1 1 GENET GENET İ İ K TANI K TANI Y Y Ö Ö NTEMLER NTEMLER İ İ Yrd. Yrd. Do Do ç ç .Dr .Dr .Ay .Ay ş ş e G e G ü ü l ZAMAN l ZAMAN İ İ Sel Sel ç ç uk uk Ü Ü niversitesi Meram T niversitesi Meram T ı ı p Fak p Fak ü ü ltesi ltesi T T ı ı bbi Genetik AD, KONYA bbi Genetik AD, KONYA
50
Embed
GENETİK TANI - file.toraks.org.tr · 1- Sitogenetik ve Moleküler Sitogenetik Tanı Yöntemleri I. Sitogenetik Tanı Yöntemleri 1. Klasik Sitogenetik Tanı Yöntemleri 2. ÖzelleşmişSitogenetik
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
11
GENETGENETİİK TANI K TANI YYÖÖNTEMLERNTEMLERİİ
Yrd.Yrd.DoDoçç.Dr.Dr.Ay.Ayşşe Ge Güül ZAMANl ZAMANİİ
SelSelççuk uk ÜÜniversitesi Meram Tniversitesi Meram Tııp Fakp Faküültesiltesi
TTııbbi Genetik AD, KONYAbbi Genetik AD, KONYA
22
GENETGENETİİK TANI YK TANI YÖÖNTEMLERNTEMLERİİ11-- SitogenetikSitogenetik ve Molekve Moleküüler ler SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri
I. I. SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri1. Klasik 1. Klasik SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri2. 2. ÖÖzellezelleşşmimişş SitogenetikSitogenetik TanTanıı yyööntemlerintemleri
a. Kardea. Kardeşş kromatidkromatid dedeğğiişşimi (imi (SisterSister ChromatidChromatid Exchange= SCE)Exchange= SCE)b. b. MikronMikronüükleuskleus (MN)(MN)c. c. FrajilFrajil bböölge tayinilge tayini
II. MolekII. Moleküüler ler SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemleri ntemleri 1.Ak1.Akışış karyotiplemesikaryotiplemesi((FlowFlow karyotypingkaryotyping))2. 2. FloresansFloresans in in situsitu hibridizasyonhibridizasyon (FISH)(FISH)3. Fiber FISH3. Fiber FISH4. 4. MulticolorMulticolor--FISHFISH
a. a. SpectralSpectral karyotypingkaryotyping (SKY)(SKY)b. b. MultiplexMultiplex--FISH (MFISH (M--FISH)FISH)c. Rc. R--FISHFISHd. d. CobraCobra--FISHFISHe.e.KomparatifKomparatif genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH)(CGH)
2. Molek2. Moleküüler Genetik Tanler Genetik Tanıı YYööntemlerintemleriI. I. PolimerazPolimeraz zincir reaksiyonu (PZR)zincir reaksiyonu (PZR)II. II. AllelAllel--öözgzgüü oligonoligonüükleotidkleotid analizi (analizi (AlleleAllele--specificspecific oligonucleotidoligonucleotid= ASO)= ASO)III. DNA dizi Analizi III. DNA dizi Analizi IV. IV. MikroarrayMikroarray AnaliziAnalizi
33
Kromozomlar mitotik/mayotik metafaz
Spontan olarak bölünen dokularda
Kültürde bölünmeleri için uyarılan hücrelerde
44
Spontan olarak bölünen hücreler:Kemik iliğiLenf nodülleriSolid tumorlerBazı plevral ya da asidik sıvılarFetal asitlerKistik higromaFetus ya da yeni doğan kanı
55
Spontan olarak bölünme hızı düşük olan hücreler:
Kan lenfositleri Amniyon sıvısıKoryonik villuslarDeri ve fibroblast içeren diğer dokular
66
HÜCRE (DOKU) KÜLTÜRÜ
• Kısa süreli kültür (24-72, bazen 96 saat)
Örn: Kemik iliği, kan …• Uzun süreli kültür (1-3 hafta)
Örn: Amniyon sıvısı, deri ve diğer dokular ...
77
Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkımaddeleri (Kültür Ortamı):1. Besi Yerleri (=Vasat)
Dengelenmiş tuz solüsyonu ile hazırlanırlarHanks ya da HBSS→ozmotik basınç ve pH kontrolü
Glukoz→hücreler için enerjiMedyumlar
TC Medium 199Minimal Esential Medium (MEM)McCoy’s 5ANutrient Ham’s F-10RPMI-1640 … gibi
Daha spesifik besi yerleri. Örn: ChangLeibovitz L15
88
Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkı maddeleri (Kültür Ortamı):
Hücre büyüme faktörleri, adhezyon faktörleri, iz elementler, hormonlar,vitaminler
4. L-GlutaminÇoğunlukla besi yerinin içinde hazır
99
5. . Mitoz uyaranı
=Mitojen: EBV(Epstein Bar Virus),Pokeweed mitojen (PWM),Phorbol ester (TPA)
En çok kullanılan mitojen : Phytohemagglutinin insan periferik kan
kültüründeki olgun lenfositleri uyararak onlarıbölünmeye teşvik eder.
1010
KROMOZOM ELDESİ ve PREPARATLARIN HAZIRLANMASI(HARVESTING)
* 2 saat önce Kolşisin ya da Demekolsin
(mitozu durdurmak için)sıvı faz
* Santrifüjhücre fazı
* Hipotonik Muamelesi0.075 M KCl , % 0.95’lik Na Sitrat
* Fiksatif Muamelesi:(3 Metanol : 1 Asetik Asit) X 3 kere
* Lamlara yayma ve kurutma
1111
GG--BandlamaBandlama
Most common method usedMost common method usedChromosomes treated with Chromosomes treated with trypsintrypsin–– denatures proteindenatures protein
GiemsaGiemsa stain stain –– each chromosome each chromosome
characteristic light and dark characteristic light and dark bandsbands
–– 400 bands per haploid 400 bands per haploid genomegenome
–– Each band corresponds to Each band corresponds to 55--10 10 megabasesmegabases
–– Dark bands are gene poorDark bands are gene poor
1212
İİdiyogramdiyogram
1313
ISCNISCN
International System for International System for Human Human CytogeneticCytogeneticNomenclatureNomenclatureKromozomlarKromozomlarıın n herbirherbirbböölgesinin lgesinin numaralandnumaralandıırrıılmaslmasııSSentromereentromere (proximal) (proximal) en en yakyakıın bn böölgeler ilgeler iççin en kin en küçüüçükkSSentromereentromere (distal) (distal) en uzak en uzak bböölgeler ilgeler iççin en bin en büüyyüük k numaralarnumaralar
1414
HRBHRB--BandlamaBandlama
– Yüksek çözünme – 800 band
prometafazkromozom
– Metotreksat veKolşisin kullanılır
1515
QQ--BandlamaBandlama
ÖÖzellikle Y kromozomu zellikle Y kromozomu anomalilerinde ve anomalilerinde ve mozaisizimmozaisizim tantanııssıında nda kullankullanııllıırrGG--bandband benzeri benzeri bandlarbandlarelde edilir.Fakat elde edilir.Fakat polimorfizmlerpolimorfizmlersaptanamazsaptanamazFloresansFloresans mikroskop mikroskop gereklidir.gereklidir.
X kromozom X kromozom anomalilerini anomalilerini tantanıımlamak imlamak iççin in kullankullanııllıırrKromozomlar Kromozomlar giemsagiemsaile ile bandlanmadanbandlanmadan öönce nce ııssııya tabii tutulurya tabii tutulurAAççıık ve karanlk ve karanlıık k renkteki renkteki bandlarbandlar terstir.terstir.
1717
CC--BandlamaBandlama
SentromerleriSentromerleri ve ve heterokrometiniheterokrometinitantanıımlamak imlamak iççin in kullankullanııllıır.r.HeteroHeterokromatik kromatik bböölgelerlgeler–– Tekrarlayan diziler Tekrarlayan diziler
GGüümmüüşş(NOR)boyama:(NOR)boyama:NukleolarNukleolarorganizasyon borganizasyon böölgeleri lgeleri ve ve akrosentrikakrosentrikkromozomlarkromozomlarıın ikincil n ikincil boboğğumlarumlarıı boyanboyanıır.r.
1919
KardeKardeşş kromatidkromatid dedeğğiişşimiimi
İİki hki hüücre dcre dööngngüüssüü boyunca boyunca kromatidlerikromatidleri ayayıırma frma fıırsatrsatııveren veren BrdUBrdU ((bromobromo--deoxydeoxy--uridineuridine) k) küültltüür ortamr ortamıına na eklenir. eklenir. Sadece bir zincirde DNA Sadece bir zincirde DNA BrdUBrdU almalmışışsa normal sa normal karanlkaranlıık k GiemsaGiemsa boyamasboyamasııolur, diolur, diğğer zincir daha aer zincir daha aççıık k renkle boyanrenkle boyanıır.r.EEğğer deer değğiişşim im gergerççekleekleşştiyse, tiyse, kromatidkromatidparparçça para parçça aa aççıık ve koyu k ve koyu renklerde grenklerde göörrüüllüür: r: ""harlequinharlequin kromozomlarkromozomlarıı““..
AkciAkciğğer kanseri her kanseri hüücre dizilerinde 5cre dizilerinde 5--florokromflorokrom MM--FISH karFISH karışıışımmıı ile ile hibridizasyonhibridizasyon sonrassonrasıı A)gerA)gerççek renk ek renk metafazmetafazıı, B) s, B) sıınnııflandflandıırrıılmlmışış renk renk sunumusunumu
3333
MultiplexMultiplex FISHFISH
C). C). KaryotipKaryotip
3434
CobraCobra FISHFISH
İİnsan nsan COBRACOBRA––FISH prob FISH prob setsetİİ ile elde edilen ile elde edilen 1212--renkrenkimaimajjıı. . Sadece Sadece üçüç adet adet floroflorokromkromkullankullanıılarak yaplarak yapıılan oranllan oranlııiişşaretlemearetleme(DEAC, Cy3 and (DEAC, Cy3 and Cy5 ). Cy5 ). Beyaz ok klasik Beyaz ok klasik sitogenetiksitogenetikyyööntemlerle ntemlerle tesbittesbitedilemeyen bir edilemeyen bir translokasyonutranslokasyonuggööstermektedir.stermektedir.