullanılabilmekle birlikte, 3D daha yaygın kullanılmaktadır. En doğru ölçümün elde edilmesi için optimal olan 28 ölçüm-dür; bununla birlikte, 6-12 tekrar sıklıkla tayinin yürürlüğe konması ve eğilim ana-lizinin başlatılması için mantıklı bir ortalama ve SD sağlayacaktır. Ortalama değer ve 3D daha sonra, 20-28 deneme elde edildikten sonra ayarlanabilir. Bu durumda, alt ve üst güven sınırları belirlenir. 28 ayrı test denemesinin yapılması ve karakterize edilmesi klinik laboratuvar çalışanlarına zaman içinde yeni lotların değerlendirilebileceği sağlam sonuçlar sunmaktadır9. Sıklıkla, harici pozitif kontrollerden elde edilen sonuçlar zaman içinde çizelge haline getirilebilmekte ve tayinler arası değişkenliğin açıklanması için or-talama karşısında grafik oluşturulabilmektedir. Levey-Jennings Grafiği6 bu sonuçların yorumlanmasında kullanışlı bir yöntemdir (Şekil 1).

Şekil 2. Tanı amaçlı yöntem performansı özelliklerinn belirlenmesine yönelik planı yansıtan gerçek (2x2) tablo; GP gerçek

(doğrulanmış) pozitif sonuçları, GN gerçek negatifleri, YP yalancı pozitifleri, YN ise yalancı negatifleri göstermektedir.

Şekil 3. Gerçek Tablo hesaplamaları aşağıdakileri içermektedir: Yüzde hesaplamalar için 100’e göre tüm çoklu eşitlikler.

N

Referans Yöntem

Test 2

Yeni

Test 1

Pozitif

Negatif

N

N

N Toplam N

Pozitif

+/+ GP

+/- YN

Negatif

-/+ YP

-/- GN

Gerçek

Pozitif

Negatif

Pozitif

Negatif

NegatifPozitif

BA

DC

DUYARLILIK: A / (A+C)DUYARLILIK: D / (B+D)YALANCI NEGATİF %: C / (A+C)YALANCI POZİTİF %: B /(B+D)POZİTİF ÖNGÖRÜ DEĞERİ: A / (A+B)NEGATİF ÖNGÖRÜ DEĞERİ: D / (C+D)YENİ YÖNTEM PREVALANSI = (A+B)/ (A+B+C+D)ESKİ YÖNTEM PREVALANSI = (A+C)/ (A+B+C+D)% TOPLAM UYUM: A+D/ (A+B+C+D)

Eğilim (trends) analizi, kalitatif tayin karakterizasyonunun doğrulanmış tayinin kalite güvencesinin ortaya konması için sürekli bir süreç olarak kullanılabilen bir bölümüdür. Bazı araştırıcılar eğilim analizinin değerlendirilmesinde Westgard kurallarını kullanmış ve bu kuralları uyarlamış veya eğilim sonuçlarının izlenmesi için kendi kurallarını oluşturmuşlardır; örnekler Tablo 2’de yer almaktadır7,8. Örneğin, pozitif hasta sonucu oranının zaman içinde yavaşça yükselmekte olduğu ve hasta özelliklerinin değişmemiş olduğu izlendiğinde, testle ilgili birşeyin değişip değişmediğinin incelenmesi gerekebilir. Bu durumda, Ct değerleri eğilimlerin saptanması için grafik haline getirilmelidir.

Klinik uyum oranı veya kalitatif doğruluk.

Bu iki parametre yeni tayin ile referans yöntem arasında performans karşılaştırması yapılarak ortaya konabilir. İdeal olan, bunun bilinen pozitif numunelerin bilinen hedef yoğunlukları (düşük, orta, yüksek sinyalli pozitifler) genelinde kullanılarak yapılması ve spektrumun alt sınırında doğruluğun sağlanması için zayıf pozitiflik sergileyen yeterli sayıda numunenin dahil edilmesidir.

Tayin performanslarının karşılaştırılmasına yönelik yeterli istatistiksel gücün elde edilmesi ve laboratuvar sorumlusunda mevcut tayinin değiştirilip değiştirilmemesiyle ilgili yeterli bilgi sağlanması için, güç hesaplaması yapılmalıdır; bununla birlikte, maliyet ve yararlılığın korunması açısından, ASM Cumitech1 test için 50 pozitif ve 100 negatif sonuç önermektedir. Tayinin performansına ve test sonuçlarının kritikliğine bağlı olarak daha fazla örneğin test edilmesi gerekebilir. Laboratuvarlar bir denemede tüm sonuçların pozitif, bir diğerinde ise tümünün negatif olmadığı gerçek test ortamının taklit edilebilmesi için rastgele testler yapılmasını sağlamalıdır. % uyumun yanısıra, klinik duyarlılık, klinik spesifisite, pozitif prediktif değeri (PPV) ve negatif prediktif değeri (NPV) gibi performans parametrelerinin değerlendirilmesi laboratuvarların ve klinisyenlerin ilgili bölge ve hastalık prevalanslarına uygun test performansını hesaplama olanağı sunmaktadır. PPV ve NPV hastalık prevalansa göre değişkenlik sergileyeceğinden, klinik duyarlılık ve spesifisite, laboratuvarın hizmet vereceği gerçek yaşam popülasyonuna mümkün olduğunca yakın bir senaryoda hesaplanmalıdır. PPV gerçekten hasta olan ve inceleme altındaki test ile hasta olarak tanımlanan kişilerin oranıdır. NPV ise gerçekten hasta olmayıp, tayin ile de negatif olarak sınıflandırılan kişilerin oranıdır. Tayinin klinik performans özelliklerinin belirlenmesi için genellikle 2x2 tablo kullanılmaktadır (Şekil 2-3). Daha yeni olan moleküler tayinlerle, önceki “altın standart”ın yeni test kadar doğru olmama ihtimali söz konusudur. Bu durum çözümlenme için üçüncü bir yöntem gerektiren farklı bulgulara neden olabilmektedir. Bazı durumlarda, semptomatik hastalardan alınan klinik bilgiler kullanılabilmekte, bazı durumlarda ise farklı bir moleküler yöntem veya yeni tayinle amplifiye edilen ürünün sekanslanması gerekmektedir. Zaman zaman nihai hastalık değerlendirmesinde kombine edilen komparatör yöntemlerle elde edilen bulgular klinik “gerçek” olarak kabul edilmektedir (Şekil 3).

31

Şekil 4. Her bir yeni tayin/prosedür için dahil edilen verifikasyon bölümleri.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Tayin adı

Danışman

Bölüm

Firma

Ürün Adı

Ürün

Numarası

Başlık Sayfası

aşağıdakileri

içermektedir:

Analiz öncesi ve analiz sonrası bilgiler, numunenakliyesi, hekim testlerinin sonuçları, bilgisayarçıktıları vb.

Ürün bilgisi ve literatür incelemesi

İletişim listesi ve ilgili yazışma adresleri

Ham veriler ve test sonuçları

Cihaz ve diğer kullanma talimatları (uygulanabilir ise)

Çeşitli genetik sekans bilgileri (uygulanabilir ise),güvenlilik, insan gönüllüler (uygulanabilir ise)

Müşteri ilişkileri, bilgi formları,duyurular, web bilgisi

Verifikasyon özeti (istatistiksel analiz & özet,danışman yetki önerisi, merkez yayınlarıveya özetleri

SOP’ler, kontrol materyali, formlar,eğitim/yeterlilik, başlangıç yeterlik testi

Bilgisayar girdi bilgileri ve LaboratuvarBilgi Sİstemleri

Yürürlüğe konmas sonrası değerlendirme(uygulanabilir ise)

Maliye analizi ve test geri ödeme bilgisi(HCPCS veya CPT)*

Bulguların Özetlenmesi

Hastalara yönelik sonuç verilmesi, ancak kurum içi yöntem verifikasyonu yapıldıktan sonra başlatılabilir. Tipik olarak yöntem verifikasyonunun tamamının özeti, test öncesinde ham veriler ve diğer bilgilerle birlikte bir verifikasyon dosyası şeklinde olmak üzere sorumlu uzman tarafından oluşturulup imzalanmalıdır. Arizona Üniversitesi Tıp Merkezi verifikasyon dosyası’nda kullanılan içindekiler, başlıklar ve alt başlıklara dair örnekler Şekil 4’de yer almaktadır.

Referanslar

1. American Society for Microbiology. 2009. Cumitech 31A: Verification and Validation of Procedures in the

Clinical Microbiology Laboratory. ASM Press, Washington, D.C.

2. Armbruster, D. A. and T. Pry. 2008. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin.Biochem.Rev. 29

Suppl 1:S49-S52.

3. Bliss, C. I. 1934. The Method of Probits. Science 79:38-39.

4. Burd, E. M. 2010. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin.Microbiol.

Rev. 23:550-576. doi:23/3/550 [pii];10.1128/CMR.00074-09 [doi].

5. Centers for Medicare & Medicaid Services, Department of Health and Human Service. Clinical

Laboratory Improvement Act, Subpart K, 493.1253. 7-7-2004.

6. Levey, S. and E. R. Jennings. 1992. The use of control charts in the clinical laboratory. 1950. Arch. Pathol. Lab

Med. 116:791-798.

7. Liang, S. L., M. T. Lin, M. J. Hafez, C. D. Gocke, K. M. Murphy, L. J. Sokoll, and J. R. Eshleman. 2008. Application

of traditional clinical pathology quality control techniques to molecular pathology. J.Mol.Diagn. 10:142-146.

doi:S1525-1578(10)60141-9 [pii];10.2353/jmoldx.2008.070123 [doi].

8. Westgard, J. O., P. L. Barry, M. R. Hunt, and T. Groth. 1981. A multi-rule Shewhart chart for quality control in clinical

chemistry. Clin.Chem. 27:493-501.

9. Wolk, D. M. and E. M. Marlowe. 2011. Molecular Method Verification, p. 861-884. In: D. P. Persing (ed.), Molecular

Microbiology, Diagnostic Principles and Practice. 2 ed. ASM Press, Washington, DC.

AMADS.pdf 1 6/7/12 4:35 PM

Haziran 2012 Sayısı

Documents