UNIVERSIDAD DE CORDOBA
INDICE
Pg.
I.CUIDADOS EN EL LABORATORIO02
II.AMINOCIDOS Y PROTEINAS04
01.Titulacin potencio mtrica de los aminocidos04
02.Separacin e identificacin de aminocidos por
electroforesis09
03.Separacin de aminocidos por cromatografa13
04. Determinacin del punto iz elctrico de una protena17
05.Protenas: separacin y caracterizacin20
06.Dosificacin de protenas de la leche por el mtodo
fotocolorimtrico del Biuret23
07.Ensayos con protenas29
III.ENZIMAS30
08.Enzimas: amilasa salival30
09.Estudio de la polifenoloxidasa (ppo) extrada de la papa33
10.Enzimas y su desempeo en los alimentos (CHO)37
IV.CARBOHIDRATOS39
11.Identificacin de carbohidratos39
12.Polisacrido - aislamiento e hidrlisis44
V.LPIDOS46
13.Qumica de los lpidos46
14.Determinacin del valor de acidez de una grasa51
15.Extraccin y caracterizacin de lpidos54
VI.BIBLIOGRAFA56
I - CUIDADOS EN EL LABORATORIO
1. Ejecucin de los trabajos prcticos
Realizar todas las prcticas con atencin, rigor tcnico y
disciplina.
La falta de observacin de cualquiera de los requisitos tcnicos
puede llevar a errores que invalidan, parcial o totalmente, el
trabajo realizado, sin llevar en cuenta el desperdicio de material,
reactivos y tiempo.
Para que el alumno alcance la eficiencia deseada es necesario
que el mismo sea puntual, asista los laboratorios, ordenado, aseado
y tenga conocimiento previo del trabajo a ser ejecutado.
Ser exigido de los estudiantes el mximo de cuidado con su local
de trabajo y con el respectivo material.
Terminada la prctica, el estudiante deber proceder a la limpieza
de su local y material, dejndolo completamente limpios y en
condiciones de ser nuevamente utilizado.
Colocar sobre el mesn solamente el material estrictamente
necesario como lpiz, borrador, lapicero, regla, gua de laboratorio.
Dejar los bolsos y otros objetos fuera del mesn donde ser realizado
el trabajo prctico.
No gastar soluciones intilmente. Retirar solamente la cantidad
que va a necesitar.
No realizar experiencias "extras" en el laboratorio a ttulo de
curiosidad. Los "juegos" pueden llevar a riesgos inesperados.
2. Prevencin de accidentes
Todo laboratorio qumico es normalmente sitio de accidentes, la
mayora de pequea importancia, pero algunos de graves consecuencias,
causados por descuido o falta de atencin en el trabajo. En el
sentido de prevencin de accidentes desnecesarios, se recomienda la
observacin rigurosa de las precauciones indicadas a seguir:
Trabajar siempre protegido por la bata.
No fumar dentro del laboratorio.
Al prender el mechero, tener el cuidado de no abrir la llave del
gas antes de que tenga a la mano la llama que debe prender el
gas.
No trabajar con sustancias inflamables (alcohol, ter) en las
proximidades de la llama.
Jams calentar un sistema completamente encerrado.
Es peligroso calentar o mezclar cualquier especie de reactivos
prximo al rostro.
Mantener el rostro tan lejos posible durante las operaciones de
calentamiento o de mezcla de reactivos.
Evitar montajes no estables de aparatos, como: soporte de
libros, lpiz, caja de fsforos, etc.
No degustar nada en el laboratorio, excepto sea especialmente
orientado para hacerlo.
Al verter un lquido del frasco, evitar que escurra en el
respectivo rtulo, debiendo protegerlo debidamente.
Los reactivos txicos o corrosivos, como lcalis o cidos, fuertes
(cuando muy concentrados), no debern ser medidos por pipetas pero
medidos en probetas o en algunos casos, en buretas, o con ayuda de
una pera.
Al transferir o manipular sustancias que desprendan humos
txicos, hacerlo en el interior de una campana extractora de gases o
entonces en un local con buena ventilacin.
cido sulfrico concentrado debe ser adicionado al agua y no lo
contrario.
Para calentar soluciones, nunca utilizar, como recipiente, un
frasco volumtrico.
En caso de dudas en la ejecucin de cualquier trabajo prctico,
buscar siempre el instructor.
II. AMINOACIDOS Y PROTEINAS
1.TITULACION POTENCIOMETRICA DE AMINOACIDOS
I. OBJETIVOS
- Construir con datos experimentales la curva de titulacin de un
aminocido.
- Establecer grficamente el punto ISOELECTRICO de los
aminocidos.
- Interpretar correctamente la curva de titulacin de los
aminocidos.
II. INTRODUCCION
Todos los organismos vivos contienen (- aminocidos, los cuales
comparten la misma columna estructural.
H
tomo de carbono- ( (
H3N+ ( C ( COO-
Grupo (- amino ( Grupo (- carboxlico
R
Se puede concluir que este tipo de estructura tiene 3
caractersticas comunes:
- Posee un grupo carboxilo (. La letra alfa indica que este
grupo est unido al tomo de carbono central o alfa.
- Posee un grupo alfa amino.
- Contiene una cadena lateral o grupo R, que est enlazada con el
carbono alfa.
Todos los aminocidos pueden clasificarse como cidos, neutros o
bsicos, segn sea la carga del grupo R a pH = 7.
Los grupos R cidos son portadores de una carga negativa a pH = 7
porque son poderosos dadores. Los 2 alfa aminocidos cidos son el
asprtico y el glutmico.
Los grupos R, bsicos llevan una carga positiva a pH = 7 porque
reciben protones. Los 3 alfa aminocidos bsicos comunes son la
lisina, arginina e histidina.
Los aminocidos tienen un marcado carcter anftero debido a la
coexistencia en una misma molcula de grupos cidos y bsicos que se
pueden disociar dependiendo del pH.
En solucin cida, los aminocidos se encuentran en la forma con
carga neta positiva, y en la solucin alcalina en la forma con carga
neta negativa segn lo muestra la figura 1.
H H ((((((( H
( ( (
H ( C ( COOH R ( C ( COO- OH- OH- R ( C ( COO- ( ( ((((((( (
NH2 NH3+ NH2
Forma no disociada In doble Forma cida
( predomina en medio bsico)
H
( R ( C ( COOH
(
NH3+
Forma bsica
( predomina en medio cido)
Figura 1
A pH comprendido entre los 2 pKa, el aminocido se encuentra en
la forma de zwitterion o de un in doble que es la forma en que
cristaliza y la que se obtiene al disolverlo.
Cuando se titulan los aminocidos con NaOH y HCl puede observarse
dos mesetas cuyos valores corresponden a los pKa de los grupos alfa
carboxilo y alfa amino respectivamente, segn figura 2.
El punto de inflexin en esa figura corresponde al punto
isoelctrico del aminocido, pH al que las especies no aportan carga
neta y por lo tanto, no migra en un campo elctrico.
Figura 2
pH 14 14 pH
7 7
0 0
10 5 0 5 10
meq HCl consumidos meq NaOH consumidos
Complete la siguiente grfica. Determine el pI del aminocido
representado.
14
13
12 pKa3 = 11,8
11
10
9
pH 8
7
6
5
4 pKa2 = 3,9
3
2
1 pKa1 = 2,1
0
10 20 40 60
Meq de NaOH 0,1 M
III. REACTIVOS
L- alanina 0,1 M
L- cido asprtico 0,1 M
L- arginina 0,1 M
L- glicina 0,1 M
Buffers estandarizados pH 3 y pH 9
IV. MATERIALES
Potencimetro
2 vasos de precipitados (50 y 100 ml)
1 agitador magntico
1 bureta (50 ml)
1 soporte de bureta
1 varilla de vidrio
V. MATERIAL DE PRUEBA
Soluciones de aminocidos
VI. PROCEDIMIENTO
1. Calibracin del potencimetro
Calibrar el potencimetro con dos soluciones estandarizadas.
2. Determinacin de un punto isoelctrico de un aminocido.
En un vaso de precipitados, medir 50 ml de una solucin de
aminocidos (alanina, arginina y asprtico). Medir el pH inicial del
aminocido.
Proceder a titular con HCl 0,1 M adicionando lentamente y
tomando el pH despus de cada adicin, hasta que se haya consumido ms
de 10 ml de cido.
Desechar el titulado, lavar el vaso y medir nuevamente 50 ml del
mismo aminocido y repetir el procedimiento con NaOH 0,1 M.
En el caso del cido asprtico se debe continuar adicionando NaOH
hasta que se hayan consumido ms de 20 ml de lcali.
Con los datos del pH frente al de los miliequivalentes (2ml = 1
mEq) de cido o base consumidos, hacer figuras en las que el pH se
grafique en las ordenadas y en las abcisas, los miliequivalentes de
cido (hacia la izquierda) y lcali (hacia la derecha) consumidos. A
partir de la figura, determinar el pH en el punto isoelctrico (pI)
y los valores de pK del aminocido con cido y con base.
VII. CONSULTA
a) Registrar en una tabla los resultados obtenidos.
b) Dibujar y determinar el pI del aminocido.
c) Determinar el pI de los aminocidos que aparecen en la tabla
No. 1.
TABLA 1
Aminocido pK1 pK2 pk3 Glicina 2,4 9,7 _
Alanina 2,3 9,9 _
Glutmico 2,2 4,3 9,7
Histidina 1,8 6,0 9,2
Treonina 2,6 10,4 _
Lisina 2,2 9,2 10,8
Asprtico 1,9 3,6 9,6
d) Determinar el pI de los siguientes aminocidos:
Valina
Triptfano
- Metionina
2. SEPARACION Y IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS POR
ELECTROFORESIS
I. INTRODUCCION
La electroforesis es una tcnica analtica de separacin
fundamentada en la migracin de partculas cargadas cuando sobre la
accin de un campo elctrico. Es una tcnica utilizada para la
separacin de mezclas de compuestos biolgicos, siendo muy eficiente
en la separacin de mezclas de aminocidos, pptidos o protenas.
Sistema bsico de electroforesis
soporte
+ nodo ctodo -
solucin tampn solucin tampn
Fuente de alimentacin (Amperagen/Voltagen)
Una diferencia de potencial es establecida entre dos cubas,
conteniendo solucin tampn, por la conexin de dos electrodos a una
fuente de alimentacin (amperagen/voltagen). El circuito es
completado por una tira de material poroso saturado con solucin
tampn (soporte) que tiene las extremidades sumergidas en cada cuba.
Compuestos cargados positivamente, en el pH de la solucin tampn
conocida irn migrar a travs del soporte para el ctodo (electrodo
negativo), compuestos cargados negativamente irn migrar para el
nodo (electrodo positivo) y compuestos elctricamente neutros
permanecern en el punto de aplicacin (origen). Estos movimientos
pueden ser influenciados por la intensidad de corriente elctrica,
por la carga lquida de las molculas, por la forma y tamao de las
molculas, y por electrosmosis (dependiendo del soporte). La carga
lquida de un aminocido en un dado pH es una funcin de los valores
de pK de sus grupos ionizables. En una solucin con pH que
corresponde al punto isoelctrico del aminocido (pH en el cual el
numero de cargas positivas se equivalen al numero de cargas
negativas) el aminocido se presenta elctricamente neutro y no hay
migracin en campo elctrico. El mismo comportamiento es presentado
por pptidos y protenas, donde todos los grupos ionizables de sus
radicales contribuyen para la carga total de la molcula.
Tipos de soportes ms usados en electroforesis de aminocidos y
protenas: papel de filtro, acetato de celulosa, gel de almidn y de
policriamida.
II. OBJETIVOS
Separar una mezcla de aminocidos e identificar los componentes
de la mezcla por comparacin con estndares.
Comprender sus propiedades inicas a travs del comportamiento
electrofortico de los aminocidos.
III. MATERIAL
Tampn de cido actico/acetato (pH 4,6)
Solucin de glicina, cido asprtico, arginina y mezcla de estos
aminocidos
Solucin de ninhidrina en acetona
Tiras de papel de filtro (2 x 15 cm)
Tubos capilares
Nebulizador
Estufa
Aparato de electroforesis
IV. PROCEDIMIENTO
Marcar el centro de la tira de papel con una lnea sombreada a
lpiz.
Identificar una extremidad como polo + y la otra como polo
-.
Escribir el nombre de la muestra a ser aplicada en una de las
extremidades del papel.
Ejemplo: tira de papel donde ser aplicada una solucin de
glicina
- Gly +
lnea de aplicacin de la muestra
Cuidado!! Evite tocar con los dedos el papel.
A seguir, aplicar la muestra (solucin de aminocidos) con ayuda
del tubo capilar, a lo largo de la lnea sombreada, buscando evitar
que la solucin de aminocidos se derrame en el papel.
Repetir la aplicacin por ms dos veces.
Ejemplo: rea de aplicacin de la muestra: mximo 0,5 cm de cada
lado de la lnea de cada lado de aplicacin segn esquema
- Gly +
lnea de aplicacin de la muestra
Dejar secar al aire.
Embeber la tira en solucin tampn retirando el exceso con papel
higinico.
Colocar la tira de papel en el aparato de electroforesis, siendo
que las extremidades de la tira deben permanecer mergulladas en la
solucin tampn contenida en las cubas.
Prender el aparato manteniendo el voltaje en 300V por hora.
Retirar el papel y llevar a la estufa hasta que est seca.
Pulverizar con solucin de ninhidrina (revelador de aminocidos)
la tira de papel.
Llevar nuevamente a la estufa.
Observar el surgimiento de lneas de color violeta evidenciando
la migracin de los aminocidos a lo largo de la tira de papel.
Despus de la revelacin, identificar los componentes de la mezcla
por comparacin con los estndares.
Explicar el comportamiento inico de cada aminocido en las
condiciones establecidas.
3. SEPARACION DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA
I. INTRODUCIONLa identificacin de sustancias orgnicas tiene
despertado el inters de los analistas en el sentido de aprimorar
tcnicas conocidas y desarrollar nuevos mtodos de anlisis cada vez
ms rpidos y eficientes.
La cromatografa es una tcnica de separacin de sustancias afines
que tuvo sus primeros ensayos hechos por el botnico ruso Tswett en
1900. An, solamente en 1906 que este investigador consigui la
separacin de pigmentos de hojas. La tcnica iniciada por Tswett para
la separacin de sustancias coloreadas (cromos - color) tambin es
vlida para sustancias incoloras, desde que haya un revelador. Este
invento qued 25 aos olvidado, cuando en 1931 dos otros
investigadores, Kuhn y Lederer, usando la tcnica de Tswett
conseguirn aislar el ( y (-caroteno de otros pigmentos
foliares.
La cromatografa tiene evolucionado desde entonces y hoy contamos
con diversas tcnicas tales como:
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa delgada
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin molecular
Cromatografa de fase gaseosa y lquida
Genricamente, podemos decir que los componentes de la mezcla son
distribuidos en dos fases, una estacionaria y otra mvil. La
separacin puede ser efectuada de tres modos:
Adsorcin: los componentes son diferencialmente retenidos en la
fase estacionaria por fuerza fsica superficial
Particin: los componentes son distribuidos entre un lquido
existente en el soporte slido (fase estacionaria) y otro en la fase
mvil.
Intercambio inico: cuando se forman interacciones inicas entre
la fase estacionaria y el compuesto que se desplaza con el solvente
(fase mvil).
La separacin es fundamentada en el coeficiente de particin entre
las dos fases (estacionaria y mvil). El coeficiente de particin (()
es definido como la relacin entre la concentracin del soluto en la
fase estacionaria y la concentracin del soluto en la fase mvil.
( S ( E
( = ( S ( M
En la cromatografa en papel y en capa delgada la distancia
recurrida por la muestra relacionada con la distancia recurrida por
el solvente, nos da origen a un factor llamado Rf, que es constante
para una sustancia en las mismas condiciones de trabajo.
Distancia recurrida por la muestra
Rf = -----------------------------------------------------------
Distancia recurrida por el solvente
Rf ( 1
II. CROMATOGRAFIA EN PAPEL
Es un tipo de cromatografa que se basa en la particin lquido /
lquido. El papel acta como soporte para la fase estacionaria lquida
(H2O del papel). El papel debe ser uniforme, o sea, sus fibras
distribuidas en el mismo sentido; ser puro, con ausencia de
sustancias no celulsicas, siendo que el mas usado es el Whatman no.
.
El solvente es escogido segn su polaridad. En orden creciente de
carcter polar tenemos: ter de petrleo, ciclo-hexano, benceno,
n-butano, n-propano, H2O y piridina. En general se trabaja con un
sistema de solventes que estn en proporciones definidas. La muestra
aplicada se distribuir de acuerdo su afinidad por el H2O del papel
(fase estacionaria) y el sistema de solvente (fase mvil).
La migracin de las sustancias podr ser ascendente donde
verificase actuacin de la fuerza de capilaridad, o descendente
donde acta la fuerza de gravedad. La migracin en una sola direccin
es denominada corrida unidireccional. Podemos tambin utilizar la
corrida bidireccional. El solvente desplaza primero en una
direccin, se seca el papel, se da en el mismo un giro de 90(,
colocndolo nuevamente en una cmara cromatogrfica con otro sistema
de solvente diferente del primero.
III. OBJETIVO
La presente tcnica tiene como objetivo capacitar al alumno a
ejecutar una corrida cromatogrfica en papel.
Calcular el Rf, interpretar el cromatograma e identificar las
muestras.
IV. MATERIAL
Papel de filtro (Whatman no. 1)
Muestra (solucin de aminocidos)
Soluciones estndar de aminocidos (0,1 M)
Solvente: mezclar en volmenes 100 partes de n-butanol, 30 partes
de cido frmico y 25 partes de agua.
Revelador: solucin de ninhidrina al 0,1% en acetona
Cmara cromatogrfica
Tubos capilares
Estufa a 100(C
Nebulizador
Nota: Evite tocar el papel con la mano.
V. PROCEDIMIENTO:
Cortar el papel con las dimensiones 15 x 15 cm.
Trazar con lpiz al largo de una de las extremidades a 2,5 cm de
las bordas.
Marcar puntos distintos con distancias adecuadas a lo largo de
la raya para aplicacin de la muestra y de los estndares.
Aplicar crculos de solucin de aminocidos de ( 0,5 cm de dimetro
usando tubos capilares.
Con auxilio de una grapadora dar la forma cilndrica al
papel.
Introducir el cilindro de papel en la cmara cromatogrfica,
teniendo el cuidado de no dejar el solvente tocar en las manchas
formadas en los puntos de aplicacin de las muestras.
Sellar la cmara y dejar que el solvente se desarrolle hasta ( 1
hora o hasta alcanzar 1 cm de la extremidad superior del papel.
Retirar el cilindro de papel y marcar con lpiz la altura
alcanzada por el solvente (frontera del solvente).
Dejar secar en estufa .
Revelar con ninhidrina al 0,1% en acetona y secar. Despus de
secado aparecern las manchas que sealan la presencia de los
aminocidos.
Identificar los aminocidos de la muestra por comparacin con los
estndares y calcular los Rfs.
Conclusin e interpretacin.
Nota: Evitar que la ninhidrina toque en su piel.
4. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE UNA PROTENA
I. OBJETIVO Hallar el punto isoelctrico de la casena.
II. TEORIA
Las unidades fundamentales de una protena son los aminocidos,
los cuales contienen en sus molculas grupo amino y grupo carboxilo;
por lo tanto tienen propiedades cidas y bsicas.
Los aminocidos de las protenas se pueden obtener por hidrlisis
cida o enzimtica. Estos aminocidos son fcilmente solubles en agua y
existen como iones bipolares conocidos como zwitterion, no como
molculas ionizadas.
Dependiendo del pH de la solucin, los aminocidos pueden tener
carga positiva, negativa o neutra; igual comportamiento tiene las
protenas.
Existe un pH en el cual los aminocidos y las protenas forman
especies sin carga; en este valor de acidez estas molculas no
migran en un campo elctrico, y este valor se le llama punto
isoelctrico o pH isoelctrico.
En el pH isoelctrico las protenas tienen la menor solubilidad,
conductividad, presin osmtica y la menor viscosidad.
III. REACTIVOS
- 0,25 g de casena
- NaOH 1N
- CH3COOH
IV. MATERIALES
- Vaso de precipitado de 100 ml.
- 4 buretas
- 9 tubos de ensayoV. PROCEDIMIENTOEn un vaso de 100ml limpio y
seco, pesar 0,25g de casena. Agregar luego con exactitud 20ml de
agua y 5 ml de NaOH 1N, agitar hasta obtener una disolucin total.
Adicionar 5ml de cido actico 1N. Determinar el punto isoelctrico de
una protena.
Pasar el contenido del beaker a un baln volumtrico de 50ml,
lavando las paredes del beaker con suficiente agua destilada y
llevando el volumen hasta la marca. Mezclar muy bien. La solucin
deber quedar clara y limpia, de lo contrario debe filtrarse o
repetir el procedimiento.
Preparar cuatro buretas de 25 ml y rotularlas as:
- Bureta No. 1, agua destilada
- Bureta No. 2, cido actico 0,1 N
- Bureta No. 3, cido actico 0,01 N
- Bureta No. 4, cido actico 1 N
Las soluciones 2 y 3 se preparan por dilucin a partir de la
solucin 1N.
Colocar en la gradilla los tubos de ensayo y preparar las
siguientes soluciones:
Tubo No.123456789
Agua destilada8,47,758,758,587517,4
Ac.actico ,01 N0,621,25-------
Ac.actico 0,1 N--0,250,51248-
Ac. actico 1 N--------1,6
pH resultante5,95,65,354,74,44,13,83,5
Agregar a cada tubo 1ml de la solucin de casena; agitar el tubo
inmediatamente y dejar reposar 20 minutos.
Usando la escala de cruces, anotar el grado de turbidez de cada
tubo; mirar el grado de precipitacin de cada tubo y anotar el pH al
que presenta mayor precipitacin. Este pH en el cual se dio la mayor
precipitacin, es el ms cercano al pI de la casena.
VI. PREGUNTAS
1. Cual fue el pI hallado por usted en el laboratorio para la
casena ?
2. Cul es el pI para la casena y en qu alimento(s) se encuentra
en forma abundante?
3. Un a.a. tiene los siguientes pK de acidez: 1,82 6 9,17
Seale si las informaciones son falsas o verdaderas, segn lo
anterior:
a. El aminocido es bsico
b. El pI del aminocido es 3,91
c. El pI del aminocido es 7,59
d. El aminocido es cido
e. A un pH de 5, el aminocido se desplazar a ctodo
f. El pI de la arginina debe ser: ( tenga en cuenta su
estructura )
- cerca de 7
- muy por debajo de 7
- muy por encima de 7
5. PROTENAS: SEPARACIN Y CARACTERIZACIN
I. INTRODUCCION
Diversas propiedades caractersticas de las protenas globulares
en solucin pueden ser utilizadas para separar mezclas de protenas
tales como peso molecular, solubilidad, carga elctrica, diferencias
en las caractersticas de adsorcin y afinidad biolgica por otras
molculas. En ese sentido, varios mtodos de separacin han sido
desarrollados como, por ejemplo, centrifugacin, dilisis,
precipitacin isoelctrica, fraccionamiento por solventes,
electroforesis, cromatografa de intercambio inico, filtracin glica
y otros.
Las protenas pueden ser clasificadas, de acuerdo con su
solubilidad en diversos solventes, en:
a) Albminas: protenas solubles en agua y soluciones salinas.
b) Globulinas: protenas ligeramente solubles en agua, solubles
en soluciones salinas diluidas.
c) Prolaminas: protenas insolubles en agua, pero solubles en
etanol 70-80%.
d) Glutelinas: protenas insolubles en agua y etanol, mas
solubles en cidos y bases.
e) Escleroprotenas: protenas insolubles en solventes
acuosos.
Segn esos criterios de solubilidad, se puede obtener
informaciones preliminares sobre las caractersticas de las protenas
de un material biolgico.
El efecto de la temperatura tambin se puede observar en relacin
a la solubilidad de protenas, siendo por lo tanto utilizado como
criterio de separacin. En temperaturas de 0 a 40(C, la solubilidad
de las protenas globulares aumenta progresivamente. En el rango de
40 a 50(C la mayora de las protenas se tornan inestables y empiezan
a desnaturalizar con prdida de la solubilidad. Entre 60 a 70(C las
protenas presentan desnaturalizacin. La desnaturalizacin consiste
en el desenrollamiento de la estructura nativa caracterstica de las
protenas globulares, pasando a una cadena doblada al acaso. La
estructura primaria se mantienen inalterada siendo rotas los
enlaces dbiles que estabilizan la estructura terciaria nativa de
una protena globular (puentes de H, atracciones electrostticas,
interacciones hidrfobas). La ocurrencia de estos fenmenos causa
cambios en las propiedades de las protenas como disminucin de la
solubilidad y prdida de la actividad biolgica. Entre los diversos
agentes desnaturalizantes se pueden citar variaciones bruscas del
pH, temperaturas elevadas, solventes orgnicos, radiaciones, urea,
sulfato de amonio, cloruro de guanidina, etc.
Una vez aislada la protena, ella puede ser caracterizada por una
secuencia de mtodos para evaluar sus propiedades, como, peso
molecular, composicin aminoacdica, y la secuencia de aminocidos en
la cadena, numero de cadenas peptdicas, etc.
La caracterizacin o el reconocimiento de la porcin protica en un
material biolgico puede ser hecha, sencillamente, a travs de
reacciones colorimtricas, como la reaccin del Biureto, reaccin
xantoprotica, etc.
II. TRABAJO PRCTICO
Separacin de las protenas de la clara del huevo por la
solubilidad en agua, identificacin de protenas por la reaccin
xantoprotica.
La clara del huevo esta constituida principalmente por protenas
(albminas y globulinas). La albmina de la clara del huevo es la
ovomucina. Agitndose la clara del huevo con agua se consigue
separar la ovalbumina (soluble en agua) de la ovomucina (poco
soluble en agua).
La reaccin xantoprotica ocurre cuando las protenas son
calentadas con cido ntrico concentrado, formando compuestos
amarillos. El cido ntrico reacciona con los compuestos bencnicos
formando nitroderivados de color amarillo. En las protenas tenemos
aminocidos con anillo bencnico sustituido como la tirosina, el
triptfano y la fenilalanina. La reaccin ocurre, por lo tanto, a
nivel de los radicales de aminocidos que contiene anillos aromticos
y que hacen parte de las cadenas peptdicas de la mayora de las
protenas. En medio alcalino la coloracin amarilla se intensifica
debido al comportamiento como indicador de los nitroderivados
formados. De esta manera, a travs de la reaccin xantoprotica, se
puede hacer el reconocimiento de la porcin proteica de un material
biolgico.
III. MATERIAL
Clara de huevo
Erlenmeyer de 250 ml
Probeta de 250 ml
Embudo
Papel filtro
Beacker de 250 ml
Bastn de vidrio
Pipetas de 2 ml
Tubos de ensayo
Goteros
cido ntrico concentrado
Hidrxido de sodio al 20%
Solucin de tirosinaIV. PROCEDIMIENTO
1. Tomar una clara de huevo en un beacker. Adicionar
aproximadamente 200 ml de agua destilada. Agitar con el bastn de
vidrio. Dejar en reposo por algunos minutos.
2. Filtrar un poco del sobrenadante; recoger el filtrado en un
erlenmeyer (solucin de ovoalbmina).
3. En un tubo de ensayo adicionar 2 ml de la solucin de
ovoalbmina y en seguida 5 gotas de HNO3 concentrado (cuidado: no
pipetear el cido ntrico). Observar y explicar los cambios cuando se
le adiciona cido a la protena.
4. Tomar un beaker con un poco de agua. Colocar el tubo en bao
mara y dejar hervir por 2 minutos. Observar y explicar los cambios
(reaccin xantoprotica).
5. Enfriar el material y, cuidadosamente, adicionar hidrxido de
sodio en exceso. Observar y explicar lo que ocurre.
6. Repetir el mismo test (a partir del tem 3) utilizando 2 ml de
solucin de tirosina. Apuntar y explicar los cambios observados.
6. DOSIFICACION DE PROTEINAS DE LA LECHE POR EL METODO
FOTOCOLORIMETRICO DEL BIURET
I. INTRODUCCON
La determinacin cuantitativa de protenas puede ser hecha a travs
de varios mtodos. La escogencia del mtodo depender de varios
factores tales como: la naturaleza de la protena y de otros
componentes en la muestra proteica, la rapidez, la eficiencia y
sensibilidad del mtodo. Entre los diversos mtodos se puede
citar:
a) Mtodo micro-kjeldahl
Escogido para dosificar protenas en alimentos y muestras clnicas
y agriculturas. Es tambin usado para estimar nitrgeno no proteico
de una muestra despus de la precipitacin de protenas. La muestra es
digerida con cido sulfrico concentrado en presencia de catalizador,
sob condiciones donde compuestos de nitrgeno son convertidos a
sulfato de amonio. Por destilacin a vapor en presencia de una base
fuerte (NaOH), el amonio es liberado y se puede estimar por varios
medios. En general case todas las protenas posee 16% de nitrgeno en
su composicin, o sea, 1 mg de nitrgeno corresponde a 6,25 mg de
protena. As, por la cantidad de amonio formado de una conocida
cantidad de muestra, se puede calcular la cantidad de protena
presente.
b) Mtodo de Lowry
Puede ser aplicado en material seco o en solucin. Es muy
sensible, dosifica 5 (g de protena. El color formado es debido a la
reaccin de la protena con el cobre alcalino del reactivo y a la
reduccin de las sales fosfomolibdato-fosfotungstato en el reactivo
por los aminocidos aromticos de la protena (Tyr y Trp). El color
producido es medido en el foto colormetro siendo proporcional a la
cantidad de protena en la muestra.
c) Mtodo de la Absorcin en el Ultravioleta
Muchas protenas absorben en el ultravioleta en la regin de 280
(m debido a la presencia de tirosina y triptfano. Como la cantidad
de esos dos aminocidos es generalmente constante en muchas
protenas, se puede estimar la concentracin de las protenas como
siendo proporcional a la absorbancia a 280 (m. Soluciones puras de
protenas conteniendo 1 mg de protena/ml presentan absorbancia en
280 (m igual a 1,0 cuando en cubetas de dimetro de 1 cm. cidos
nucleicos son contaminantes en extractos proteicos y presentan
fuerte absorcin en 260 (m, que enmascara la absorcin por la
protena. Una frmula es usada para solucionar el problema:
Concentracin de protena (mg/ml) = 1,55 . D.O.280 - 0,76 .
D.O.260
d) Mtodo del Biuret
Est basado en el hecho de que compuestos conteniendo dos o mas
enlaces peptdicos forman un complejo con sal de cobre en soluciones
alcalinas. El color desarrollado es debido a un complejo de
coordinacin entre el Ion cuprico y cuatro grupos NH de dos cadenas
peptdicas segn lo observado abajo:
................ NH - C - COO - NH - C - COO - NH - C - COO - NH
.................
( ( (
R R R
Cu++
............... NH - C - COO - NH - C - COO - NH - C - COO - NH
..................
( ( (
R R R
El procedimiento de este mtodo es simples y rpido, adems de eso,
ofrece una buena estimativa de la cantidad de protenas en muestra
analizada.
El mtodo es llamado mtodo del "Biuret", porque el Biuret resulta
reaccin positiva semejante a la protena cuando colocada en
presencia de sal de cobre en medio alcalino. La estructura del
Biuret es la siguiente:
H2N - CO - NH - CO - NH2.
No hay prcticamente ninguna otra sustancia presente en
materiales biolgicos y que pueda interferir en esto mtodo. Adems el
desarrollo del color no es el mismo con todas las protenas y los
resultados pueden ser afectados por la presencia de lpidos, de ah
la recomendacin de utilizarse muestras desengrasadas.
El mtodo puede ser usado para varios tipos de alimentos, adems
de la leche, entre ellos, carnes y cereales, observndose algunos
cambios y adaptaciones.
II. TRABAJO PRCTICO
En este experimento ser hecho, inicialmente, la separacin de la
casena (principal protena de la leche), a travs de precipitacin
isoelctrica.
Alcanzndose el punto isoelctrico de la casena (pH 4,6), esta se
precipita, restando en solucin la lactoalbmina y lactoglobulina,
cuya proporcin en la leche es considerablemente menor relacionado
con la casena. La solubilidad de la mayora de las protenas
globulares esta influenciada por el pH del medio en que se
encuentran. El pH en que la protena tiene su menor solubilidad es
en su pH isoelctrico, definido como el pH en que la molcula no
presenta carga elctrica efectiva y es incapaz de desplazarse en un
campo elctrico. En esas condiciones, no existe repulsin
electrosttica entre las molculas proteicas vecinas y ellas tienden
a coalescer y precipitar. Entretanto, en valores de pH arriba o
abajo del punto isoelctrico, todas las molculas poseen una carga
efectiva de misma seal. Como consecuencia, ellas irn repelar una
con las otras, evitando la coalescencia de las molculas aisladas en
agregados insolubles. De ese manera, en valores de pH arriba o
debajo de su pH isoelctrico la solubilidad de las protenas se eleva
acentuadamente. Como las protenas presentan punto isoelctrico
diferente, ellas pueden ser separadas unas de las otras por
precipitacin isoelctrica.
Despus de la separacin de las protenas de la leche, ser hecha la
dosificacin cuantitativa de las protenas basndose en la ley de
Lambert Beer: "la concentracin" es directamente proporcional a la
absorbancia (A) o densidad ptica (D.O.).
Despus la reaccin del reactivo de Biuret con la protena, la
intensidad del color desarrollado es medida en el fotocolormetro
con una intensidad de onda de 540 (m y comparada con patrones de
protenas tratadas de la misma manera, usndose los datos en la
formula a seguir para determinar la concentracin de protena en la
muestra.
Absorbancia de la muestra
Conc. de la muestra = x conc. del patrn
Absorbancia del patrn
Al efectuarse estos clculos se hace las debidas correcciones
debido a las diluciones de las muestras.
Debe considerarse an en este mtodo que su sensibilidad est
alrededor de concentracin de 1,0 a 5,0 mg/ml, por lo tanto muestras
que contengan concentraciones de protenas debajo de ese rango, no
deben ser analizadas por este mtodo, pus el resultado no ser real;
muestras de concentracin arriba de ese rango deben ser diluidas
adecuadamente.
III. MATERIAL
Erlenmeyer
Bureta
Pipetas
Probeta
Embudo
Tubos de ensayo
Fotocolormetro
Papel de filtro
Solucin estndar de casena (concentracin 1 mg/ml)
cido clorhdrico al 2%
Leche descremada
Reactivo de Biuret: * Sulfato de cobre cristalizado
Tartarto doble de sodio y potasio
Agua destilada
Hidrxido de sodio al 10%
IV. PROCEDIMIENTO
En esa prctica hay necesidad de preparar dos muestras de
leche.
a) Preparo de muestra I:
- En un erlenmeyer adicionar 25 ml de leche y 25 ml de agua
destilada.
Homogenizar, acrecentar HCl, gota a gota, utilizndose una
bureta, con agitacin constante, hasta que la leche coagule. Anotar
en volumen de cido gastado, pues este dato ser utilizado en los
clculos finales.
Filtrar (papel de filtro) y usar el filtrado posteriormente para
la dosificacin. En esta muestra I tenemos entonces la lactoalbmina
y lactoglobulina ya que la casena fue separada por precipitacin
isoelctrica.
El pH de la leche es aproximadamente 6.9 y al adicionarle HCl el
pH va bajando hasta llegar a 4.6 (punto isoelctrico de la casena) y
en ese pH la casena precipita separndose de la lactoalbmina y
lactoglobulina.
b) Preparo de la muestra II
Diluir 1 ml de leche con 19 ml de agua destilada, hacindose por
lo tanto una dilucin 1/20. Homogenizar.
En esta muestra no ser separada ninguna de las 3 protenas
tenindose por lo tanto en ella las protenas totales.
c) Dosificacin de las muestras y estndar
Enumerar 4 tubos de ensayo y distribuir las soluciones segn el
cuadro abajo:
Tubo H2O Protena Muestra I Muestra II Reactivo de
(ml) estndar (ml) (ml) (ml) Biuret (ml)
1 (blanco) 3 12
2 3 12
3 3 12
4 3 12
Mezclar el contenido de los tubos por inversin y dejar en reposo
por 15 min para que ocurra la reaccin de complejacin del ion cprico
con las cadenas peptdicas de las protenas.
Hacer la lectura de las soluciones en el fotocolormetro a 540 (m
usando el contenido del tubo 1 (blanco) para cerrar el equipo.
Hacer los clculos usando la frmula citada anteriormente hacer
las correcciones necesarias debido a las diluciones hechas en las
muestras.
Reportar los resultados en g de protena por 100 ml de leche y
calcular el porcentaje de casena por diferencia entre la muestra I
y II.
7. ENSAYOS CON PROTEINAS
I. OBJETIVO
Identificar algunas reacciones de las protenas.
II. TEORA
Las protenas son molculas de alto peso molecular, que contienen
carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y con frecuencia azufre.
Las unidades fundamentales de las protenas son los aminocidos
que son compuestos orgnicos que contienen grupos amino y
carboxilos, por lo tanto poseen propiedades cidas bsicas.
Los aminocidos se unen por enlaces peptdicos para formar
dipptidos,
tetrapptidos, oligopptidos y polipptidos.
Las protenas se consideran que estn formadas por polipptidos
que
adquieren diferentes configuraciones espaciales, determinando as
la
estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las
protenas.
Las propiedades fisicoqumicas de las protenas estn determinadas
por la
secuencia de aminocidos, su configuracin, las fuerzas
interinicas, puentes
de hidrgeno, etc.
III. PARTE EXPERIMENTAL
Preparacin de la muestra*:
- Batir una clara de huevo y acrecentar 6 veces su volumen de
agua.
1- Desnaturalizacin
A 3 tubos de ensayo (A, B Y C), adicionar 3 ml solucin
albmina.
Al tubo A caliente hasta coagulacin, al tubo B adicione 1 gota
de HCl concentrado y al tubo C adicione 1 gota de NaOH.
Anotar observaciones.
* CADA GRUPO DEBE TRAER UN HUEVO.
2 - Solubilidad en Etanol
A un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina y 5 ml
de etanol.
Observar lo ocurrido.
3- Reaccin de Biuret
En un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina, 1 ml
de NaOH al 10% y 1 gota de CuSO4.al 1%.
- Anotar observaciones.
4- Reaccin de precipitacin de cationes
- En un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solucin de albmina y
3ml CuSO4 al 10%.
Anotar observaciones.
III. ENZIMAS
8. ENZIMAS: AMILASA SALIVAL
I. OBJETIVOS
- Comprobar la accin de la amilasa salival sobre el almidn.
- Analizar los factores que afectan la velocidad de reaccin de
las enzimas.
- Comprobar la accin de la amilasa con reactivos de Fehling y de
Lugol.
II. TEORIA
Las enzimas son protenas conjugadas, generalmente de estructura
globular. Su principal propiedad es ser catalizadores biolgicos. Al
ser catalizador, no interviene en el producto final.
Las enzimas poseen un sitio activo en forma de hendidura donde
reacciona con el sustrato por medio de enlaces covalentes. Otro
aspecto importante de las enzimas es su especificidad, en cuanto a
sustrato, temperatura y pH. Cada enzima tiene condiciones ptimas
para su funcionamiento.
Las enzimas necesitan una coenzima o cofactor. Este cofactor, es
generalmente un compuesto orgnico: un nucletido libre, aunque puede
ser un mineral.
III. PARTE EXPERIMENTAL
Calentar agua a 40( C en un beaker, y tomar un poco en la
boca.
Enjuagar muy bien.
Recoger el enjuagado, y repetir el proceso 2 veces.
Filtrar la solucin obtenida
b)
- Tomar 3 tubos de ensayo y marcarlos: A, B y C
Agregar a cada uno 5 ml de solucin de saliva
Al tubo A, hervir por 5 minutos y enfriar
El tubo B, no se le echar nada.
Al tubo C, acrecentar 2 ml de HCl 1M.
Mezclar bien el contenido de todos los tubos.
Adicionar 5 ml almidn 2% a cada tubo.
Realizar pruebas de Fehling y Lugol a los 3 tubos.
Colocar los tres tubos a 40 ( C.
Agitar cada 5 minutos.
Realizar pruebas de Lugol y de Fehling a cada 10 minutos hasta
observar cambio.
NOTA: Realizar las pruebas de lugol en vidrio de reloj.
9. ESTUDIO DE LA POLIFENOLOXIDASA (PPO) EXTRAIDA DE LA PAPA
I. INTRODUCION
Las enzimas son protenas sintetizadas en la clula viva, que
catalizan o aceleran una reaccin qumica. Una de las caractersticas
principales de la clula es su capacidad de hacer con que las
reacciones complejas se procesen rpidamente a la temperatura del
medio circundante. Estas transformaciones se deben a las protenas
llamadas enzimas, que son los catalizadores biolgicos. Las enzimas
comparadas a los catalizadores no proticos tales como Pt, H+, Cu++,
se destacan por la notada especificidad a los sustratos debido a su
compleja estructura protica. Muchas veces una enzima exige un
componente adicional para que pueda ejercer su funcin, estos
componentes son los cofactores que pueden ser: grupos prostticos,
coenzimas y activadores metlicos. Las enzimas estn sujetas a
influencia de varios factores como: pH, calor, cidos y bases
fuertes, pudiendo perder su actividad biolgica "desnaturalizndose".
Para su perfecto funcionamiento es necesario, que todos los
factores arriba mencionados sean bien definidos. Se evala la
actividad de una enzima rutinariamente por el surgimiento de los
productos o por el desaparecimiento del sustrato.
II. OBJETIVOS
Extraer la PPO de la papa.
Verificar su especificidad en lo relacionado a diversos
compuestos.
Testar la influencia de la temperatura sobre su actividad.
La PPO es una enzima cprica con un pH ptimo alrededor de 6 a 7,
presentando su mayor actividad enzimtica a 37(C. Esta enzima
cataliza la reaccin de varios difenoles, en la posicin orto y para,
llevando estos sustratos a quinonas correspondientes con
surgimiento de color.
Tales reacciones comnmente ocurren en vegetales promoviendo el
oscurecimiento enzimtico de ciertos frutos y hojas como: pera,
durazno, manzana, hojas de tabaco y caf, cuando su tejido es
magullado (herido). Estos oscurecimientos poden alterar el sabor,
apariencia y hasta mismo el valor nutricional. Algunos alimentos
por tradicin son deseados el oscurecimiento como: caf, cervezas, t,
etc. La formacin de estas quinonas es dependiente de la enzima y
del oxgeno, siendo que la intensidad de la reaccin es
verdaderamente evaluada por el consumo de oxgeno. La industria
busca prevenir estos oscurecimientos adicionando productos como:
CH3I, CH3OH, (CH3)2SO4, cido ascrbico, SO2, a pesar de traer
ciertos inconvenientes el uso de algunos de estos (SO2, CH3OH), o
an, alterando el pH y la temperatura.
En esta prctica varios compuestos sern tratados con el extracto
conteniendo PPO, con la finalidad de verificar la especificidad de
esta enzima con varios sustratos, que podr ser observada con el
aparecimiento del color oscuro. "Sustratos" como: tirosina, cido
qunico, clorognico, cido glico, hidroquinona, glucosa, sern
testados para nuestra observacin.
Los meta difenoles raramente son sustratos para las fenolasas y
en algunos casos otros sustratos debern antes seren hidroxilados
para transformaren en las quinonas correspondientes.
OH OH O Tirosina 3,4 dihidroxifenilalanina 3,4
benzoquinonilanina
Dentro de los sustratos recomendados los difenoles en posicin
orto presentan oscurecimiento enzimtico ms rpido y acentuado.
III. MATERIAL Y REACTIVOS
cido cafico
cido clorognico
cido quinico
Glucosa
Floroglucinol
Resorcinol
cido glico
Catecol
Fenol
Tirosina
Hidroquinona
Buffer fosfato 0,1 M pH 6,5
Tubos de ensayo
Bao mara
Pipetas
Licuadora
Tela de lino o gaza
Papa
Termmetro
Vasos
Erlenmeyer
IV. PROCEDIMIENTO
a) Especificidad
El extracto de PPO es preparado licuando una porcin de papa con
150 ml de buffer fosfato 0,1 M pH 6,5.
Filtre en tela de lino o gasa, deje decantar (5 minutos), retire
el sobrenadante que es la fuente de PPO.
Enumere los tubos de 1 a 12, y en cada tubo adicione 1 ml del
extracto de PPO, 1 ml de sustrato, homogeneice, colocando en bao
mara a 37(C, durante 5 minutos.
El tubo 1 ser el blanco y contendr a penas 1 ml de agua y 1 ml
del extracto de PPO. A mayor especificidad ser observada en los
tubos donde aparezca el color ms oscuro el que demuestra la
especificidad de la enzima por el sustrato resultando en las
quinonas correspondientes.
Comente su observacin y justifique.
b) Influencia de la temperatura
Tome cerca de 3 ml del extracto conteniendo PPO y le de un
ligero calentamiento.
A seguir, coloque en un tubo de ensayo 1 ml de este extracto y 1
ml del sustrato que mejor reacciono con PPO en la prueba anterior.
Deje por 5 minutos a 37(C.
Comente su observacin y justifique.
En otro tubo de ensayo coloque 1 ml del extracto de PPO y deje
en bao de hielo por 5 minutos. Adicione 1 ml del mismo sustrato
tambin mantenido a 0(C. Homogeneice. Deje descansar por 5 minutos
en bao de hielo.
Comente su observacin y justifique.
En cul temperatura (0(C, 37(C, calentamiento) la enzima presento
mayor actividad?
10. ENZIMAS Y SU DESEMPEO EN LOS ALIMENTOS (CHO)
I. INTRODUCION
La saliva es producida por las glndulas partidas submaxilares y
sublinguales, as como tambin por las glndulas bucales y membranas
mucosas de la boca, garganta y esfago.
La saliva contiene un 99% de agua. El material slido que
contiene, incluye ptialina (amilasa salivaria), varias protenas y
otras sustancias como urea, cido rico, colesterol, calcio, sodio,
potasio, fosfato, etc. El pH promedio es de 6,8.
PARTE A
Determinacin del pH ptimo en la accin de la ptialina.
II. PROCEDIMIENTO
- Coloque en una gradilla 5 tubos de ensayo y mrquelos pH 8;
7,4; 7,0; 6,8; 5,2.
- Aada a cada tubo 5 ml de la solucin amortiguadora de su
respectivo pH. A continuacin aada a cada tubo 2 ml de almidn al 1%,
1 ml de cloruro de sodio al 0,1 M, 1 ml de saliva diluida* y 3
gotas de lugol.
- Coloque todos los tubos numerados, en un bao de agua a 38( C y
determine cual tubo alcanza el punto acrmico ( sin color ).
* 1 ml de saliva en 9 ml de agua destilada.
III. PREGUNTAS
a) Cul es el pH ptimo para la Ptialina?
b) Cmo explica la accin incontinua de la Ptialina en el
estmago?
c) Qu ocurre cuando se alcanza el punto acrmico?
PARTE B
Influencia de la temperatura sobre la accin de la Ptialina.
II. PROCEDIMIENTO
- Tome 4 tubos de ensayo y reprtalos as:
El primero No. 1, en mezcla de agua-hielo
El segundo No. 2, temperatura ambiente
El tercero No. 3, en bao mara a 38( C.
- Aada a cada uno de los 3 primeros tubos, 5 gotas de saliva
diluida ( 1:9 ) y 2 ml de solucin de almidn al 1% y mezcle bien. Al
cuarto tubo aada 2 gotas de saliva diluida que haya sido calentada
en agua hervida por 5 minutos, mas los 2 ml del almidn al 1%.
- A intervalos de 5 minutos, saque una muestra de cada tubo y
pruebe con 2 gotas de yodo 0,01M y note la velocidad de digestin en
cada tubo; cuando no haya color, se da por terminada la
reaccin.
III. PREGUNTAS
a) Cul tubo alcanza primero el punto acrmico?
c) Qu significa que los otros tubos permanezcan iguales?IV.
CARBOHIDRATOS
11. IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
I. OBJETIVOS
Al finalizar esta prctica, el estudiante estar en capacidad
de:
- Reconocer la presencia de carbohidratos en una sustancia
orgnica, utilizando reactivos de Molisch Antrona.
- Diferenciar un carbohidrato reductor de otro no reductor, de
acuerdo a la formacin de un precipitado de color amarillo o rojo
ladrillo, en presencia del reactivo de Fehling, Benedict o
Tollens.
II. MATERIAL Y EQUIPO
- Tubos de ensayo
- Esptula
- Beaker
- Bao de Mara
- Antrona
- Molisch
- Acido sulfrico concentrado
- Hielo
- Agua
- HCl concentrado
- Fehling
- Lugol
- Tollens
- Seliwanoff
- Acetado de sodio
- HCl 10%
- NaOH 10%
- Sacarosa 5%
- Glucosa 5%
- Fructosa 5%
- Almidn en polvo
- Clorhidrato de fenilhidrazona
II. TEORIA
Los hidratos de carbono son compuestos que contienen adems de
carbono, hidrgeno y oxgeno en proporcin de 2 a 1. Este nombre
tambin se usa para algunos de sus derivados en los que la definicin
dada no se cumple estrictamente. Los carbohidratos ms simples
contienen C, H, O pero muchas de las que existen en la naturaleza
contienen tambin P, S y/o N.
Cx(H2O)y
Han sido definidos como polihidroxialdehidos o
polixidroxicetonas.
Segn el grupo carbonlico que presenten, se clasifican como
aldosas y cetosas.
Se dividen en 4 grandes grupos:
a. Monosacridos: aquellos carbohidratos que no son hidrolizables
a compuestos ms simples. Ej: glucosa
b. Disacridos: un carbohidrato que por hidrlisis da dos molculas
de monosacridos. Ej: sacarosa, maltosa, etc.
c. Oligosacridos: son los carbohidratos que por hidrlisis,
generan entre 2 y 10 unidades de monosacridos. Ej: rafinasa,
estaquiosa.
d. Polisacridos: al hidrolizarlos se obtiene ms de 10 unidades
de monosacridos.
Ej: Almidn, celulosa.
Los carbohidratos y sus derivados se encuentran en casi todas
las partes de la clula, desempeando papeles tanto estructurales
como funcionales.
Estos compuestos son de importancia fundamental en la biosfera y
se elaboran durante la fotosntesis. Por fotosntesis las plantas
verdes y las algas pueden usar la energa solar, para sintetizar
hidratos de carbono a partir de bixido atmosfrico y agua. Muchas
plantas almacenan grandes cantidades de hidratos de carbono, que en
algunos casos, son consumidos por el hombre y los animales para su
alimento. Despus de que los carbohidratos complejos han sido
ingeridos, la molcula se rompe en el estmago e intestinos, dando
glucosa, la cual es luego oxidada a CO2 y H2O, o es almacenada
temporalmente como glicgeno en el hgado y los msculos.
En el hombre ms del 60% de los requerimientos totales de energa
proviene de la oxidacin de los hidratos de carbono.
En esta forma los animales, que no pueden realizar fotosntesis,
pueden aprovechar la energa solar.
CO2 + H2O
Energa solar
CO2 + H2O CO2 + H2O
Energa
Cx(H2O)y Cx(H2O)y
Plantas verdes Animales
O2 O2 Ciclo del carbono en la biosfera
IV. PARTE EXPERIMENTAL
1. Reacciones Genricas de los Carbohidratos
1.1. Reaccin de la Antrona
El H2SO4 concentrado, hidroliza enlaces glicosdicos para dar
monosacridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y
sus derivados. Estos productos se combinan con antrona dando un
complejo azul-verdoso.
El procedimiento es el siguiente: en tubos de ensayo a
aproximadamente 2 ml de las soluciones problemas, agregue 5 gotas
del reactivo de Antrona; agite lentamente y observe el cambio de
color.
1.2. Reaccin de Molisch
El fundamento es similar al de la reaccin de antrona, excepto
que el furfural se combina con (- naftol sulfonado, originando un
complejo prpura.
El procedimiento es el siguiente: agregue 2 gotas de la solucin
de (- naftol a 2 ml de la sustancia problema. Aada cuidadosamente
por las paredes del tubo aproximadamente 1 ml de H2SO4 concentrado
hasta que se formen dos capas , observe cuidadosamente cualquier
cambio de color en la interfase de los dos lquidos.
Repita el procedimiento para cada una de las muestras problemas
disponibles, y tambin con el agua en vez de la muestra
problema.
1.3. Reacciones de los Azcares Reductores
En la prctica se usa una solucin alcalina de una sal de cobre y
un compuesto orgnico, que contiene OH alcohlico bajo estas
condiciones, el cobre forma un complejo soluble y el reactivo es
estable; ste complejo en presencia de sustancias reductoras y calor
se precipita a xido cuproso de coloracin parda, as:
2 Cu(OH)2 ( CU2O + H2O
Los carbohidratos que poseen un aldehdo libre o potencialmente
libre o un grupo cetnico, tienen propiedades reductoras en solucin
alcalina.
1.3.1. Reaccin de Fehling En tubos de ensayo mezcle 2 ml de la
solucin A de Fehling con 2 ml de la solucin B de Fehling, agregar 2
ml de la solucin problema. Introduzca los tubos en bao Mara
previamente calentado, contine el calentamiento, registre el tiempo
necesario para la aparicin de un precipitado rojizo.
Caliente como mximo 25 minutos.
1.3.2. Reaccin de Tollens
Coloque en un tubo de ensayo 1 ml de reactivo de Tollens, aada 2
ml de la solucin problema, caliente en bao Mara 10 15 minutos.
Observe si hay formacin de espejo de plata.
1.4. Reaccin de Seliwanoff
Mezcle 1 ml del reactivo con 1 ml de la solucin problema al 5%.
Caliente la mezcla a ebullicin, el desarrollo de un color rojo en 2
minutos, es indicativo de que la prueba es positiva, para presencia
de cetosas.
1.5. Preparacin de Ozasonas
En un tubo de ensayo, coloque 0,2 g de clorhidrato de
fenilhidrazona y 0,3 g de acetato de sodio disueltos en 3 ml de
agua, agregue 1 ml de la solucin problema. Caliente por 20 minutos,
enfre y observe. Mida el tiempo de formacin de cada osazona.
1.6. Hidrlisis de la Sacarosa
Tres tubos de ensayo, conteniendo cada uno 4 ml de solucin
acuosa de sacarosa al 50%, se colocan en bao Mara y se les agrega
igual volumen de agua al primero, al segundo HCl al 10%, y al
tercero de NaOH al 10%. Se calientan y despus se ensaya una porcin
de cada uno de ellos con el reactivo de Fehling. Qu grado de
hidrlisis observ en cada caso?
1.7. Hidrlisis del Almidn
Mezcle 1 g de almidn molido con 10 ml de agua fra, y vierta esta
suspensin en 200 ml de agua hirviendo. Enfrie 5 ml de esta solucin,
y agregue 4 gotas de lugol.
Al resto de la solucin aada 10 ml de HCl concentrado y lleve a
ebullicin. A cada 5 minutos, tome 2 porciones de 3 ml cada una y
haga la prueba de Fehling en una y en la otra, previo enfriamiento
con bao de hielo, la prueba del lugol.
12. POLISACARIDO - AISLAMIENTO E HIDROLISIS
I. OBJETIVO
Al finalizar la prctica, el estudiante estar en capacidad de
:
- Identificar monosacridos a partir de una hidrlisis de
polisacridos, mediante las pruebas caractersticas de
carbohidratos.
II. MATERIAL Y EQUIPO
- Hgado
- cido tricloroactico (TCA) 10% en agua
- Etanol absoluto
- Etanol al 95%
- ter etlico
- cido clorhdrico
- Hidrxido de sodio
- Hielo
III. TEORIA
El glicgeno es un polisacrido de almacenamiento en las clulas
animales. A menudo se le designa como almidn animal, tiene una
estructura ramificada con unidades de cadena lineal de 11 a 18 (-D-
glucopiranosas, las cuales presentan una unin glucosdica en ( (1-4)
con ramificacin, mediante uniones glucosdicas en ( (1-6).
El glicgeno no es reductor y con el yodo toma un color rojo.
IV. PARTE EXPERIMENTAL
1. Aislamiento
El hgado fro deber ser pesado. Luego, macere el hgado en un
mortero preenfriado con TCA 10% (1ml de TCA por gramo de hgado).
Centrifugue el homogeneizado por 5 minutos; pase el sobrenadante a
un tubo de ensayo, se agrega lentamente 2 volmenes de etanol 95%,
mezcle bien y deje decantar el precipitado; si esto no ocurre
agregue una pizca de sal y caliente de nuevo el tubo hasta que el
precipitado flocule, centrifugue despus por 3 minutos.
Descarte el sobrenadante, el precipitado es el glicgeno.
Disolver el precipitado en 5 ml de agua, adicione luego 2
volmenes de etanol al 95%, centrifugue, lavar el precipitado con 3
ml de etanol 95%.
Saque la preparacin en un vidrio de reloj y pese el
glicgeno.
2. Hidrlisis cida de glicgeno
Haga una solucin de glicgeno de 8 mg/ml, tome un volumen de 5
ml, rotule 4 tubos de ensayo. Deje el tubo 1 con 0,4 ml de agua
como blanco, al resto de los tubos coloque 0,4 ml de la solucin de
glicgeno y aada 0,6 ml de HCl 2 N; a los tubos 1 y 2 agregue 1 ml
de NaOH 1,2 N; colquelos en un bao de agua hirviendo, lo mismo haga
con el tubo 3 , al cabo de 10 min neutralice el cido en el tubo 3
con 1 ml de NaOH 1,2 N; el tubo 4 djelo 25 minutos, y luego
neutralice con 1 ml de NaOH 1,2 N.
Determine la glucosa liberada mediante algn mtodo conocido
(antrona-Molisch). Determine por el mtodo de lugol, la presencia de
glicgeno.
V. LIPIDOS
13. QUIMICA DE LOS LIPIDOS
I. OBJETIVO
Al finalizar esta prctica, el estudiante estar en capacidad de
identificar la presencia de lpidos en un compuesto orgnico o
alimento, mediante la comprobacin de diferentes propiedades
fsicas.
II. MATERIAL Y EQUIPO
- Tubos de ensayo
- Beacker
- Agua destilada
- Cloroformo
- ter
- Alcohol
- Aceite de algodn
- Sales biliares
- Solucin saponificada (grasa y KOH etanlico al 20%)
- Cloruro de calcio 10%
- cido ntrico concentrado
- cido esterico 5%
- cido oleico
- Aceite de oliva
III. TEORIA
Los lpidos son un grupo grande y heterogneo de biomolculas
orgnicas, presentes en las clulas, solubles en solventes orgnicos
no polares, por ejemplo (benceno, cloroformo, ter, tetracloruro de
carbono) y son insolubles en agua.
Los lpidos pueden clasificarse en complejos y simples, segn que
por hidrlisis alcalina generan o no sales de cidos grasos
(jabones).
Los lpidos simples como esteres de cidos grasos son diversos
alcoholes (grasas y ceras).
Tenemos como ejemplo derivados de lpidos como terpenos,
esteroides y prostaglandinas.
1. Acilglicrido
Son esteres de los cidos grasos y del alcohol glicerol, son los
ms abundantes dentro de los lpidos, sobre todo los de reserva en
los seres vivos, la estructura se representa as: O
CH2 - O - C
O ( R1
C - O - C - H
R2 ( O
CH2 - O - C
R3
O-Los grupos acilo ( R - C ) pueden ser iguales o diferentes y
los R forman
R1parte de cidos grasos de cadena lineal larga; estas cadenas
completamente saturadas constituyen las grasas y con
insaturaciones, los aceites.
2. Fosfoglicridos
Son componentes esenciales de las membranas biolgicas. Los
fosfoglicridos y las esfingomielinas se consideran fosfolpidos o
fosftidos, porque contienen el grupo fosfato en la molcula.
O- CH2 - O - C
O R1 C - O - CH
R2 OH
CH2 - O - P O - X
La X constituye grupos de cabeza polar, provenientes de amino
alcoholes, inositol, glicerol, carbohidrato y componentes ms
complejos.
Se encuentran principalmente en las membranas celulares del
tejido nervioso.
Los esfingolpidos se dividen en esfingomielina y
glucoesfingolpidos.
4. Ceras
Son esteres de cidos grasos saturados superiores, con alcoholes
monohidroxlicos o con esteroles y son insolubles en el agua: el
principal constituyente de la cera de abejas es el palmitato de
miricilo.
O
CH3 - (CH2)14 - C
O - ( CH2)29 - CH3
Las ceras forman pelculas protectoras en la superficie de las
hojas, frutos, piel, pelo y plumas.
5. Terpenos
Son compuestos lineales o cclicos constituidos por dos o ms
unidades de isopreno.
CH2 = C - CH = CH ( CH3
Los terpenos y terpenoides se encuentran en las plantas en la
forma de aceites esenciales, resinas, pigmentos, caucho, etc. Ej:
geraniol, limoneno, eucaliptol, alcanfor, carotenides, vitaminas A,
E, K, y la coenzima Q.
6. Esteroles Son derivados del ciclopentano
perhidrofenantreno.
Los esteroles son alcoholes esteroides cuyo miembro
representativo es el colesterol, el cual se encuentra normalmente
esterificado con los cidos grasos, otros ejemplos de esteroides son
los cidos biliares, hormona corticales y sexuales y la vitamina
D.
7. Prostaglandinas
Son derivados cclicos de cidos grasos, no saturados de 20 tomos
de carbono que actan en la regulacin metablica.
IV. PARTE EXPERIMENTAL
1. Solubilidad de los lpidos
Preparar 4 tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema:
TUBOS No.1234
ml agua destilada2---
ml cloroformo-2--
ml ter--2-
ml alcohol---2
Gotas de aceite de algodn5555
Agitar los tubos y observar los resultados.
2. Emulsin de los lpidos.
Preparar 2 tubos de acuerdo al siguiente esquema:
TUBOS No.12
ml de agua destilada75
ml sales biliares-2
Gotas de aceite de algodn33
Agitar los tubos y observar los resultados.
3. Saponificacin de las grasas
Preparar 3 tubos de acuerdo al siguiente esquema:
TUBOS No.123
ml solucin saponificada555
ml cloruro de calcio al 10%-1-
ml cido ntrico (gota a gota)--1
Agitar los tubos y observar los resultados.
Solucin saponificada: Tome 10 g de grasa en un erlenmeyer, aada
30 ml de KOH etanlico (20%), colquelo por 1 hora en bao de Mara,
agregue luego 30 ml de agua destilada.
4. ndice de YodoPreparar 4 tubos de ensayo segn es siguiente
esquema:
TUBOS No. 1234
ml cloroformo5555
Gotas de cido esterico al 5%-2--
Gotas de cido olico--2-
Gotas de aceite de oliva---2
A cada tubo aada solucin de HUBL, gota a gota, con agitacin,
hasta reproducir el color desarrollado en el tubo No. 1, comparar
las cantidades de solucin de HUBL gastadas en cada caso.
Explicar los resultados.
5. Consultar:
a) Qu es ndice de Yodo?
b) Qu es ndice de saponificacin?
c) Qu es cido graso?
d) Qu es glicolpido?
e) Qu es lipoprotena?
14. DETERMINACIN DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA GRASA
I. FUNDAMENTOLas grasas almacenadas pueden enranciarse debido a
la oxidacin de los dobles
enlaces, para formar perxidos; y, a su hidrlisis por
microorganismos, con
liberacin de cidos grasos. La cantidad de cidos grasos da, por
tanto, un ndice
de la frescura y la calidad de la grasa.
Se sugiere que cada par de estudiantes escoja un lpido y haga un
ensayo de:
- Una muestra seca.
- Una que haya sido expuesta al aire por un tiempo.
Compare sus resultados con los obtenidos por otros grupos para
diferentes
lpidos.
El valor de acidez es el numero de miligramos de KOH requerido
para neutralizar los cidos grasos libres presentes en 1g de
grasa.
II. MATERIALES
1. Aceite de oliva, mantequilla y margarina (usar una muestra
fresca y otra que se ha dejado al aire por varios das.
2. Solvente de grasa (volmenes iguales de 95% v/v de alcohol y
ter) neutralizado a la fenolftalena.
3. Fenolftalena (10 g/l en alcohol).
4. KOH (0,1 mol/l).
5. Buretas (5 ml y 25 ml).
III. METODOLOGIA
1. Determinacin de la acidez
Pesar cuidadosamente 10 g de la sustancia problema, y
suspenderla, despus de
derretirla, en 50 ml de un solvente de grasa. Agregar 1 ml de
solucin de
fenolftalena; mezclar cuidadosamente y titular con KOH 0,1
mol/l, hasta que el
color rosado plido permanezca por ms de 20-30 s. Anotar el nmero
de
ml de lcali que necesita, y calcular el valor de acidez de la
grasa.
Nota: 0,1 mol/l KOH contiene 5,6 g/l o 5,6 mg/ml.
2. Prueba del fro
Utilizar aceite de girasol, algodn, oliva y manteca de
cerdo.
Rotular 3 tubos de ensayo y poner 5 ml de cada aceite en cada
tubo segn la
rotulacin.
Colocar los tubos sumergidos en un bao de hielo dentro de una
nevera, a
intervalos vayan observando para determinar si se produce
enturbiamiento del
aceite por cristalizacin de sus glicridos y anoten el tiempo en
que ella se
produce.
3. Pruebas de insaturacin
Esas pruebas son aplicadas en la caracterizacin y el control del
procesamiento de tales productos para transfrmalos en mantecas
vegetales.
a) Prueba de adicin de yodo
- Colocar 1 ml de cada aceite por ensayar en un tubo de ensayo
rotulado.
- Agregar 3 gotas de solucin de yodo o lugol a la muestra de
aceite, agitar con
vigor y observar el color rojizo de la mezcla.
- Calentar con suavidad y observar si el color va cambiando
hasta desaparecer
por completo.
- Enfriar, agregar 5 gotas de solucin de almidn, agitar y
observar si no hay
yodo libre en la mezcla.
- Repetir la prueba con otra muestra del mismo aceite, pero
agregando lugol
hasta que su coloracin rojiza persista en la mezcla y observen
la coloracin
azul que se produce con el almidn, lo cual indica que ya hay
yodo libre en la
prueba.
b. Prueba de adicin de bromo
- Colocar 1 ml de cada aceite por ensayar en un tubo de ensayo
rotulado.
- Disuelve 2 ml de bromo en 50 ml de tetracloruro de
carbono.
- Gota a gota, con ayuda de una pipeta graduada, vaya agregando
solucin de bromo a cada muestra de aceite, con agitacin despus de
cada gota de reactivo, hasta cuando el bromo se decolore por
completo.
- Anotar el volumen o el numero de gotas de solucin de bromo
requeridas para que el reactivo deje de decolorarse, con el fin de
comparar entre los aceites ensayados.
Trate de explicar los resultados obtenidos, con inclusin de las
correspondientes
reacciones.
15. EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE LIPIDOS.
I. OBJETIVOS
Extraer e identificar los lpidos de la yema de huevo:
triacilglicridos, fosfolpidos, colesterol.
II. MATERIAL
Yema de huevo
Beacker
Erlenmeyer
Pipetas
Condensador de reflujo
Plancha de calentamiento
Papel de filtro
ter sulfrico
ter etlico
Cloroformo
cido sulfrico concentrado
KOH 10% etanlico
Solucin de cloruro de calcio saturada
Acetato de cadmio o zinc
Acetona
Acetato de plomo
Bastn de vidrio
III. PROCEDIMIENTO
Tome una yema de huevo en un beacker de 200 ml juntamente con 50
ml de ter etlico, agitando con un bastn durante 5 minutos.
Deje reposar hasta que se forme buen volumen de
sobrenadante.
Retire el sobrenadante para un vaso de 100 ml y abandone el
precipitado.
a) Prueba para Fosfolpido
Adicione 20 ml de propanona sobre el sobrenadante.
Filtre en papel de filtro, reservando el filtrado para las
siguientes etapas.
Pase por el papel de filtro en uso 10 ml de etanol y recoja 2 ml
en un tubo de ensayo.
Adicione algunas gotas de acetato de cadmio; la formacin de un
precipitado blanco confirma la presencia de fosfolpido.
b) Reaccin de Saponificacin
Al filtrado reservado adicione 20 ml de KOH etanlico al 10%, en
un baln acoplado a un condensador de reflujo y calentado con la
plancha.
Mantenga el calentamiento (ebullicin) por 15 minutos. Transfiera
todo el material del baln para el embudo de separacin con 30 ml de
ter de petrleo y 30 ml de agua. Agite cuidadosamente dejando en
reposo sobre el soporte para la separacin.Pruebas para confirmacin
del jabn
Recoja de la fase inferior (fase acuosa) 2 ml en un tubo de
ensayo con 3 ml de agua y agite obstruyendo la boca del tubo con el
dedo. Observe lo que ocurri.
Recoja 2 ml en otro tubo y adicione algunas gotas de solucin
saturada de cloruro de calcio, observe lo que ocurri.
Repita el mismo ensayo para la solucin de acetato de plomo.
c) Prueba para Colesterol
Recoja un poco (3 ml) de la fase etrea del embudo de separacin
en un beacker y, a seguir, pngalo en una plancha de calentamiento
para que todo el ter se evapore hasta que se seque (cuidado con
esta operacin).
Cuando el beacker estuviere fro adicione 2 ml de cloroformo,
agitando con un bastn de vidrio.
Retire 2 ml para un tubo de ensayo y con este inclinado adicione
a lo largo de la pared 1 ml de H2SO4 concentrado.
El aparecimiento de un anillo rojo confirma la presencia de
colesterol.
16. BIBLIOGRAFIA
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1983.
BOHINSKI, R. C. Bioqumica. Bogot: Addison-Wesley Iberoamericana,
1991.
COOPER, T. C. Instrumentos y Tcnicas de Bioqumica. Espaa:
Revert, S.A. 1984.
GONZALEZ, J. M. et alli. Problemas de Bioqumica. Espaa:
Alhambra, 1979.
MACARULLA, J. M. y MARIO, A. Bioqumica cuantitativa. Espaa:
Revert, S.A. 1988. UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS
PROGRAMA DE INGENERIA DE ALIMENTOS
BIOQUIMICA GENERALGUIAS DE LABORATORIO
PROF. CLAUDIA DENISE DE PAULA
M.Sc. CIENCIA DE LOS ALIMENTOS
MONTERIA, 2000
OH
H2N - C -COOH
(
CH2
(
H2N - C -COOH
(
CH2
(
H2N - C -COOH
(
CH2
(
(
+ O2
PPO
+ O2
PPO
O
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