Guia Trabajos Practicos Toxicologia Agosto 2015 (1)

Universidad Andrés Bello Facultad de Medicina

Escuela de Química y Farmacia

_______________________________________________________________

Guía de Trabajos Prácticos _______________________________________________________________

Toxicología QYF 337

Prof. QF. Fernando Torres Moscoso Prof. QF. Aleida Kulikoff Bravo

I.- Actividades prácticas Para la realización de las actividades prácticas que se describen a continuación, debe leer con atención las instrucciones señaladas en esta guía y las indicaciones entregadas por el profesor, Recuerde que trabajará con muestras biológicas, por lo que es necesario que las manipule con cuidado y siempre con guantes y elementos de protección personal. Revise el caso proporcionado por el profesor y desarrolle las actividades que se indican al final de cada paso práctico, relacionadas con él. Conocimiento El alumno deberá conocer y aplicar conceptos básicos en el estudio del tóxico y su actividad; el fenómeno tóxico en sus fases de exposición, cinética y dinámica, así como las reacciones de transformación de un xenobiótico y sus consecuencias; los principios del análisis químico-toxicológico; el pretratamiento y extracción de muestras para la separación del tóxico de la matriz biológica; los métodos más actuales de análisis cualitativo presuntivos, inmunoensayos, de extracción y aislamiento de analitos y de las técnicas fisicoquímicas de análisis instrumental de más amplio y generalizado uso en los laboratorios toxicológicos incluidas las técnicas acopladas; tóxicos volátiles y gaseosos, plaguicidas, metales y aniones tóxicos, medicamentos y drogas de abuso, su toxicidad, sintomatología y métodos de análisis. No nos podemos olvidar del importante tema de los sistemas de calidad en toxicología en referencia a la calidad de los resultados analíticos, contemplando la toma de muestra, los problemas existentes en la denominada cadena de custodia de las muestras y en la validación de los métodos analíticos de acuerdo con los criterios estadísticos aplicables y exigidos. Habilidades Es importante que alumno adquiera habilidades para el pre tratamiento y extracción de muestras biológicas y no biológicas para el análisis toxicológico; observar e interpretar los resultados propios de una investigación toxicológica; utilizar los instrumentos analíticos que se dispongan de forma eficaz; integrar los conocimientos previamente adquiridos en otras asignaturas; desarrollar la habilidad de búsqueda bibliográfica específica y su correcta utilización. Es importante que el estudiante desarrolle las habilidades necesarias para trabajar en equipo y manifestar de forma clara su razonamiento crítico. Objetivos del Aprendizaje Los objetivos específicos que se establecen en este curso teórico práctico son:

Aplicar conceptos y principios generales relacionados con el estudio de la toxicología. Aplicar los conocimientos adquiridos sobre el mecanismo de toxicidad de una sustancia

con relación al compuesto químico objeto de estudio, en sus fases de exposición, cinética y dinámica.

Conocer los métodos de análisis rápidos que se utilizan en el análisis toxicológico. Conocer técnicas instrumentales de análisis químico habitualmente utilizadas,

incluyendo las técnicas acopladas o híbridas. Buscar e interpretar la información toxicológica. Considerar los protocolos analíticos a seguir en un análisis toxicológico en muestras

biológicas.

LABORATORIO 1:

IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS MEDIANTE ENSAYOS CUALITATIVOS DE COLORACIÓN Y SCREENING EN CAPA FINA En este laboratorio el alumno desarrollará reacciones de coloración cromáticas de screening.

Algunas drogas y otros tóxicos si se encuentran en concentraciones altas y en

ausencia de compuestos que interfieran dan colores característicos con reactivos

apropiados. Algunos de estos ensayos son prácticos y específicos. Hay otros

compuestos que, al presentar grupos funcionales similares pueden también

reaccionar y dar interferencia con los tóxicos y/o sus metabolitos.

Estos ensayos suelen ser realizados satisfactoriamente en tubos de vidrio limpios,

cápsulas de porcelana o placas de toque.

Cuando se realizan los ensayos de color es importante analizar conjuntamente

con la muestra un blanco de reactivo y un testigo positivo.

1.- Detección cualitativa mediante el Test de O-Cresol Este test cualitativo permite detectar compuestos relacionados con el Paracetamol y Fenacetina mediante reacciones con el reactivo de Orto cresol.

Procedimiento a) Rotular 4 tubos de Kahn como: blanco ,estándar, muestra 1 y muestra 2 b) Colocar en cada tubo 1 ml de blanco, estándar y muestras respectivamente, agregar

0,2 ml de HCL concentrado, hidrolizar en baño María a 100ºC por 5 minutos cuando se trata de muestra de orina, .para muestras de suero o contenido gástrico realizar el ensayo directamente, sin hidrolizar.

c) Tomar 200 uL del hidrolizado del paso anterior y agregar en cada tubo 0,5 ml de O-cresol al 5%, agitar y finalmente una gota de NaOH al 10%. Agitar

d) Observar la coloración de cada tubo, comparando la muestra con el blanco (agua destilada) y el estándar de concentración conocida. Una coloración azul indica que el test esta positivo.

e) Completar el informe de resultados

2.- Detección cualitativa mediante test de Trinder. El reactivo de Trinder da coloración positiva (color violeta) cuando se enfrenta a compuestos fenólicos, como el Ácido acetil salicílico. En muestras biológicas este reactivo, primero precipita las proteínas presentes, debido a que su composición contiene cloruro de mercurio y acido clorhídrico. La coloración se debe a la reacción del salicilato que se compleja con el ión Fe3+ del nitrato ferrico. El test es positivo para compuestos fenólicos cuando aparece una coloración violeta fugaz Procedimiento

a) Rotular 4 tubos de Kahn como blanco, estándar, muestra 1 y muestra 2 b) Colocar en cada tubo 1 ml de blanco, estándar y muestra respectivamente c) Agregar 0,2 ml de Reactivo de Trinder a cada tubo d) Observar la coloración, comparando la muestra con el blanco (agua destilada) y los estándares de concentración conocida.

e) Completar el informe de resultados

3.- Detección cualitativa mediante el test de Forrest. Este test permite detectar cualitativamente fármacos del tipo Antipsicóticos y Antidepresivos tricíclicos. El test es positivo para Clorpromazina, Fluoperazina, Triptilina, Nortriptilina y Amitriptilina, cuando aparece un color amarillo verdoso que vira a Verde oscuro o azul Procedimiento

f) Rotular 4 tubos de Kahn como blanco ,estándar 1, muestra 1 y muestra 2 a) Colocar en cada tubo 0,5 ml de blanco, estándar y muestra respectivamente b) Agregar 1 ml de Reactivo de Forrest a cada tubo c) Observar la coloración, comparando la muestra con el blanco (agua destilada) y los

estándares de concentración conocida. d) Completar el informe de resultados

4.- Detección cualitativa mediante el test de Marquis Este test da coloración Positiva para Compuestos Nitrogenados y Alcaloides. El test se interpreta como positivo con las siguientes coloraciones:

Naranja: Adrenalina, Anfetamina, Tetraciclina Amarillo: Clordizepoxido, Lorazepam, Colchicina Violeta: Codeína, Morfina, Promazina Marrón: doxepina, ergotamina, LSD, Naproxeno

Procedimiento

Rotular 4 tubos de Kahn como blanco ,estándar, muestra 1 y muestra 2 Colocar en cada tubo 0,5 ml de blanco, estándar y muestra respectivamente Agregar 2 gotas de Reactivo de Marquis a cada tubo Observar la coloración, comparando la muestra con el blanco (agua destilada) y los estándares de concentración conocida.:

Completar el informe de resultados 5.- Detección cualitativa Alcaloides mediante el test de Bouchardat Este test es sensible para alcaloides Procedimiento

a) Rotular 4 tubos de Kahn como blanco ,estándar 1, muestra 1 y muestra 2 b) Colocar en cada tubo 0,5 ml de blanco, estándar y muestra respectivamente c) Agregar 0,5 ml de Reactivo de Bouchardat a cada tubo

d) Observar la coloración, comparando la muestra con el blanco (agua destilada) y los estándares de concentración conocida. El test es positivo para cuando aparece una coloración café

e) Completar el informe de resultados 6. Reacción de Scott con Tiocianato de Cobalto: Esta prueba rápida se realiza para identificar presencia de clorhidrato de cocaína Se adicionan 5 gotas de Tiocianato de Cobalto a la sustancia sospechosa . Si se torna AZUL TURQUESA, indica resultado parcialmente positivo. •A la sustancia AZUL se le adiciona una gota de acido clorhídrico concentrado (HCL), en presencia de cocaína el color azul cambia a ROSADO. 7. Test de identificación de compuestos fenotiacínicos con reactivo FPN Este test es sensible a compuestos fenotiacínicos, dando coloración Rosada para fenotiacinas Cloradas, morado para fenotiacinas fluoradas y azul para tioridazina.

a) Rotular 4 tubos Kahn como banco, estándar, muestra 1 y muestra 2 b) Colocar en cada tubo 1 ml de blanco, estándar y muestra c) Agregar 1mL de reactivo FPN a cada tubo d) Observar la coloración, comparando la muestra con el blanco y los estándares de

concentración conocida. 7.- Detección del Alcohol (Método de Nicloux):

Procedimiento a) En un vaso pp. agregar 1g de Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) y disolver en 5ml de

agua destilada. Adicionar 5ml de H2SO4 concentrado y homogenizar.

b) Adicionar gotas de esta solución a la muestra problema, si la solución da

color:Amarillo : Negativo

Azul verdoso : Positivo

8- Detección de monóxido de carbono en sangre (método de dilución y alcalinización)

Procedimiento

a) En un tubo de ensayo agregar gotas de sangre a analizar

b) Agregar 5 mL de agua destilada y agitar suavemente

c) Alcalinizar la solución antes obtenida con NAOH al 10%

d) Una muestra positiva mantiene el rojo carmín, la sangre que no contiene CO pasa del

rojo al castaño

e) El color debe observarse rápidamente, pasado los 5 minutos las muestras se vuelven

color castaño.

9.- Identificación de manchas en prendas de ropa o papel Detección de Vino Tinto:

a) Recortar la mancha de la prenda de ropa e introducirla en un matraz erlenmeyer de 250

mL

b) Acidificar con HCL 20% (tiene que producirse una coloración ROJA).

c) Alcalinizar la muestra con Amoniaco: si esta cambia de “ROJO a VERDE” estamos en

presencia de “vino tinto”.

Detección de Sangre: (Reacción de Adler)

extraer con éter desde la matriz que contiene la mancha, sembrar muestra problema en

una placa de silica gel

Calentar en estufa a 90° por 5 minutos.

Asperjar con solución saturada de Bencidina en Acido Acético.

Esperar 2 minutos (sin que aparezcan manchas).

Asperjar con una solución de agua oxigenada al 3% (recientemente preparada).

Si se aprecia una coloración azul estamos frente a una muestra de sangre.

10- Scrrening en capa fina mediante la reacción de Dragendorff

Esta reacción da positivo para Aminas aromáticas primarias y secundarias, aminas terciarias y

cuaternarias y alcaloides.

Procedimiento

a) Trazar con lápiz grafito, en su placa cromatográfica la línea de sembrado (1 cm desde la base) y con los capilares disponibles sembrar su muestra problema y los estándares disponibles en su mesón (dejando una separación de 1 cm entre cada estándar)

b) Desarrollar en cámara cromatografica, previamente saturada con una mezcla de Cloroformo : Metanol = 9:1

c) Una vez que el frente de solvente llegue a la parte superior de la cromatoplaca, esta debe ser retirada de la camara y secar con secador de pelo suavemente, para evaporar el solvente

d) Observar a luz Ultravioleta e) Asperjar sobre la placa cromatográfica reactivo de Dragendorff f) Comparar las bandas (coloración, desplazamiento y calcular su Rf) contra las bandas

de los estándares sembrados

11- Scrrening en capa fina mediante la reacción de FPN

Esta reacción da positivo para para derivados fenotiazínicos y otros antidepresivos como la

imipramina.

Procedimiento

a) Trazar con lápiz grafito, en su placa cromatográfica la línea de sembrado (1 cm desde la base) y con los capilares disponibles sembrar su muestra problema y los estándares disponibles en su mesón (dejando una separación de 1 cm entre cada estándar)

b) Desarrollar en cámara cromatografica, previamente saturada con una mezcla de Metanol: amoniaco= 100:1.5

c) Una vez que el frente de solvente llegue a la parte superior de la cromatoplaca, esta debe ser retirada de la cámara y secar con secador de pelo suavemente, para evaporar el solvente

d) Observar a luz Ultravioleta e) Asperjar sobre la placa cromatográfica reactivo de Dragendorff f) Comparar las bandas (coloración, desplazamiento y calcular su Rf) contra las bandas

de los estándares sembrados

Registro de resultados Test Cualitativo

Test Coloración del estandar

Coloración de la muestra Resultado del análisis Muestra 1 Muestra 2

Test de O-cresol

Test de Trinder

Test de Forrest

Test de Marquis

Test de Bouchardat X

Tes FPN/tiocianato de cobalto

Test de Nicloux

Test HCl 20% / NH3

Test de Adler

Presuntos analitos presentes en la muestra

Test Resultados

Test de O-cresol

Test de Trinder

Test de Forrest

Test de Marquis

Test de Bouchardat

Test de p-DMABD

Test de Nicloux

Test HCl 20% / NH3

Test de Adler

Preguntas 1.- ¿Cual es la finalidad de hacer análsis cualitativos a una muestra proveniente de un paciente hospitalizado o muestra forense? 2.- ¿Por qué en un ensayo cualitativo es necesario comparar los resultados de la muestra problema con un blanco y con un estándar conocido? 3.- Investigue sobre el fundamento químico de los métodos utilizados

LABORATORIO N°2:

FARMACOS: EXTRACCIÓN DE FÁRMACOS, SEPARACIÓN DE FÁRMACOS ÁCIDOS Y BÁSICOS DESDE UNA MISMA MATRRIZ BIOLÓGICA, IDENTIFICACION MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y CUANTIFICACIÓN DE PARACETAMOL MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS Extracción de sustancias en medio alcalino Procedimiento

g) Rotular los tubos de ensayo como blanco , estandar y muestra h) Colocar en cada tubo 5 ml de blanco, estándar y muestra respectivamente i) Agregar 0,5 mL de Buffer amonio/amoniaco a cada tubo y agitar j) Agregar 5 mL de una mezcla de Diclorometano: isopropanol 85:15. Extraer mediante

agitación en embudo de decantación k) Separar, recuperar la fase orgánica en tubo kahn. NO eliminar la fase acuosa. l) Evaporar la fase orgánica a sequedad, en baño maría m) El extracto obtenido se debe reconstituir en 20 uL de Metanol. Agitar en vortex n) Sembrar 20 uL del extracto en la placa cromatografica (Silca F254), o) Desarrollar en cámara cromatografica, con una mezcla de Cloroformo : Metanol:

amoniaco = 9:1:0,1 p) Una vez que el frente de solvente llegue a la parte superior de la cromatoplaca, esta

debe ser retirada de la camara y secar con secador de pelo suavemente, para evaporar el solvente

q) Observar a luz Ultravioleta r) Aplicar sobre la placa cromatográfica, en la siguiente secuencia los reactivos

reveladores: solución de Yodo Metanol s) Comparar las bandas (coloración, desplazamiento y calcular su Rf) contra las bandas

de los estándares sembrados Extracción de sustancias en medio Acido Procedimiento

a) Agregar 20 mg de acido tartarico, a la fase acuosa que mantiene en el embudo de decantación

b) Agregar 5 mL de una mezcla de Diclorometano: isopropanol 85:15. Extraer mediante agitación manual

c) Recuperar la fase orgánica en tubo KahnEvaporar la fase orgánica a sequedad, en baño maría

d) El extracto obtenido se debe reconstituir en 20 uL de Metanol. Agitar en vortex e) Sembrar el extracto en la placa cromatografica (Silca F254), sembrar 20 uL de

cada estándar f) Desarrollar en cámara cromatografica, con una mezcla de g) Cloroformo : Metanol: amoniaco = 9:1:0,1 h) Una vez que el frente de solvente llegue a la parte superior de la cromatoplaca,

esta debe ser retirada de la camara y secar con secador suavemente, para evaporar el solvente

i) Observar a luz Ultravioleta j) Aplicar reactivo revelador: solución de Yodo Metanol k) Comparar las bandas (coloración, desplazamiento y calcular su Rf) contra las

bandas de los estándares sembrados

Dibuje el esquema de separación mediante extracción liquido liquido Registro de resultados Cromatografía en Capa Fina (Extracción Alcalina)

Rf detectados (cm) Coloración de la banda Presunto analito

Registro de resultados Cromatografía en Capa Fina (Extracción Acida)

Rf detectados (cm) Coloración de la banda Presunto analito

Cuantificación de Paracetamol mediante Espectrofotometría UV-Vis

Aplicabilidad Este método es apropiado para determinación de acetominofeno (paracetamol) en orina, plasma y contenido gástrico Si la muestra es de suero o plasma: la recolección debe se después de 4 horas de posingesta, Antes de este tiempo la absorción no se ha completado .Antes del análisis, se debe desproteinizar la muestra. Si la muestra es de orina: En lo posible de recolección de 6 horas .cambios de pH por almacenamiento pueden alterar el resultado. Es necesario realizar hidrólisis ácida debido a que se elimina conjugado con glucuronido o sulfato. Contenido Gástrico: Antes del análisis, se debe desproteinizar la muestra Interferencias del mètodo: Los Salicilatos en concentraciones mayores a 40 mg/dL aumenta la intensidad del color del nitroderivado en una cantidad equivalente a 2mg/dl Otras interferencias: Epinefrina, Salicilamida, L-Dopa Materiales y Reactivos - Set de soluciones estandar de paracetamol - Ácido Tricloroaceticos (TCA) al 3% p/v

- Ácido Clorhídrico Concentrado - Solución de nitrito de sodio 0,07M

- Solución de NaOH 8M - Tubos de ensayo - Baño termosotatizado a 37ºC - Micro pipetas y puntas amarillas y azules

- Pipetas - Pro pipeta de goma - Guantes de latex

4. Procedimientos

a) Rotular lo tubos como blanco, estandar y muestra b) Para muestras de orina colocar en un tubo 0,5 ml de muestra y 0,5 ml de HCL,

hidrolizar en baño a 100ºC por 5 minutos. Para muestra de suero o contenido gástrico usar muestra directamente.

c) Colocar en cada tubo 2 ml de TCA y luego 200 µL de la muestra (o hidrolizado), blanco y estándar (respectivamente)

d) Agitar para homogenizar y centrifugar. e) Tomar 1,6 ml de cada tubo y traspasarlo a un tubo limpio y seco f) Agregar 0,4 ml de nitrito de sodio y homogeneizar g) Incubar a 37ºC por 10 minutos h) Retirar del baño y agregar 1 gota de NaOH i) Leer absorbancia a 430 nm j) Corregir absorbancia con blanco reactivo

5. Cálculos Los resultados deben expresarse en ug/ml Valores de referencia (Plasma)

Rango terapéutico 20-25 ug/ml Rango toxico 200-400 ug/ml cuatro horas post ingesta Nivel letal 1500 ug/ml

Registro de resultados Metodo Espectrofotomètrico Determinaciòn de Paracetamol

Curva de Calibración

Concentración (mg/dl) Absorbancia

Concentración (mg/dl) Absorbancia

Blanco = 0

Muestra =

Muestra =

6. Referencias bibliográficas

* Flanagan, R,J, Braithwaite, R,A Basic Analitica Toxicologìa, WHO 1995 * Pesce, Kaplan, L Methods in Clinical Chemmistry MOSBY 1987


LABORATORIO N°3 :

DROGAS DE ABUSO: SCREENING INMUNOQUIMICOS, EXTRACCIÓN BENZOFENONAS E IDENTIFICACIÓN CON TLC, y CUANTIFICACIÓN DE ALCOHOL EN SANGRE

El test Inmunoquìmico de un solo paso, emplea una técnica de inmunoanalisis de flujo lateral y sirve para la detección cualitativa de una droga, de alguno de sus metabolitos o varios de ellos, en orina de humanos. Durante el análisis la droga contenida en la orina muestra, compite con el conjugado de la droga (droga marcada químicamente, que fue impregnada e la membrana de reacción), por los sitios limitados del anticuerpo que consiste en un anti analito-monoclonal coloreado oro coloidal colocado al extremo derecho de la membrana:

En la zona T, La mezcla se mueve hacia arriba por capilaridad y al pasar por la zona del conjugado de drogas forma una línea visible entre el anticuerpo complejado y el conjugado. Por lo tanto para un resultado negativo, se formara en la membrana una banda coloreada de precipitación entre el conjugado coloreado y anticuerpo complejo anti metabolito. La ausencia de banda coloreada en la región test sugiere un resultado positivo, pues la droga contenida en la orina al estar en mayor cantidad que el conjugado lo desplazara de la reacción y ocupara los sitios del anticuerpo, sin dar color. En cambio, la banda de control C debe aparecer siempre coloreada tanto para un test negativo como para un positivo Procedimiento:

Llevar las muestra a temperatura ambiente. Si la orina se presenta turbia, centrifugar una alícuota para realizar el test con muestras claras

Dispensar 4 gotas de la muestra de orina clara (con el gotario incluido en el envoltorio)

en el posillo de muestra (S) del cassette.

esperar 10 minutos (no mas allá) e interpretar los resultados Interpretación de los resultados Negativo: Se observan 2 bandas de color rosado en las ventanas de lecturas: una marca en la zona C (control) y otra en la zona T (test), la cual puede ser mas o menos intensa que la del control. Este resultado se interpreta como “No se detecta” Positivo: Aparece una sola banda de color rosado en la zona C (control).Además esto significa una correcta ejecución de la técnica. Este resultado se interpreta “Se detecta” Error. Si no aparece ninguna banda de color, el test debe considerarse nulo, ya sea por error o por deterioro del mismo. En este caso el ensayo debe repetirse Limitaciones: Este lanálisis fue diseñado para trabajar con orinas humanas solamente


Un resultado positivo indica la presencia de la droga o un metabolito, pero no el grado de intoxicación

Existe una posibilidad de que el mal procedimiento u otras sustancias puedan interferir con el análisis y producir resultados falsos.

Tabla de especificaciones de sensibilidad de los Test Inmunoquìmicos en placa, para Drogas de Abuso y Farmacos

Analito Sensibilidad

Anfetamina Desde 300 ng/ml de Anfetamina y sus metabolitos

Benzodiazepinas Desde 300 ng/ml de Benzodiazepinas y sus metabolitos

Benzoilecgonina (Cocaina) Desde 150 ng/ml de Benzoilecgonina

Marihuana Desde 50 ng/ml de acido11-nor ∆-tetrahidrocarabinol-9-carboxilo

Metaanfetaminas Desde 500 ng/ml de metanfetamina y sus metabolitos

Desde 300 ng/ml de Opiaceos y sus metabolitos o sus análogos Los valores referenciados en la tabla, dependen de cada proveedor de los test.

CANNABIS, Principal metabolito D-9 tetrahidrocannabinol (THC). Los test de screening en orina (inmunoensayos) pueden detectar metabolitos de THC en los consumidores esporádicos hasta 2 – 5 días después de fumar (en algunos casos incluso hasta 10 días). En los consumidores habituales el test puede ser positivo hasta 3 – 4 semanas de abstinencia. Debido a las fluctuaciones en la excreción de THC por el organismo, el test puede variar entre valores positivos a negativos cuando se realizan medidas seriadas durante el periodo de abstinencia. Esto puede provocar un error en la interpretación y confundirse con una reincidencia en el consumo. En teoría, existe la posibilidad de obtener un resultado positivo por la inhalación de cannabis (personas que frecuentan ambientes de fumadores de marihuana). En la práctica esto es muy poco probable ya que las concentraciones de metabolitos del cannabis en orina en los fumadores pasivos suelen estar muy por debajo del valor umbral establecido para la positividad.

COCAÍNA, Principales metabolitos urinarios: benzoilecgonina y ecgonina metil éster. La mayoría de los inmunoensayos detectan benzoilecgonina. Estos test pueden ser positivos de 1 – 5 días después del consumo. En los consumidores crónicos el período de detección puede extenderse hasta 10 – 22 días después de la última dosis. Posibles falsos positivos: medicamentos que contengan lidocaína u otros anestésicos locales, bebidas que contengan productos derivados de la coca. Las pruebas confirmatorias (Cromatografía de gases/espectrometría de masas) identifican ecgonina metil éster, cocaína y benzoilecgonina. La cocaína puede ser identificada en orina por métodos cromatográficos sólo de 8 – 12 h después del uso y de 4 – 5 días en los crónicos.

OPIÁCEOS Metabolismo: Heroína 6-acetil morfina Morfina + Morfina glucurónido y Codeína Morfina + Morfina glucurónido

Los inmunoensayos detectan principalmente morfina y codeína. El periodo de detección es de 1 a 5 días después de la dosis. Posibles falsos positivos: medicamentos que contengan morfina, codeína y otros opiáceos (oxicodona, levopharnol, hidrocodona); alimentos que contengan derivados de la amapola. La metadona, la nolaxona y la fenciclidina no darán positivo en esta prueba. Para detectar la metadona y la fenciclidina existen pruebas específicas. Tras el consumo de codeína, una pequeña cantidad (10%) se convierte en morfina, por lo tanto ambos son detectados en orina por técnicas cromatográficas tras el consumo de codeína. Tras el consumo de heroína, en orina aparece morfina y 6-acetil morfina.

ANFETAMINA, Los inmunoensayos para la anfetamina y la metanfetamina pueden presentar reacciones cruzadas con otras aminas simpático miméticas tales como la efedrina, seudoefedrina, fenilpropanolamina. El período de detección tras el consumo es de 2 a 4 días. Los resultados positivos deben ser confirmados por un método definitivo (cromatografía de gases/espectrometría de masas). La MDMA (metilendioximetanfétamina) conocido como "éxtasis" dará positivo, aunque existe una prueba específica para determinarla.


Registro de resultados Test Inmunoquimico (Test Pack)

Analito Resultado

Cocaina

Benzodiazepinas

Marihuana

Si el resultado del test inmunoquímico realizado en su muestra problema arrojó: “se detecta benzodiacepinas o sus metabolitos”, proceda a realizar la siguiente actividad práctica.

Identificación de Benzodiazepinas mediante Cromatografía en Capa Fina, previa extracción líquido-líquido de Benzofenonas en una matriz biológica.

Procedimiento: Hidrólisis Ácida

Antes de empezar debe disponer de un baño de agua hirviendo

Tomar 5ml de muestra (o llevarla a 5ml con agua destilada)

Agregar 1,5 ml de HCL concentrado, Hidrolizar por media hora en baño de agua hirviendo (sin interrumpir en ningún momento, y la Tª debe ser siempre igual)

Luego de la media hora de hidròlisis, retirar el tubo del baño. Una vez el tubo este frío llevar a embudo de decantación, agregar 5ml de cloroformo y extraer con agitación manual.

Recuperar la fase orgánica en tubo Kahn Reconstruir en una gota de metanol y sembrar en placa cromatográfica

Desarrollar en cámara saturada con vapores de una mezcla de BENCENO: CLOROFORMO 3:1

Para revelara la placa una vez seca y ya observada al UV, preparar 4 ml de una mezcla de nitrito de sodio al 0,007M y HCL al 10% en proporción de 1:1 (2ml de cada uno) poner sobre la laca y dejar reposara 10 min. .

Agregar 4 ml de una solución acuosa de N- (Naftil) etilendiamina bicloruro. Secar y luego observar los colores

Establecer los Rf encontrados y compararlos con los Rf señalados en la tabla para Benzofenonas. Cualquier estandar utilizado debe ser hidrolizado de igual forma que la muestra

Cuántificación de Alcohol en sangre mediante Determinación por Microdifusión y

lectura por espectrofotometría a 450 nm. Alcohol

Dentro de los tóxicos volátiles, los alcoholes Etanol y Metanol son sustancias de importancia toxicológica dada su acción farmacológica depresora del sistema nervioso central (SNC) y el abuso creciente del consumo de bebidas alcohólicas. Las vías de penetración posibles de los alcoholes son la digestiva, la respiratoria y la absorción a través de la piel.


.

Las intoxicaciones agudas con etanol son el resultado de la ingestión de bebidas

alcohólicas.

También ocurren intoxicaciones con alcohol industrial conteniendo varias sustancias

desnaturalizantes como por ejemplo el metanol. Alcoholemia es la concentración de alcohol en sangre, expresado en gramos por mil. El alcohol posee una cinética de orden cero, cuya velocidad de eliminación para todo efecto legal es 0.1 gramos por mil, por cada hora transcurrida. En Chile la Ley 20.580 establece límites legales en razón a los valores de alcohol en sangre:

Bajo la influencia del alcohol: 0.31 a 0.79 gramos por mil En estado de ebriedad: mayor a 0.8 gramos por mil

Determinación por el método de winnick El método se basa en una reacción óxido reducción del etanol con dicromato de potasio en medio ácido, el producto final de la reacción es un compuesto coloreado el cual puede ser determinado espectrofotométricamente. La liberación del etanol de la muestra se basa en la volatilidad del etanol y la reacción con el dicromato de potasio, la cual ocurre en la cámara de difusión Conway. La cuantificación se realiza por medida espectrofotométrica a 450 nm. Cálculos: mg de volátiles reductores/ 100 mL = (abs del blanco – abs de la muestra) x F F= concentración del estándar/ (abs del blanco –abs del estándar) También puede realizar una curva de calibración midiendo la absorbancia de testigos de concentración conocida de etanol. Procedimientos:

1. Disponer de la celda de Conway dentro de la cápsula de Petri

2. Colocar 1,0 mL de la solución de Dicromato de Potasio dentro de la celda Conway

3. Fuera de la celda de conway colocar 1.0 mL de solución saturada de carbonato de

potasio.

4. Adicionar 1,0 mL del estándar uno, 1,0 mL del estándar dos y 1,0 mL de la muestra

problema. No olvidar realizar un blanco.

5. Cerrar el sistema y dejar incubando por una hora, a temperatura ambiente

6. Una vez cumplido el tiempo de difusión, trasvasar el contenido del

compartimento interno en forma cuantitativa (enjuagando el compartimiento

con pequeños volúmenes de agua destilada varias veces) a un tubo

graduado de 10 ml de capacidad. Llevar a 10 ml con agua, mezclar por inversión.


7. Preparar un blanco en tubo graduado de 10 ml, colocando 2 ml de solución

sulfúrica de dicromato de potasio y llevar a 10 ml con agua. Mezclar por

inversión.

8. Leer en espectrofotómetro a 450 nm llevando a cero con agua destilada

LABORATORIO N 4:

CONTAMINANTES AMBIENTALES : Cuantificación de CO, delta Ala y porfirinas.

El monóxido de carbono (CO) es un gas incoloro, inodoro e insípido. Se produce durante la combustión incompleta de materia orgánica. Las fuentes más frecuentes de producción de este gas son: tubos de escape de automóviles, calefacciones de fuel-oil, madera, lana, algodón, papel, aceites y gasolina, entre otras. Es por ello que la máxima incidencia de intoxicación por CO se produzca durante los meses de invierno. El monóxido de carbono ingresa por la vía respiratoria, una vez en la sangre, el CO se une fuertemente a la hemoglobina, cuya afinidad es unas 200-300 veces superior a la afinidad que tiene por el oxígeno, formándose carboxihemoglobina (COHb), la cual no tiene capacidad para transportar oxígeno Esta situación conlleva una disminución del transporte de oxígeno a los tejidos. El Monóxido de carbono también tiene la capacidad de unirse a la mioglobina. La cuantificación de Carboxihemoglobina se realiza para diagnosticar intoxicación con monóxido de carbono. Los niveles de carboxihemoglobina contribuyen al diagnóstico, ya que es imprescindible que sus niveles se encuentren elevados por sobre el 10%. En la población general, los niveles de carboxihemoglobina oscilan entre un 2-3% en no fumadores, y un 5-8% en fumadores, aunque en grandes fumadores se han llegado a detectar niveles de hasta el 15% sin clínica alguna. la intoxicación por CO va a presentarse generalmente con una clínica inespecífica, como cefalea, náuseas, vómitos, mareo, somnolencia y desorientación. Cabe señalar que la piel de aspecto rojo cereza que clásicamente se suele describir en estos pacientes, y que se debe al color de la carboxihemoglobina, no es tan frecuente verla en la clínica como signo de esta intoxicación. La forma más frecuente de presentación es la de un paciente consciente, agitado, desorientado, confuso y no cooperante. Habitualmente, la causa última del fallecimiento suele ser la insuficiencia cardíaca que se produce a consecuencia de la hipoxia miocárdica. Niveles de Carboxihemoglobina en relación a sus síntomas

0 a 10% Asintomático, angina en pacientes coronarios, irritabilidad, apnea en niños pequeños

10 a 20% Cefalea, disnea, disminución de la capacidad intelectual

20 a 30% Cefalea, Inestabilidad emociona, irritabilidad, fatiga, disminución del juicio

30 a 40% Cefalea, náuseas, vómitos, confusión disminución de la agudeza visual, coloración rosada de la piel y mucosas (no siempre)

40 a 50% Aumenta la confusión, ataxia, disnea, taquicardia

50 a 60% Síncope, convulsiones, taquicardia

60 a 70% Compromiso de conciencia, convulsiones, paro cardiorespiratorio

70 a 80% muerte

http://www.clinicadam.com/salud/5/002804.html

http://www.clinicadam.com/salud/5/002804.html


Principio del método: se basa en la distinta localización de los máximos y mínimo de absorción de las bandas correspondientes a los espectros de absorción de la oxihemoglobina. Haciendo 2 lecturas (una corresponde al máximo y la otra al mínimo) y calculando el cuociente de absorbancia a 541nm y 555nm se obtienen valores que siguen con gran exactitud las diferencias de los correspondientes coeficientes de intoxicación. Se realizan dos lecturas, una a541 nm y la otra a 555 nm. El valor del cuociente entre estas absorbancias indica indirectamente el porcentaje de carboxihemoglobina en sangre. Aplicabilidad: muestra de sangre entera (total) en tubo heparinizado Reactivos:

1. Amoniaco al 0,4% 2. Ditionito de sodio

Procedimiento:

a) tomar 25 uL de sangre total y diluirla en 5 mL de amoniaco al 0,4% b) Tapar el tubo con parafilm, homogenizar y dejarlo reposar por 10 minutos c) Traspasar a tubos limpios, 2 mL del homogenizado d) Agregar a cada tubo 10 mg de ditionito de sodio (previamente pesado), cubrir con

parafilm y agitar suavemente por inversión (10 veces) e) Leer absorbancia a 541 nm y 555 nm, utilizando amoniaco al 0,4% como blanco

reactivo f) Calcular el porcentaje de saturación

Calculo del porcentaje de saturación:

R = A 550nm A 480 nm

Con el valor de R, interpolar el valor de %S en la siguiente tabla

R % Saturación R % Saturación R % Saturación

3,15 0 2,60 35 2,21 70

3,05 5 2,53 40 2,16 75

2,97 10 2,47 45 2,11 80

2,89 15 2,41 50 2,07 85

2,81 20 2,36 55 2,02 90

2,74 25 2,31 60 1,98 95

2,67 30 2,26 65 1,93 100

Valores de referencia:

No fumadores hasta 1,5 % Fumadores activos hasta 2,5 % Fumadores con exposición a otras fuentes hasta 5%

Cuantificación de la gravedad Leve : mayor de 5% y hasta 15% Moderada : 15 a 35% Severa : mayor a 35%

Determinación de Acido Deltaamino Levulínico (Δ-ALA) en orina El ácido delta amino levulínico en orina es utilizado como indicador biológico de intoxicación Plúmbica. El plomo es capaz de alterar la actividad de enzimas involucradas en la biosíntesis


de la hemoglobina (delta amino levulínico deshidrogenasa citoplasmática). El bloqueo de estos mecanismos enzimáticos producen acumulación de intermediarios que se excretan en forma amentada en orina = Δ-ALA. Fundamento del método: Se basa en la formación de un compuesto pirrólico, producto de la reacción de Δ-ALA con acetilacetona a pH 0 4,6 para luego reaccionar con p-dimetilaminobenzaldehído, generando un compuesto de coloración rosado que es capaz de absorber a 553nm. Aplicabilidad: muestra de orina de recolección (24 horas) Reactivos:

a) Acetato de Sodio 0,5 M b) Acetilacetona c) Buffer Acetato pH = 4,6 d) Reactivo de Erhlich

Procedimiento: 1. Rotular los tubos (blanco, estándar, muestra) 2. Colocar dentro de cada tubo de tapa rosca 7 mL de acetato de sodio 0,5M y

adicionar 1 mL de blanco, estándar y muestra respectivamente 3. Agregar a cada tuno 200uL de Acetilacetona y aforar a 10 mL con buffer acetato pH

= 4,6 4. Tapar los tubos, homogenizar y colocar a baño de agua hirviendo por 10 minutos.

Retirar y dejar enfriar a temperatura ambiente 5. Mezclar 2 mL de cada tubo con Reactivo de Erhlich, agitar para homogenizar y dejar

reposar por 15 minutos a temperatura ambiente. 6. Leer absorbancia a 553 nm

Cálculos: Se puede determinar la concentración de Δ-ALA presente en la orina de recolección confeccionando una curva de calibración, o bien mediante la siguiente expresión (si se usa un solo estándar) Δ-ALA = Absorbancia de la muestra X Concentración del estándar (mg/dL)

Absorbancia del estándar

Valores de referencia: Δ-ALA adultos = 0,1 a 0,57 mg/dL (1,5 a 7,5 mg/24 horas)

Determinación de Porfirinas urinarias


Las porfirinas son compuestos cíclicos complejos, presentes en la orina, heces y eritrocitos cuando existen algunas enfermedades genéticas denominadas Porfirias y en casos de intoxicación por Plomo.

Núcleo base de las Porfirinas Aplicabilidad: Muestras de orina de recolección (24 horas) Reactivos:

a) Solución saturada de Cloruro de Bario b) Acido clorhídrico 1,5 M

Procedimiento: 1. Disponer en cada tubo de ensayo 1,5 mL de Cloruro de Bario 2. Agregar 2,5 mL de muestra de orina y en otro tubo 2,5 mL de HCl como blanco reactivo 3. agitar, centrifugar y descartar el sobrenadante 4. Resuspender el precipitado en 5 mL de HCl 1,5 M 5. Agitar, centrifugar y transferir el sobrenadante a un tubo limpio 6. Leer en espectrofotómetro a 405 nm y registrar la absorbancia, luego leer a 505 nm

.multiplicar por 2 ambas lecturas de absorbancias Cálculos Uroporfobilinogeno = {(absorbancia a 405 * 2)-(Absorbancia 505*2)}380 = ug/L Valores de referencia: Uroporfobilinogeno = menor a 50 ug/L


Laboratorio N° 5

Investigación criminalística y forense en delitos sexuales

I. Prueba presuntiva

Detección de fosfatasa ácida prostática, utilizando el método de Sivaran y Bami

(Identification of Seminal Stains by the Inhibition of Acid phosphatase by L(+) Tartrate.

S. SIVARAM and H. L. BAMI. Central Forensic Science Laboratory, CBI, New Delhi,

India):

Mecanismo de detección:

El método permite diferenciar la fosfatasa ácida prostática de otra con un origen

diferente mediante la inhibición de esta, en forma especifica por el reactivo L (+)

Tartrato.

Reacción química enzimática:

Se le denomina fosfatasa ácida a cualquier enzima capaz de hidrolizar un fosfato

orgánico en un medio ácido en particular. Se llama fosfatasa ácida prostática a la

existente en el plasma seminal, que produce la hidrólisis, por ejemplo sobre el fenil

fosfato.

La fosfatasa ácida actúa aun pH= 4.9 determinado por las condiciones de trabajo de

este método.

Inhibición de la enzima fosfatasa ácido prostática:

El fundamento para la inhibición de la enzima fosfatasa ácida prostática por el efecto

del L (+) Tartrato, se debe a que el grupo hidroxilo del C3 es atacado para formar dos

enlaces cruciales con Arg-79 e His-257.

Estudios cristalográficos previos recopilados sobre el complejo binario de fosfatasa

ácida prostática de ratas con le Tartrato, han posicionado erróneamente el D-Tartrato

dentro del sitio activo.

Estudios de modelos han demostrado que el grupo hidroxilo del C3 del estéreo- isómero

D (-) del Tartrato, no inhibe significativamente a la fosfatasa ácida prostática y no forma

fuertes enlaces de hidrógeno con Arg-79 e His-257.


La estructura de la fosfatasa ácida prostática humana, ligada no covalentemente al n-

propil-L-Tartrato, es usado para desarrollar inhibiciones con alta especificidad y

potencia frente al L (+) Tartrato.

Es sabido que las enzimas comúnmente se unen al sustrato mediante interacciones de

Van Der Waals y electrostáticas, por enlaces de hidrógeno ó más raramente por

formación de enlace covalente. Es así como el complejo binario no covalente enzima-

fosfato inorgánico se forma vía mecanismo SN2.

La inhibición de la enzima en cuestión por el L (+) Tartrato es por una propiedad óptica

estereoespecifica, por que el D (-) Tartrato y el distereómero meso Tartrato son

solamente inhibidores muy pobres.

En nuestro caso, al ser inhibida la enzima por el L (+) Tartrato, ella no puede hidrolizar

el fenilfosfato y por lo tanto, en la etapa final de la reacción al adicionar el reactivo de

Folin-Ciocolteau no se tendrá la característica coloración azul, puesto que no existirá

fenol en el medio, ya que este no sería liberado.

El reactivo de Folin-Ciocolteau, en su preparación se necesitan los siguientes reactivos:

Tungstato de sodio, molibdato de sodio, ácido fosfórico concentrado, ácido clorhídrico

concentrado, sulfato de Litio y Bromo elemental.

De tal manera, que en solución coexisten dos estructuras del ácido fosfotúngstico-

fosfomolibdico ó también denominado como las sales liticas del ácido fosfomolibdo-

túngstico.

Procedimiento:

1. Cortar un pedazo pequeño de prenda en lugares donde se observe

fluorescencia (6x6mm aprox.) o coloración amarillenta.

2. Cortar cada muestra que se extraiga en dos partes.

3. Depositar una parte de la muestra en un tubo eppendorf que contenga

solución PBS (buffer sustrato).

4. Depositar el resto de la muestra en un tubo eppendorf que contenga

sustrato para prueba de la fosfatasa ácida.


Muestra con PBS:

5. Dejar reposar durante 1 hora.

6. Centrifugar.

7. Someter la muestra a prueba Sivaram y Bami como se indica más adelante

8. Preparar un frotis como se indica más adelante

9. Realizar tinción como se indica más adelante

MÉTODO SIVARAM Y BAMI

Materiales y reactivos

Gotario.

Tubos eppendorf de 500µL

Micropipeta de 200µL.

Reactivos para Sivaram

Equipos

Baño termoregulado.

Procedimiento

1. Tomar el sobrenadante del centrifugado agregando 150µL a dos tubos

eppendorf.

2. Incubar por 30 minutos a 37ºC.

3. Agregar 3 gotas de reactivo de Sivaram con inhibidor a un tubo con muestra y 3

gotas de reactivo de Sivaram sin inhibidor al otro tubo.

4. Tapar y agitar suavemente.

5. Observar coloración de ambas muestras.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

1. Si ambos tubos poseen la misma intensidad de color o son incoloros, el

resultado es negativo para fosfatasa ácida prostática.

2. Si existe una gran diferencia en coloración (sin inhibidor de color azul intenso y

con inhibidor incolora), el resultado es positivo para fosfatasa ácida prostática.

MÉTODO ENZIMÁTICO DE LA FOSFATA ÁCIDA


Gotario.

Reactivo de folin

Solución de carbonato de sodio


Equipos

Baño termo regulado.

Procedimiento

1. Luego de incubar la muestra, agregar 2 gotas de reactivo de folin.

2. Inmediatamente agregar 3 gotas de carbonato de sodio.

Interpretación de resultados

Si se observa un cambio de coloración a un azul intenso, el resultado es

positivo para enzima fosfatasa ácida.

Si no existe coloración, el resultado es negativo para el enzima fosfatasa ácida.

II. Prueba de certeza

Preparación de frotis para tinción, identificación de espermatozoides


Cubreobjetos.


Eukitt.

Fijador etanol-eter-formalina 10:10:1.

Gotario.

Materiales y reactivos para tinción

Micropipeta de 1000µL.

Tubos eppendorf de 1.5mL.

Portaobjetos.

Puntas para micropipeta.

Equipos

Placa calefactora.

Microscopio objetivo 40X

Procedimiento

1. Eliminar el sobrenadante del centrifugado con PBS, tomar el pellet y

traspasarlo a un portaobjeto y distribuirlo por todo el espacio dispuesto,

teniendo cuidado de que sea suficiente para observarlo pero no demasiado

concentrado.

2. Dejar secar en placa calefactora a 56ºC.

3. Fijar la muestra agregando etanol-eter-formalina 10:10:1 cubriendo toda la

muestra.

4. Dejar secar en placa calefactora a 56ºC,

5. Teñir a con solución Tinción árbol de navidad.

6. Montaje

Luego de la tinción, secar portaobjeto en placa calefactora a 56ºC.

Agregar gotas de Eukitt de tal forma de cubrir toda la muestra.

Poner un cubreobjeto sobre la muestra teniendo cuidado de no dejar

aire dentro.

7. Observar al microscopio sin inmersión a 40X.

Guia Trabajos Practicos Toxicologia Agosto 2015 (1)

Documents