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KARINE FURTADO MEYER USO DA GLICINA NA PREVENÇÃO DAS LESÕES DA ENTEROCOLITE
NECROSANTE NEONATAL: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Doutor em Ciências.
SÃO PAULO 2006
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KARINE FURTADO MEYER USO DA GLICINA NA PREVENÇÃO DAS LESÕES DA ENTEROCOLITE
NECROSANTE NEONATAL: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. José Luiz Martins Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Gonzaga de Freitas Filho
SÃO PAULO 2006
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Meyer, Karine Furtado Uso da Glicina na prevenção das lesões da enterocolite necrosante neonatal: estudo experimental em ratos/ Karine Furtado Meyer. -- São Paulo, 2006.
xvii, 64f
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina.
Programa de Pós-Graduação em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental.
Título em inglês: Glycine in the prevention of neonatal necrotizing
enterocolitis lesions: experimental study on rats.
1. Intestino. 2. Glicina. 3. Enterocolite necrosante. 4. Rato.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA - UNIFESP - EPM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TÉCNICA OPERATÓRIA E
CIRURGIA EXPERIMENTAL COORDENADOR: Prof. Dr. José Luiz Martins
TESE DE DOUTORADO
AUTOR: Karine Furtado Meyer ORIENTADOR: Prof. Dr. José Luiz Martins CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Luiz Gonzaga de Freitas Filho TÍTULO: USO DA GLICINA NA PREVENÇÃO DAS LESÕES DA ENTEROCOLITE NECROSANTE NEONATAL: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS BANCA EXAMINADORA Presidente: Prof. Dr. José Luiz Martins
Professor Adjunto Livre Docente- Disciplina de Cirurgia Pediátrica Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina Prof. Dr. Joaquim Murray Bustorff Silva Professor Livre Docente- Disciplina de Cirurgia Pediátrica Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo Professor Adjunto Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina Prof. Dr. Manoel Carlos Prieto Velhote Doutor em Medicina da Faculdade de Medicina Universidade de São Paulo
Membros Efetivos:
Prof. Dr. Pedro Muñoz Fernandez Professor Adjunto Departamento de Saúde Materno Infantil Faculdade de Medicina da Fundação Universitária do ABC Prof. Dr. Flavio Saad Doutor em Medicina do Departamento de Clínica Cirúrgica II Universidade Luzíadas de Santos
Suplentes:
Prof. Dr. Fábio Luis Peterlini Doutor da Disciplina de Ciurgia Pediátricada Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina
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Acredito que o futuro brilhante é baseado em um passado intensamente vivido. Só temos
sucesso na vida, quando perdoamos os erros e as decepções do passado.
Por isso, é tempo de lutar pela felicidade. Ela é um estado de alma que precisamos
aprender a cultivar dentro do nosso coração em todos os momentos de nossa vida. Não está
fora de nós, e nem na presença das pessoas, por mais que as amemos. Está dentro de nós, na
plenitude da vida, quando colocamos nosso amor para fora e enxergamos as coisas boas que
possuímos. É benção a ser conquistada. Ela flui de dentro para fora e independe até das
outras pessoas.
Se você quer ser feliz, esqueça os erros do passado, esqueça sua culpa. Cultive as
bênçãos do presente, e perceberá que a felicidade sempre esteve ao seu lado sem que você a
deixasse entrar. Matheus Furtado
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DEDICATÓRIA
Ao meu marido
CLAUDIO HERING MEYER Pelo apoio constante.
Ao meu pai
ADROALDO CERVI FURTADO que sempre vibrou com minhas vitórias e me
incentivou nos momentos difíceis.
À minha mãe INGRID SUZANA FURTADO
que me ensinou que tudo podemos,
basta querer e sorrir.
Aos meus irmãos,
MATHEUS E ISABELLE,
meu amor, respeito e admiração.
Representam muito para mim.
Aos meus colegas
OLGA MARIA GARCIA FERREIRA MAURÍCIO MACEDO e
LUIZ GONZAGA DE FREITAS FILHO que me mostraram o caminho
da realização profissional.
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AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. JOSÉ LUIZ MARTINS,
Orientador deste trabalho
Um rumo tranqüilo para os menos experientes
Um profissional competente.
Ao Prof. Dr. LUIZ GONZAGA DE FREITAS FILHO,
Co-orientador deste trabalho
Um professor e amigo
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AGRADECIMENTOS À Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista De Medicina – UNIFESP-EPM, pela
acolhida.
À FAPESP- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo financiamento.
Ao Prof. Dr. Djalma José Fagundes, Ex-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Técnica
Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM. Bons conselhos nos dão o rumo certo; amizade
que deve durar.
A Profª. Dra. Edna Frason de Souza Montero, Professora Afiliada do Departamento de Cirurgia da
UNIFESP-EPM, pela consideração.
Aos demais professores e colegas do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP, pela convivência e amizade.
À Profª. Dra. Francy Reis da Silva Patrício, Chefe da Disciplina de Patologia Médica e Coordenadora
do Curso de Pós-Graduação em Patologia da UNIFESP-EPM. Ajuda desinteressada gera admiração.
À Profª. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva, Professora Adjunta da Disciplina de Biologia Molecular,
Departamento de Bioquímica da UNIFESP-EPM. Paciente em me ensinar desde os princípios básicos
para que fossem realizadas as dosagens bioquímicas apresentadas.
Ao Dr. Iberê Cauduro Soares, médico patologista do Hospital do Servidor Público Estadual, pela
realização de todas as lâminas para estudo imunohistoquímico, bem como o auxílio na interpretação dos
resultados.
Ao Dr. Maurício Macedo, aluno do curso de pós-graduação em nível de doutorado, pela ajuda na
execução dos exames laboratoriais, análise das lâminas e na dissertação da tese. Foi um companheiro
para todas as horas.
À amiga Dra. Lina Wang, residente de cirurgia pediátrica do Hospital do Servidor Público Estadual, pelo
grande estímulo na execução deste trabalho, mesmo nos momentos em que o cansaço e o desânimo
tentavam ser mais fortes.
À Srta. Ana Cristina Garcia Ferreira, aluna do 6° ano do curso de graduação Medicina, UNIFESP-EPM,
pela ajuda durante a fase experimental da pesquisa.
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Ao Sr. Lincohn H.Takeda, aluno do curso de pós-graduação em Biologia Molecular, nível de Doutorado,
pelo auxílio na realização dos exames laboratoriais.
À Sra. Sandra Malagutti, pelo talentoso desempenho na realização da estatística deste trabalho.
À Professora Danusia Apparecida Silva. Querida professora do meu ginásio (Lages, SC) que fez, com
tanto amor, as correções de português.
Aos meus colegas de trabalho do Hospital de Servidor Público Estadual e ao meu colega Dr. Luís Ricardo Longo dos Santos do Hospital do Tatuapé. Sustentaram a minha ausência para que eu
pudesse me dedicar à pós-graduação.
As Sras. Elaine Maria Alves Bazzi Dantas e Valdelice Justiniano Soares, secretárias da Disciplina de
Técnica Operatória e Cirurgia Experimental, pela paciência, amizade ajuda e disponibilidade nos
momentos em que precisei durante a execução deste trabalho.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Molécula da glicina........................................................................................................ 3
Figura 2- Rato recém-nascido...................................................................................................... 6
Figura 3- Esquema de distribuição dos animais nos grupos........................................................ 7
Figura 4- Câmara para sacrifícios de roedores com entrada de gás O2 e CO2.......................................... 8
Figura 5- Segmento de jejuno (A), íleo (B) e cólon (C) retirados para histologia......................... 8
Figura 6- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa sem alterações
(grau 0). (HE- 200x).....................................................……………………………..........
19
Figura 7- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa com vilosidades
bem constituídas, sem lise celular ou processo inflamatório, porém, com formação
do espaço subepitelial de Grunhagen (grau 1). (HE- 200x)..........................................
19
Figura 8- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa com presença
de lises celulares, formação do espaço subepitelial de Grunhagen e espaçamento
aumentado entre as vilosidades (grau 2). (HE- 200x).........................................…......
20
Figura 9- Fotomicrografia de corte histológico de intestino do animal do Grupo H-R mostrando
mucosa com destruição da porção livre das vilosidades, presença de capilares
dilatados e de células inflamatórias (grau 3). (HE- 200x)......…....................................
20
Figura 10- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa com destruição
estrutural das vilosidades, havendo apenas esboço de algumas, formadas por
células inflamatórias e material necrótico, com hemorragia e ulceração glandular
basal (grau 4). (HE- 200x)......…………………………………………………………........
21
Figura 11- Fotomicrografia de corte histológico de intestino mostrando mucosa com destruição
de toda túnica mucosa, não sendo mais observado qualquer estrutura glandular,
mas apenas material amorfo depositado sobre a tela submucosa (grau 5). (HE-
200x)......................................……………………………………………………………….
21
Figura 12- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Caspase-3-
Clivada no jejuno dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X).......
25
Figura 13- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Caspase-3-
Clivada no íleo dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas pretas
mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)..................
25
Figura 14- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Caspase-3-
Clivada no cólon dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X).......
26
Figura 15- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Lamina-A-
Clivada no jejuno dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X).......
29
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Figura 16- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Lamina-A-
Clivada no íleo dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas pretas
mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)..................
30
Figura 17- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Lamina-A-
Clivada no cólon dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X).......
30
Figura 18- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Caspase-3-
Clivada no fígado dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X).......
28
Figura 19- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Caspase-3-
Clivada no fígado dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X).......
29
Figura 20- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Lamina-A-
Clivada no fígado dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X).......
36
Figura 21- Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com Lamina-A-
Clivada no rim dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas pretas
mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)..................
37
Figura 22- Programa de edição de imagem utilizado para captura das imagens provenientes do
microscópio óptico.........................................................................................................
55
Figura 23- Programa de edição de imagem utilizado para contagem dos corpúsculos
apoptóticos....................................................................................................................
56
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Análise histopatológica das lesões do jejuno................................................................ 14
Tabela 2- Comparações entre os grupos na análise histopatológica das lesões no jejuno.......... 14
Tabela 3- Análise histopatológica das lesões do íleo.................................................................... 15
Tabela 4- Comparações entre os grupos na análise histopatológica das lesões no íleo.............. 16
Tabela 5- Análise histopatológica das lesões do cólon................................................................. 17
Tabela 6- Comparações entre os grupos na análise histopatológica das lesões no cólon........... 17
Tabela 7- Resultado da contagem de corpúsculos apoptóticos pela imunohistoquímica para
Caspase-3-Clivada no jejuno, íleo e cólon dos animais................................................
22
Tabela 8- Comparações entre os grupos na contagem de corpúsculos apoptóticos pela
imunohistoquímica para Caspase-3-Clivada no jejuno, íleo e cólon dos animais........
23
Tabela 9- Resultado da contagem de corpúsculos apoptóticos pela imunohistoquímica para
Lamina-A-Clivada no jejuno, íleo e cólon dos animais..................................................
27
Tabela 10- Comparações entre os grupos na contagem de corpúsculos apoptóticos pela
imunohistoquímica para Lamina-A-Clivada no jejuno, íleo e cólon dos animais...........
27
Tabela 11- Valores de MDA tecidual no intestino............................................................................ 31
Tabela 12- Comparações entre os grupos na dosagem do MDA tecidual no intestino dos
animais..........................................................................................................................
31
Tabela 13- Resultado da contagem de corpúsculos apoptóticos pela imunohistoquímica para
Caspase-3-Clivada no fígado e rim dos animais...........................................................
32
Tabela 14- Comparações entre os grupos na contagem de corpúsculos apoptóticos pela
imunohistoquímica para Caspase-3-Clivada no fígado e rim dos animais....................
33
Tabela 15- Resultado da contagem de corpúsculos apoptóticos pela imunohistoquímica para
Lamina-A-Clivada no fígado e rim dos animais.............................................................
35
Tabela 16- Comparações entre os grupos na contagem de corpúsculos apoptóticos pela
imunohistoquímica para Lamina-A-Clivada no fígado e rim dos animais.....................
36
Tabela 17- Valores de MDA tecidual no fígado............................................................................... 38
Tabela 18- Comparações entre os grupos na dosagem do MDA tecidual no fígado dos
animais..........................................................................................................................
39
Tabela 19- Número de corpúsculos apoptóticos em 6 campos de 400X pelo método da
Caspase-3-Clivada em todos os grupos no jejuno, íleo, cólon, fígado e rim................
58
Tabela 20- Número de corpúsculos apoptóticos em 6 campos de 400X pelo método da Lamina-
A-Clivada em todos os grupos no jejuno, íleo, cólon, fígado e rim...............................
59
Tabela 21- Caracterização dos animais do grupo controle (G1) com as dosagens de proteína e
malondialdeído intestinais.............................................................................................
60
Tabela 22- Caracterização dos animais do grupo hipóxia-reoxigenação (G2) com as dosagens
de proteína e malondialdeído intestinais.......................................................................
61
Page 13
Tabela 23- Caracterização dos animais do grupo hipóxia-reoxigenação + glicina (G3) com as
dosagens de proteína e malondialdeído intestinais......................................................
62
Tabela 24- Caracterização dos animais do grupo controle (G1) com as dosagens de proteína e
malondialdeído hepáticos..............................................................................................
63
Tabela 25- Caracterização dos animais do grupo hipóxia-reoxigenação (G2) com as dosagens
de proteína e malondialdeído hepáticos........................................................................
63
Tabela 26- Caracterização dos animais do grupo hipóxia-reoxigenação + glicina (G3) com as
dosagens de proteína e malondialdeído hepáticos.......................................................
64
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LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1- Exame histopatológico no jejuno. Distribuição por grupos........................................ 15
Gráfico 2- Exame histopatológico no íleo. Distribuição por grupos............................................ 16
Gráfico 3- Exame histopatológico no cólon. Distribuição por grupos......................................... 18
Gráfico 4- Caspase-3-Clivada no jejuno. Distribuição por grupos.............................................. 24
Gráfico 5- Caspase-3-Clivada no íleo. Distribuição por grupos.................................................. 24
Gráfico 6- Caspase-3-Clivada no cólon. Distribuição por grupos............................................... 25
Gráfico 7- Lamina-A-Clivada no jejuno. Distribuição por grupos................................................ 28
Gráfico 8- Lamina-A-Clivada no íleo. Distribuição por grupos.................................................... 28
Gráfico 9- Lamina-A-Clivada no cólon. Distribuição por grupos................................................. 29
Gráfico 10- Caspase-3-Clivada no fígado. Distribuição por grupos.............................................. 33
Gráfico 11- Caspase-3-Clivada no rim. Distribuição por grupos................................................... 34
Gráfico 12- Lamina-A-Clivada no fígado. Distribuição por grupos................................................ 36
Gráfico 13- Lamina-A-Clivada no rim. Distribuição por grupos..................................................... 37
Gráfico 14- Curva de proteína construída com o padrão de albumina humana........................... 57
Gráfico 15- Curva de calibração do MDA traçada com 1,3,3 tetra-metoxipropano
malondialdeído bis (acetildimetilo).............................................................................
57
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LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
A........................... absorbância ANOVA................ análise de variância BSA...................... soroalbumina bovina °C......................... graus Celsius CBB...................... coomassie brilhant blue cm........................ centímetro cNOS................... óxido nítrico sintetase constitutiva CO2...................... gás carbônico DNA..................... ácido desoxirribonucléico dp......................... desvio padrão ECN..................... enterocolite necrosante neonatal EPM..................... Escola Paulista de Medicina
et al...................... e colaboradores FAPESP............... Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo G.......................... grupo g........................... grama H2O2 ................... peróxido de hidrogênio H-R....................... hipóxia-reoxigenação IR......................... isquemia-reperfusão kg......................... quilograma µg......................... micrograma M.......................... molar MDA..................... malondialdeído mg........................ miligrama ml......................... mililitros µl............................. microlitro N.......................... número nm……………….. nanômetro nmol..................... nanomol NO........................ óxido nítrico O2......................... oxigênio
OUT..................... outbread pH........................ potencial hidrogênio-iônico PO2...................... pressão de oxigênio RAM .................... rapid access memory RN........................ recém-nascido rpm....................... rotações por minuto TBA...................... ácido tiobarbitúrico TRIS..................... solução tampão de Tris-hidroximetil aminometano UI......................... Unidade Internacional UNIFESP............. Universidade Federal de São Paulo X .......................... vezes
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RESUMO
Objetivo: Avaliar o efeito da glicina no intestino e em órgãos à distância num modelo
experimental de enterocolite necrosante neonatal em ratos recém-nascidos.
Métodos: Foram utilizados ratos Wistar recém-nascidos distribuídos em três grupos:
G1: controle, G2: animais submetidos a hipóxia-reoxigenação (H-R), G3: animais
submetidos a hipóxia-reoxigenação após uma infusão intraperitoneal de glicina
5%.Segmentos intestinais foram preparados para análise histológica,
imunohistoquímica com caspase 3 clivada e lamina A clivada, como marcadores para
apoptose e dosagem tecidual de Malondialdeído (MDA). O fígado foi preparado para
avaliação imunohistoquímica e dosagem de malondialdeído tecidual, e os rins foram
preparados para avaliação imunohistoquímica.
Resultados: A dosagem de MDA tecidual mostrou que o grupo de animais submetido a
H-R apresentou valores maiores do que o grupo previamente submetido à injeção
intraperitoneal de glicina (p < 0,05). O índice apoptótico pela avaliação da caspase 3
clivada e lamina A clivada foi maior nos animais submetidos à H-R do que nos animais
que receberam previamente glicina em todos os órgãos examinados, porém nos rins a
avaliação pela lamina A clivada não foi significante, quando da avaliação estatística. A
análise histológica não mostrou diferença estatística entre o grupo H-R e o previamente
submetido à injeção de glicina.
Conclusões: A glicina foi capaz de reduzir os efeitos deletérios da hipóxia-
reoxigenação, quando se considerou como critério de avaliação a dosagem de MDA e
os índices de apoptose celular e não influenciou, estatisticamente, as alterações
histológicas.
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ABSTRACT Objective: To evaluate the effect of glycine on the intestine and in distant organs, in an
experimental model of neonatal necrotizing enterocolitis in rats.
Methods: Newborn Wistar rats were utilized, distributed into three groups: G1: control,
G2: animals subjected to hypoxia-reoxygenation (H-R), G3: animals subjected to
hypoxia-reoxygenation after intraperitoneal infusion of 5% glycine. Intestinal segments
were prepared for histological analysis, immunohistochemistry using cleaved caspase-3
and cleaved lamina-A as markers for apoptosis, and tissue assaying for malonaldehyde
(MDA). The liver and kidneys were prepared for immunohistochemical evaluation and
the liver alone for tissue MDA assaying.
Results: Tissue MDA assaying showed that the animals subjected to H-R alone
presented higher values than did those previously subjected to glycine infusion (p <
0.05). The apoptosis index from evaluation of cleaved caspase-3 and cleaved lamina-A
was greater in the animals subjected to H-R alone than in those previously subjected to
glycine infusion, in all the organs examined. However, in the kidneys the findings from
cleaved lamina-A did not present any statistical difference. The histological analysis did
not show any statistical difference between the group with H-R alone and the group
previously subjected to glycine infusion.
Conclusions: Glycine was capable of reducing the deleterious effects from hypoxia-
reoxygenation, when the MDA assay and cell apoptosis index were considered as the
evaluation criteria.
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SUMÁRIO Dedicatória................................................................................................................... v
Agradecimentos........................................................................................................... vi
Listas........................................................................................................................... ix
Resumo....................................................................................................................... xvi
Abstract........................................................................................................................ xvii
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS.............................................................................................................. 5
3 MÉTODOS................................................................................................................ 6
3.1 Amostra................................................................................................................. 6
3.2 Experimento........................................................................................................... 7
3.3 Preparo do tecido para histologia.......................................................................... 8
3.4 Exame histopatológico........................................................................................... 9
3.5 Procedimento imunohistoquímico.......................................................................... 10
3.6 Determinação do malondialdeído tecidual............................................................. 11
3.6.1 Dosagem de proteína......................................................................................... 11
3.6.2 Dosagem de malondialdeído.............................................................................. 12
3.7 Estudo estatístico.................................................................................................. 13
4 RESULTADOS......................................................................................................... 14
4.1 Exame histopatológico........................................................................................... 14
4.2 Imunohistoquímica................................................................................................. 22
4.2.1 Caspase-3-clivada.............................................................................................. 22
4.2.2 Lamina-A-clivada................................................................................................ 30
4.3 Determinação de malondialdeído tecidual............................................................. 38
4.3.1 Intestino.............................................................................................................. 38
4.3.2 Fígado................................................................................................................. 39
5 DISCUSSÃO............................................................................................................. 40
6 CONCLUSÕES......................................................................................................... 47
7 REFERÊNCIAS........................................................................................................ 48
8 ANEXOS................................................................................................................... 54
Apêndice
Normas Adotadas
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1
1. INTRODUÇÃO
Apesar dos avanços significativos na prática de cuidados neonatais, a enterocolite
necrosante neonatal (ECN) continua sendo a mais importante causa cirúrgica de
mortalidade e morbidade em crianças com baixo peso ao nascer. A ECN é a
emergência gastrointestinal mais comum nas unidades de cuidados intensivos
neonatais; cerca de 5% dos recém-nascidos com baixo peso ao nascer acabam
desenvolvendo ECN (1).
A maior parte dos recém-nascidos (RN) que desenvolvem ECN é tratada com
jejum, nutrição parenteral total, e antimicrobianos de amplo espectro de ação, ficando a
indicação operatória restrita às complicações. O objetivo da cirurgia é atuar antes que
ocorram perfurações intestinais, situação em que a mortalidade cirúrgica pode chegar a
45% (2-3).
Estudos mostram que na ECN, além do trato gastrointestinal, outros órgãos são
envolvidos pela liberação de mediadores inflamatórios na corrente sanguínea, como os
produtos da peroxidação lipídica, que podem levar à disfunção e à falência de múltiplos
órgãos. A deterioração das funções cardiovascular, respiratória, renal, hepática e
hematológica ocorre no momento, ou poucas horas após, o diagnóstico da doença. A
gravidade e o prognóstico da ECN estão correlacionados com o número de sistemas
envolvidos (3).
Crianças submetidas à ressecção de grandes extensões de intestino podem
desenvolver a síndrome do intestino curto, comprometendo o desenvolvimento
pôndero-estatural, e também o desenvolvimento neuro-psico-motor (2).
A ECN permanece como uma doença com causa desconhecida e de patogênese
incerta. O tratamento ainda é baseado em observações empíricas e nenhum método
de prevenção mostrou sucesso absoluto (1).
O recém-nascido prematuro está sujeito a várias intercorrências clínicas
perinatais, como hipotensão, hipotermia, hipóxia e anemia, principalmente quando
associados ao início da alimentação enteral ou ao cateterismo dos vasos umbilicais,
que são rotulados como desencadeantes da lesão isquêmica intestinal levando a uma
redistribuição do fluxo sangüíneo esplâncnico para órgãos vitais como coração e
cérebro e provocando uma diminuição do fluxo sanguíneo da mucosa intestinal (1,4,5).
Essas intercorrências, isoladas ou conjuntamente, lesam a mucosa ao atuarem em
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2
uma barreira intestinal imatura. Nesta fase, na barreira mucosa há uma menor
produção de mucina, ausência de bactérias comensais e concomitante proliferação de
bactérias potencialmente patogênicas, uma quantidade menor de antioxidantes e
proteases, oxigenação tecidual deficiente, motilidade intestinal diminuída, resposta
imune pouco desenvolvida e menor capacidade de regeneração e reparo (5).
Vários modelos animais foram propostos utilizando a hipóxia como evento
desencadeante da enterocolite necrosante neonatal (6-15). Barlow et al (6,8) provocaram
lesão intestinal em ratos recém-nascidos alimentados com fórmula artificial e em
seguida submetidos a hipóxia ao serem colocados num saco plástico durante 3 a 5
minutos por dia. Harrison et al (7), utilizando cães recém-nascidos submetidos a hipóxia
com 7% de O2 por duas horas, demonstraram alterações precoces na mucosa
intestinal e nas células capilares endoteliais, quando estes órgãos foram observados à
microscopia eletrônica. Hansbrough et al (9), também utilizando cães recém-nascidos,
provocaram necrose isquêmica intestinal ao produzir hipóxia com O2 a 10% por 2
horas. Da mesma forma, mantendo porcos recém-nascidos a 50% da concentração
normal de PO2 por 30 minutos, Cohen et al (10) observaram lesão da parede intestinal,
através da análise microscópica e macroscópica. Caplan et al (11) conseguiram produzir
ECN alimentando animais com fórmula artificial e submetendo-os a 60 segundos de
asfixia, utilizando 100% de nitrogênio, duas vezes ao dia, seguido por exposição ao
frio. A lesão isquêmica de mucosa intestinal esteve também presente em um modelo
onde ratos recém-nascidos foram submetidos a 5 minutos de hipóxia, seguidos de 5
minutos de reoxigenação (12,13,15).
Vários agentes foram utilizados na prevenção das lesões intestinais em modelos
experimentais de ECN como: leite materno (6), vitamina E (12), suplementação com
bifidobactérias (14), interleucina-10 recombinante humana (15), pentoxifilina (16), óxido
nítrico (17), glutamina (18) e dexametasona (18). Outros agentes como glucagon (19), 21-
amino-esteróides (20), somatostatina (21) e perfluorocarbonos (22) são descritos como
atenuantes das lesões provocadas pela isquemia-reperfusão intestinal em trombose ou
oclusão mesentérica, mas ainda não foram utilizados em modelos experimentais de
ECN. Mais recentemente, também utilizando um modelo de isquemia-reperfusão
intestinal em ratos, a glicina foi testada como agente protetor das lesões intestinais (23-
28).
A glicina é um aminoácido simples, não essencial, formado por uma molécula de
carbono ligada a um grupo amino e a um grupo carboxil (figura 1). Na membrana
Page 21
3
plasmática, ela ativa um canal de cloro que estabiliza ou hiperpolariza o potencial de
membrana. Como conseqüência, bloqueia a entrada intracelular de cálcio, que vai
estimular a cascata de formação de citocinas (28). A glicina tem efeito antiinflamatório,
imunomodulador e citoprotetor. Ela protege contra o choque causado tanto por
hemorragia como por endotoxinas, previne a lesão por isquemia-reperfusão em uma
variedade de órgãos e tecidos como fígado, rim, coração, intestino e músculo
esquelético, e diminui a lesão renal e hepática causada por drogas (28).
Figura 1: molécula de glicina.
A apoptose que ocorre nas células epiteliais das vilosidades intestinais pode ser
observada em fragmentos histológicos de pacientes submetidos à ressecção intestinal
por ECN (29). Ela ocorre durante a morfogênese, regula a constante renovação dos
enterócitos, e está aumentada em muitas condições patológicas do intestino como na
ECN (29). A apoptose abundante do epitélio intestinal é um evento que antecede e leva
à necrose tecidual ao provocar a quebra da barreira mucosa do intestino (29). Uma
família de proteases, denominada caspase, desempenha um papel importante na
execução da apoptose celular. Estas enzimas estão presentes nas células sob a forma
latente, e são ativadas durante o processo de apoptose (30). Podem ser classificadas
como reguladoras (caspases 2, 7 e 8) ou como efetoras (caspases 3, 6 e 7) (30). A mais
conhecida delas é a caspase-3 e sua ativação demonstra que o evento que leva à
morte celular (apoptose) foi desencadeado (29). A Lamina A é uma proteína de
Page 22
4
membrana nuclear e é especificamente clivada pela caspase 6, funcionando como
outro marcador do desencadeamento do processo de apoptose.
Os radicais livres de oxigênio desempenham, também, um papel importante no
desencadeamento da ECN (12,13,15,30). Estes radicais livres de oxigênio lesam o tecido
pela peroxidação de lipídeos insaturados presentes na membrana mitocondrial e
celular (30). O malondialdeído (MDA) é o produto final da peroxidação lipídica e é um
parâmetro bem estabelecido para determinar o aumento da formação destes radicais
livres no tecido na presença de lesão intestinal (15).
Tendo em vista os efeitos antiinflamatório, imunomodulador e citoprotetor da
glicina (28), buscou-se avaliar sua capacidade para prevenir as lesões intestinais e de
órgãos distantes (rim e fígado) em modelo experimental já descrito de ECN (12).
Page 23
5
2. OBJETIVOS
2.1. Geral: buscar um método para prevenção da enterocolite necrosante
neonatal.
2.2. Específico: avaliar o efeito de um aminoácido (glicina) na prevenção das lesões
intestinais de órgãos à distância (fígado e rim) na enterocolite
necrosante neonatal.
Page 24
6
3. MÉTODOS O experimento foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal de São Paulo, e aprovado com o protocolo n° 0560/04 (anexo 1).
3.1. Amostra Foram utilizados 50 ratos recém-nascidos da linhagem OUT B EPM-1 Wistar
(Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), com peso variando de 4 a 6 gramas
(figura 2). Utilizou-se a ninhada de seis ratas, sendo que, em cada ninhada,
distribuiram-se aleatoriamente os animais nos três grupos estudados. Para
identificação dos animais, eles foram tatuados com diferentes marcas, injetando-se 0,1
ml de tinta nanquim por via subcutânea em uma das patas.
Cinco animais foram canibalizados e, os quarenta e cinco restantes, foram
distribuídos em três grupos (figura 3):
• G1: (N=12): ratos que não foram submetidos à hipóxia-reoxigenação (Grupo
Controle).
• G2: (N=16): ratos que foram submetidos somente à hipóxia-reoxigenação (H-R).
• G3: (N=17): ratos submetidos à hipóxia-reoxigenação e a uma injeção
intraperitoneal prévia e diária de glicina.
Figura 2: Rato recém-nascido.
Agulha insulina
Page 25
7
Grupo 3 H-R + Glicina
N = 17
Grupo 2 H-R
N = 16
Grupo 1 Controle
N = 12
Amostra N = 45
Figura 3: Esquema de distribuição dos animais nos grupos.
3.2. Experimento Utilizou-se o modelo de ECN descrito por Okur et al (12). Os animais foram
submetidos à hipóxia em uma câmara para sacrifício de roedores (figura 4), onde
receberam um fluxo de gás contendo 100% de gás carbônico (CO2), durante 5 minutos.
Após a hipóxia os animais foram reanimados com fluxo de gás contendo oxigênio (O2)
a 100% durante 5 minutos, e, em seguida, foram mantidos junto às respectivas mães
em ambiente normotérmico. Todos os animais receberam leite materno antes e após o
procedimento.
Nos animais do Grupo 3 utilizou-se 0,2 ml (1,7 a 2,2 mg/g de peso corporal) de
solução de glicina a 5% em solução salina (24,26,27). A injeção de glicina foi administrada
30 minutos antes da hipóxia-reoxigenação e mantida uma vez ao dia até a eutanásia
dos animais.
Todos os animais foram submetidos à eutanásia por decapitação no quarto dia de
vida.
Page 26
8
Figura 4: Câmara para sacrifícios de roedores com entrada de gás O2 e CO2.
3.3. Preparo do tecido
Foram retirados segmentos de jejuno, íleo e cólon (figura 5), cada um com 1 cm
de comprimento, para análise histológica e imunohistoquímica. Foram também
retiradas amostras de tecido hepático e renal para realização de análise
imunohistoquímica. O material foi fixado em formol a 10%, desidratado, e incluído em
parafina.
Figura 5: Segmento
O restante do int
menos 80°C para poste
A
de jejuno (A), íleo (B) e cólon (C) ret
estino foi removido em bloco e im
rior homogeneização e dosagem de m
B
irados para histologia.
ediatamente congela
alondialdeído tecidua
C
do a
l.
Page 27
9
Em 6 animais do grupo G1, 8 do grupo G2 e 10 do grupo G3, o fígado foi
removido e imediatamente congelado a menos 80°C para posterior homogeneização e
dosagem de malondialdeído tecidual.
3.4. Exame histopatológico
Fragmentos de 1 cm de intestino (jejuno, íleo e cólon) foram fixados em formol a
10%, desidratados, incluídos em parafina, e corados com hematoxilina-eosina. Foram
realizados cortes de 6 micrômetros em cada fragmento, e as lâminas foram analisadas
à microscopia óptica pelo patologista, sem o prévio conhecimento do grupo a que cada
animal pertencia.
Utilizou-se a classificação de Chiu et al (31), para avaliar o grau de lesão tecidual
intestinal:
Grau Achado
0 mucosa sem alteração
1 vilosidades bem constituídas, sem lise celular ou processo inflamatório,
porém, com formação do espaço subepitelial.
2 presença de lises celulares, formação do espaço subepitelial de
Grunhagen e espaçamento aumentado entre as vilosidades.
3 destruição da porção livre das vilosidades, presença de capilares
dilatados e de células inflamatórias.
4 destruição estrutural das vilosidades, havendo apenas esboço de
algumas, formadas por células inflamatórias e material necrótico, com
hemorragia e ulceração glandular basal.
5 destruição de toda túnica mucosa, não mais sendo observado qualquer
estrutura glandular, mas apenas material amorfo depositado sobre a
tela submucosa.
Page 28
10
3.5. Procedimento imunohistoquímico
Utilizando-se o material previamente parafinado, foram realizadas novamente
secções de 3 micrômetros, e os cortes foram processados pela técnica da
streptavidina-biotina-peroxidase para pesquisa de Caspase-3-Clivada e Lamina-A-
Clivada.
Seqüência de procedimentos para obtenção das lâminas:
1. Desparafinização em estufa.
2. Desparafinização em xilol.
3. Reidratação em álcool absoluto, em álcool a 70%, lavagem em água corrente e
em água destilada.
4. Recuperação antigênica com tampão citrato 0,01M, pH 6,0, em forno de
microondas, potência máxima, por três ciclos de 5 minutos cada, mantida esta
incubação por mais 20 minutos em temperatura ambiente, seguida por lavagem
em água corrente e água destilada.
5. Bloqueio da peroxidase endógena com uma solução de peróxido de hidrogênio
(H2O2), 10 volumes, por 2 ciclos de 10 minutos, seguida por lavagem em água
corrente e água destilada.
6. Bloqueio de reação inespecífica através da incubação com tampão fosfato, pH
7,2, acrescido de soroalbumina bovina 1% por 15 minutos, desprezando o
excesso após este tempo.
7. Incubação no anticorpo primário Caspase-3-Clivada na diluição de 1:30
(Monoclonal Anti-human/mouse Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1) Antibody -
Cell Signaling Technology) e Lamina-A-Clivada na diluição de 1:50 (Policlonal
Anti-human/mouse Cleaved Lamin A (Small Subunit) Antibody - Cell Signaling Technology), durante a noite, em temperatura de cerca de 8°C.
8. Lavagem em tampão.
9. Incubação em anticorpo secundário biotinilado, em temperatura ambiente, por 30
minutos.
10. Lavagem em tampão.
11. Incubação no complexo streptavidina-biotina-peroxidase, em temperatura
ambiente, por 30 minutos.
12. Lavagem em tampão.
13. Incubação com o substrato enzimático diaminobenzidina.
Page 29
11
14. Lavagem em água corrente e água destilada.
15. Contracoloração com hematoxilina de Harris.
16. As lâminas coradas foram analisadas pelo sistema computadorizado de análise
de imagens, constituído por uma vídeo-câmera Sony® CCD-IRIS, acoplada a um
microscópio óptico Olympus (BX 50), com objetivas pancromáticas, que
transmitiram as imagens a um microcomputador Pentium 4, com 512 megabytes
de memória RAM, trabalhando em ambiente Windows 98® e equipado com placa
digitalizadora e o software “Image-Pro-Plus”®, versão 4.1 (anexo 2). Foram
capturadas imagens correspondentes a 6 campos com aumento de 400 vezes (26).
O número de corpúsculos apoptóticos foram contados pelo patologista, sem o
prévio conhecimento do grupo a que cada animal pertencia com o auxílio do
programa de análise de imagem “Image Tool”® (anexo 3).
3.6. Determinação de Malondialdeído Tecidual
Malondialdeído (MDA) é um produto final da peroxidação de lipídeos e é um
parâmetro bem estabelecido para determinar o aumento de radicais livres no tecido
intestinal (11). Para determinar os níveis de MDA foi utilizado o método do ácido
tiobarbitúrico (TBA) proposto por Kohn e Liversedge (32) e os valores foram expressos
como nanomoles de MDA por miligrama de proteína (nmol MDA/mg proteína).
O conteúdo protéico do homogenato foi determinado mediante o uso do
“coomassie brilliant blue” (CBB).
As amostras teciduais foram descongeladas, anotou-se o peso e adicionou-se um
volume correspondente a cinco vezes o peso em gramas, de solução tampão de TRIS
0,01M/pH 7,4. As amostras teciduais foram homogeneizadas em banho de gelo, 4
vezes por trinta segundos, e posteriormente centrifugadas por 5 minutos a 10.000 rpm
a 4° C.
3.6.1. Dosagem de proteína
O reagente CBB interage com a proteína, permitindo sua quantificação, utilizando
uma curva padrão de albumina com concentrações conhecidas.
Preparo do reagente CBB:
1. Agitou-se bem até dissolver 100 mg de CBB em 50 ml de etanol 95%.
Page 30
12
2. Adicionou-se a seguir 100 ml de ácido fosfórico 85%, com agitação constante,
acrescentando-se água destilada para um volume final de 1 litro.
3. O reagente foi deixado em repouso por 24 horas e, em seguida, filtrado e mantido
em frasco escuro.
Utilizando uma solução estoque de albumina bovina (BSA) 10 mg/ml, preparou-se
200 µl das seguintes soluções: 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,8 mg/ml e 1 mg/ml
(albumina bovina/ml de água) para fazer a curva padrão de albumina bovina (anexo 4).
Colheram-se 25 µl e 50 µl do homogenato, posteriormente diluídos em 5 vezes
em tampão de TRIS 0,01M/pH 7,4, e acrescentaram-se 2,5 ml do CBB. As leituras
foram feitas em 595 nm após 10 minutos da adição do reagente de CBB.
3.6.2. Dosagem de Malondialdeído
Foram coletados 400 µl do sobrenadante do homogenato centrifugado e
adicionados 1 ml de ácido tricloroacético 20% e 400 µl de ácido tiobarbitúrico a 1,6%. A
mistura foi incubada por 30 minutos, a 95°C.
Os lipídeos foram extraídos pela adição de n-butanol (1,6 ml) e vigorosa agitação.
A amostra foi então centrifugada novamente por 10 minutos a 3000 rpm, e a camada
superior foi cuidadosamente separada. A absorbância da camada orgânica foi
determinada em 510, 532, e 560 nm. Para o cálculo dos valores finais utilizou-se a
seguinte equação, proposta para minimizar a interferência dos pigmentos heme e da
hemoglobina na dosagem de MDA (33):
MDA532= 1,22[(A532)-(0,56)(A510)+(0,44)(A560)]
A curva de calibração foi traçada com 1,3,3 tetra-metoxipropano malondialdeído
bis (anexo 5).
Page 31
13
3.7. Estudo Estatístico
As variáveis quantitativas contínuas foram representadas por média, desvio
padrão da média (dp), valores mínimo e máximo, e as discretas por freqüência absoluta
(N) e relativa (%).
O teste de Kolmogorov-Smirnov foi aplicado para testar a existência de
distribuição normal nas variáveis quantitativas dentro de cada grupo de estudo. Na
comparação entre os grupos de estudo foi utilizada a técnica de Análise de Variância
(ANOVA) com o fator fixo Grupo. As diferenças foram localizadas pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey.
Aplicou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis para amostras
independentes na análise do grau de lesão tecidual nas três localizações avaliadas. As
diferenças foram estabelecidas pelo teste de comparações múltiplas de Dunn.
Adotou-se o nível de significância de 0,05 (α = 5%) para rejeição da hipótese de
nulidade, e níveis descritivos (p) iguais ou inferiores a esse valor foram considerados
significantes e representados por um asterisco.
Page 32
14
4. RESULTADOS
4.1. Intestino 4.1.1. Exame histopatológico
Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de estudo,
quanto à distribuição do grau de lesão tecidual no jejuno dos animais (p < 0,001).
(tabela 1).
Tabela 1: ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS LESÕES DO JEJUNO
Grupo G1 Grupo G2 Grupo G3
Grau N % N % N %
0 10 83,3 1 6,3 4 23,5
1 1 8,3 1 6,3 3 17,6
2 0 0 3 18,8 3 17,6
3 1 8,3 7 43,8 5 29,4
4 0 0 3 18,8 2 11,8
5 0 0 1 6,3 0 0
Escore 12 10,92* 16 31,16 17 23,85
N= número de ratos. %= porcentagem. Teste de Kruskal-Wallis p < 0,001*
Os animais dos grupos G2 e G3, cujas lesões não diferem de forma significante
entre si, apresentaram graus significantemente maiores de lesão do que os animais do
grupo G1. (tabela 2).
Tabela 2: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
DAS LESÕES DO JEJUNO
Intestino
G2 > G1*
G3 > G1*
G2 = G3
Teste de comparações múltiplas de Dunn.
Page 33
15
0102030405060708090
100
G1 G2 G3
Grupo
Porc
enta
gem
de
anim
ais
Grau 0 Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Grau 5
Gráfico 1: Exame histopatológico no jejuno. Distribuição por grupos.
Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos de
estudo quanto à distribuição do grau de lesão tecidual no íleo (p = 0,310). (Tabela 3 e
4).
Tabela 3: ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS LESÕES DO ÍLEO
Grupo G1 Grupo G2 Grupo G3
Grau N % N % N %
0 9 75 7 43,8 9 52,9
1 1 8,3 2 12,5 2 11,8
2 1 8,3 6 37,5 5 29,4
3 1 8,3 1 6,3 1 5,9
4 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
Escore 12 18,79 16 25,63 17 23,50
N= número de ratos. %= porcentagem
Teste de Kruskal-Wallis p = 0,310
Page 34
16
Tabela 4: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
DAS LESÕES DO ÍLEO
Intestino
G1 = G2
G1 = G3
G2 = G3
Teste de comparações múltiplas de Dunn.
0
20
40
60
80
100
G1 G2 G3
Grupo
Porc
enta
gem
de
anim
ais
Grau 0 Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Grau 5
Gráfico 2: Exame histopatológico no íleo. Distribuição por grupos.
Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de estudo
quanto à distribuição do grau de lesão tecidual no cólon dos animais (p = 0,003).
(Tabela 5).
Page 35
17
Tabela 5: ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS LESÕES DO CÓLON
Grupo G1 Grupo G2 Grupo G3
Grau N % N % N %
0 10 83,3 2 12,5 5 29,4
1 0 0 2 12,5 3 17,6
2 1 8,3 8 50 5 29,4
3 1 8,3 0 0 3 17,6
4 0 0 2 12,5 1 5,9
5 0 0 2 12,5 0 0
Escore 12 13,17* 16 29,19 17 24,12
N= número de ratos. %= porcentagem.
Teste de Kruskal-Wallis p = 0,003*.
O grupo G1 apresentou graus de lesão significantemente menores do que os
animais dos grupos G2 e G3, cujas lesões não apresentaram diferenças significantes
entre si. (Tabela 6).
Tabela 6: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
DAS LESÕES DO CÓLON
Intestino
G2 > G1*
G3 > G1*
G2 = G3
Teste de comparações múltiplas de Dunn.
Page 36
18
0
20
40
60
80
100
G1 G2 G3
Grupo
Porc
enta
gem
de
anim
ais
Grau 0 Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Grau 5
Gráfico 3: Exame histopatológico no cólon. Distribuição por grupos.
Page 37
19
Figura 6: Fotomicrografia de corte histológico de intestino
mostrando mucosa sem alterações (grau 0). (HE- 200x)
Figura 7: Fotomicrografia de corte histológico de intestino
mostrando mucosa com vilosidades bem constituídas, sem
lise celular ou processo inflamatório, porém, com formação
do espaço subepitelial de Grunhagen- seta preta (grau 1).
(HE- 200x).
Page 38
20
Figura 8: Fotomicrografia de corte histológico de
intestino mostrando mucosa com presença de lises
celulares, formação do espaço subepitelial de
Grunhagen e espaçamento aumentado entre as
vilosidades (grau 2). (HE- 200x)
Figura 9: Fotomicrografia de corte histológico de
intestino do animal do Grupo H-R mostrando
mucosa com destruição da porção livre das
vilosidades, presença de capilares dilatados e de
células inflamatórias (grau 3). (HE- 200x)
Page 39
21
Figura 10: Fotomicrografia de corte histológico de intestino
mostrando mucosa com destruição estrutural das vilosidades,
havendo apenas esboço de algumas, formadas por células
inflamatórias e material necrótico, com hemorragia e
ulceração glandular basal (grau 4). (HE- 200x)
Figura 11: Fotomicrografia de corte histológico de intestino
mostrando mucosa com destruição de toda túnica mucosa, não
sendo mais observado qualquer estrutura glandular, mas apenas
material amorfo depositado sobre a tela submucosa (grau 5). (HE-
200x).
Page 40
22
4.1.2. Imunohistoquímica
4.1.2.1. Caspase-3-Clivada A tabela 7 contém os resultados da contagem de corpúsculos apoptóticos em 6
campos de grande aumento (400 vezes) no jejuno, íleo e cólon dos animais,
distribuídos nos três grupos estudados (anexo 6). Através da Análise de Variância
foram constatadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para as
variáveis analisadas (p < 0,05).
Tabela 7: RESULTADO DA CONTAGEM DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3-CLIVADA NO JEJUNO, ÍLEO E CÓLON
DOS ANIMAIS
Caspase G1 G2 G3 Comparações
Jejuno p < 0,001* média ± desvio padrão 5,0 ± 2,8 21,3 ± 7,0 5,3 ± 2,1 mediana 5,5 20,5 4,0 mínimo – máximo 1,0–8,0 14,0 - 31,0 4,0 – 8,0 Íleo p < 0,001* média ± desvio padrão 6,5 ± 4,0 22,3 ± 4,2 6,7 ± 1,6 mediana 4,5 21,5 6,5 mínimo – máximo 3,0 – 13,0 18,0 – 27,0 5,0 – 9,0 Cólon p < 0,001* média ± desvio padrão 4,7 ± 3,4 23,2 ± 10,5 5,3 ± 3,0 mediana 4,0 21,5 4,5 mínimo – máximo 1,0 – 11,0 10,0 – 39,0 2,0 – 9,0
Análise de Variância
A Tabela 8 contém os resultados das comparações duas a duas entre os grupos
G1, G2 e G3. O resultado das comparações múltiplas foi o mesmo para os resultados
obtidos no jejuno, íleo e cólon na realização da imunohistoquímica para Caspase-3-
Clivada. O grupo G2 é significativamente maior, em média, do que os grupos G1 e G3.
Entre estes dois últimos não foi encontrada diferença estatisticamente significante.
Page 41
23
Tabela 8: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA CONTAGEM DE
CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3-
CLIVADA NO JEJUNO, ÍLEO E CÓLON DOS ANIMAIS
Jejuno Íleo Cólon
G2 > G1* G2 > G1* G2 > G1*
G2 > G3* G2 > G3* G2 > G3*
G1 = G3 G1 = G3 G1 = G3
Teste de comparações múltiplas de Tukey.
JEJUNO
G2 G1 G3
Gráfico 4: Caspase-3-Clivada no jejuno. Distribuição por grupos.
Page 42
24
ÍLEO
G1 G3G2
Gráfico 5: Caspase-3-Clivada no íleo. Distribuição por grupos.
G1 G2 G3
CÓLON
Gráfico 6: Caspase-3-Clivada no cólon. Distribuição por grupos.
Page 43
25
Figura 12: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Caspase-3-Clivada no jejuno dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina
(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)
G2G1 G3
Figura 13: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Caspase-3-Clivada no íleo dos animais: G1:controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina
(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom
escuro).(400X)
G2 G3G1
Page 44
26
Figura 14: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Caspase-3-Clivada no cólon dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina
(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom
escuro).(400X)
G1 G3G2
4.1.2.2. Lamina-A-Clivada
A tabela 9 contém os resultados da contagem de corpúsculos apoptóticos em 6
campos de grande aumento (400 vezes) no jejuno, íleo e cólon dos animais,
distribuídos nos três grupos estudados (anexo 7). Através da Análise de Variância
foram constatadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para as
variáveis analisadas (p < 0,05).
Page 45
27
Tabela 9: RESULTADO DA CONTAGEM DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LAMINA-A-CLIVADA NO JEJUNO, ÍLEO E CÓLON
DOS ANIMAIS
Lamina G1 G2 G3 Comparações
Jejuno p < 0,001* média ± desvio padrão. 4,17 ± 1,94 13,5 ± 3,5 4,00 ± 1,41 mediana 3,5 13,0 4,0 mínimo – máximo 2,0 – 7,0 9,0 – 18,0 2,0 – 6,0 Íleo p < 0,001* média ± desvio padrão. 4,83 ± 2,14 15,8 ± 3,2 3,50 ± 2,26 mediana 4,0 15,5 3,5 mínimo – máximo 3,0 – 8,0 11,0 – 21,0 0,0 – 7,0 Cólon p < 0,001* média ± desvio padrão 4,3 ± 2,5 13,8 ± 3,6 2,8 ± 1,6 mediana 4,0 13,0 2,0 mínimo – máximo 1,0 – 8,0 9,0 – 19,0 2,0 – 6,0
Análise de Variância
A Tabela 10 contém os resultados das comparações duas a duas entre os grupos
G1, G2 e G3. No jejuno, íleo e cólon, o grupo G2 é significativamente maior do que os
outros dois. Entre G1 e G3 não foi constatada diferença estatisticamente significante.
Tabela 10: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA REALIZAÇÃO DA
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LAMINA-A-CLIVADA NO JEJUNO, ÍLEO E CÓLON
DOS ANIMAIS
Jejuno Ìleo Cólon
G2 > G1* G2 > G1* G2 > G1*
G2 > G3* G2 > G3* G2 > G3*
G1 = G3 G1 = G3 G1 = G3
Teste de comparações múltiplas de Tukey.
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28
JEJUNO
Gráfico 7: Lamina-A-Clivada no jejuno. Distribuição por grupos.
G1 G2 G3
G1 G2 G3
ÍLEO
Gráfico 8: Lamina-A-Clivada no íleo. Distribuição por grupos.
Page 47
29
CÓLON
G1 G3G2
Gráfico 9: Lamina-A-Clivada no cólon. Distribuição por grupos.
Figura 15: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Lamina-A-Clivada no jejuno dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina
(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)
G3G1 G2
Page 48
30
Figura 16: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Lamina-A-Clivada no íleo dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).
G1 G2 G3
Figura 17: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Lamina-A-Clivada no cólon dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina
(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)
G1 G2 G3
Page 49
31
4.1.3. Determinação de Malondialdeído Tecidual
Os valores de MDA (anexos 8-10) dos grupos em estudo podem ser observados
na tabela 11. Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de
estudo, quando se comparou a média da dosagem de MDA nos animais (p = 0,002).
Tabela 11: VALORES DE MDA TECIDUAL NO INTESTINO
nmol MDA/mg de Proteína Grupo
Média Desvio padrão Mínimo Máximo N
G1 1,0539* 0,4916 0,4455 2,0337 12
G2 2,6007* 1,8711 0,5993 6,4034 16
G3 1,1090* 0,6680 0,3189 2,7606 17
Análise de Variância: p = 0,002*
As comparações entre os pares de grupos mostraram que o grupo G2 tem média
significantemente maior do que a do grupo G1 (p = 0,015); os grupos G1 e G3 não
diferiram de forma significante entre si (p = 0,992) e o grupo G2 tem média
significantemente maior do que a do grupo G3 (p = 0,021). (Tabela 12)
Tabela 12: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA DOSAGEM DO MDA
TECIDUAL NO INTESTINO DOS ANIMAIS
Intestino
G2 > G1*
G2 > G3*
G1 = G3
Teste de comparações múltiplas de Tukey.
Page 50
32
4.2. Órgãos distantes 4.2.1. Imunohistoquímica
4.2.1.1. Caspase-3-Clivada A tabela 13 contém os resultados da contagem de corpúsculos apoptóticos em 6
campos de grande aumento (400 vezes) no fígado e rim dos animais, distribuídos nos
três grupos estudados (anexo 6). Através da Análise de Variância foram constatadas
diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para as variáveis analisadas
(p < 0,05).
Tabela 13: RESULTADO DA CONTAGEM DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3-CLIVADA NO FÍGADO E RIM DOS
ANIMAIS
Caspase G1 G2 G3 Comparações
Fígado p < 0,001* média ± desvio padrão 5,7 ± 2,6 11,5 ± 4,3 4,7 ± 1,8 mediana 5,0 11,5 4,5 mínimo – máximo 3,0 – 10,0 6,0 – 18,0 2,0 – 7,0 Rim p < 0,001* média ± desvio padrão 5,7 ± 5,3 12,7 ± 4,9 4,2 ± 2,8 mediana 5,0 12,5 4,0 mínimo – máximo 0,0 – 15,0 8,0 – 21,0 1,0 – 9,0
Análise de Variância
A Tabela 14 contém os resultados das comparações duas a duas entre os grupos
G1, G2 e G3. O resultado das comparações múltiplas foi o mesmo para os resultados
obtidos no fígado e rim na realização da imunohistoquímica para Caspase-3-Clivada. O
grupo G2 é significativamente maior, em média, do que os grupos G1 e G3. Entre estes
dois últimos não foi encontrada diferença estatisticamente significante.
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33
Tabela 14: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA CONTAGEM DE
CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3-
CLIVADA NO FÍGADO E RIM DOS ANIMAIS
Fígado Rim
G2 > G1* G2 > G1*
G2 > G3* G2 > G3*
G1 = G3 G1 = G3
FÍGADO
Teste de comparações múltiplas de Tukey.
Gráfico 10: Caspase-3-Clivada no fígado. Distribuição por grupos.
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34
RIM
Gráfico 11: Caspase-3-Clivada no rim. Distribuição por grupos.
Figura 18: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Caspase-3-Clivada no fígado dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina
(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)
G1 G2 G3
Page 53
35
Figura 19: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Caspase-3-Clivada no rim dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina
(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)
G1 G2 G3
4.2.1.2. Lamina-A-Clivada
A tabela 15 contém os resultados da contagem de corpúsculos apoptóticos em 6
campos de grande aumento (400 vezes) no fígado e rim dos animais, distribuídos nos
três grupos estudados (anexo 7). Através da Análise de Variância foram constatadas
diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para as variáveis analisadas
(p < 0,05).
Tabela 15: RESULTADO DA CONTAGEM DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS PELA
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LAMINA-A-CLIVADA NO FÍGADO E RIM DOS
ANIMAIS
Lamina G1 G2 G3 Comparações
Fígado p < 0,001* média ± desvio padrão 6,3 ± 3,4 15,0 ± 4,0 3,5 ± 2,3 mediana 6,0 15,0 3,5 mínimo – máximo 2,0 – 10,0 9,0 – 21,0 0,0 – 7,0 Rim p = 0,500 média ± desvio padrão 14,0 ± 3,5 19,3 ± 11,8 14,0 ± 9,2 mediana 14,5 15,5 12,0 mínimo – máximo 9,0 – 18,0 8,0 – 41,0 5,0 – 29,0
Análise de Variância
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36
A Tabela 16 contém os resultados das comparações duas a duas entre os grupos
G1, G2 e G3. No fígado, o grupo G2 é significativamente maior do que os outros dois.
Entre G1 e G3 não foi constatada diferença estatisticamente significante. No rim, não
foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos (p > 0,05).
Tabela 16: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA REALIZAÇÃO DA
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LAMINA-A-CLIVADA NO FÍGADO E RIM DOS
ANIMAIS
Fígado Rim
G2 > G1* G2 = G1
G2 > G3* G2 = G3
G1 = G3 G1 = G3
Teste de comparações múltiplas de Tukey.
G1 G2 G3
FÍGADO
Gráfico 12: Lamina-A-Clivada no fígado. Distribuição por grupos.
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37
RIM
G1 G3G2
Gráfico 13: Lamina-A-Clivada no rim. Distribuição por grupos.
Figura 20: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Lamina-A-Clivada no fígado dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina
(setas pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)
G1 G3G2
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38
Figura 21: Fotomicrografia representativa da coloração imunohistoquímica com
Lamina-A-Clivada no rim dos animais: G1: controle, G2: H-R, G3: H-R + Glicina (setas
pretas mostram os corpúsculos apoptóticos corados em marrom escuro).(400X)
G2 G3G1
4.2.2. Determinação de Malondialdeído Tecidual no Fígado
Os valores de MDA (anexos 11-13) dos grupos estudados podem ser observados
na tabela 17. Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de
estudo, quanto se comparou a média da dosagem de MDA no fígado dos animais (p =
0,004).
Tabela 17: VALORES DE MDA TECIDUAL NO FÍGADO.
Grupo nmol MDA /mg proteínas
Média Desvio padrão Mínimo Máximo N
G1 0,8043* 0,2316 0,3483 0,9787 6
G2 1,9328* 1,1099 0,8028 4,2304 8
G3 0,6891* 0,4908 0,1131 1,4560 10
Análise de Variância: p = 0,004*
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39
As comparações entre os pares de grupos mostraram que o grupo G2 tem média
significantemente maior do que a do grupo G1 (p = 0,023); os grupos G1 e G3 não
diferiram de forma significante entre si (p = 0,949) e o grupo G2 tem média
significantemente maior do que a do grupo G3 (p = 0,004). (Tabela 18)
Tabela 18: COMPARAÇÕES ENTRE OS GRUPOS NA DOSAGEM DO MDA
TECIDUAL NO FÍGADO DOS ANIMAIS
Fígado
G2 > G1*
G2 > G3*
G1 = G3
Teste de comparações múltiplas de Tukey.
Page 58
40
5. DISCUSSÃO
A enterocolite necrosante neonatal (ECN) é a doença mais freqüente e letal que
afeta o trato gastrointestinal de recém-nascidos (1). Não se sabe ao certo sua
etiopatogenia, porém, a maioria dos investigadores acredita que ela seja fruto de uma
combinação de eventos atuando num recém-nascido de vulnerabilidade variável.
Assim, um recém-nascido prematuro, de muito baixo peso, com uma barreira intestinal
fisiológica e imunologicamente imatura, poderia desenvolver a doença, mesmo em
presença de um só evento desencadeante. Já em um recém-nascido de peso perto do
normal, a doença teria tendência a acontecer somente em presença de diferentes
eventos concomitantes, como hipotensão arterial, hipotermia, hipóxia, anemia ou
cateterismo de vasos umbilicais (34).
A ECN pode desenvolver-se em um só segmento intestinal, estender-se para
quase todo o intestino, ou acometer diferentes segmentos intestinais de forma
descontínua. Os segmentos mais comumente envolvidos são o íleo terminal e o cólon (3).
A lesão microscópica característica da ECN em fase inicial é a necrose de
coagulação da superfície mucosa que se caracteriza pela conversão da célula em um
“arcabouço” acidofílico e opaco. Isso em geral ocorre com a perda do núcleo, mas com
preservação da forma celular básica, permitindo o reconhecimento dos contornos
celulares e arquitetura tissular. Presumivelmente, o padrão resulta da desnaturação
que bloqueia a proteólise da célula, não só das proteínas estruturais como também das
proteínas enzimáticas. (35).
Os achados clínicos da ECN são inespecífícos, tais como febre, letargia, apnéias
recorrentes, bradicardia, hipoglicemia e choque, e representam simplesmente uma
instabilidade fisiológica no recém-nascido. Os sintomas específicos do trato gastro-
intestinal aparecem mais tardiamente e são, fundamentalmente, distensão abdominal,
enterorragia, resíduo gástrico aumentado, vômitos e diarréia (34).
Nos modelos animais utilizados para estudo da etiopatogenia da ECN, ficou
demonstrado que a hipóxia leva a um decréscimo da perfusão intestinal, e a lesão
resultante é desencadeada por um mecanismo de isquemia e reperfusão (6-15). Os
modelos que utilizaram a hipóxia isoladamente, como evento desencadeante,
apresentaram lesão intestinal restrita à camada mucosa (36), com conseqüente quebra
Page 59
41
da barreira intestinal, mediada por apoptose celular (29), propiciando a entrada de
bactérias e endotoxinas, e o subseqüente desenvolvimento de todo o processo de ECN (29,36).
Diferentes mecanismos estariam envolvidos na progressão desta lesão como o
aumento da produção de radicais livres de oxigênio, aumento de moléculas de adesão
e infiltração de neutrófilos, e aumento da peroxidação lipídica, com a conseqüente
produção de mediadores inflamatórios como as citocinas (3).
Diferentes animais já foram utilizados para o estudo da ECN, porém, escolheu-se
o rato como animal de experimentação, porque as funções intestinais de mamíferos
com curto período de gestação, amadurecem após o parto (37), de forma semelhante ao
que ocorre com o intestino das crianças prematuras. Escolheu-se também o modelo
utilizado por Okur et al (12) em que ratos recém-nascidos eram submetidos a cinco
minutos de hipóxia, seguidos por cinco minutos de oxigenação, provocando doença
semelhante à ECN. Neste modelo os autores injetavam vitamina E por via
intraperitoneal e observaram que as lesões histológicas dos animais que haviam
recebido a vitamina E eram menos intensas e que a produção de radicais livres no
intestino era menor (12).
O modelo utilizado no experimento mostrou-se de fácil reprodução. Apesar de
provocar lesão histológica restrita à camada mucosa, como observada no estudo e já
demonstrada anteriormente (13), o que dificultou avaliar o uso da glicina através do
exame histopatológico, foi um bom modelo para avaliação da liberação de radicais
livres teciduais e para avaliação da apoptose (eventos que antecedem a lesão
tecidual). Uma de suas vantagens é não necessitar da administração de fórmulas
enterais para obtenção de lesão intestinal. Uma limitação para este modelo é o
pequeno tamanho dos animais. Os ratos no primeiro dia de vida pesam entre 4 e 6
gramas o que dificulta o estudo de drogas administradas por via oral e impede o estudo
de drogas utilizadas por via endovenosa. Também, nos animais deste tamanho, não é
possível o estudo de métodos de tratamento.
Vários agentes atenuantes ou preventivos foram testados em modelos
experimentais de ECN. O leite materno, ao contrário das fórmulas artificiais, mostrou-se
eficaz em reduzir o risco de desenvolvimento da doença (6). A Vitamina E e a
interleucina recombinante humana diminuíram a peroxidação lipídica e a lesão
histopatológica no tecido intestinal em ratos recém-nascidos (12,15). A suplementação
com bifidobactérias reduziu o risco de ECN ao diminuir a concentração de endotoxinas
Page 60
42
plasmáticas e a expressão da fosfolipase A2 intestinal (14). A suplementação com
aminoguanidina, um inibidor da óxido-nítrico-sintetase-indutora, também diminuiu a
reação inflamatória intestinal, reduzindo, portanto, o risco de ECN (17). Agentes como a
glutamina e a dexametasona também demonstraram efetividade ao diminuir a reação
inflamatória intestinal (18). Nenhum destes agentes, no entanto, teve sucesso absoluto
na prevenção da ECN (1).
Diferentes agentes, ainda não testados em modelos experimentais de ECN,
mostraram-se eficazes na prevenção de lesões intestinais por isquemia e reperfusão,
por oclusão da artéria mesentérica, em experimentos utilizando animais adultos (38).
Estão descritos o pré-condicionamento isquêmico, a terapia anticomplemento e
antileucocitária, os perfluorocarbonos, diferentes agentes antioxidantes, e o utilizado
neste estudo, que foi a utilização de glicina (38).
O pré-condicionamento isquêmico é apresentado como a melhor estratégia de
prevenção contra a lesão provocada por isquemia e reperfusão intestinal (38,39). Apesar
de estar demonstrado que ele pode ser realizado induzindo um evento de isquemia e
reperfusão em áreas corporais distantes do local desejado (40), é difícil pensar em sua
aplicabilidade clínica em recém-nascidos com risco de desenvolver ECN. A elucidação
dos mecanismos moleculares que estão envolvidos no pré-condicionamento isquêmico
e a identificação de drogas que mimetizem esta resposta protetora pode, no entanto,
ser a chave da prevenção das lesões por isquemia e reperfusão de vários órgãos no
futuro próximo (38,39).
A glicina, um aminoácido não essencial, já demonstrou sua capacidade de
proteger o intestino contra a lesão causada por isquemia e reperfusão em modelos de
oclusão mesentérica e em transplantes de intestino (23-28). Ela é considerada um agente
antiinflamatório, imunomodulador e com função citoprotetora direta (28). Lee et al (24,25),
em experimento com animais em que se provocou oclusão da artéria mesentérica,
demonstraram que a infusão mesentérica local de glicina aumentou o conteúdo
protéico e de DNA da mucosa, diminuiu a atividade da mieloperoxidase intestinal, e
manteve a atividade da glutaminase na mucosa. Outros dois estudos (26-27), também em
modelo de isquemia e reperfusão intestinal em ratos, demonstraram o efeito protetor da
glicina, usada em infusão intravenosa sistêmica, ao diminuir a apoptose (26), e preservar
a integridade e a contratilidade da parede intestinal (27).
A glicina pode ser facilmente administrada suplementando infusões intravenosas
de manutenção basal do metabolismo ou como componente de soluções de nutrição
Page 61
43
parenteral total. Pode também ser utilizada por via oral, tendo sido observada uma
excelente resposta nos diferentes estudos realizados (41,42). A dose já descrita de glicina
utilizada para prevenção da lesão causada por isquemia e reperfusão intestinal é de
0,5 a 3 mg por grama de peso corporal (24-28) e, quando administrada por via parenteral,
deve ser diluída em solução salina, pois sua diluição em água pode ser fatal ao induzir
hiponatremia (43,44). Seu uso em doses elevadas também pode levar à morte por
produção aumentada de amônia plasmática (43,44).
Ao analisar os resultados histológicos do experimento observou-se que os
animais submetidos a hipóxia-reoxigenação apresentaram lesões com graduação de
Chiu maior que os animais do grupo controle no jejuno e no cólon, e tenderam a
apresentar lesões com graduação maior no íleo. Os animais que deveriam ter sido
protegidos pela glicina apresentaram lesões histológicas com graduação de Chiu
semelhantes aos dos animais que não receberam a glicina. O resultado observado de
que a infusão de glicina não previne o dano tecidual já havia sido encontrado em
estudos prévios (23,25,27). Diferentes argumentos podem justificar estes achados. Um
deles é que a amostra retirada para exame histopatológico pode não refletir a extensão
global da lesão, pois as alterações morfológicas resultantes da isquemia-reperfusão
não são uniformes, podendo haver áreas histologicamente normais adjacentes a áreas
com necrose (45). É possível também que, como a glicina age na proteção da
membrana celular, a avaliação histológica não seja o critério mais adequado para
estudar seu efeito (23).
Mangino et al (23), avaliando os efeitos da glicina na função e metabolismo
intestinal após lesão por isquemia e reperfusão hipotérmica, observaram que houve
uma melhora do fluxo sanguíneo e do consumo de oxigênio após a reperfusão, uma
menor atividade da mieloperoxidase, e uma menor produção de leucotrieno B4.
Observaram também, porém, que não houve uma proteção efetiva, quando se
considerou como critério de avaliação as lesões histológicas provocadas no intestino.
Lee et al (25), em um modelo utilizando clampeamento da artéria mesentérica, também
não conseguiram observar um efeito protetor da glicina, quando utilizaram como critério
de avaliação as alterações histológicas, mas observaram que a atividade da
mieloperoxidase intestinal estava diminuída, e que a atividade da glutaminase na
mucosa estava mantida. Kallakuri et al (27), utilizando um modelo semelhante ao de Lee
et al, demonstraram que a glicina não foi capaz de evitar a alteração da cobertura
mucosa, porém manteve a espessura total da parede e o raio circunferencial da
Page 62
44
vilosidade. No presente estudo o modelo animal utilizado não produziu lesão
histológica suficiente o que dificultou a avaliação da proteção oferecida pela glicina
através do exame histopatológico.
A peroxidação lipídica é um processo complexo que pode ocorrer em membranas
biológicas constituídas por ácidos graxos poliinsaturados reagentes ao oxigênio
molecular, levando à produção de hidroperóxidos lipídicos e seus metabólitos. Na
maioria dos casos em que há peroxidação lipídica, ocorre uma reação em cadeia que
se propaga, mediada pela presença de radicais livres (12,13,15). Os hidroperóxidos
lipídicos acumulam-se na membrana, inativando seus receptores e enzimas,
prejudicando suas funções, levando a sua desestabilização, e tornando-a permeável a
íons (12,13,15). Um método simples e de alta sensibilidade para demonstrar esta
peroxidação lipídica é a reação de substâncias que se combinam com o ácido
tiobarbitúrico, como o malondialdeído (MDA). O MDA é, desta forma, um indicador
adequado para medir a peroxidação lipídica provocada por radicais livres (12,13,15).
As lesões intestinais da ECN levam à liberação destes radicais livres e
mediadores inflamatórios na corrente sanguínea, que podem acarretar disfunção e
falência de múltiplos órgãos (3,46), a maior causa de mortalidade nos pacientes
portadores de ECN. O fígado é o primeiro órgão a receber estes mediadores tóxicos (47)
provenientes do intestino, e, por esse motivo, ele foi o órgão escolhido para averiguar a
ação da glicina na peroxidação lipídica em órgãos distantes.
Se as lesões histológicas não permitiram afirmar que a glicina tem um efeito
protetor efetivo no intestino, a dosagem do malondialdeído mostrou que o grupo
submetido à hipóxia-reoxigenação apresentou valores maiores do que o grupo
previamente submetido à infusão de glicina (p = 0,021). Os resultados obtidos são
semelhantes aos estudos de Okur et al utilizando a vitamina E, e os de Öztürk et al
utilizando a interleucina-10 recombinate humana (12,15).
Resultado semelhante encontrou-se no fígado. O grupo submetido à hipóxia-
reoxigenação teve valores médios de MDA hepático significativamente maiores que os
animais previamente protegidos pelo uso de glicina (p = 0,004), demonstrando que a
les. A ausência de diferença entre o grupo controle e o grupo que usou glicina (p =
0,949) demonstra que o nível de proteção fornecido pela glicina foi importante a ponto
de o nível de peroxidação ser semelhante ao dos ratos do grupo controle.
A apoptose do epitélio intestinal precede e induz a lesão tecidual pela quebra da
barreira mucosa (29). Com a progressão do processo, há liberação de mediadores
Page 63
45
inflamatórios na corrente sanguínea, que provocam morte celular em diferentes órgãos
como fígado e rim. A apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos, por meio
de receptores específicos na superfície celular, ou por estímulos internos, como dano
ao DNA, alterações do ciclo celular ou das vias metabólicas. Estas diferentes vias
culminam com a ativação de proteases conhecidas como caspases, que têm papel
fundamental no processo de morte celular (48).
As caspases estão presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas inativas,
tornando-se ativas após clivagem proteolítica do ácido aspártico (48). Pelo menos
quatorze membros dessa família já foram identificados nos mamíferos, e estão
envolvidos no processo de inflamação e apoptose (48). Algumas caspases iniciam a
atividade proteolítica e agem como reguladoras da morte celular, enquanto outras,
como a caspase 3 e 6, agem como efetoras na fragmentação celular. A lamina A é uma
proteína de membrana nuclear, e é especificamente clivada pela caspase 6. A
determinação imunohistoquímica da lamina A clivada também, foi, por este motivo,
utilizada, neste estudo, como marcadora da ativação da caspase 6.
O índice apoptótico, quando determinado pela reação da caspase-3-clivada, foi
maior nos animais submetidos à hipóxia-reoxigenação do que nos animais previamente
protegidos pela glicina, em todos os órgãos examinados. O mesmo resultado foi
observado, quando o índice apoptótico foi medido pela reação da lamina-A-clivada, em
todos os órgãos examinados, porém no rim o resultado não foi significante quando da
análise estatística.
A comprovada diminuição da peroxidação lipídica e da apoptose celular nos
animais tratados com glicina decorre, provavelmente, de seu mecanismo de ação na
membrana plasmática, onde ativa um canal de cloro que estabiliza ou hiperpolariza o
potencial de membrana, bloqueando o acréscimo intracelular de cálcio que vai
desencadear todo o processo de lesão celular (28).
A glicina foi capaz de reduzir os efeitos deletérios da hipóxia-reoxigenação,
quando se considerou como critério de avaliação a dosagem de MDA e os índices de
apoptose celular. As lesões histológicas, incapazes de mostrar as alterações mais
precoces, talvez não configurem o melhor marcador, quando se quer detectar os
fenômenos patológicos numa fase mais inicial.
Como a glicina pode ser administrada em qualquer solução intravenosa ou
mesmo por via oral, é provável que a recomendação de seu uso rotineiro nas unidades
Page 64
46
neonatais de terapia intensiva seja uma boa prática e, quem sabe, seja esta a
mensagem mais importante deste trabalho.
Page 65
47
6. CONCLUSÕES
No modelo experimental de ECN a injeção de glicina:
1. não é capaz de, estatisticamente, prevenir as alterações histológicas;
2. diminui a peroxidação lipídica no intestino e no fígado, avaliada pela dosagem de
malondialdeído tecidual;
3. diminui a apoptose celular no intestino, rim e fígado, quando se considera a
determinação da Caspase-3-Clivada;
4. diminui a apoptose celular no intestino e fígado, quando se considera a
determinação da Lamina-A-Clivada.
Page 66
48
7. REFERÊNCIAS
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8. ANEXOS
Anexo 1: Carta de aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa:
Page 73
55
Anexo 2:
Figura 22: Programa de edição de imagem utilizado para captura das imagens
provenientes do microscópio óptico.
Page 74
56
Anexo 3:
Figura 23: Programa de edição de imagem utilizado para contagem dos
corpúsculos apoptóticos.
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57
Anexo 4:
Curva de Proteína
0
0,5
1
1,5
0 0,1 mg/ml 0,2 mg/ml 0,4 mg/ml 0,8 mg/ml 1,0 mg/ml
Concentração
Abs
orbâ
ncia
Curva de proteína
Gráfico 14: Curva de calibração de proteína construída com o padrão de albumina
humana.
Anexo 5:
Curva de MDA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0 1,5 3 6 12 24
nmol MDA
Abs
orbâ
ncia
Curva de MDA
Gráfico 15: Curva de calibração do MDA traçada com 1,3,3 tetra-metoxipropano
malondialdeído bis (acetildimetilo).
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58
Anexo 6: Tabela 19: NÚMERO DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS EM 6 CAMPOS DE 400X
PELO MÉTODO DA CASPASE-3-CLIVADA EM TODOS OS GRUPOS NO JEJUNO,
ÍLEO, CÓLON, FÍGADO E RIM
Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1
N Total N total N total N total N total 1 8 1 13 1 1 1 10 1 7 2 7 2 4 2 4 2 4 2 0 3 1 3 5 3 5 3 7 3 3 4 4 4 10 4 11 4 6 4 15 5 7 5 4 5 4 5 3 5 2 6 3 6 3 6 3 6 4 6 7
Total 30 Total 39 Total 28 Total 34 Total 34 Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim
Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 N Total N Total N Total N Total N Total 1 14 1 24 1 19 1 18 1 14 2 28 2 19 2 24 2 14 2 14 3 31 3 27 3 39 3 12 3 21 4 14 4 18 4 16 4 8 4 11 5 20 5 19 5 10 5 6 5 8 6 21 6 27 6 31 6 11 6 8
Total 128 Total 134 Total 139 Total 69 Total 76 Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim
Grupo G3 Grupo G3 Grupo G3 Grupo G3 Grupo G3 N Total N Total N Total N Total N Total 1 4 1 5 1 5 1 6 1 3 2 4 2 7 2 9 2 4 2 5 3 4 3 5 3 2 3 4 3 2 4 8 4 8 4 4 4 5 4 5 5 8 5 6 5 9 5 2 5 9 6 4 6 9 6 3 6 7 6 1
Total 32 Total 40 Total 32 Total 28 Total 25
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59
Anexo 7: Tabela 20: NÚMERO DE CORPÚSCULOS APOPTÓTICOS EM 6 CAMPOS DE 400X
PELO MÉTODO DA LAMINA-A-CLIVADA EM TODOS OS GRUPOS NO JEJUNO,
ÍLEO, CÓLON, FÍGADO E RIM
Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1 Grupo G1
N total N total N total N total N total 1 6 1 3 1 6 1 2 1 15 2 7 2 4 2 8 2 4 2 11 3 3 3 8 3 3 3 10 3 17 4 4 4 7 4 5 4 10 4 18 5 3 5 4 5 3 5 4 5 9 6 2 6 3 6 1 6 8 6 14
Total 25 Total 27 Total 26 Total 38 Total 84 Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim
Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 Grupo G2 N Total N Total N Total N Total N Total 1 12 1 11 1 13 1 9 1 23 2 14 2 16 2 12 2 15 2 18 3 11 3 15 3 13 3 15 3 41 4 18 4 15 4 19 4 13 4 8 5 9 5 17 5 9 5 17 5 13 6 17 6 21 6 17 6 21 6 13
Total 81 Total 95 Total 83 Total 90 Total 116 Jejuno Íleo Cólon Fígado Rim
Grupo G3 Grupo G3 Grupo G3 Grupo G3 Grupo G3 N Total N Total N Total N Total N Total 1 2 1 7 1 2 1 7 1 29 2 5 2 4 2 2 2 4 2 5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 6 4 4 4 4 4 2 4 4 4 10 5 6 5 3 5 6 5 3 5 14 6 4 6 0 6 2 6 0 6 20
Total 24 Total 21 Total 17 Total 21 Total 84
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60
Anexo 8: Tabela 21: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO CONTROLE (G1) COM
AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E MALONDIALDEÍDO INTESTINAIS.
N Peso órgão g MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteína
1 0,61 2,63 2,9 0,90
2 0,55 2,32 3,46 0,67
3 0,59 5,09 3,31 1,53
4 0,62 3,61 2,86 1,26
5 0,54 3,08 2,52 1,22
6 0,63 1,45 1,89 0,76
7 0,68 1,39 3,12 0,44
8 0,58 5,18 3,14 1,64
9 0,66 1,18 2,35 0,50
10 0,6 2,19 2,48 0,88
11 0,56 3,62 1,78 2,03
12 0,52 1,77 2,31 0,76
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61
Anexo 9: Tabela 22: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO HIPÓXIA-
REOXIGENAÇÃO (G2) COM AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E MALONDIALDEÍDO
INTESTINAIS
N Peso órgão g MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteína
1 0,81 4,34 2,7 1,60
2 0,85 16,42 3,29 4,99
3 0,72 10,43 3,75 2,78
4 0,83 5,45 2,89 1,88
5 0,96 9,97 2,94 3,39
6 0,4 4,13 2,71 1,52
7 0,63 4,39 1,53 2,86
8 0,75 6,38 2,7 2,36
9 0,5 3,66 1,21 3,02
10 0,39 15,24 2,38 6,40
11 0,34 14,41 2,28 6,32
12 0,36 5,89 5,84 1,00
13 0,64 8,52 6,99 1,21
14 0,53 6,4 6,76 0,94
15 0,33 4,05 5,98 0,67
16 0,28 3,68 6,14 0,59
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62
Anexo 10: Tabela 23: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO HIPÓXIA-
REOXIGENAÇÃO + GLICINA (G3) COM AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E
MALONDIALDEÍDO INTESTINAIS.
N Peso órgão (g) MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteína
1 0,87 1,44 2,7 0,53
2 0,97 2,34 3,53 0,66
3 0,93 4 2,88 1,38
4 0,94 5,63 3,11 1,81
5 0,93 4,66 2,82 1,65
6 0,81 3,92 5,58 0,70
7 0,62 1,5 4,52 0,33
8 0,8 1,36 1,44 0,94
9 0,72 4,24 10,1 0,41
10 0,73 1,55 4,86 0,31
11 0,47 5,88 2,13 2,76
12 0,2 4,16 2,31 1,80
13 0,26 11,33 6,7 1,69
14 0,54 7,67 6,42 1,19
15 0,2 6,98 6,03 1,15
16 0,3 5,09 6 0,84
17 0,22 4,46 7,03 0,63
Page 81
63
Anexo 11: Tabela 24: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO CONTROLE (G1) COM
AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E MALONDIALDEÍDO HEPÁTICOS.
N Peso órgão g MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteínas
1 0,3 2,56 7,35 0,34
2 0,33 6,3 7,2 0,87
3 0,25 5,52 5,64 0,97
4 0,33 3,4 4,17 0,81
5 0,28 5,56 6,5 0,85
6 0,21 4,26 4,47 0,95
Anexo 12: Tabela 25: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO HIPÓXIA-
REOXIGENAÇÃO (G2) COM AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E MALONDIALDEÍDO
HEPÁTICOS.
N Peso órgão g MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteínas
1 0,42 9,73 2,3 4,23
2 0,48 6,43 3,9 1,64
3 0,44 7,11 4 1,77
4 0,47 7,4 5,33 1,38
5 0,25 3,99 4,97 0,80
6 0,3 5,67 4,21 1,34
7 0,3 4,47 1,53 2,92
8 0,27 7,47 5,55 1,34
Page 82
64
Anexo 13: Tabela 26: CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS DO GRUPO HIPÓXIA-
REOXIGENAÇÃO + GLICINA (G3) COM AS DOSAGENS DE PROTEÍNA E
MALONDIALDEÍDO HEPÁTICOS.
N Peso órgão g MDA nmol/ml Proteínas mg/ml nmol MDA/mg proteínas
1 0,43 7,43 5,103 1,45
2 0,39 6,01 5,6826 1,05
3 0,29 7,4 5,44 1,36
4 0,4 5,84 6,73 0,86
5 0,42 4,62 5,99 0,77
6 0,44 4,77 16,45 0,28
7 0,26 1,97 17,42 0,11
8 0,31 3,96 9,07 0,43
9 0,43 9,17 21,68 0,42
10 0,28 1,83 15,82 0,11