GUIA DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA II INGENIERIA BIOTECNOLOGICA
PRACTICA N 1
GLICOLISIS
RELACIN DE EXPERIMENTOS1.- Gliclisis anaerbica en un preparado
de msculo esqueltico de conejo
a) Determinacin de glucosa basal y despus de 1 hora
b) Determinacin de cido lctico basal y despus de 1 hora.
INTRODUCCIN
La gliclisis es una va metablica que consiste en una secuencia
de reacciones citoplasmticas a travs de las cuales 1 mol de glucosa
se convierte en 2 moles de piruvato con la concomitante produccin
de ATP y la reduccin del NAD+ a NADH + H+ si es que ocurre en
presencia de oxgeno. En condiciones de anaerobiosis, es decir en
ausencia de oxgeno, stos 2 moles de piruvato se reducen a 2 moles
de Lactato a expensas del NADH + H+. En presencia de oxgeno los
tejidos pueden posteriormente oxidar el piruvato totalmente hasta
CO2 y H2O a nivel mitocondrial.
La gliclisis es una va que ocurre en todas las clulas del
organismo, con la finalidad de hacer posible que la glucosa pueda
degradarse, proporcionando la energa qumica necesaria para la
actividad celular en forma de compuestos fosfricos ricos en energa
(ATP). As, por molcula de glucosa que se convierte en 2 de cido
lctico, se produce una sntesis neta de 2 molculas de ATP, de tal
modo que el proceso global que ocurre en las clulas, podra
resumirse como:
Glucosa + 2ADP + 2Pi 2 Lactato + 2 ATP + 2 H2O
Tanto las reacciones as como las enzimas que catalizan las
diversas etapas de la gliclisis se encuentran en el citoplasma, no
obstante existe una estrecha asociacin con las mitocondrias en
donde se lleva a cabo la descarboxilacin oxidativa del Piruvato,
las reacciones del ciclo de Krebs y la fosforilacin oxidativa.
En la presente prctica se evaluar a la gliclisis a travs del
consumo de glucosa y la produccin de cido lctico en un sistema de
ensayo que contiene homogenizado de msculo esqueltico mantenido en
condiciones de anaerobiosis a 37 C durante una hora.
EXPERIMENTO 1
Gliclisis anaerbica en un sistema preparado con msculo
esqueltico de cobayo
Objetivos
1. Demostrar como la glucosa en ausencia de oxgeno se transforma
en cido lctico, utilizando como fuente enzimtica un homogeneizado
de msculo de cobayo o en caso contrario de rata.
2. Comprobar el consumo de glucosa durante el proceso
3. Comprobar la produccin de cido lctico en condiciones de
anaerobiosis
Procedimiento:a) Degradacin de la glucosa:1. En un Erlenmeyer de
125 ml. limpio y seco, medir 10 ml de una solucin de glucosa al 1%,
disuelta en una solucin Krebs Ringer Fosfato (*) conteniendo
Nicotinamida 0.03 M, NAD+ 0.2 % y ATP 0.2 %.
2. Incubar la solucin en bao mara a 37 C por 10 minutos.
3. Agregar al Erlenmeyer 50 ml de homogenizado de msculo al 10 %
(P/V), 8,1016,18,20,22preparado previamente en solucin Krebs Ringer
Fosfato.
4. Mezclar y rpidamente tomar un volumen de aproximadamente 20
ml en una probeta y colocarlo inmediatamente en hielo. Esta muestra
constituye la muestra basal a tiempo cero.
5. Despus de haber extrado la muestra basal, aadir al Erlenmeyer
con la muestra sobrante, un volumen adecuado de parafina lquida,
para crear las condiciones de anaerobiosis. Proseguir entonces con
la incubacin a 37 C durante 60 minutos. Esta ser la muestra
incubada en donde se habr de producir la gliclisis.
6. Realizar las determinaciones de glucosa y cido lctico, tanto
en la muestra basal a tiempo cero, as como en la muestra incubada
por 60 minutos a 37C, siguiendo la metodologa para cada una de
ellas.
b) Determinacin de glucosa. ( Mtodo de Nelson-Somogy ). La de
terminacin de glucosa por este mtodo, recomienda que la muestra a
analizar est libre de protenas, ya que de no ser as, stas podran
reaccionar con el reactivo de cobre utilizado dando interferencia
en la coloracin obtenida.
Desprotenizacin:
a) Para cada muestra, medir en un tubo de ensayo 4 ml de agua
destilada y agregar 2 ml. de muestra respectiva.
b) Agregar 2 ml. de ZnSO4 al 5 %, agitar y dejar en reposo por 5
minutos.
c) Aadir 2 ml. de Ba(OH)2 0.3 N. Agitar y dejar en reposo por 5
minutos.
d) Transcurrido el tiempo, proceder a centrifugar o filtrar
dichas muestras. El filtrado libre de protenas deber ser incoloro y
transparente. La determinacin de glucosa se har en este
filtrado.
Procedimiento para cuantificar glucosa:
1. Preparar 4 tubos de Folin, de acuerdo a la siguiente
tabla:
REACTIVOS1234
Filtrado de la muestra basal
Filtrado muestra incubada
Solucin Estandar (**)
Agua destilada
Reactivo Cprico-alcalino1 ml
---
---
---
1 ml---
1 ml
---
---
1 ml---
---
1 ml
---
1 ml--
---
---
1 ml
1 ml
(**) Solucin estndar de glucosa conteniendo 50 ug/ml. La
absorbancia leda del sistema estndar fue de 0.154 D.O. ( 67
UK).
2. Colocar los tubos en bao mara hirviente por 15 minutos.
3. Enfriar los tubos en agua corriente.
4. Aadir a cada tubo, 1 ml del reactivo arsenomolibdato,
disolviendo con suave agitacin el Cu2O producido.
5. Completar con agua destilada a 25 ml y mezclar. Dejar en
reposo 5 minutos.
6. Leer en el fotocolormetro con filtro verde y anotar.
7. Hacer los clculos respectivos y expresar la concentracin de
glucosa en mg %.
c) Determinacin de Acido Lctico (Mtodo Volumtrico).
El cido lctico se determinar por titulacin con una solucin de
KOH 0.02 N, utilizando al rojo de fenol como indicador.
Procedimiento:
1. En cada uno de dos beakers medir aproximadamente 15 ml de las
muestras basal e incubada respectivamente y hacerlas hervir por 2
minutos teniendo cuidado de que no se proyecten
2. Enfriar y filtrar a travs de una gasa y luego a travs de
papel filtro.
3. Proceder a la titulacin de 3 ml de cada muestra con KOH 0.02
N, agregando 1 gota del indicador rojo de fenol, hasta obtener un
color naranja-rosa.
4. Anotar el volumen de soda gastado y calcular la normalidad
del cido lctico.
Resultados
Anote sus resultados en la siguiente tabla :
MUESTRA BASALMUESTRA INCUBADA
Glucosa en mg %
Acido lctico en mEq/L
En el siguiente espacio discuta los resultados obtenidos
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
INTERROGANTES
1. Defina a la gliclisis anaerbica y gliclisis aerbica
2. En que clulas o tejidos, la glucosa es degradada
anaerbicamente, y en cuales aerbicamente
3. Escriba las reacciones de la gliclisis que requieren de ATP y
las que producen ATP
a)
b)
c)
d)
4. Cul es la produccin neta de ATP en la oxidacin anaerbica de
un mol de glucosa. Haga los clculos respectivos.
5. Como se define la fosforilacin a nivel de sustrato. Qu
enzimas de la gliclisis catalizan estas reacciones?
6. Cul es la produccin neta de ATP por la oxidacin aerbica de 1
mol de glucosa hasta CO2 y H2O. Describa de manera general las
etapas en donde se forma ATP.
7. Cul es la importancia de la gliclisis para los eritrocitos y
las neuronas
8. Mediante un esquema demuestre la funcin del NAD+ en la
gliclisis. Por qu no aparecen NADH y NAD+ en la reaccin neta?
9. A qu se llama enlaces fosfricos ricos en energa. Qu
intermediarios de la gliclisis lo presentan? 10. Escriba las
reacciones irreversibles de la gliclisis, indicando las enzimas que
las catalizan
11. Cmo se regula la gliclisis?
12. A partir del G de la gliclisis y del nmero neto de ATPs
producidos, calcule la eficiencia en porcentaje del proceso.
13. Qu inhibidores de la gliclisis conoce Ud.? Indique el lugar
y el mecanismo de accin de estas sustancias.
14. Si se aadiese CN y/o dicumarol en el experimento de la
presente prctica, se afectara la sntesis de ATP de la
gliclisis?
PRACTICA N 2
CICLO DE KREBS
RELACION DE EXPERIMENTOS
1.- Determinacin del consumo de oxgeno (Manometra)2.-
Determinacin del consumo de piruvato (Colorimetra)INTRODUCCION
Cuando la glucosa se degrada por la va glicoltica se obtiene
como producto final piruvato o lactato. En condiciones aerbicas, la
etapa siguiente en la degradacin de la glucosa, es la
descarboxilacin oxidativa del piruvato a nivel mitocondrial, para
formar acetil CoA, el cual puede oxidarse hasta CO2 y H2O en una va
metablica llamada ciclo de Krebs, ciclo de los cidos tricarboxlicos
o ciclo del cido ctrico el cual funciona en estrecha relacin con la
cadena respiratoria mitocondrial. Es necesario remarcar que el
acetil CoA no slo proviene del metabolismo de los carbohidratos,
sino que tambin se forma durante la beta oxidacin de los cidos
grasos o en la oxidacin de algunos aminocidos.
El ciclo de Krebs se realiza en las mitocondrias y est
ntimamente ligado a la cadena respiratoria; este hecho tiene
importancia metablica por que los hidrgenos provenientes de las
oxidaciones producidas en el ciclo de Krebs, son captados por los
transportadores de la cadena respiratoria para llevarlos hasta el
oxgeno molecular que se reduce y forma agua. Como consecuencia se
produce 2 3 molculas de ATP por cada proceso oxidativo.
Durante el ciclo de Krebs ocurre esencialmente lo siguiente: Un
compuesto de 4 tomos de carbono (oxalacetato), se condensa con el
acetato (acetil CoA) para dar lugar a un cido tricarboxlico de 6
tomos de carbono (citrato). Un ismero de ste el isocitrato es
descarboxilado y oxidado para dar un cetocido de 5 carbonos (alfa
ceto glutarato), l cual a su vez es descarboxilado oxidativamente
para formar un cido dicarboxlico de 4 carbonos (succinato). A
partir del succinato se regenera oxalacetato a travs de reacciones
en las que ocurren dos oxidaciones.
En esta prctica se utilizar un homogenizado de hgado como fuente
de enzimas, y se demostrar el requerimiento de varios cofactores
para un buen funcionamiento
del ciclo. Como en este proceso de oxidacin de Piruvato, el
oxgeno es reducido hasta agua, el ciclo de Krebs ser estudiado:
1. Midiendo el consumo de oxgeno mediante el empleo de un mtodo
manomtrico.
2. Midiendo los micromoles de Piruvato consumidos, mediante un
mtodo colorimtrico
Experimento 1
Determinacin del consumo de oxgeno.
La integracin del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria
mitocondrial va a originar que el oxgeno sea reducido y convertido
en agua, producindose un consumo neto de este gas, consumo que
puede ser medido mediante el uso del respirmetro de Warburg.
Fundamento del respirmetro de Warburg.
El frasco de Warburg que contiene el sustrato, cofactores y el
homogenizado de hgado, en cuyo medio se quiere medir el consumo de
oxgeno, es colocado en bao de agua a temperatura constante. Estando
cerrado el frasco y en comunicacin con el manmetro, el consumo de
oxgeno determinar una disminucin de la presin del sistema, lo cual
se evidencia por un desnivel del lquido manomtrico presentes en las
columnas. ( el funcionamiento del respirmetro de Warburg as como
los clculos respectivos ya fueron indicados en la practica de
Fotosntesis: Bioqumica I ) .
Procedimiento.
Se preparan 6 frascos de Warburg; en la copa central de cada uno
de ellos medir 0.4 ml de KOH al 20 % y colocar un fragmento de
papel filtro plegado en acorden. Luego en el compartimiento
principal de cada frasco medir los siguientes reactivos:
123456
ATP 0.01 M0.4 ml0.4 ml----0.4 ml0.4 ml0.4 ml
MgSO4 0.02 M0.3 ml0.3 ml0.3 ml----0.3 ml0.3 ml
NAD0.1 ml0.1 ml0.1 ml0.1 ml---------
Sustrato * ----0.6 ml0.6 ml0.6 ml0.6 ml0.6 ml
Buffer fosfato 0.1 M pH 7.30.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5
ml
H2O0.7 ml0.1 ml0.5 ml0.4 ml0.2 ml----
Fluoroacetato --------------------0.1 ml
Homogenizado de hgado **2.0 ml2.0 ml2.0 ml2.0 ml2.0 ml2.0 ml
* El sustrato contiene 5 volmenes de piruvato de sodio 0.1M y un
volumen de fumarato de sodio 0.01M.
** El homogenizado de hgado se obtuvo al homogenizar en frio
durante 2 minutos, hgado de rata en ayunas con 9 volmenes de
sacarosa 0.25 M de buffer tris 0.02 M pH 7.4.
Preparar adems un frasco termobarmetro( TB) que debe contener 4
ml de agua destilada para corregir o compensar los cambios de
presin y temperatura durante el experimento.
Equilibrar los sistemas por 10 minutos sin cerrar la llave de
los manmetros, permitiendo el libre intercambio gaseoso con el
medio ambiente. Cerrar luego la llave de los manmetros y la llave
lateral de los frascos de Warburg y hacer la lectura cada 15
minutos.
Expresin de resultados
Confeccionar una Tabla o Cuadro y anotar las lecturas obtenidas
cada 15 minutos para cada sistema.
Convertir las lecturas obtenidas en l de oxgeno consumido en una
hora para cada uno de los sistemas.
Interpretar los resultados para cada sistema.
Sistema 1:
_____________________________________________________________________________________________________________________________Sistema
2: ________________________________________________________CUADRO
DE RESULTADOS: ( Completar el siguiente cuadro, realizando los
clculos respectivos ).
Tiemp
TB1
KO2=0.962
KO2=1.033
KO2=0.944
KO2=1.005
KO2=0.896
KO2=0.88
0
183295297289278274275
10
184
234205250230220250
20
186211120220185170229
30
185182 40
299
190135130200
40
188136206173 100100185
50
188 113
135155 65292 80165
60
186 92 48 50275 65145
Consumo de oxgeno
en l / 60
Consumo de Piruvato
en Moles
Sistema 3:
___________________________________________________________
___________________________________________________________________
Sistema 4:
_____________________________________________________________
___________________________________________________________________
Sistema 5:
___________________________________________________________
____________________________________________________________________
Sistema 6:
___________________________________________________________
___________________________________________________________________
2.- Determinacin de los micromoles de piruvato consumidos.
Fundamento.
El piruvato reacciona con la 2,4-dinitrofenil hidrazina, dando
lugar a la formacin de una hidrazona que en medio alcalino toma una
coloracin pardo oscura, cuya absorbancia se mide en el
fotocolormetro.
Procedimiento.
Al finalizar el experimento de la medicin del consumo de oxgeno
se abren todas las llaves de los manmetros y frascos Warburg. Luego
se trasvasa el contenido del compartimento principal de cada frasco
a tubos de prueba numerados del 1al 6.
A parte preparar en tubos de prueba los sistemas 1, 2 y 6 (que
estn marcados con ) donde el tubo 1 sirve de blanco; los tubos 2 y
6 sirven de estndares.
Luego con los 8 tubos ( 1 6 despus de haber medido el consumo de
oxgeno; y los sistemas basales 1, 2 y 6 ) se procede de la
siguiente manera:
Medir en tubos de prueba 2 ml del contenido de cada tubo
Aadir 18 ml de ATCA al 5 % . Mezclar. Dejar en reposo por 5
minutos y filtrar.
En otros tubos medir respectivamente:
0.4 ml de cada filtrado
0.6 ml de agua destilada
1.0 ml de 2,4-dinitro fenil hidrazina, dejar 20 minutos en
reposo.
Aadir 10 ml de NaOH al 10 %. Dejar en reposo por 5 minutos
Leer con filtro verde
Tubo 1 : 0.038 Tubo 2 : 0.612 Tubo 6 : 0.605
Absorbancia de los tubos del 1 al 6 :
1: 0.038 2: 0.088 3: 0.471 4: 0.467 5: 0.458 6: 0.589Calcular el
Factor de calibracin:
Factor de calibracin: .......................
Calcular los micromoles de piruvato consumidos en cada
sistema:
1: ............ 2: ............. 3: .............. 4:
.............. 5: .............. 6: ...............
INTERROGANTES:
1.- Qu es el ciclo de Krebs, qu importancia tiene y en qu lugar
de la clula ocurre?
2.- Haga el balance energtico del Ciclo de Krebs asociado a la
cadena respiratoria mitocondrial para un mol de acetil CoA.
3.- Qu finalidad tiene la preparacin del sistema
termobarmetro?
3.- Qu finalidad tiene en la presente prctica, el empleo de KOH
en el compartimiento central de cada frasco Warburg ?
4.- Qu es el KO2
5.- Explicar la relacin que existe entre el consumo de oxgeno y
el funcionamiento del ciclo de Krebs.
6.- Cul es la razn de que el sustrato contenga fumarato?
7.- Qu inhibidores del ciclo de Krebs conoce Ud.? . Dnde
actan?
8.-Indique qu vitaminas o derivados de vitaminas se necesitan
para la descarboxilacin oxidativa del alfa ceto glutarato. Qu otro
cido relacionado con el metabolismo de la glucosa sufre igual
transformacin.
9.- Cmo se regula el flujo metablico del ciclo de Krebs. Qu
enzimas regulatorias intervienen en este proceso y como son
reguladas?
10.- Cul es el rendimiento neto de ATPs, cuando 1 mol de
Piruvato es oxidado hasta CO2 y H2O ?. Cul sera el cambio de energa
libre ( G ) total?
PRACTICA N 3
FERMENTACION ALCOHOLICA DE LA GLUCOSA
RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Formacin de Acetaldehido y Etanol a partir de glucosa en
presencia de Saccharomyces cerevisiae.
a) Identificacin de acetaldehido
b) Cuantificacin de etanol
2. Cuantificacin del contenido alcohlico en diversas bebidas
INTRODUCCION.
Las fermentaciones son procesos anaerbicos que liberan energa
para la formacin de ATP en un proceso conocido como fosforilacin a
nivel de sustrato. La energa producida en los procesos de
fermentacin y que las clulas aprovechan para las reacciones
endergnicas, se acumula en forma de ATP; parte de la cual se emplea
en la fosforilacin de las hexosas.
La fermentacin alcohlica es un proceso bioqumico que por accin
de las levaduras, 1 mol glucosa es convertida anaerbicamente en 2
moles de etanol. Las clulas de levadura son esenciales para
producir las enzimas necesarias que participar en el proceso
fermentativo, pero una vez que stas estn presentes ya no sern tan
indispensables para que la fermentacin se produzca en forma
normal.
En levaduras, la glucosa anaerbicamente es convertida en etanol
y dixido de carbono, y las etapas enzimticas son idnticas a las de
la fermentacin lctica o gliclisis, a excepcin de la etapa terminal
catalizada por la Deshidrogenasa lctica, la cual es reemplazada por
dos etapas enzimticas adicionales, donde intervienen la Piruvato
Descarboxilasa y la Alcohol Deshidrogenasa.
La reaccin de descarboxilacin del Piruvato, en acetaldehido y
dioxido de carbono, es catalizada por la Piruvato Descarboxilasa,
enzima que requiere de Pirofosfato de Tiamina (PPT) como coenzima,
adems de iones Mg2+. Como producto intermediario se forma cido
pirvico activo que por liberacin del CO2 se convierte en
acetaldehido activo (PPTAcetaldehido), intermediario que luego se
descompone en PPT acetaldehido, ste ltimo se reducir a etanol en la
reaccin siguiente ; no obstante, una parte del acetaldehido activo
se condensa a acetaldehido libre para formar acetil-metil-carbinol.
(Acetona).
La conversin de acetaldehido en etanol es llevada a cabo por la
alcohol deshidrogenasa, la cual es una enzima que requiere de NADH
+ H+ y que cataliza la reaccin de izquierda a derecha cuando esta
se lleva a cabo en un medio ligeramente cido ( pH de 5 a 6 ), por
el contrario en medio ligeramente alcalino (pH 8) esta se realiza
de derecha a izquierda.
Como inductores de la fermentacin alcohlica, no slo actan las
levaduras de Saccharomyces cerevisiae, sino tambin las bacterias:
pseudomonas, xantomonas y aeromonas.
En la fermentacin alcohlica, adems del etanol y dioxido de
carbono se originan productos secundarios como glicerina, cido
actico y cido succnico.
EXPERIMENTO 1.
FERMENTACION DE LA GLUCOSA POR Saccharomyces cerevisiae HASTA
ACETALDEHIDO Y ETANOL
En 2 matraces ( M-1 y M-2 ) de 50 ml., agregar lo siguiente:
M - 1M 2
1.- Levadura de panificacin fresca
1.0 g1.0 g
2.- Solucin de glucosa al 5 %, recin preparada y a pH 5.5
10.0 ml------
3.- Solucin de glucosa al 5 %, recin preparada y a pH 8.0
------10.0 ml
4.- Mezclar bien y agregar el reactivo sulfito de calcio
------500 mg
5.- Mezclar y agregar rpidamente parafina lquida hasta que
cubra la superficie.5.0 ml5.0 ml
Incubar en bao de agua a 37 C durante 60 minutos
6.- Centrifugar a 3,000 rpm.
10 min.10 min.
Obtener los sobrenadantes por separado para las determinaciones
del acetaldehido y etanol
Identificacin del acetaldehido.
Fundamento:
En el sobrenadante de la muestra de incubacin el sulfito de
calcio atrapa al acetaldehido, el cual puede observarse por el
color azul que se produce al reaccionar con el nitroprusiato de
sodio y la piperidina.
Procedimiento.
En 3 tubos de ensayo ( T) debidamente rotulados, agregar lo
siguiente:
T - 1T 2T 3
1. Sobrenadante de M 1 1.0 ml------
2. Sobrenadante de M 2 ---1.0 ml---
3. Agua destilada------1.0 ml
4. Solucin de Nitroprusiato de Sodio 0.5 ml0.5 ml0.5 ml
Mezclar y colocar los tubos en bao de agua hirviente por 5
minutos.
5.Observar. Anotar el color y olor caracterstico
del acetaldehido
CUANTIFICACION del Etanol (Mtodo de Shefftel modificado).
Fundamento.
La mezcla oxidante Dicromato-cido sulfrico acta sobre el alcohol
etlico transformndolo en cido actico, a la vez que se forma sulfato
cromoso con una coloracin que vara del amarillo al verde, en forma
proporcional a la concentracin de etanol existente en la muestra,
susceptible a ser medido por fotocolorimetra.
Reactivos:
a) Dicromato de potasio.8.524 g.
Agua destilada
1000 ml.
b) Acido sulfrico Q.P.1000 ml
c) Mezcla sulfocrmica: Verter lentamente el cido sulfrico a la
solucin de bicromato (Reaccin exotrmica).
Procedimiento:
1. Colocar 0.5 ml de la mezcla sulfocrmica en un frasco de 30
ml. aproximadamente.
2. Colocar exactamente 0.2 ml. de la muestra a analizar en una
tira doblada de papel filtro adherida a un tapn de jebe con un
alfiler.
3. Finalmente colocar hermticamente en el frasco que contiene la
solucin sulfocrmica, cuidando que la tira de papel filtro no toque
las paredes del frasco ni el reactivo.
4. Colocar las tapas rosca y llevarlos a Bao Mara hirviente o a
estufa a 100 C por 10 minutos.
5. Retirar el tapn con la tira de papel que contiene a la
muestra. Enfriar y agregar 12.5 ml de agua destilada.
6. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 578 nm.
7. Preparar sistemas estndar del mismo modo que para las
muestras problema, slo que en su lugar medir 0.2 ml del estndar
respectivo ( 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml y 2 mg/ml ) en la tira de papel
filtro.
8. De igual modo preparar un blanco, procediendo exactamente de
la misma manera que para la muestra problema, slo que en lugar de
esta ltima medir 0.2 ml de agua destilada en la tira de papel
filtro.
RESULTADOS.
Calcular los Factores de calibracin respectivos en base a los
datos indicados:
Absorbancia
( D.O )Absorbancia netaFactor de
Calibracin.
Blanco0.001-----------------
Estandar 1 ( 0.5 mg/ml )0.005
Estndar 2 ( 1.0 mg/ml )0.009
Estndar 3 ( 2.0 mg/ml )0.018
Anotar los resultados obtenidos del experimento 1 (fermentacin
alcohlica de la glucosa ), en el siguiente Cuadro:
T 1T 2T 3
Identificacin de acetaldehido
Coloracin obtenida
Cantidad de etanol (mg % )
Anotar los resultados obtenidos en el experimento 2.
Bebida alcohlicaAbsorbanciaConcentracin en la cantidad de
muestraConcentracin en mg %
Blanco0.001
Anizado
Cerveza
Chicha
Pisco
INTERROGANTES Y COMENTARIOS. 1.- Comente o explique los
resultados obtenidos en la identificacin del acetaldehido.
2.- Comente o explique los resultados obtenidos en la
cuantificacin de etanol del experimento 1.
3.- Esquematice la secuencia de reacciones de la fermentacin
alcohlica de la fructosa
4.- Escriba las coenzimas y/o cofactores que necesita la
piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa. 5.- Indique
para qu se utilizan los siguientes compuestos o sustancias, en la
presente prctica:
Sulfito de calcio:
Solucin sulfocrmica diluida:
6.- Mencione las diferencias entre la fermentacin lctica y
fermentacin alcohlica.
7.- De qu otras maneras se puede estudiar la fermentacin
alcohlica?
8.- Qu otros compuestos se pueden formar durante la fermentacin
alcohlica?
PRACTICA N 4
OXIDACION DE ACIDOS GRASOS Y FORMACION DE CUERPOS CETONICOS
INTRODUCCION:
Como se sabe, la oxidacin de los cidos grasos comprende una
serie de reacciones enzimticas que al final conducen a la formacin
de Acetil CoA y un acil CoA de 2 tomos de carbono menos; este ltimo
compuesto reingresa al ciclo, de tal manera que el cido graso queda
convertido finalmente en varios Acetil CoA dependiendo del nmero de
carbonos del cido graso. As por ejemplo, para el caso del cido
palmtico, oxidacin dar lugar a 8 Acetil CoA y tratndose del cido
butrico originar 2 Acetil CoA. Las molculas de Acetil CoA sern
ampliamente utilizadas por el organismo y as de primera importancia
es el empleo en la produccin de energa, al unirse al oxalacetato y
seguir las reacciones del ciclo de Krebs; interviene tambin en la
sntesis de cidos grasos, sntesis de colesterol, en procesos de
acetilacin. Aqu estudiaremos tambin de forma particular el rol del
acetil CoA en la formacin de cuerpos cetnicos, lo que ocurre
especialmente en el hgado. Se conocen bajo la nominacin de cuerpos
cetnicos a los cidos: Aceto actico, beta hidroxibutrico y a la
acetona.
En esta prctica se utilizar un homogenizado de hgado como fuente
de enzimas para la oxidacin del butirato y la formacin de cuerpos
cetnicos. Se emplear para este efecto, el aparato manomtrico de
Warburg para medir el consumo de oxgeno.
OBJETIVOS:
1. Estudiar la oxidacin del cido butrico a travs del consumo de
oxgeno utilizando un homogenizado de hgado como fuente
enzimtica.
2. Demostrar la necesidad del NAD, iones magnesio y ATP en la
oxidacin de los cidos grasos.
3. Determinar cualitativamente la formacin de cuerpos cetnicos
en los diferentes sistemas de estudio.
4. Interpretar los resultados sobre el consumo de oxgeno y
formacin de cuerpos cetnicos. Procedimiento:
Preparar 4 frascos de Warburg en la siguiente forma:
1. Colocar 0.4 ml de KOH 20% en la copa central de cada frasco y
un pedazo apropiado de papel filtro plegado en acordeon, y luego en
el compartimiento principal de cada frasco medir lo siguiente:
1234
ATP 0.01M0.4 ml.0.4 ml.-------0.4 ml.
Mg SO4 0.02 M0.3 ml.0.3 ml.0.3 ml.0.3 ml.
NAD 0.1 ml.0.1 ml.0.1 ml.-------
Sustrato -------0.6 ml.0.6 ml.0.6 ml.
Buffer Fosfato 0.1 M; pH 7.40.5 ml.0.5 ml0.5 ml.0.5 ml.
Agua destilada 0.7 ml.0.1 ml.0.5 ml.0.2 ml.
Enzimas 2.0 ml.2.0 ml.2.0 ml.2.0 ml.
NAD 3.0 mg y 43 mg de nicotinamida.
.. Sustrato ( 5 volmenes de butirato de sodio 0.1 M y 1 volumen
de Fumarato de sodio 0.01 M.
... Enzimas : Homogenizado de hgado de rata en ayunas con 9
volmenes de sacarosa 0.25 M en buffer
Tris 0.02 M ( pH 7.4 ).
2. Preparar adems, un frasco termobarmetro conteniendo 4 ml. de
agua destilada para compensar los cambios de presin y temperatura
durante el experimento.
3. Colocar cada frasco en su correspondiente manmetro; sin
cerrar la llave de los manmetros, equilibrar durante 10 minutos a
37 C en el aparato de Warburg con agitacin constante. Despus de
esta fase inicial, cerrar la llave de los manmetros y proceder a la
lectura basal. (Cuadro de Resultados )
4. Continuar las lecturas cada 10 minutos, haciendo las
correcciones necesarias de acuerdo a los cambios observados en el
termobarmetro. (Cuadro de Resultados )
5. Al final del experimento, calcular el consumo de oxgeno total
de cada frasco y trasvasar el contenido de cada compartimiento
principal de los frascos a tubos de ensayo enumerados en forma
similar.
Identificacin de cuerpos cetnicos:
6. Saturar el contenido de cada frasco con sulfato de amonio
slido y dejar en reposo durante 5 minutos. Filtrar despus de
decantar los cristales de la sal.
7. A un volumen igual de cada filtrado ( por ejemplo 1.0 ml. ),
agregar 3 gotas de NH4OH concentrado y 2 gotas de nitroprusiato de
sodio al 5 %. Agitar lateralmente y dejar ambos tubos en reposo
durante 5 minutos. La concentracin relativa de cuerpos cetnicos
(aceto acetato) en cada tubo ser apreciada por la presencia de un
color violeta, cuya intensidad de color ser considerada de 0 a
++++.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1.- Interprete y comente los resultados obtenidos en :
Sistema N 1 :
Sistema N 2 :
Sistema N 3 :
Sistema N 4 :
INTERROGANTES:
1.- A travs de un diagrama describa la beta oxidacin del cido
butrico
2.- Cul es la razn de que se use fumarato junto al sustrato
butirato?
3.- De qu otros modos se podra evaluar la oxidacin de los cidos
grasos?
4.- Calcule cuantos ATPs netos se obtienen cuando el butirato se
degrada completamente hasta CO2 y H2O y calcule su eficiencia
energtica (%).
5.- Donde ocurrir la activacin de este cido graso? , por
que?
6.- Hay necesidad de carnitina para la oxidacin de butirato? .
por qu?
7.- Explicar la relacin existente entre consumo de oxgeno y
oxidacin de cidos grasos.
8.- Un desacoplador de la fosforilacin oxidativa tendra algn
efecto sobre la oxidacin de los cidos grasos en la presente
prctica?
9.- Cul es el fundamento de la determinacin cualitativa de los
cuerpos cetnicos?
10.- Qu finalidad tiene en la presente prctica el empleo de KOH
en el compartimiento central del frasco Warburg?
11.- Escriba la reaccin de sntesis de cada uno de los cuerpos
cetnicos
12.- Como los cuerpos cetnicos pueden cumplir un rol
energtico?
13.- Qu entiende por cetosis. Cules son los llamados cuerpos
cetnicos. En qu condiciones se acumulan en el organismo
14.- Qu hormonas estimulan la capacidad de transformar la
glucosa en cidos grasos?
15.- Qu hormonas intervienen en la movilizacin de cidos grasos
desde los depsitos?
16.- Cual es la principal razn de utilizar acido butrico y no
otro acido graso en la
presente practica? Cuadro de Resultados. Complete los datos del
siguiente cuadro
TIEMPO
( Minutos) TB1
KO2 = 0.982
KO2 = 1.123
KO2 = 0.954
KO2 = 0.94
0
180298300295280
10 182 260 231 270 258
20 181 229 175 250 230
30 179 220 114 233 221
40 181 197 42 215 208
50 180 168 298 -----
214 198 191
60 180 149 140 162 153
Consumo de Oxgeno
en l.
Cuerpos Cetnicos
+++++++++
PRACTICA No 5DEGRADACIN DE AMINOCIDOS: TRANSAMINACIN
RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Transaminacin utilizando un extracto enzimtico de hgado de
paloma
INTRODUCCION
La transaminacin es el proceso que consiste en la transferencia
reversible del grupo amino desde un aminocido hasta un cetocido ,
dando como resultado conversin del primero en un cetocido y el
segundo en un nuevo aminocido Esta reaccin es de gran importancia
en el metabolismo de los aminocidos y es catalizada por enzimas
llamadas TRANSAMINASAS o Aminotransferasas, presentes en la mayora
de tejidos animales. El cofactor de estas enzimas es el piridoxal
fosfato y para casi todas las transaminasas el alfa-cetoglutarato
es el aceptor del grupo amino, formndose por tanto cido
glutmico.
R-CH-COO- R-C-COO- L-aminocido + alfa-cetoglutarato
alfa-cetocido + L-glutmico El inters clnico est centrado
especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfa-cetoglutarato
aminotransferasa (Transaminasa glutmico Pirvica o TGP) y
L-aspartato: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa
Glutmico Oxalactica o TGO). Estas enzima tienen una accin
eminentemente intracelular, por lo que la actividad srica en
condiciones normales es baja o nula. Un aumento de actividad ser
evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran de
los cuales resultan particularmente importantes corazn e hgado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce
en suero un marcado aumento de la actividad de TGO, debido a la
liberacin al torrente sanguneo de esta enzima tan abundante en el
miocardio. En este caso no existir aumento e la actividad srica de
TGP o ser mnimo.
En hepatitis vrales u otras formas de enfermedad heptica que
involucren necrosis de tejido, habr tambin un incremento
considerable de la actividad srica de transaminasas, incluso antes
de la aparicin de sntomas clnicos como la ictericia. En este caso
TGP ser la enzima predominante debido a su gran concentracin en el
tejido heptico. Una elevada actividad de transaminasas puede
detectarse tambin en otras condiciones como: traumas accidentales o
quirrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, etc.
TRANSAMINACION EN PRESENCIA DE UN PREPARADO DE HIGADO DE
PALOMA
Objetivo:
Aplicacin de la tcnica de cromatografa en capa fina para
estudiar la transaminacin en presencia de un preparado de hgado de
paloma como fuente enzimtica, utilizando alanina y aspartato como
substratos.
Procedimientos:
Preparacin de la fuente enzimtica (Polvos acetnicos): Los hgados
recientemente extrados de 4 pichones son homogeneizados en 10
volmenes de acetona fra durante un minuto, luego de filtrar y lavar
varias veces, el residuo obtenido es secado a temperatura ambiente
obtenindose as polvos secos, fciles de conservar.
El da de la prctica se muelen en un mortero 700 mg de polvos
acetnicos con 7 ml de agua destilada y luego se centrifuga el
preparado a 2000 r.p.m. por 10 minutos. Se decanta el sobrenadante
y se completa el volumen a 35 ml con agua destilada.
La acetona por su accin deshidratante facilita la extraccin de
enzimas de los tejidos. En esta forma la acetona reduce la
desnaturalizacin de las (enzimas) protenas y concomitantemente
produce la desintegracin de las estructuras celulares y la
disrupcin de los enlaces lipoproteicos.
Preparacin del experimento de la transaminacin.
En cuatro tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con
HNO3 concentrado, medir lo siguiente:
REACTIVOSSISTEMAS
IIIIIIIV
Alanina 0.05 M0,2 ml---
Glutamato 0.05 M-0,2 ml--
Aspartato 0.05 M--0,2 ml0,2 ml
alfa-cetoglutarato 0.1 M0,2 ml-0,2 ml0,2 ml
Piruvato 0.1 M-0,2 ml--
Extracto enzimtico0,2 ml0,2 ml0,2 ml-
Extracto enzimtico hervido---0,2 ml
Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en bao mara
a 37 oC durante una hora
Identificacin de los productos de la reaccin por cromatografa en
capa fina: Cada grupo dispondr de una placa de vidrio con Silica
Gel, de 200 x 200 mm, en la que se han marcado los puntos de origen
a 15 mm del borde inferior, con una distancia entre ellos de 25 mm
y en el siguiente orden: Uno para cada uno de los cuatro tubos de
experimento y tres para los tres estndares de: Alanina, Glutamato y
Aspartato. Estos sistemas estndares debern ser preparados de la
siguiente manera:
Medir 0.2 ml del Aminocido (Alanina, Glutamato o Aspartato) que
previamente se encuentra a concentracin 0.05 M y agregar 0.8 ml de
agua.
PUNTOS DE ORIGEN
Muesta o
Sistema No1234Estandar EstandarEstndar
AlaninaGlutmic.Asprtico
Rf x 100
Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto de
origen que les corresponde, 10 ul de cada sistema incubado y 2 ul
de las soluciones estndar de aminocidos en alcuotas de no ms de 1
ul cada vez, dejando secar cada rea despus de cada aplicacin. Al
final, colocar la placa en la cmara cromatogrfica conteniendo como
solvente 75 volmenes de fenol y 25 de agua.
La cromatografa termina cuando el solvente alcanza la lnea
marcada a 10 cm de los puntos de origen. Entonces sacar la placa,
secarla en la estufa a 110 C por 3 minutos, y revelar el
cromatograma rociando una solucin de ninhidrina al 0.1% en
n-butanol saturado con agua y luego dejarla secar. La representacin
esquemtica de los resultados obtenidos luego de revelar el
cromatograma se muestra en la pgina siguiente.
Expresin de Resultados: Calcular los Rf x 100 de cada mancha,
completar la tabla anterior e interpretar el cromatograma con los
resultados obtenidos. Haga un comentario de cada uno de los
sistemas preparados:
Rf
Rf
Mancha N 1 ................
Mancha N 5 ................
Mancha N 2 ................
Mancha N 6 ................
Mancha N 3 ................
Mancha N 7 ................
Mancha N 4 ................
Haga la identificacin de cada una de las manchas sealando a qu
aminocido corresponde en base a sus valores de Rf. Tenga en cuenta
que los valores de Rf para los aminocidos: Alanina, ac. glutmico y
ac. Asprtico son de 58, 26 y 11.2 respectivamente, para el solvente
usado en la presente cromatografa.
Aminocido
Aminocido
Mancha N 1 ................
Mancha N 5 ................
Mancha N 2 ................
Mancha N 6 ................
Mancha N 3 ................
Mancha N 7 ................
Mancha N 4 ................
INTERROGANTES BIOQUIMICAS
1. Que es Rf
2. Cuales son las reacciones catalizadas por TGO y TGP
3. Que papel desempea el piridoxal fosfato en las reacciones de
transaminacin?. Cul es el grupo funcional del cofactor?. Explique
su mecanismo
4. Cul es el objeto del sistema 2
5. Explique el mecanismo que permite la separacin de sustancias
por cromatografa en capa fina
6. Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reaccin
de transaminacin?. Fundamente su respuesta
7. Pronostique el efecto de una deficiencia de vitamina B6 sobre
la degradacin de los aminocidos. La degradacin de los 20 aminocidos
sera afectada?.
8. Cul ser la distribucin celular de la TGO y TGP?
9. Si en el experimento de transaminacin que Ud. realiza colocar
cido pirvico uniformemente marcado con C14, Qu aminocidos espera
encontrar marcados preferentemente?. Fundamente.
10. Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos
marcados se incorporaran en una protena. Seale algunas secuencias
de reacciones que permitan explicar este fenmeno.
11. Participan las reacciones de transaminacin en la biosntesis
de aminocidos?
12. Que pensara de un ensayo en el cual una muestra biolgica
como el suero se mezclara con aspartato, alfa-cetoglutarato, NADH y
un exceso de malato deshidrogenasa?. Que ideara para determinar la
actividad de TGP por un mtodo similar?.
13. Si se utilizara leucina y -ceto glutarato para estudiar la
transaminacin; qu productos se podra identificar?. Qu nombre
propondra para la enzima involucrada?
14. Es factible la identificacin de cetocidos mediante
cromatografa?. De qu manera?
EXPERIMENTO 2
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ALANINA AMINO TRANSFERASA (TGP)
EN SUERO SANGUINEO
Objetivos
Estudio de la transaminacin en sueros normales y patolgicos
Aplicacin del mtodo colorimtrico de Reitman y Frankel para la
determinacin de la actividad de la TGP srica.
Mtodos.Determinar la cantidad de piruvato formado luego de
reaccionar Alanina y - ceto Glutarato en presencia de la TGP del
suero utilizando la reaccin con la 2,4 dinitro fenilhidrazina en
medio alcalino.Procedimiento:En dos tubos de ensayo rotulados como
B (Blanco) y D (Desconocido), colocar:
REACTIVOSBD
Sustrato TGP (Alanina y ceto glutarato en Tampon Fosfato pH
7.4)0.25 ml0.25 ml
Colocar en Bao mara a 37 C por 2 minutos y aluego agregar:
Suero sanguineo------50 l
Agua destilada50 l------
Mezclar por agitacin suave. Incubar exactamente por 30 minutos y
luego agregar:
Reactivo 2.4 DNFH ( 2,4 Dinito fenilhidrazina)0.25 ml0.25 ml
Mezclar. Dejar durante 10 minutos a 37 C. Luego agregar:
NaOH 0.4 M2.5 ml2.5 ml
Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 2 minutos leer
en el fotocolormetro con filtro verde (500-550 nm), llevando
previamente el aparato a cero D.O. con agua destilada.Construccin
de la curva de calibracin.Para poder convertir la absorbancia de la
muestra en unidades de actividad enzimtica es necesario construir
la curva de calibracin respectiva.
As, usando los datos de la siguiente Tabla, haga en papel
milimetrado la curva correspondiente y pguela en el espacio
sealado. Coloque en el eje vertical (Y) las absorbancias netas y en
el eje horizontal (X) las actividades en unidades/litro de suero.
Actividad TGP en U/L01328466690
Absorbancia (DO)0.1650.2400.3000.3600.4100.455
Valores Normales.
Actividad TGP srica : 6 30 U/L
Actividad TGO srica : 8 40 U/L
Expresin de Resultados:
1.- Complete la siguiente Tabla:
SISTEMASBD
Absorbancia bruta
Absorbancia neta
Actividad de TGP (U/L)
2.- Haga un breve comentario del experimento realizado y del
valor de actividad transaminsica obtenida.
Interrogantes Bioqumicas.1.- Escriba las reacciones catalizadas
por la TGP y TGO.
2.- Qu papel desempea el piridoxal fosfato en las reacciones de
transaminacin. Explique su mecanismo de accin.
3.- Se desprende amoniaco libre en el medio durante las
reacciones de transaminacin? Fundamente su respuesta.
4.- De qu manera es de utilidad la determinacin de la actividad
TGP en el diagnstico de la deficiencia de piridoxina? Si en un
paciente se encuentra disminuida la actividad TGP del suero, es
suficiente este dato para diagnosticarlo como deficiente en
piridoxina?. Por qu?
5.- Se hace referencia de que en el hepatocito TGP es una
enzima, exclusivamente citoslica. Est Ud. de acuerdo con esta
afirmacin? Cul sera la distribucin intracelular de la TGO?
Fundamente su respuesta.
6.- Si en el experimento de transaminacin que Ud. ha realizado,
colocara cido pirvico uniformemente marcado con C-14. Qu aminocidos
esperara encontrar marcados preferentemente? Fundamente su
respuesta.
7.- Si se administra glucosa C-14 a un animal de laboratorio,
los carbonos marcados se incorporarn en una protena? Seale la
secuencia de reacciones que permita explicar este proceso.
8.- Participan las reacciones transaminacin en la biosntesis de
aminocidos? Cite algunos ejemplos.
9.- Qu otro mtodo, adems del que se us en esta prctica, podra
emplear para detectar los productos de la reaccin de
transaminacin.
10.- Qu pensara de un ensayo en el cual una muestra de suero es
mezclada con aspartato, alfa ceto glutarato, NADH y un exceso de
malato deshidrogenasa? Cul sera su fundamento? La actividad de qu
enzima se estara midiendo?
PRACTICA N 6
GLUCOGENO HEPATICO
RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Determinacin de glucgeno heptico en animal alimentado
2. Determinacin de glucgeno heptico en animal en ayunas
3. Determinacin de glucgeno heptico en animal tratado con
adrenalina
4. Determinacin de glucgeno heptico en animal tratado con
aloxano
INTRODUCCION
El glucgeno es una forma de almacenamiento de glucosa fcilmente
movilizable. Al igual que la amilopectina del almidn, es un
polisacrido ramificado, constituido por unidades de D-glucosa
unidas mediante enlaces alfa (1-4) , y ramificaciones ligadas por
enlaces alfa (1-6). Las ramificaciones estn separadas unas de otras
por lo menos cuatro residuos en las porciones ms centrales de la
molcula hacindola ms compacta.
El glucgeno, polisacrido de reserva, se encuentra en los tejidos
animales, pero abunda especialmente en el hgado y en el msculo.
Aparece en las clulas como partculas discretas, las cuales
evidentemente son agregados de molculas con un peso molecular que
varia alrededor de 2 X 107. La cantidad de glucgeno varia
ampliamente, no solamente entre diferentes tejidos, sino tambin
dentro de un mismo tejido, dependiendo del suministro de glucosa y
de la demanda metablica de energa. El hgado y el msculo contienen
los ms grandes depsitos de glucgeno, por lo que nosotros nos
ocuparemos de su metabolismo en estos rganos.
En general la dieta afectar ms el contenido de glucgeno del
hgado que el del msculo, mientras que el ejercicio fsico afectar ms
el contenido de glucgeno muscular que el del hgado. Adems los
depsitos de glucgeno heptico y muscular tendrn diferentes roles. El
glucgeno muscular esta presente para servir como una reserva de
combustible para la sntesis de ATP dentro del msculo, mientras que
el glucgeno heptico funcionar como una reserva de glucosa para el
mantenimiento de la concentracin de glucosa en sangre
(glicemia).
Un valor tpico para el contenido de glucgeno heptico en una
persona bien alimentada es alrededor de 6,5g/100g de tejido; hay
mucho menos despus del ayuno y mucho ms despus de una dieta rica en
carbohidratos. El msculo esqueltico tpicamente tiene 1,4g/100g de
tejido, el cual no cambia mucho despus del ayuno nocturno o con una
dieta rica en carbohidratos.
El glucgeno heptico puede formarse a expensas de glucosa y otros
monosacridos (glucognesis), como tambin de residuos provenientes
del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono, protenas
y lpidos (gluconeognesis). Las vas de sntesis de glucgeno
(glucognesis) y de degradacin hasta glucosa (glucogenolisis), son
independientes, lo que determina que los mecanismos regulatorios
del metabolismo del glucgeno acten independientemente.
La glucgeno sinteasa y la glucgeno fosforilasa son las enzimas
regulatorias de sntesis y degradacin de glucgeno respectivamente.
Ellas son reguladas recprocamente; cuando una es estimulada, la
otra es inhibida, nunca estn completamente activas
simultneamente.
Sntesis de glucgeno favorecida
Degradacin de glucgeno favorecida
Regulacin recproca de la glucgeno sinteasa y la glucgeno
fosforilasa por fosforilacin y defosforilacin. Los grupos seril
fosforilados se muestran como -O-P
OBJETIVOS:
1. Realizar la determinacin de glucgeno heptico
2. Cuantificar los niveles de glucgeno heptico en diferentes
estados nutricionales y hormonales:
Animal alimentado normalmente (ad libitum)
Animal en ayunas
Animal tratado con adrenalina
Animal Diabtico (tratado con aloxano)
PROCEDIMIENTO:
1. PREPARACION DE LOS ANIMALES EXPERIEMNTALES
a) Rata A: Que recibir su alimentacin habitual sin restriccin
alguna.
b) Rata B: Que permanecer en ayunas por lo menos 24 horas antes
del experimento.
c) Rata C : Estando el animal bien alimentado, pesarlo y
proceder a inyectarle 0,025 mg de adrenalina por cada 100 g de
peso, con dos horas de anticipacin a la prctica. Utilizar una
solucin de adrenalina que contenga 0,25 mg / ml.
d) Rata D: 24 horas antes del experimento se inyectar por va
subcutnea una solucin de aloxano ( 50 mg / ml ) a razn de 200 mg /
Kg de peso.
2. EXTRACCIN DEL GLUCGENO
Mtodo: Mtodo de krisman
Fundamento:
Se trata un trozo de tejido heptico con una base fuerte (KOH) en
caliente, siendo degradadas las protenas y otros constituyentes;
quedando preservado el glucgeno, el cual es precipitado con etanol
y se le hace reaccionar con el yodo para hacer su determinacin
colorimtrica. Se aumenta la sensibilidad de esta reaccin con la
presencia del cloruro de calcio.
Reactivos:
1. Solucin iodo-iodurada: Pesar 0,26 g de yodo y 2,6 g de yoduro
de potasio. Disolver en 10 ml de agua destilada
2. Cloruro de calcio saturado a temperatura ambiente. Pesar 97,7
g de cloruro de calcio, disolver en 100 ml de agua. Filtrar antes
de usar
3. Reactivo de yodo: Mezclar 130 ml de la solucin de cloruro de
calcio con 0,5 ml de la solucin iodo-iodurada. Guardar en frasco
oscuro a 0 C, durante siete das mximo.
Procedimiento:1. En un tubo de centrfuga medir 0,9 ml de KOH al
33 % y colocarlo en un bao mara hirviente
2. Sacrificar los animales por decapitacin y tan rpido como sea
posible extraer el hgado y pesar 100 mg de l. Colocar
inmediatamente el trozo de hgado en la solucin de KOH que se
encuentra en el bao hirviente y dejarlo all por 20 minutos,
agitando de vez en cuando para permitir la disgregacin del
tejido.
3. Retirar el tubo del bao y enfriar. Aadir 1,3 ml de etanol al
96% mezclar y calentar la solucin hasta la ebullicin teniendo
cuidado que no se proyecte. Enfriar inmediatamente en bao de hielo
por 5 minutos, para permitir la precipitacin del glucgeno
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y decantar el
sobrenadante. Colocar el tubo boca abajo sobre un papel filtro
5. Neutralizar el exceso de lcali aadiendo 0,2 ml de cloruro de
amonio saturado y mezclar cuidadosamente con una varilla de vidrio
permitiendo que la solucin aadida entre en contacto con toda la
pared interna del tubo 6. Preparar un blanco para lo cual se mide
0,4 ml de agua destilada y 2,6 ml del reactivo de yodo; proceder
enseguida igual que las muestras problema.
7. Colocar el tubo en bao mara hirviente durante 15 minutos y
enfriar. Aadir 0,2 ml de agua destilada y 2,6 del reactivo de yodo.
Si la cantidad de glucgeno precipitado es grande, hacer en esta
etapa una dilucin apropiada.
8. Medir la absorbancia utilizando filtro verde
9. Para preparar las soluciones estndar se pueden medir 0,4 ml
de soluciones que contengan 0,06 mg, 0,18 mg 0,24 mg de glucgeno. A
cada una de estas tres soluciones estndar, aadir 2,6 ml del
reactivo de iodo , mezclar y proceder de la misma forma que la
sealada para la muestra de hgado.
Resultados.
1. Anotar el aspecto y tamao del hgado de los animales de
experimentacin
Rata A: ........................................... Rata C:
................................................
Rata B: ............................................ Rata D:
................................................
2. Observar la cantidad de precipitado despus de
centrifugar.
Absorbancia brutaAbsorbancia netaConcentracin de Glucgeno
(mg)Factor de calibracin
BLANCO0.118
ESTANDAR 10.192
ESTANDAR 20.338
ESTANDAR 30.416
3. Calcular el factor de calibracin:
..........................
4. Graficar la curva de calibracin con los datos anteriores.
Utilizando papel milimetrado
5. Calcular la concentracin de glucgeno en cada una de las
muestras Expresar los resultados en mg de glucgeno por 100 mg, 200
mg y en el peso total del tejido heptico
Peso del hgado (mg)Ab BrutaAb NetaCONCENTRACION en mg
/ 200 mg
Hgado/ 100 mg
Hgado/ Hgado
Total
Rata A
(Alimentado )5.351.20
Rata B
(ayunas)4.500.50
Rata C
(trat. con adrenalina)4.320.44
Rata D
(trat. con aloxano)3.980.38
6. Calcular el porcentaje de disminucin del glucgeno en 100 mg
de hgado con relacin al animal alimentado
mg de glucgeno/
100 mg de hgadoPorcentaje de disminucin en relacin al animal
alimentado
RATA A
RATA B
RATA C
RATA D
7. Haga la interpretacin de los resultados para cada rata:
Rata A:
Rata B:
Rata C:
Rata D
INTEROGANTES
1. Qu ventaja tiene la fosforlisis del glucgeno en comparacin
con la hidrlisis.
2. Qu diferencia hay entre la accin glucogenollitica de la
adrenalina y glucagon en el hgado y en el msculo.
3. Represente esquemticamente el mecanismo de accin de la
adrenalina sobre la regulacin en el metabolismo del glucgeno.
3. Si se administra leucina marcada con C-14 ser factible ala
identificacin posterior de glucgeno marcado con C-14.
4. Cmo se explica que el animal diabtico tenga menores niveles
de glucgeno heptico que su contraparte normal.
5. Represente esquemticamente el mecanismo de accin de la
insulina sobre el metabolismo del glucgeno.
PRACTICA No 7
METABOLISMO DE LIPIDOS: HIGADO GRASO EXPERIMENTAL
RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Produccin de un hgado graso en rata
2. Determinacin de cidos grasos en el hgado de una:
Rata control
Rata a la cual se ha administrado Etionina
Rata a la cual se ha administrado Etionina + Metionina
INTRODUCCION
El rol que cumple el hgado en el metabolismo lipdico es
sumamente importante. En este sentido podemos decir que los
siguientes procesos se realizan en la:
Oxidacin de los cidos grasos
Sntesis de cidos grasos y colesterol
Sntesis de lipoproteinas plasmticas :Lipoproteinas de muy baja
densidad (VLDL); lipoproteinas de alta densidad (HDL)
Sntesis de cidos biliares
Se encarga casi exclusivamente de la sntesis de cuerpos
cetnicos
En ocasiones puede ocurrir alteraciones de estos procesos en el
hgado, lo que determina un anormal aumento en su contenido graso,
esta situacin se denomina hgado graso o esteatosis heptica. Esta
entidad merece una especial atencin del mdico ya que resulta ser
con frecuencia el antesala de la cirrosis heptica.
Desde un punto de vista general podemos considerar hasta cuatro
situaciones importantes que pueden ocasionar hgado graso.
Aumento en la cantidad de cidos grasos que llegan al hgado; sea
procedentes de la alimentacin o de otros tejidos
Menor oxidacin de los cidos grasos en el hgado
Mayor sntesis de cidos grasos en el hgado
Disminucin en la salida lipdica del hgado generalmente debido a
un defecto en la sntesis de lipoproteinas plasmticas.
Nota: Las lneas discontinuas indican que el evento no se est
realizando.
Experimentalmente se puede inducir el hgado graso mediante la
administracin de diversos agentes, como el tetracloruro de carbono,
puromicina, cido ortico, etionina, etc. En esta prctica
estudiaremos el hgado graso inducido por la etionina, tomando como
parmetro el contenido de cidos grasos del hgado, ya que a pesar que
el hgado graso puede ser inducid de diversas formas, es comn
denominador el aumento de triglicridos
Etionina es un compuesto estructuralmente relacionado al
aminocido esencial metionina y por lo tanto tiene un comportamiento
de antagonista competitivo, en la sntesis de protenas y de
fosfatidil colina, de esta manera bloquea la sntesis de
lipoproteinas y finalmente la salida de lpidos del hgado.
COOH COOH
CH CH2 CH2 S CH3 CH CH2 CH2 S CH2 CH3
NH2 NH2 Metionina Etionina
Objetivos:
1.- Conocer el mecanismo bioqumico por el cual etionina induce
esteatosis heptica
2.- Conocer el fundamento de la determinacin de los cidos grasos
en el hgado
3.- Estudiar el efecto de la metionina sobre el hgado graso
producido por metionina
4.- Indicar algunas alternativas de tratamiento en pacientes que
sufren esteatosis heptica
Metodologa.
El da anterior a la prctica se inyecta va intraperitoneal a un
lote de tres ratas hembras, las siguientes soluciones:
1.- Rata control: Solucin salina isotnica 3 ml. Inyectar la
misma cantidad a las 2:30, 5 horas y 7 horas despus de la primera
inyeccin.
2.- Rata tratada con Etionina: Se inyectar intraperitonealmente
3 ml de una solucin de DL-Etionina (16,7 mg/ml). Inyectar la misma
cantidad alas 2,5 horas; 5 horas y 7 horas despus de la primera
inyeccin.
3.- Rata tratada con Etionina + Metionina: Recibe el mismo
tratamiento que la rata con etionina, pero adems se le inyecta 3 ml
de L-metionina ( 20 mg/ml ) una hora antes de la primera inyeccin
de etionina y una hora despus de cada inyeccin de etionina.
En este experimento se usarn ratas hembras, debido a que el
incremento de grasa heptica es mucho ms pronunciada en hembras que
en machos.
DETERMINACION DE LOS ACIDOS GRASOS
- Transcurridas 24 horas de iniciado el tratamiento de los
animales se les sacrifica y se les retira rpidamente del hgado un
trozo de 2,5 g, el que se fragmenta con la ayuda de tijeras y se
deposita en un Erlenmeyer de 250 ml.
- Se le aade luego 10 ml de hidrxido de potasio al 33% y 40 ml
de etanol al 96% con alcohol isoamlico al 0,4%.
- Se calienta la preparacin en bao mara hirviente durante 20
minutos, teniendo cuidado que no se proyecte el contenido.
- Aadir 17 ml de HCl al 25%, mezclar y dejar en reposo algunos
minutos
- Aadir luego con pipeta volumtrica 25 ml de ter de petrleo.
- Tapar cuidadosamente el recipiente y agitar fuertemente
durante un minuto. Dejar en reposo por 10 minutos para conseguir
una adecuada separacin de las fases ter de petrleo y etanol-cido.
Para esta ltima etapa se puede utilizar una probeta en lugar del
Erlenmeyer, con la ventaja de mirar mejor la separacin de las dos
fases.
- Retirar 5 ml de la capa etrea (superior), y colocarlos en un
Erlenmeyer y aadir 1 ml de solucin de etanol-alcohol isoamlico y
dos gotas de azul de timol.
- Finalmente titular con NaOH 0.1 N hasta obtener un color azul
verdoso que debe permanecer estable por lo menos 3 minutos.
Para efecto de los clculos asuma que el PM promedio de los cidos
grasos que se estn titulando es de 284.
Complete la siguiente tabla:
Caractersticas del hgado
Peso totalColorConsistencia
Rata control6.8 gr
Rata con etionina7.3 gr
Rata con Etionina + Metionina7.2 gr
Anote el contenido de cidos grasos en miliequivalentes en el
volumen de titulacin y en miligramos por gramo de tejido heptico
hmedo.
Contenido de cidos grasos
NaOH 0,1 N
ml gastadosmEq / 5 mlmEq / 25 mlmg de A.G. por gramo
de hgado
Rata Control
1.3
Rata con etionina (E)3.6
Rata con E + Metionina2.0
INTERROGANTES1.- Haga una interpretacin adecuada de los esquemas
mostrados
2.- Porque la administracin de adenina revierte en cierta forma
los efectos de la etionina
3.- Cite por lo menos cinco alteraciones bioqumicas que se
producen en los animales tratados con etionina
4.- Porqu la deficiencia de cido pantotnico puede determinar
hgado graso
5.- Qu conocimientos tiene, en relacin al hgado graso inducido
por etanol
PRACTICA N 8
HIPERBILIRRUBINEMIAS
RELACION DE EXPERIMENTOS
1.- Determinacin de la bilirrubina directa e indirecta en el
suero sanguneo
2.- Identificacin de pigmentos biliares en la orina (Reaccin de
Gmelin)
INTRODUCCION
Se denominan hiperbilirrubinemias a las enfermedades que cursan
con aumento en la concentracin de bilirrubina en el suero sanguneo.
Este aumento puede ser a predominio de la bilirrubina directa
(conjugada); en cuyo caso se hablara de hiperbilirrubinemias a
predominio indirecto o a predominio directo. Sin embargo resulta ms
apropiado agrupar las hiperbilirrubinemias en atencin al mecanismo
de su produccin y desde este punto de vista, se describen cuatro
categoras:
I.- Hiperbilirrubinemias por sobreproduccin de bilirrubina
II.- Hiperbilirrubinemias por menor captacin heptica de
bilirrubina
III.- Hiperbilirrubinemias por alteracin en la conjugacin
heptica de la bilirrubina
IV.- Hiperbilirrubinemias por alteraciones en la excrecin de
bilirrubina
Para la tipificacin de las hiperbilirrubinemias se han descrito
diversos anlisis de laboratorio. Entre estos podemos destacar :
a) Determinacin de bilirrubina directa e indirecta en el suero
sanguneo
b) Identificacin de pigmentos biliares (bilirrubina) en la
orina
c) Excrecin urinaria de urobilingeno
d) Medida de la actividad transaminsica (TGP y TGO) en suero
e) Medida de la actividad glucoronil transfersica del hgado
f) Medida de la actividad fosfatsica alcalina del suero
g) Prueba de la bromosulfotaleina
De todas estas determinaciones slo se practicarn las dos
primeras en la presente prctica y se usarn como muestra el suero
sanguneo y la orina de un paciente ictrico y de una persona
aparentemente normal. EXPERIMENTO 1
DETERMINACION DE LA BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA EN EL SUERO
(Mtodo: Malloy Evelyn.) Fundamento del mtodo.
Objetivos:
1.- Determinar las bilirrubinas en el suero de un paciente con
ictericia.
2.- Determinar las bilirrubinas en el suero de un sujeto
aparentemente normal
3.- Comparar el resultado obtenido en ambas determinaciones
Procedimiento
1.- En 4 tubos de prueba rotularlos como I, II, III y IV, medir
lo siguiente:
IIIIIIIV
Suero diluido (1/10)2,02,02,02,0
Agua destilada2,52,5------
Metanol------2,52,5
Reactivo de Erhlich0,5---0,5---
Reactivo blanco---0,5---0,5
2.- Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos
3.- Leer en el fotocolormetro utilizando filtro verde
4.- Con anterioridad a la practica se prepar un sistema estndar,
midiendo 2,5 ml de una solucin de bilirrubina (0.004 mg/ml), se
aadi luego 2.5 ml de metanol y 0.5 ml del reactivo de Erhlich. Se
midi la absorbancia en las condiciones sealadas para el suero (2 y
3) y se obtuvo una lectura de 0.224.
5.- Utilizar el procedimiento descrito tanto para el suero del
paciente ictrico y el suero normal
Expresin de los resultados
1.- Estimar el factor de calibracin porcentual
Absorbancia del Estndar
: .................
Concentracin del Estndar : ................. Factor de
calibracin
: .................
Factor de calibracin porcentual: ................
2.- Completar la siguiente tabla: ABSORBANCIASCONC.
BILIRRUBINAS
IIIIIIIVBTBDBI
Suero Normal
Suero A
Suero B0.0520.0340.4300.046
Suero C0.1940.0580.2920.052
3.- Completar la siguiente tabla indicando si los valores de la
concentracin de bilirrubina directa (BD) y de la bilirrubina
indirecta (BI), estn aumentados (A), normales (N) o disminuidos
(D).
Bilirrubina directa (BD)Bilirrubina indirecta (BI)
MUESTRA A
MUESTRA B
MUESTRA C
EXPERIMENTO 2IDENTIFICACIN DE PIGMENTOS BILIARES EN LA ORINA
Objetivos
1.- Realizar la reaccin de Gmelin en una orina colrica
2.- Realizar la reaccin de Gmelin en una orina normal y comparar
el resultado obtenido con el correspondiente a la orina colrica
Mtodo
Identificar la presencia de bilirrubina en la orina utilizando
la accin oxidante del cido conteniendo trazas de cido nitroso
(reaccin de Gmelin).
Procedimiento
1.- En un tubo de prueba medir 2 ml de orina
2.- Con una pipeta hacer llegar hasta el fondo del tubo, 2 ml de
cido ntrico-nitroso, tratando que se formen dos capas
3.- Observar los cambios de coloracin que ocurren entre ambas
capas
4.- Hacer la reaccin utilizando la orina patolgica y una orina
normal
Expresin de los resultados
Anote sus resultados en el espacio en blanco
1.- Orina normal 2.- Orina patolgica
INTERROGANTES 1.- Qu Contiene el reactivo de Erhlich
2.- Porqu no se prepara un tubo blanco para la determinacin de
bilirrubinas por el
mtodo de Malloy Evelyn. Tenga en cuenta que los tubos 2 y 4 no
corresponden a
los blancos que Ud. esta acostumbrado a preparar.
3.- Qu bilirrubina es la que se determina en el tubo N 3 y por
qu?4.- Dan positiva los bilatrienos (biliverdina) la reaccin de
Gmelin. Fundamente su
respuesta. 5.- El urobilingeno da positiva la reaccin de
Gmelin?
6.- Qu tipo de bilirrubina es la que se encuentra en la orina en
cantidades trazas en una persona normal?
7.- A qu se llama ictericia?
8.- Cumplen rol fisiolgico los pigmentos biliares?
9.- Seale las causas ms comunes de un aumento de bilirrubina
tipo directa.
PRACTICA-TALLER N 9ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LOS
NUCLEOTIDOS
Caso Clnico 1
N.S.T.es un empleado de 47 aos de edad que asisti al servicio de
emergencia de un hospital, quejndose de un dolor muy intenso en el
primer dedo del pi derecho y que haba comenzado 6 horas antes de la
consulta.
No haba sufrido ningn trauma en ese dedo, pero al examen clnico
apareca rojo e hinchado. Estaba con mayor temperatura y
extremadamente doloroso a cualquier presin. El Paciente no poda
flexionar ni extender las articulaciones de dicho dedo y el
movimiento pasivo de las mismas le causaba un intenso dolor. El
resto del examen clnico fue completamente normal.
Los exmenes de laboratorio resultaron normales, con excepcin de
una excrecin urinaria de cido rico de 1.21 g / 24 hrs (V.N. 0.3 a
0.6 g / 24 hrs.) y una concentracin de cido rico en el suero de
0.64 mmoles / L. Se obtuvo mediante aspiracin con una aguja, una
muestra de lquido de la articulacin comprometida y la observacin
bajo microscopa de luz polarizada revel la presencia de cristales
semejantes a agujas y que se encontraban tambin fagocitados por
leucocitos. Este material fue informado como cristales de urato de
sodio.
En Vista de lo anterior, nuestro paciente fue diagnosticado como
gotoso y una vez mejorado el cuadro agudo, se le indic para su
tratamiento Alopurinol por va oral a la dosis de 150 mg dos veces
al da. A los pocos das de iniciado el tratamiento el cido rico
srico comenz a bajar y luego de varias semanas dichos valores ya
estaban muy cerca de lo normal.
El Paciente fue controlado durante los meses siguientes, no
volviendo a presentar un episodio similar de artritis gotosa e
igualmente no se constat manifestaciones sugerentes de la presencia
de clculos renales de cido rico.
Caso Clnico 2
Nuestro paciente es ahora una nia de 22 meses de edad, nica hija
de un matrimonio entre primos hermanos. Desde su nacimiento present
una severa deficiencia de linfocitos T, que se manifest por
infecciones respiratorias frecuentes, candidiasis y marcada
linfopenia, menos de 500 linfocitos por microlitro de sangre. Se
considera linfopenia en nios cuando el nmero de linfocitos es menor
a 3000 por microlitro de sangre; normalmente los linfocitos T son
cerca del 50 % del nmero total de linfocitos.
La administracin de vacuna contra la difteria, tos convulsiva y
ttano produjo una mnima respuesta en la nia.
Se practic la determinacin de la actividad de las isoenzimas de
Adenosina Desaminasa (ADA) en un lisado de hemates de la paciente,
hacindose el mismo estudio en ambos padres y en dos controles
normales. Los resultados se muestran en la figura adjunta y
corresponden a la separacin electrofortica de las dos isoenzimas ms
importante de la ADA y su tincin para determinar su actividad. La
determinacin espectrofotomtrica de la actividad total de la ADA
demostr ausencia de actividad en los hemate de la nia ; en tanto
que el padre y la madre tenan actividades de ADA que correspondan
al 50 % y 60 % de lo normal respectivamente..
En la nia deficiente de ADA, se detrminaron los niveles de
desoxinucletidos de adenina en los eritrocitos, obtenindose los
resultados que se muestran en la tabla siguiente.
dATP ( nmoles/ml)dADP (nmoles/ml)dAMP (nmoles/ml)
PACIENTE904985
NORMALNSDNSDNSD
NSD: No se detecto
Bases Moleculares y Correlato Clnico-Bioqumico.
Si bien se ha descrito varias enfermedades asociadas a
alteraciones en el metabolismo de los nucletidos pricos y
pirimidnicos, las alteraciones que predominan en humanos son
aquellas que resultan de un alterado catabolismo de los nucletidos
pricos.
La Tabla 2. Muestra las diferentes enfermedades asociadas a
alteraciones en el metabolismo de nucletidos pricos y
pirimidnicos
1.- ALTERACIONES EN EL CATABOLISMO DE LAS PURINAS
EnfermedadEnzima afectada
GotaPRPP Sinteasa, PRPP Amidotransferasa
HGPRT (parcialmente)
Sndrome de Lesch-NyhanHGPRT (completamente)
Inmunodeficiencia Severa Combinada (SCID)Adenosina Desaminasa
ADA
XantinuriaXantino Oxidada
InmunodeficienciaPurinonuclesido Fosforilasa (PNP)
Enfermedad de Von GierkeGlucosa 6 Fosfatasa
2.- ALTERACIONES EN EL CATABOLISMO DE LAS PIRIMIDINAS
Aciduria Ortica Tipo IOrotatofosforribosiltransferasa y OMP
Descarboxilasa
Aciduria Ortica Tipo IIOMP Descarboxilasa
Aciduria Ortica Moderada sin el componente hematolgicoOrnitina
carbamil transferasa (enzima del Ciclo de la rea).
GOTA.
Es el transtorno ms frecuente del metabolismo de los nucletidos
y se caracteriza por una excesiva produccin de cido rico, que a
causa de su escasa solubilidad en el agua tiende a precipitar como
cristales de urato de sodio, de manera especial en el lquido
sinovial de las articulaciones. Las clulas fagocticas intentan
digerir este material, pero su tamao y la indigestibilidad de los
cristales causa ms bien la destruccin de estas clulas y la
liberacin de sus enzimas lisosomales al espacio articular. Estas
enzimas a su vez determina una reaccin inflamatoria aguda de la
capsula articular (sinovitis) determinando las tpicas
manifestaciones de la artritis gotosa.
La manifestacin bioqumica caracterstica de la gota es el aumento
de cido rico en sangre (hiperuricemia) y casi siempre esta
acompaada con aumento en su excrecin urinaria (uricosuria). Los
valores normales para el cido rico en sangre son de 3.5 a 7.0 mg %
en varones y de 2.6 a 6.0 mg % en mujeres y debe tenerse en cuenta
que estos valores aumentan con la altitud. La excrecin urinaria
vara normalmente entre 0.3 a 0.6 g/da.
Se acostumbra clasificar a la gota en primaria y secundaria. La
primera corresponde al transtorno producido por alteracin gentica,
la secundaria es consecuencia de otras alteraciones, como la
leucemia, la policitemia, el uso de antimetabolitos para disminuir
la sntesis de cidos nucleicos, etc.
La frecuencia con la que se presenta al gota es relativamente
alta, cerca del 3% en los EEUU y en otros pases parece ser muy
similar. La incidencia familiar es del 70 al 80% y es mucho ms
frecuente en varones que en mujeres (proporcin 3 a 1).
Se han descrito diversas situaciones que pueden explicar la
mayor produccin de cido rico en un paciente gotoso. Destaquemos las
siguientes:
Aumento en la actividad de la fosforribosil Pirofosfato Sinteasa
(PRPP sinteasa).
Resistencia de la PRPP sinteasa a su inhibicin por
retoalimentacin. Sera el caso en que sus metabolitos reguladores,
como el GMP. AMP e IMP que normalmente se unen a la enzima y la
inactivan, por algn cambio en la estructura de la misma, no se
pueden unir y por lo tanto sigue aumentando la sntesis de
nucletidos pricos.
Aumento en la afinidad de la enzima por la Ribosa 5P. Al cambiar
la estructura de la enzima su afinidad por el sustrato aumenta
(menor KM) y por lo tanto aumenta la sntesis de PRPP.
Aumento en la afinidad de la PRPP amidotransferasa por el PRPP
motivado por una alteracin en la estructura de la enzima.
Perdida de la inhibicin por retroalimentacin de la PRPP
amidotransferasa. Los nucletidos que normalmente la inhiben (AMP,
ADP, ATP, GMP, GDP y GTP) no pueden hacerlo.
Deficiencia pacial en la actividad de la enzima
Hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa ( HGPRT) que impide
la reutilizacin de hipoxantina y guanina determinando su destino
hacia la mayor formacin de cido rico.
En el tratamiento de la gota se usa un anlogo de hipoxantina que
es el Alopurinol. Recordemos que la Xantino Oxidasa cataliza la
conversin de hipoxantina en xantina y posteriormente de la xantina
en cido rico (ver figura). Estando en el medio el alopurinol, la
xantino oxidasa lo hidroxila y lo convierte en aloxantina
(oxipurinol). Este compuesto permanece unido al complejo Mo-S de la
enzima y lo inhibe, no permitiendo la formacin de ms cido rico.
Tambin se ha descrito que el alopurinol puede reaccionar con el
PRPP formando el nucletido correspondiente y utilizando PRPP y
determinando que bajen sus niveles y disminuya la sntesis de
purinas.
Sindrome de Lesch-Nyhan.
El sndrome de Lesch-Nyhan resulta de una alteracin a nivel del
gen que codifica para la enzimahipoxantina-guanina fosforribosil
transferasa, que est localizado a nivel del cromosoma X
(Xq26-q27.2) determinando una enfermedad que se transmite bajo la
modalidad ligada al sexo. Los pacientes tiene severas
manifestaciones de gota, ya que hay un gran aumento en la formacin
de cido rico y adems desarrollan conductas sumamente agresivas que
los lleva a su propia automutilacin, frecuentemente se muerden las
extremidades distales de los dedos y los labios. Junto a lo
anterior, los pacientes muestran movimientos involuntarios y
retardo mental. El pronstico es malo y generalmente estos pacientes
mueren antes de alcanzar los 20 aos de edad.
La severidad de esta alteracin hace ver la importancia de la va
de sntesis de nucletidos pricos por la va de recuperacin y parece
ser que sta sntesis a nivel extraheptico es sumamente importante y
se vera completamente afectada en estos pacientes, contribuyendo a
explicar la severidad de su cuadro.
Deficiencia de Adenosina Desaminasa.
En esta enfermedad tambin denominada Inmunodeficiencia Severa
Combinada8SCID), hay una marcada deficiencia de la enzima Adenosina
Desaminasa que normalmente cataliza la remocin del grupo amino de
la desoxiadenosina y de la adenosina, durante el catabolismo de las
purinas. Las clulas que ms sufren la deficiencia de esta enzima son
los linfocitos T y tambin los linfocitos B. Estas clulas acumulan
grandes cantidades de desoxiadenosina que al ser fosforilada rinde
grandes cantidades ( 50 veces ms de lo normal) de dATP. La alta
concentracin de ste nucletido inhibe a la Ribonucletidoreductasa
evitando la formacin de otros dNTP y por lo tanto inhibiendo la
sntesis de ADN. Como los linfocitos tienen que proliferar en
respuesta a los invasores que llegan al organismo, la respuesta
inmune fracasa y los nios portadores de esta enfermedad no pueden
superar el menor proceso infeccioso y frecuentemente mueren antes
de los 2 aos de edad.
BIBLIOGRAFIA.
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PASCUAL E. and PEDRZ T. (2004) Gout. Crystal deposition
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ROTT K. and AGUDELO C. (2003). Gout. JAMA 289: 2857-2860
CUESTIONARIO
1.- Expresar la concentracin del cido rico del paciente del caso
clnico 1, en mg% (PM del cido: 168).
2.- La concentracin intracelular del PRPP es normalmente es de
10-5 a 10-6 mol/L. La determinacin de la KM de la fosforribosil
pirofosfato amidotransferasa para PRPP en un paciente gotoso dio un
valor de 2 x 10-5 M, en comparacin con un control normal cuyo valor
result 3 x 10-4 M. Utilizando estos datos proponga el mecanismo que
explicara la hiperuricemia del paciente.
3.- Para determinar si una persona con gota ha desarrollado su
enfermedad por una sobreproduccin de cido rico o a causa de una
disminucin en su capacidad de excretarlo, se hace con frecuencia la
prueba de la administracin oral de un aminocido radioactivo. Qu
aminocido sera el ms apropiado y como se procesara dicha
prueba?
4.- Qu alimentos por su alto contenido en purinas deben ser
excluidos de la dieta del paciente gotoso? Es suficiente este tipo
de tratamiento para normalizar los valores sricos de cido rico en
los pacientes gotosos?
5.- Explicar la hiperuricemia de los pacientes con el sndrome de
Lesch-Nyhan. Proponga alguna explicacin sobre la causa de las
alteraciones neurolgicas que estos pacientes presentan.
6.- Explicar la hiperuricemia que se encuentra frecuentemente
asociada: a) A la deficiencia de glucosa 6 fosfatasa (Enfermedad de
Von Gierke) y b) A la hiperactividad de la glutatin reductasa.
7.- Como acta el alopurinol en el tratamiento de la gota? Por qu
se seala que el alopurinol es un inhibidor suicida?
8.- Cul es el mecanismo de accin de la colchicina en el
tratamiento de la gota? En que momento se le usa?
9.- Cmo se explica que los cristales de cido rico en el lquido
articular de los gotosos corresponda a urato monosdico, en cambio
en la orina de los mismos pacientes los cristales sean
frecuentemente de cido rico solamente. Podra encontrarse en estos
pacientes, cristales de urato disdico en algn lugar del
organismo?
10,. Por qu mecanismo (s) el alcoholismo puede determinar
hiperuricemia?
11.- Que explicacin puede dar a los resultados mostrados en el
electroforetograma de las isoenzimas de ADA en el caso clnico 2?.
Teniendo en cuente que en los hemates hay una gran cantidad de
protenas, cmo se puede mediante la tcnica utilizada,detectar
solamente las dos isoenzimas ms importantes de la Adenosina
Desaminasa?
12.- Como se explica la linfopenia del paciente del caso clnico
2 y los continuos cuadros de infeccin respiratoria que present?
13.- Que evidencia (s) existe (n) que los altos niveles de dATP
en los pacientes con deficiencia de ADA sean los que inhiban a la
Ribonucletidoreductasa y determinen menor sntesis de ADN y con ello
el dao a los linfocitos?
15.- De qu manera se ven afectadas las reacciones de metilacin
en que interviene S- Adenosil Metionina (SAM), en los pacientes con
deficiencia de ADA. Utilice en su explicacin el siguiente
esquema.
PRACTICA N 10INTEGRACION Y REGULACION DEL METABOLISMO
RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Produccin de Diabetes Experimental
2. Determinacin de glucosa en sangre
3. Determinacin de glucosa en orina
4. Determinacin de cuerpos cetnicos en orina
INTRODUCCION.
El metabolismo intermediario de cada clase de sustrato por lo
general es considerado por separado; sin embargo, estos procesos
ocurren en nuestro organismo en forma concertada, donde las
diferentes vas metablicas se hallan enlazadas, formando una
verdadera red metablica controlada rigurosamente por diferentes
mecanismos regulatorios.
Esta integracin exquisitamente regulado, es la que permite a
cada clula llevar a cabo sus funciones bioqumicas y sin duda, de
esta intima y armoniosa organizacin depender la funcin integrada de
todas las clulas que conforman un organismo, caso contrario
sobrevendr una enfermedad.
Un aspecto muy interesante en la regulacin del metabolismo
celular corresponde a la participacin de las hormonas que son
sintetizadas en tejidos especficos (Glndulas) secretadas a al
sangre y luego transportadas hasta alcanzar sus clulas blanco,
donde previa interaccin con sus receptores ejercern sus efectos
regulatorios fundamentalmente a travs de :
Activacin o desactivacin de enzimas ya existentes en las clulas
blanco, a travs de segundos mensajeros
Induccin de la sntesis de enzimas o alguna otra protena. En esta
prctica centraremos nuestra atencin en algunas acciones metablicas
de la insulina usando como modelo experimental el estado
diabtico.
La diabetes Mellitus es una enfermedad producida por la carencia
absoluta o relativa de insulina en el organismo, se conoce dos
tipos de esta enfermedad: La diabetes tipo I o insulino dependiente
y la diabetes tipo II o insulino no dependiente. Hay varias
diferencias en cuanto a la etiologa y alteraciones metablicas
entre los dos tipos mencionados; pero lo que caracteriza a cada uno
de ellas y les da el nombre es el hecho de que en la diabetes tipo
I, la causa primaria es un defecto o destruccin de las clulas beta
del pncreas, productores de insulina, y el paciente solo se alivia
con la administracin de insulina. En tanto que en la diabetes tipo
II la causa primaria es un defecto en la respuesta a la insulina,
aqu el paciente alivia sus sntomas por administracin de
antidiabticos que estimulan la secrecin de insulina por las clulas
beta del pncreas y raramente hacen cetosis. Adems la diabetes tipo
II aparece en pocas tardas de la vida (Despus de lo cuarenta aos )
y la herencia juega un rol importante. En cambio en la Diabetes
tipo I La cetosis es comn y aparece en etapas tempranas de la vida
niez o juventud. La tabla I resume las caractersticas ms
importantes de ambos tipos de diabetes.
TABLA I. Caractersticas distintivas entre la diabetes mellitus
insulino dependiente (Tipo I) y la diabetes mellitus no dependiente
de insulina (Tipo II).
CARACTERSTICASTIPO ITIPO II
Edad de inicio
Cetosis
Peso corporal
Prevalencia
Presencia de anticuerpos contra islotes
Complicaciones
Secrecin de insulina
Tratamiento con insulina
Resistencia a la insulinaMenos de 30 aos
Comn
No obeso
0,2- 0,3%
SI
Frecuentes
Casi nula o nula
Siempre necesaria
OcasionalMas de 40 aos
Raro
Obeso (80%)
2-4%
NO
Frecuentes
Normal o casi normal
No es necesario
Usual
Hay muchas sustancias que pueden producir los sntomas diabticos
cuando son administrados al organismo debido a que pueden producir
un deterioro o destruccin de las clulas beta del pncreas, con la
consiguiente ausencia parcial o total de insulina.
Una de las sustancias que produce diabetes es el aloxano
(2,4,5,6 tetraoxipirimidina o pirimina tetrona). Causa un dao
permanente de las clulas beta de los islotes de Langerhans,
producindose un cuadro de diabetes mellitus humana. Esta sustancia
tambin es txica y hepatotxica pero a dosis mayores.
La estreptozotocina es otra sustancia que causa diabetes, es un
antibitico de amplio espectro obtenido de Streptomyces achromogenes
produce necrosis de las clulas beta y su accin es ms selectiva
sobre dichas clulas que el aloxano razn por la cual ahora se el usa
mas en diabetes experimental.
Otras sustancias con capacidad de producir diabetes por afectar
a las clulas beta de los islotes de Langerhans son el cido
dehidroascrbico, la 8-hidroxiquimolina, la ditizona y otras
quimolinas; pero su accin diabetognica es menos pronunciada y menos
especfica que el aloxano y estreptozotocina.
EXPERIEMNTO 1
DETERMINACIN DE LA GLICEMIA
Objetivo :
Determinar la concentracin de glucosa en sangre de un paciente ,
utilizando el mtodo colorimtrico ( Nelson y Somogy).
NOTA: EL uso de este mtodo requiere la desproteinizacin de la
muestra sangunea a fin de evitar interferencia en las reacciones
que deben depender nicamente de la glucosa)
Fundamento: El filtrado libre de protenas se calienta en
presencia de una solucin cprico-alcalino (Cu++) obtenindose la
reduccin del cobre a CuO, el cual acta luego sobre el
arseno-molibdato producindose un complejo de molibdeno reducido de
color azul, cuya intensidad se mide en el fotocolormetro
Procedimiento:
Desproteinizado: En un tubo de ensayo medir :
3,0 ml de NaCl 0,9 %
0,2 ml de sangre
0,4 ml de Sulfato de Zinc al 5%
0,4 ml de hidrxido de Bario al 0,3%
Mezclar bien y dejar en reposo por 5 minutos, luego filtrar o
centrifugar para recuperar el filtrado libre de protenas
Determinacin de glucosa : En tubo de Folin Wo medir lo siguiente
:
1 ml de filtrado libre de protenas
1 ml de reactivo cprico alcalino
mezclar y calentar en bao mara hirviente por 15 minutos
Enfriar en agua corriente y luego aadir:1 ml de reactivo
arseno-molibdato
Mezclar suavemente; aadir agua destilada hasta la marca de 25
ml, mezclar por inversin, dejar en reposo por 5 minutos y leer en
el fotocolormetro con filtro verde.
Preparar un blanco usando 1 ml de agua destilada en lugar del
filtrado.
Preparar un estndar de glucosa que contenga 50 g/ml. Medir 1 ml
de sta solucin y colocarla en un tubo de Folin Wo y proceder como
para el caso de la muestra. La lectura en el fotocolormetro fue de
67 UK (D. O : 0,134).
Resultados
1. Estimar el Factor de calibracin porcentual
Absorbancia blanco __________________
Absorbancia bruta del estndar __________________
Absorbancia neta del estndar __________________
Concentracin del estndar __________________
Factor de calibracin __________________
Factor de calibracin % __________________
2. Completar los espacios en blanco
Lectura Bruta Lectura Neta
Tubo blanco ____________ ____________
Tubo Muestra (N) ____________ ____________
Tubo Muestra (P) ____________ ____________
Concentracin de Glucosa en la muestra (N) es de
___________mg/100 ml
Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es Normal,
Alto o Bajo _________
Concentracin de Glucosa en la muestra (P) es de
___________mg/100 ml
Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es Normal,
Alto o Bajo _________
EXPERIMENTO 2
DETERMINACION DE GLUCOSA EN ORINAObjetivo :
Determinar la concentracin de glucosa en orina utilizando la
prueba de Benedict
Fundamento :
Esta reaccin redox ocurre ms rpidamente en medio alcalino; as
cuando se calienta una suspensin de hidrxido cprico en medio
alcalino y en presencia de una sustancia reductora, como