UNIVERSITÉ PAUL SABATIER-TOULOUSE III U.F.R. Sciences de la Vie et de la Terre (SVT) École Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies T T H HÈ È S S E E Pour l’obtention du grade de D DO OC CT TE EU UR R D DE E L L ’ ’ U UN NI I V VE ER RS S I I T TÉ É T TO OU UL L O OU US S E E I I I I I I Spécialité : IMMUNOPATHOLOGIE Présentée et soutenue par C Cé é l l i i n n e e F F O OU UL L Q QU UI I E E R R Le 2 octobre 2007 Jury F. APPARAILLY Rapporteur A.-S. KORGANOW Rapporteur S. VALITUTTI Examinateur J. ROUDIER Examinateur M. SEBBAG Examinateur G. SERRE Directeur de thèse Unité « Différenciation Épidermique et Auto-immunité Rhumatoïde » UMR 5165 CNRS-Université Paul Sabatier Toulouse III Gen Gen è è se des cibles des auto se des cibles des auto - - anticorps anti anticorps anti - - prot prot é é ines ines citrullin citrullin é é es es dans le tissu dans le tissu synovial rhumato synovial rhumato ï ï de : de : peptidyl peptidyl - - arginine arginine d d é é siminases siminases et fibrine et fibrine citrullin citrullin é é e e Gen Gen è è se des cibles des auto se des cibles des auto - - anticorps anti anticorps anti - - prot prot é é ines ines citrullin citrullin é é es es dans le tissu dans le tissu synovial rhumato synovial rhumato ï ï de : de : peptidyl peptidyl - - arginine arginine d d é é siminases siminases et fibrine et fibrine citrullin citrullin é é e e
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UNIVERSITÉ PAUL SABATIER-TOULOUSE III U.F.R. Sciences de la Vie et de la Terre (SVT)
F. APPARAILLY Rapporteur A.-S. KORGANOW Rapporteur
S. VALITUTTI Examinateur J. ROUDIER Examinateur M. SEBBAG Examinateur G. SERRE Directeur de thèse
Unité « Différenciation Épidermique et Auto-immunité Rhumatoïde » UMR 5165 CNRS-Université Paul Sabatier Toulouse III
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peptidylpeptidyl--arginine arginine ddéésiminasessiminaseset fibrine et fibrine citrullincitrullinééee
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Remerciements
Mes remerciements s'adressent en premier lieu au Professeur Guy SERRE pour m'avoir
accueillie dans son équipe de recherche et pour m'avoir permis de réaliser ce travail.
Je remercie très sincèrement Florence APPARAILLY, chargée de recherche INSERM
(Montpellier, INSERM U 844) et Anne-Sophie Korganow, maitre de conférence de
l'université Strasbourg I, de m'avoir fait l'honneur d'être les rapportrices de ce travail et
d'avoir accepté avec enthousiasme la lourde tâche d'évaluer ce manuscrit.
Je tiens également à remercier Jean Roudier, Professeur de l'Université Aix Marseille II, et
Salvatore VALITUTTI, professeur de l'université Paul Sabatier (Toulouse III), pour m'avoir
fait l'honneur de juger cette thèse.
Mireille, je pense que tu le sais, mais merci encore pour TOUT ce que tu as fait pour
moi !!! Merci pour ton investissement, ton soutien et tes encouragements. Sans toi, je n'en
serai pas arrivée là ! Merci aussi de m'avoir supportée (patiemment) durant ces 5
années…
Un grand merci à toi Roula pour ton aide précieuse au microscope et pour l'investissement
et l''intérêt que tu as porté à ce travail.
Un grand merci à Régine et Mitou, qui on partagé avec moi les "joies" du western blot et
du clonage … Finalement les " plus que 2 ans !!! " vont me manquer…☺
Un très grand merci "aux deux Marie" : merci pour votre aide et votre bonne humeur qui
m'ont permis de mieux supporter ces longues heures passées au cryo-microtome…
Merci à tous les membres de l'équipe (passés et présents) qui ont partagé avec moi ce
travail et qui m'ont soutenue toutes ces années : Sabine, Valérie, Cyril, Léonor, Christina et
Keyvan.
Remerciements
Un grand Merci à l'équipe du " 3ième "… Marina, merci pour ton "coaching" et ton aide en
biologie moléculaire et surtout durant ces longs mois passés sur le clonage de la PAD6 !
Eve et Nico, mille fois merci pour votre aide très précieuse et pour toutes les fois où je
vous ai dérangés avec mes petits soucis techniques ou autres…
Je remercie également toutes les personnes du laboratoire et plus particulièrement celles
qui sont intervenues de près ou de loin dans ce travail… Marie-Claire, merci pour l'intérêt
que tu as porté à ce travail durant ces années.
"Laetiti" : notre cohabitation fût courte mais j'espère qu'elle n'aura pas été trop difficile…
En tout cas, fini les petits dessins ! J'espère que tu prendras le relai Fanny… ☺
Véro, je sais que ça te fera plaisir : je te passe (avec joie) le briquet !!!! ☺
Un grand merci à toute la "bande de naze" : Choupinet et Choupinette, Guigui, CriCri et
Bernardin, Jé, sophie… Merci pour votre bonne humeur et votre présence.
Un merci tout particulier à ma Vivi… je suis heureuse que tu sois toujours là (même à
distance) depuis toutes ces années !!!
Un merci tout spécial à mon chouchou… Merci d'avoir été présent et de m'avoir soutenue
et supportée surtout ces loooooooooongs derniers mois !
Et enfin un grand merci à ma famille et surtout à toi Maman… Merci pour tes
encouragements et ton soutien tout au long de cette thèse et même avant !
Liste des Abréviations
ACPA auto-anticorps anti-protéines citrullinées ACR American College of Rheumatology ADN Acide Désoxyribo-Nucléique ADNc ADN Complémentaire AFA auto-anticorps anti-Filaggrine AhFibA auto-anticorps anti-Fibrinogène humain citrulliné AKA auto-anticorps anti-kératine APF Facteur anti-périnucléaire ARA American Rheumatism Association ARNm Acide Ribo-Nucléique messager Ca Calcium CCP Cyclic Citrullinated Peptide CI Complexe immun CIA Collagen-Induced Arthritis CMH Complexe Majeur d'Histocompatibilité CPA Cellule Présentatrice d'Antigène Da/kDa Dalton / kilodalton EBV Epstein-Barr Virus ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EST Expressed Sequence Tag FcR Récepteur au fragment cristallisable des immunoglobulines FNH Facteur Naturel d'Hydratation FR Facteur Rhumatoïde GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein GPAO Glaucome Primaire à Angle Ouvert HLA Human Leukocyte Antigen Ig Immunoglobuline IL Interleukine LPS Lipopolysaccharide MBP Myelin Basic Protein M-CSF Monocyte-Colony Stimulating Factor MEC Matrice Extra-Cellulaire Mφ Macrophage MMP Matrix Metallo-Protease NLS Nuclear Localisation Sequence NO monoxyde d'azote PAD Peptidyl-Arginine Désiminase PADI gène codant pour une PAD pb paire(s) de bases PCR Polymerase Chain Reaction pI point isoélectrique PR Polyarthrite Rhumatoïde
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est la maladie auto-immune la plus fréquente. Elle se caractérise par une inflammation chronique des articulations synoviales pouvant conduire à leur destruction. Chez les patients, de nombreux auto-anticorps ont été décrits parmi lesquels les auto-anticorps anti-protéines citrullinées (ACPA) qui, sur leurs antigènes-cibles, reconnaissent des épitopes porteurs de résidus citrullyl. Ces derniers sont générés par la désimination (citrullination) de résidus arginyl catalysée par une peptidyl-arginine désiminase (PAD). De nombreux arguments suggèrent un rôle important des ACPA dans la physiopathologie de la PR. En effet, ils sont très spécifiques de cette maladie et sont détectés dans le sérum des patients très précocement, parfois même avant l'apparition des signes cliniques. Ils sont de plus synthétisés et concentrés au sein du tissu synovial rhumatoïde où leur cible antigénique, la fibrine citrullinée, est présente.
Nous avons cherché à préciser l'origine et le rôle du conflit immunologique entre fibrine citrullinée et ACPA dans la physiopathologie de la PR, à travers 3 questions : i/ quelles sont les PAD impliquées dans la désimination de la fibrine ? ii/ cette désimination est-elle spécifique de la PR ? et iii/ la fibrine citrullinée est-elle immunogène et arthritogène ?
Nous avons établi que, parmi les cinq isotypes de PAD existantes, seules les PAD2 et 4 sont présentes au sein du tissu synovial rhumatoïde. En outre, nous avons montré que l'expression synoviale des PAD2 et 4 n'est pas exclusivement associée à la PR, puisqu'elle est observable au cours d'autres rhumatismes inflammatoires et corrélée à l'inflammation tissulaire. Cependant alors que la PAD2 est également présente dans le tissu synovial de patients atteints d'arthrose, l'expression de la PAD4 est associée aux seuls rhumatismes inflammatoires. Des analyses immunohistologiques ont révélé que ces 2 PAD sont exprimées par des cellules mononucléées infiltrant le tissu mais également, en ce qui concerne la PAD4, par les synoviocytes hyperplasiques. L'expression de CD68 par les cellules PAD-positives indique leur origine myélo-monocytaire. De plus, la localisation des PAD2 et 4 au voisinage proche ou au sein des dépôts de fibrine citrullinée suggère fortement que ces 2 isotypes sont tous deux impliqués dans la citrullination de la fibrine.
En cohérence avec ces résultats, nous avons également montré que la fibrine citrullinée n'est pas spécifique du tissu synovial rhumatoïde. En effet, sa présence dans le tissu synovial enflammé de patients atteints d'autres rhumatismes, inflammatoires ou non, indique que la citrullination de la fibrine est une caractéristique générale des synovites qui n'induit donc pas nécessairement la production d'ACPA.
Enfin, nous avons étudié l'immunogénicité et l'arthritogénicité de la fibrine citrullinée autologue chez le rat. Seuls les animaux ayant reçu des inoculations de fibrinogène sous forme citrullinée, et non ceux ayant reçu la forme native, ont développé une " réponse anticorps ". Cependant, cette réponse auto-immune n'a pas induit d’arthrite, ni permis d’aggraver une arthrite aigüe transitoire. Des dépôts de fibrine citrullinée ne s'étant pas formés au sein des articulations, le défaut d'arthritogénicité pourrait être dû à l'absence de conflit immunologique local.
Ces résultats conduisent à s'interroger sur les mécanismes d'induction chez les seuls patients atteints de PR, d'une réponse auto-immune spécifique vis-à-vis d'un auto-antigène présent dans toutes les arthrites. Restent également à identifier les facteurs qui induisent l’expression des PAD2 et 4, à expliquer comment et/ou pourquoi ces enzymes sont relarguées et activées pour désiminer des protéines extracellulaires telles que la fibrine. L'inhibition de l'activité ou de l'expression des PAD2 et/ou 4 pourrait en effet constituer une stratégie thérapeutique nouvelle de la PR.
Abstract
Rheumatoid arthritis (RA), essentially characterized by chronic inflammation of synovial joints with frequent extra-articular manifestations, is the most common human autoimmune disease. In the serum of patients with RA, presence of autoantibodies to citrullinated proteins (ACPA) also constitutes a major disease feature. Citrullyl residues are essential components of the ACPA-targeted epitopes. They result from the posttranslational conversion of arginyl residues by a peptidylarginine deiminase (citrullination). ACPA are very probably involved in the pathophysiology of RA. Indeed, they are highly specific for the disease and appear early in the disease course. In addition, they are produced and concentrated into the rheumatoid synovial tissue (ST) where their major antigenic target, citrullinated fibrin, is present.
In this work, we tried to clarify the origin and role of the immunological conflict between ACPA and citrullinated fibrin in RA pathophysiology by asking 3 questions: i/ What PAD isotypes are involved in the citrullination of fibrin ? ii/ Is fibrin citrullination specific for RA ? and iii/ Is citrullinated fibrin immunogenic and arthritogenic ?
We established that, among the five PAD isotypes, only PAD2 and PAD4 were present in the rheumatoid ST. In addition, we showed that synovial expression of PAD2 and PAD4 was not exclusively associated to RA but observed in other arthritides and correlated with the intensity of tissue inflammation. While PAD2 was also present in the ST of patients with osteoarthritis, PAD4 expression was restricted to arthritides. Immunohistological analyses revealed that mononuclear cells infiltrating the ST were a major source of both PAD2 and PAD4, and that hyperplastic cells of the synovial lining constituted another important source of PAD4. Finally, localization of PAD2 and PAD4 within or at the close vicinity of citrullinated fibrin deposits strongly suggested that these two isotypes were involved in fibrin citrullination.
In accordance with these results, we also showed that the presence of citrullinated fibrin in the ST was not specific for RA. Indeed, it was also observed in the inflamed ST of patients suffering from other, inflammatory or non inflammatory, rheumatisms. This indicates that fibrin citrullination is a general feature of synovitides that does not necessarily induce ACPA production.
Finally, we assessed the immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen in the rat. Only inoculation of citrullinated fibrinogen, and not that of native fibrinogen, induced an autoimmune response. However, this response was neither spontaneously arthritogenic nor able to aggravate acute ankle arthritis. This lack of arthritogenicity was probably due to the absence of a local immunological conflict, citrullinated fibrin deposits being absent from the ankle joints.
The mechanisms governing induction of an RA-specific autoimmune response to a non-disease type specific antigen still remain to be established. Moreover, factors inducing PAD2 and PAD4 expression in the ST are still unknown. Finally, the way these enzymes are secreted and activated to citrullinate extracellular proteins like fibrin remains to be determined. Inhibition of PAD2 and/or PAD4 expression or activity could represent a new valuable therapeutic approach for RA.
1.1.4. Caractéristiques anatomo-pathologiques............................................................................ 4 1.1.4.1. Sur un plan articulaire ................................................................................................... 4 1.1.4.2. Sur un plan extra-articulaire........................................................................................... 6 1.1.4.3. Signes biologiques ........................................................................................................ 7
1.1.5. Etiologie de la maladie ..................................................................................................... 7 1.1.5.1. Facteurs génétiques ...................................................................................................... 8
1.1.5.2. Facteurs hormonaux et environnementaux..................................................................... 11
2. ASPECTS PHYSIOPATHOLOGIQUES DE LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE .......14
2.1. Rôle des lymphocytes T .........................................................................................................15 2.1.1. Généralités .................................................................................................................... 15 2.1.2. Les cellules TH17............................................................................................................ 18 2.1.3. Les cellules T régulatrices dans la PR ................................................................................ 21
2.2. Rôle des macrophages..........................................................................................................22 2.2.1. Activation des macrophages dans la PR............................................................................ 24 2.2.2. Stimulation/ régulation de l'activation des macrophages dans la PR .................................... 25
2.2.3. Molécules effectrices des macrophages dans la PR ............................................................ 29 2.2.3.1. Cytokines pro-inflammatoires....................................................................................... 29 2.2.3.2. Cytokines anti-inflammatoires/régulatrices .................................................................... 30 2.2.3.3. Cytokines avec un double rôle dans l'arthrite................................................................. 30 2.2.3.4. NO et espèces réactives oxygénées (ROS)..................................................................... 31
2.3. Autres cellules ......................................................................................................................32 2.3.1. Les neutrophiles.............................................................................................................. 32 2.3.2. Les mastocytes................................................................................................................ 32 2.3.3. Autres cellules ................................................................................................................ 33
2.4. Rôle des lymphocytes B .........................................................................................................33 2.4.1. Accumulation de cellules B dans le synovium rhumatoïde................................................... 34 2.4.2. Cellules B en tant que cellules présentatrices d'antigène..................................................... 36 2.4.3. Rôle des cellules B dans des modèles murins d'arthrite ....................................................... 37
2.4.4. Complexes immuns dans la polyarthrite rhumatoïde .......................................................... 39 2.4.4.1. Complexes immuns circulant dans la polyarthrite rhumatoïde ......................................... 40 2.4.4.2. Complexes immuns dans l'articulation rhumatoïde......................................................... 40
Table des matières
2.4.5. Activation du complément ............................................................................................... 41 2.4.5.1. Généralités ................................................................................................................ 41 2.4.5.2. Activation du complément dans la PR ........................................................................... 42
2.4.6. FcγR et PR ...................................................................................................................... 43 2.4.6.1. Caractéristiques des FcγR ............................................................................................ 43 2.4.6.2. FcγR dans la PR .......................................................................................................... 44
3.1. Étapes de la découverte des auto-anticorps anti-protéines citrullinées.........................................48 3.1.1. Anticorps anti-kératine (AKA, "anti-keratin antibodies") ....................................................... 48 3.1.2. Facteur anti-périnucléaire (APF, "anti-perinuclear factor") ................................................... 49 3.1.3. Caractérisation de la cible articulaire des AFA................................................................... 50
3.1.3.1. Caractérisation des épitopes des AFA ........................................................................... 50 3.1.3.2. Synthèse des AFA dans le tissu synovial rhumatoïde ....................................................... 51 3.1.3.3. Identification de la cible des AFA dans le tissu synovial rhumatoïde ................................. 51 3.1.3.4. La Fibrine................................................................................................................... 52
4. LES PEPTIDYL-ARGININE DESIMINASES ..........................................................60
4.1. Introduction .........................................................................................................................60 4.1.1. La désimination ou citrullination....................................................................................... 61 4.1.2. Caractéristiques générales des peptidyl-arginine désiminases ............................................. 62
4.2. Caractéristiques des PAD : clonage, profil d'expression, conservation, activité. ............................64 4.2.1. Clonage et profil d'expression des Pad murines ................................................................. 64
4.2.3. Profil d'expression des différentes PAD humaines ............................................................... 70 4.2.3.1. Expression des gènes PADI au niveau ARNm................................................................. 70 4.2.3.2. Expression des PAD au niveau protéique....................................................................... 72
4.2.4. Conservation des différentes PAD..................................................................................... 73 4.2.4.1. Organisation génomique et conservation des gènes PADI/Padi....................................... 73 4.2.4.2. Conservation des séquences des PAD........................................................................... 75
4.2.5. Substrats et spécificités des PAD....................................................................................... 77
4.3. Relations structure / fonction : structure cristallographique de la PAD4 .......................................80 4.3.1. Structure générale........................................................................................................... 80
Table des matières
4.3.2. Sites de fixation au calcium ............................................................................................. 81 4.3.3. Implications fonctionnelles dans le domaine N-terminal ..................................................... 83 4.3.4. Implications fonctionnelles dans le domaine C-terminal ..................................................... 83 4.3.5. Site actif en forme de sillon.............................................................................................. 84 4.3.6. Dimérisation de la PAD4 ................................................................................................. 85 4.3.7. Reconnaissance de substrats naturels : les histones ............................................................ 86
4.4. PAD, désimination et processus physiologiques ........................................................................88 4.4.1. Désimination et différenciation épidermique...................................................................... 88
4.4.1.1. Désimination et Facteur naturel d'hydratation ................................................................ 89 4.4.1.1.1. Désimination de la filaggrine et FNH ...................................................................... 90 4.4.1.1.2. PAD impliquées dans la désimination de la filaggrine............................................... 92
4.4.1.2. Désimination des filaments intermédiaires de kératines................................................... 93 4.4.2. Désimination et différenciation du follicule pileux............................................................... 94 4.4.3. Désimination et apoptose................................................................................................ 99 4.4.4. Désimination et régulation génique ................................................................................ 100
4.4.4.1. Généralités .............................................................................................................. 100 4.4.4.2. Rôle de la PAD4 dans la régulation transcriptionnelle .................................................. 102 4.4.4.3. La PAD4 catalyse-t-elle la déméthylimination?............................................................. 104
4.5. PAD, désimination et pathologies autres que la PR .................................................................107 4.5.1. Maladies neurodégénératives ........................................................................................ 107
4.5.1.1. La Sclérose en plaque ............................................................................................... 108 4.5.1.2. Maladie d'Alzheimer.................................................................................................. 113
4.5.2. Glaucome primaire à angle ouvert................................................................................. 115 4.5.3. Cancer ........................................................................................................................ 116 4.5.4. Psoriasis et érythrodermie congénitale ichtyosiforme bulleuse ........................................... 117 4.5.5. Néphropathie obstructive .............................................................................................. 119
Publication N°1 : ...........................................................................................................................123 Fibrin deimination in synovial tissue is not specific for rheumatoid arthritis but commonly occurs during synovitides. The Journal of Immunology, 174:5057-5064, 2005. Chapuy-Regaud S, Sebbag M, Baeten D, Clavel C, Foulquier C, De Keyser F, Serre G.
Publication N°2 : ...........................................................................................................................133 In the rat, citrullinated autologous fibrinogen is immunogenic but the induced autoimmune response is not arthritogenic. Clinical and Experimental Immunology, 145:502-512, 2006. Duplan V, Foulquier C, Clavel C, Al Badine R, Serre G, Saoudi A, Sebbag M.
Publication N°3 : ...........................................................................................................................147 Peptidylarginine deiminase 2 and 4 but not 1, 3 and 6 are expressed in the rheumatoid arthritis synovium in close relation with tissue inflammation. Arthritis and Rheumatism (Sous presse). Foulquier C, Sebbag M, Clavel C, Chapuy-Regaud S, Al Badine R, Méchin M-C, Vincent C, Nachat R, Yamada M, Takahara H, Simon M, Guerrin M, Serre G.
Les rhumatismes sont aussi vieux que le monde. Aux XVIème et XVIIème siècles, la
goutte était tenue pour responsable de nombreuses maladies, et en particulier, de tout ce
qui touchait aux articulations. La première description de la polyarthrite rhumatoïde (PR),
en tant que maladie individualisée, remonterait à la thèse "sur la goutte asthénique
primitive", soutenue par Auguste Landré-Bauvois, le 3 août 1800.
1.1.2. Définition nosologique
La PR est une maladie auto-immune dont l'étiologie reste encore inconnue de nos
jours. Elle se caractérise par une inflammation chronique des articulations synoviales
pouvant conduire à terme à leur déformation et à leur destruction irréversibles. L'évolution
de la maladie se fait par poussées, souvent entrecoupées de phases de rémission,
conduisant le patient vers un stade d'invalidité fonctionnelle. Par définition, la
dénomination de "PR" n'est utilisée que pour des sujets de plus de 15 ans (Ryckewaert
1987).
1.1.3. Epidémiologie
1.1.3.1. Prévalence
La PR présente une distribution mondiale et affecte tous les groupes ethniques.
C'est la plus fréquente des maladies auto-immune et le plus fréquent des rhumatismes
inflammatoires chroniques. Les études épidémiologiques de la PR sont difficiles et donnent
des résultats souvent divergents à cause de l'hétérogénéité de la maladie et en fonction
des critères de diagnostics utilisés. La plupart de études utilisent les critères de l'American
Rheumatism Association (ARA) (Ropes et al. 1958), révisés en 1988 par l'American
College of Rheumatolgy (ACR) (Arnett et al. 1988). Ces critères de classification de la
Introduction
- 2 -
maladie ont été établis en prenant en compte des données cliniques, radiologiques et
biologiques (cf Tableau 1).
1. Raideur matinale : raideur articulaire matinale durant au moins une heure. 2. Arthrite simultanée d'au moins 3 articulations : gonflement des parties molles, touchant au moins 3 articulations simultanément, observé par un médecin. 14 articulations ou groupes d'articulations sont à prendre en compte : IPP, MCP, poignets, coudes, genoux, chevilles et MTP. 3. Arthrite touchant la main : gonflement d'au moins une articulation des mains (IPP ou MCP), observé par un médecin 4. Arthrite symétrique : atteinte articulaire simultanée symétrique (une atteinte bilatérale sans symétrie absolue des MCP, IPP ou MTP est acceptée) 5. Présence de nodules rhumatoïdes : nodules sous-cutanés, au niveau des proéminences osseuses, des surfaces d'extensions, ou dans les régions péri-articulaires, observés par un médecin. 6. Facteur rhumatoïde : sérologie rhumatoïde positive (taux anormal par toute méthode où les résultats sont positifs chez moins de 5 % de sujets témoins normaux). 7. Signes radiologiques : changements radiologiques typiques de polyarthrite rhumatoïde sur les radiographies des mains (IPP, MCP) et des poignets, avec présence nécessaire d'érosions ou de déminéralisation. IPP : articulations inter-phalangiennes proximales ; MCP : articulations métacarpo-phalangiennes proximales ; MTP : articulations métatarso-phalangiennes Au moins 4 des 7 critères doivent être présents. Les critères 1 à 4 doivent être présents depuis au moins 6 semaines. Tableau 1 : Critères de classification de la polyarthrite rhumatoïde proposés par l'American College of Rheumatology (ACR) en 1988.
En utilisant ces critères, la prévalence de la PR est estimée entre 0.5 et 1% de la
population adulte (Spector 1990). Il existe néanmoins des variations de prévalence selon
les populations étudiées. En France, la prévalence serait de l'ordre de 0.25 à 0.5 %. La PR
serait plus répandue en Europe du nord et en Amérique du nord, notamment dans
certaines populations consanguines comme les indiens Pima et Chippewa, avec des
prévalences particulièrement élevées (5.3 et 6.8 % respectivement). Au contraire la
maladie semble plus rare au japon et en chine ou même absente dans certaines
Introduction
- 3 -
populations rurales africaines. Ces résultats soulignent l'influence du terrain génétique et
des facteurs environnementaux sur le développement de la maladie (Silman and Pearson
2002).
1.1.3.2. Age, sexe, incidence
La polyarthrite peut apparaître à tout âge mais l'âge moyen de début de la maladie
est voisin de 45 ans avec une incidence maximale entre 40 et 60 ans. La PR touche plus
les femmes que les hommes avec un sex-ratio variant de 2:1 à 3:1 (Alamanos and Drosos
2005).
L'incidence (nombre de nouveaux cas observés par an) est variable. Aux états unis,
les chiffrent varient de 20 à 40 pour 100 000 personnes. En France, l'incidence semble
plus faible ; dans une étude sur la période de 1986-1989, l'incidence a été estimée à
environ 8.8 pour 100 000 (12,7/100 000 femmes et 4.7/100 000 hommes) (Guillemin
et al. 1994).
1.1.3.3. Evolution et pronostic
L'évolution de la PR peut être très variable d'un patient à un autre : 35 % des
malades ont un seul épisode qui dure 2 à 3 ans, 50 % ont une évolution cyclique avec
des poussées suivies de rémissions, et une détérioration fonctionnelle qui progresse lors de
chaque poussée, et enfin 15 % ont une evolution progressive sans rémission. Chez la
plupart des patients, la maladie évolue encore au-delà de 10 ou même 20 ans. La PR est
une maladie potentiellement grave en raison de son incidence fonctionnelle (l'impotence
articulaire des patients augmente avec le temps) et de son incidence sur l'espérance de vie
(en moyenne, celle des hommes est écourtée de 7 ans et celle des femmes de 3 ans).
Généralement, la mortalité est associée aux complications viscérales et/ou générales de la
maladie combinées aux effets secondaires toxiques des traitements anti-inflammatoires ou
immunosuppresseurs.
Introduction
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1.1.4. Caractéristiques anatomo-pathologiques
1.1.4.1. Sur un plan articulaire
L'inflammation articulaire concerne les articulations diarthrodiales (également
appelées articulations synoviales) des membres, où les extrémités osseuses, revêtues de
cartilage, se rejoignent latéralement par une membrane capsulo-synoviale. Cette dernière
est un tissu conjonctif formé d'une part, de la capsule articulaire, manchon périphérique
externe qui s'insère sur les os au voisinage de l'articulation, et d'autre part, de la
membrane synoviale qui tapisse la face interne de la cavité articulaire et qui, à la hauteur
de l'insertion de la capsule, se réfléchit sur l'os pour s'insérer autour des cartilages
articulaires (cf ).
La membrane synoviale se compose de 2 couches :
- la couche bordante (intima) au contact de la cavité articulaire. Elle est formée de une à
quatre assise(s) de synoviocytes de 2 types : les synoviocytes de type A ou synoviocytes de
type macrophagique, dérivés de cellules souches sanguines mononucléées, et les
synoviocytes de type B ou synoviocytes de type fibroblastique. Ces deux types cellulaires
ont respectivement des propriétés de phagocytose et de biosynthèse du liquide synovial.
- la couche sous-intimale (subintima) au contact de la capsule articulaire. Elle est formée
de fibroblastes, histiocytes, mastocytes et de fibres de collagène. Elle présente également
un réseau microvasculaire important.
L'inflammation rhumatoïde, appelée synovite rhumatoïde, se caractérise, comme
toutes les inflammations, par une vasodilation, un œdème et une infiltration cellulaire. Sur
un plan histhopathologique, de nombreux changements vont s'opérer en fonction de la
progression de la maladie. Les capillaires et veinules post-capillaires ainsi que des
synoviocytes de bordure deviennent hyperplasiques. Une infiltration massive par des
monocytes / macrophages, des cellules dendritiques, des lymphocytes T et B ainsi que des
plasmocytes a également lieu au sein de la couche sous-intimale. Finalement, par
différents mécanismes, l'inflammation aboutit à la formation d'un tissu bourgeonnant, le
pannus synovial qui va éroder le cartilage et l'os sous-jacent (cf Figure 2).
Figure 2 : Représentation schématique d'une articulation normale (a) ou rhumatoïde (b). D'après (Strand et al. 2007).
Introduction
- 6 -
Chez 80% des patients, on observe une atteinte multicompartimentale des
articulations généralement de façon symétrique. Les articulations des doigts et des
poignets sont les plus fréquemment impliquées et généralement elles sont touchées en
premier. D'autres articulations vont progressivement être également atteintes comme celles
des pieds, des coudes, des chevilles, des genoux ou encore du rachis cervical.
L'inflammation concerne beaucoup plus rarement les articulations des épaules, des
hanches, les tempo-maxillaires, les sterno-claviculaires ou les sacro-iliaques et très
exceptionnellement les segments dorsaux et lombaires du rachis (cf Figure 3).
1.1.4.2. Sur un plan extra-articulaire
Même si la PR est une maladie essentiellement articulaire, elle peut également
s'accompagner de manifestations extra-articulaires diverses, souvent liées à la gravité de la
maladie. Une de ces manifestations est la présence de nodosités sous-cutanées également
appelées nodules rhumatoïdes. Ces nodules apparaissent dans des zones typiques sur la
face postérieure des avant bras, au niveau des doigts, des coudes et aussi du pied et du
Figure 3 : Représentation schématique du profil des articulations généralement impliquées au cours de la polyarthrite rhumatoïde. La fréquence relative d'atteinte de chaque articulation est indiquée par les différents ronds. D'après (Zvaifler 2006).
Introduction
- 7 -
tendon d'Achille. Ces nodules sont détectés chez 20 à 25% des patients, et sont
généralement associés à la présence de facteur rhumatoïde sérique, d'un haplotype de
susceptibilité à la PR ainsi qu'aux PR les plus agressives (Zvaifler 2006). D'autres
manifestations extra-articulaires peuvent se développer, les principales étant des
manifestations pleuro-pulmonaires, cardiaques ou rénales. Par contre, aucune atteinte
épidermique n'a été associée à la PR.
1.1.4.3. Signes biologiques
Au niveau articulaire, le liquide synovial des patients est de type inflammatoire,
pauvre en acide hyaluronique, et riche en cellules, essentiellement des polynucléaires
neutrophiles (cf Figure 2). Le liquide contient aussi des facteurs rhumatoïdes et d'autres
auto-anticorps, qui participent à la formation de complexes immuns (CI) et ainsi
contribuent à diminuer le taux des fractions du complément en activant ces dernières. Des
enzymes protéolytiques y sont également présentes.
Plus généralement au niveau sanguin, les patients présentent les signes biologiques
classiques de l'inflammation comme une anémie, une hyperleucocytose, une
thrombocytose, une augmentation de la vitesse de sédimentation (VS) érythrocytaire, ou de
la concentration de protéines comme la protéine C réactive (CRP) ou encore une
augmentation du taux de fibrinogène. De nombreux auto-anticorps sont également
détectés dans le sérum des patients atteints de PR et seront détaillés plus loin.
1.1.5. Etiologie de la maladie
Il existe un consensus général selon lequel la PR est une maladie multifactorielle
complexe qui résulte de l'association de plusieurs facteurs à la fois génétiques et
environnementaux qui contribuent à l'apparition et au développement de la maladie. Les
facteurs génétiques ont été suspectés de jouer un rôle depuis quelques décennies sur la
base d'un regroupement ("clustering") de la maladie au sein de familles. En effet, la
prévalence de la PR est de 2 à 12% chez les parents au 1er degré de patients tandis
qu'elle est de 0.5 à 1% dans le reste de la population. Egalement, les degrés de
concordance pour la maladie de 15 à 30 % chez les jumeaux monozygotes et de 5 à 10
% chez les jumeaux dizygotes de même sexe, confirment un rôle de facteurs génétiques
dans la susceptibilité à la maladie (Silman et al. 1993; MacGregor et al. 2000).
Introduction
- 8 -
Cependant, le risque familial pour la PR ne semble pas très important et les études sur la
concordance entre jumeaux ont permis d’estimer que les facteurs génétiques pourraient
représenter 50 à 60 % du risque de développer la maladie (MacGregor et al. 2000).
1.1.5.1. Facteurs génétiques
1.1.5.1.1. Gènes HLA
Le gène le plus incontestablement impliqué dans le déterminisme génétique de la
PR est le gène HLA-DRβ1, codant pour la chaîne β de la molécule HLA-DR (molécule du
CMH de classe II) et situé sur le chromosome 6 en 6p21. L'association à la PR d’allèles de
gènes localisés dans la région HLA a été proposée pour la 1ère fois en 1976 par Stastny
(Stastny 1976). Quelques années plus tard, les gènes codant pour les molécules DR4 et
DR1 ont été identifiés comme étant associés à la PR (Stastny 1978; Woodrow et al. 1981).
A la fin des années 1990, grâce au développement d'outils moléculaires permettant le
séquençage du locus HLA-DRβ1, Gregersen et ses collaborateurs ont proposé l'hypothèse
de l'épitope partagé pour expliquer l'association de la région codant pour les molécules
de classe II du CMH avec la PR. Selon l'hypothèse formulée, les molécules HLA-DR
seraient directement impliquées dans la physiopathologie de la PR et l'association entre
HLA-DR et PR serait attribuable à des allèles de susceptibilité codant pour une séquence en
acides aminés conservée, située dans la 3ème région hypervariable de la chaîne β des
molécules HLA-DR (Gregersen et al. 1987). Ce serait la présence de cette séquence
(QKRAA, QRRAA ou RRRAA) en position 70-74, codée par les allèles DR4 (DRβ1*0401,
*0404 et *0405), DR1 (DRβ1*0101 et *0102) et DR10 (DRβ1*1010), qui serait associée
à une plus grande susceptibilité à développer une PR. Le risque relatif de développer la
maladie varie selon les allèles à l'intérieur d'une population donnée. Par exemple,
l'hétérozygotie HLA-DRβ1*0401/0404 confère un risque relatif voisin de 30 (cf Tableau 2).
De la même façon, la susceptibilité conférée par les allèles codant pour l'épitope partagé
varie à travers les populations; ces allèles ne sont en effet pas associés à la PR dans
certaines populations américaines (africaines et hispaniques) (McDaniel et al. 1995; Teller
et al. 1996).
Introduction
- 9 -
génotype DRβ1 risque relatif p
0101/DRX 2,3 10-3
0401/DRX 4,7 10-12
0404/DRX 5,0 10-9
0101/0401 6,4 10-4
0401/0404 31,3 10-33
Tableau 2 : Risques relatifs des génotypes DRβ1 pour la PR. D'après (Gregersen et al. 2006).
Bien que HLA-DRβ1semble être le facteur génétique majeur dans la PR, le locus
HLA ne contribue qu'à hauteur de 30 % dans le risque familial global. De plus, la
présence d’un des allèles HLA-DR conférant la susceptibilité à la PR est décrite dans 40 %
des individus dans la population générale et dans 70 % des patients atteints de la
maladie. Ceci indique que ces allèles ne sont ni suffisants, ni nécessaires pour provoquer
le développement de la maladie chez un individu donné. Ces données suggèrent donc
que d'autres gènes non-HLA puissent également jouer un rôle dans la susceptibilité à la
PR.
1.1.5.1.2. Gènes non-HLA
D'autres locus et gènes, outre les gènes HLA, ont été étudiés et se sont avérés être
associés à la PR. Par exemple, des gènes candidats ont été identifiés, non seulement au
niveau de la région CMH de classe II mais aussi de la région CMH de classe III où le
gène TNFα a été impliqué comme facteur de susceptibilité à la maladie (Singal et al.
2000) (pour revue (Dieude and Cornelis 2005)).
Plusieurs criblages génomiques ont identifié la région 1p36 en tant que locus
d'intérêt pour la PR. Ce locus contient en particulier le gène TNFR2 qui code pour le
récepteur 2 au TNFα. Le rôle crucial de cette cytokine dans la physiopathologie de la PR
et le fait que le gène TNFR2 soit présent dans un locus d'intérêt font de ce gène un
candidat majeur pour le développement de la PR. Un polymorphisme (SNP) a été localisé
dans l'exon 6 et se caractérise par la substitution en position 196 d'un résidu méthionyl en
résidu arginyl. Cette substitution accentue la transmission intracellulaire des signaux
générés par la fixation de TNFα sur TNFR2 (Morita et al. 2001). Plusieurs études familiales
Introduction
- 10 -
réalisées dans des populations caucasiennes et japonaises ont montré une association
significative de l'allèle TNFR2 196R et du génotype TNFR2 196R/R. Cependant, même si
des preuves d'une telle implication ont été obtenues, le rôle du gène TNFR2 reste modeste,
puisqu'il semble plutôt restreint aux formes familiales de PR.
Au sein de la même région d'intérêt que le gène TNFR2, en 1p36, est localisé le
locus PADI, qui correspond au groupe de gènes codant pour les 5 isotypes de
peptidylarginine désiminases (PAD, cf chapitre 4). L'association de ces gènes avec la PR
sera évoquée dans le chapitre discussion.
Une association entre la PR et un SNP fonctionnel du gène PTPN22 a récemment
été mise en évidence dans une étude cas-contrôle aux Etats-Unis (Begovich et al. 2004).
Ce gène, localisé sur le chromosome 1 en p13, code pour une protéine tyrosine
phosphatase LYP (Lymphoid phosphatase) impliquée dans la régulation négative de
l'activation des cellules T transitant par le TCR. L'allèle 1858T du SNP PTPN22-C1858T
provoque la substitution R620W au niveau de la tyrosine phosphatase et affecte un motif
riche en proline impliqué dans les interactions protéine-protéine. L'association à la PR de
cet allèle T a été démontrée dans plusieurs populations, toutes caucasiennes. Une
association à d'autres maladies auto-immunes incluant le diabète de type I ou encore le
lupus a également été rapportée (pour revue cf (Gregersen et al. 2006)). Bien que
plusieurs mécanismes de gain ou de perte de fonction aient été suggérés, le mécanisme
moléculaire de susceptibilité à la maladie reste à établir. Très récemment, des preuves de
l'association de l'allèle T avec la PR ont été apportées dans une population caucasienne
française, et plus précisément entre l'allèle T et les patients PR séropositifs pour le facteur
rhumatoïde. PTPN22 serait ainsi, plus généralement, "un gène de l'auto-immunité"
(Michou et al. 2007). Enfin, dans une population suédoise, l'allèle T a également été
associé avec la présence d'anti-CCP chez les patients atteints de PR, la combinaison des
deux donnant une spécificité de diagnostic très élevée de la PR (Johansson et al. 2006;
Kokkonen et al. 2007).
La protéine CTLA-4, tout comme LYP, joue un rôle important dans la régulation
négative de l'activation des cellules T, en se fixant, avec une forte affinité, aux molécules
de costimulation CD80/86 et en entrant en compétition avec CD28. Des polymorphismes
du gène CTLA-4 ont été associés avec plusieurs maladies auto-immunes, particulièrement
Introduction
- 11 -
la thyroïdite auto-immune et le diabète de type I. Ce gène semble donc être un locus
général de susceptibilité aux maladies auto-immunes. L'association entre le SNP A49G du
gène CTLA-4 et la PR a été recherchée mais les résultats apparaissent contradictoires.
Cependant, très récemment, il a été montré une association de l'allèle CT60 du gène
CTLA-4 avec le développement de la PR dans une cohorte caucasienne nord-américaine.
Dans cette cohorte, ainsi que dans une cohorte suédoise, l'association de CTLA-4 s'est de
plus révélée plus forte avec les patients PR séropositifs pour les auto-anticorps anti-
protéines citrullinées (ACPA). Ce gène serait donc un gène de susceptibilité pour
seulement un sous-ensemble de patients PR (Plenge et al. 2005).
Enfin, le groupe ayant identifié l'haplotype de susceptibilité à la PR de PADI4 a
démontré l'association entre le gène SLC22A4 et la PR (Tokuhiro et al. 2003). SLC22A4
est localisé en 5q31 et code pour une protéine transporteur de cations organiques. Bien
que ce gène ne soit pas à l'intérieur d'un locus d'intérêt, il est localisé dans une région qui
contient d'autres gènes impliqués dans des mécanismes d'inflammation, et associé avec la
maladie de Crohn (Plenge et al. 2005). Une étude au sein d'une population japonaise a
révélé une association entre la PR et un SNP intronique localisé dans une séquence
contenant un site de fixation pour un facteur de transcription, RUNX1. La présence de
l'allèle de susceptibilité aurait pour conséquence une plus grande affinité du facteur de
transciption RUNX1 vis-à-vis de son site de fixation ce qui abaisserait la transcription du
gène SLC22A4. Le même groupe japonais a également testé un SNP intronique dans le
gène RUNX1, présent tout comme SLC22A4 à l'extérieur des régions d'intérêt identifiées
par criblage génomique, et montré son association avec la PR (Tokuhiro et al. 2003).
L'ensemble de ces données illustre la complexité de la susceptibilité génétique à la
PR, qui implique probablement la combinaison de variants de nombreux gènes.
1.1.5.2. Facteurs hormonaux et environnementaux
Le fait que les femmes soient 3 fois plus touchées par la PR que les hommes a
suggéré le rôle de facteurs hormonaux dans l'apparition de la maladie. Les hormones
exogènes ont également une influence sur le risque à développer la maladie. Par exemple,
la prise d’une pilule contraceptive oestro-progestative reduirait le risque de développer
une PR. De la même façon, comme dans d'autres maladies auto-immunes, la survenue
Introduction
- 12 -
d'une grossesse aurait une influence négative sur le développement de la maladie. Même
si la protection n'est pas totale, on observe une amélioration des symptômes durant la
grossesse, qui pourrait s'expliquer par l'induction de cellules T régulatrices (Ostensen and
Villiger 2002) avec toutefois un retour de la maladie durant la période post-partum (pour
revue cf (Silman and Pearson 2002; Calvo-Alen and Alarcon 2006)).
De nombreux pathogènes, virus ou bactéries, ont également été impliqués dans
l'étiologie et la pathogenèse de la PR. C'est le cas par exemple de Borrelia burgdorferi
(agent de la maladie de Lyme), du parvovirus B-19 (vecteur de la cinquième maladie), du
virus de la rougeole ou encore du virus d'Epstein-Barr (EBV) (pour revue cf (Calvo-Alen
and Alarcon 2006)). Etant donnée la distribution mondiale de la PR, plus d'un agent
infectieux doit être impliqué dans sa causalité. Les plus vieux ossements sur lesquels ont
été observés des lésions caractéristiques de polyarthrite ont été découverts en Amérique et
dataient de 3000 à 5000 ans (Rothschild et al. 1988). Il a ainsi été suggéré que l'agent
infectieux impliqué dans la maladie soit originaire d'Amérique et ait été distribué à travers
le monde après que les Européens aient été au contact des populations natives
américaines. Cependant, la preuve directe de l'intervention d'un ou plusieurs agents
pathogènes n'a jamais été apportée. Une hypothèse serait que, chez les individus
prédiposés génétiquement, probablement plus d'un facteur environnemental, infectieux ou
non, pourrait conduire au développement de la PR en initiant une réaction
immunopathologique. Cette dernière activerait une cascade d'événements caractérisés
initialement par une inflammation (au niveau articulaire) puis par une destruction
articulaire. L'implication d'un agent infectieux ou d'un produit microbien pourrait
s'expliquer par un mimétisme moléculaire d'un peptide microbien spécifique vis-à-vis de
molécules autologues.
Un autre facteur qui semble influencer non seulement l'évolution de la PR mais aussi qui
augmente le risque de développer la maladie est le tabagisme. La cigarette est un
mélange complexe de composants parmi lesquels des adjuvants et de la nicotine. Des
adjuvants non-spécifiques sont connus pour favoriser la réaction immunitaire et même,
chez certaines souches de rongeurs, provoquer une arthrite. Au contraire, la nicotine peut
avoir des propriétés anti-inflammatoires du fait de son action sur le système nerveux
parasympathique (Czura and Tracey 2005). Ainsi, différents composants de la cigarette
Introduction
- 13 -
peuvent avoir différentes actions, qui dans certains contextes peuvent également avoir des
effets contraires sur la maladie. Le tabagisme a été décrit en tant que facteur de risque
environnemental pour la PR à la fin des années 1980 et depuis confirmé par de
nombreuses études. Cependant, pendant plusieurs années, ces études sur l'association de
la cigarette avec la PR n'avaient pas pour objectif de mieux comprendre les effets du
tabagisme dans différentes sous-classes de la maladie, ni de caractériser une association
avec des gènes particuliers. Ce n'est que très récemment que le tabagisme a été étudié
dans un contexte plus mécanistique. Il a été démontré que le tabagisme était un facteur de
risque principalement chez les patients PR séropositifs pour le facteur rhumatoïde,
marqueur sérologique de la PR, et que d'autre part, le risque conféré par le tabagisme
était supérieur chez les individus portant des allèles des molécules du CMH (HLA-DRβ1)
codant pour l'épitope partagé (Padyukov et al. 2004). Ces données montrent une
interaction gène-environnement entre le tabagisme et les gènes HLA-DRβ1 codant pour
l'épitope partagé et indique que le tabagisme pourrait favoriser des réactions immunes
spécifiques chez certains patients PR en présence de certains gènes. De plus une étude
publiée par le groupe Klareskog a montré que le tabagisme et les gènes HLA-DRβ1
codant pour l'épitope partagé étaient tous deux des facteurs de risques exclusivement pour
les PR positives pour les ACPA (Klareskog et al. 2006). Ces résultats confirmés dans deux
autres études, respectivement aux Pays–Bas (Linn-Rasker et al. 2006) et au Danemark
(Pedersen et al. 2006), n'ont cependant pas été retrouvés dans une étude très récente
réalisée sur 3 cohortes Nord-Américaines (Lee et al. 2007). Une association significative
entre tabagisme et la présence d'ACPA ou entre les allèles codant pour l'épitope partagé
et les ACPA a été retrouvée dans respectivement 2 et 3 des populations Nord-
Américaines. Cependant, aucune interaction gène-environnement (entre tabagisme et
allèle codant pour l'épitope partagé) pour la formation d'ACPA n'a pu être mise en
évidence dans aucune des 3 populations Nord-Américaines (Lee et al. 2007). D'autres
études sont nécessaires pour confirmer cette interaction gène/environnement avec les PR
positives pour les ACPA, et éventuellement mettre en évidence, outre le tabagisme, de
nouveaux facteurs de risque environnementaux.
Introduction
- 14 -
2. Aspects physiopathologiques de la polyarthrite rhumatoïde
Parce que la PR est le plus commun des rhumatismes inflammatoires et une source
majeure de handicap pour les malades sa physiopathologie a été et demeure très étudiée.
Depuis le milieu du 20ième siècle, les notions qui prévalaient sur cette physiopathologie ont
beaucoup évolué. La première idée sur le rôle d'une auto-réactivité immune dans la PR est
venue avec la découverte du facteur rhumatoïde (FR) dans le sérum des patients affectés.
Waaler en 1939, puis Rose en 1948, ont décrit un facteur sérique capable d’agglutiner
des globules rouges de mouton pré-revêtus de sérum de lapin. Le facteur, jusque là
inconnu, a finalement été caractérisé par l'équipe de Kunkel comme étant un anticorps se
fixant à la partie Fc des immunoglobulines G (Franklin et al. 1957). Cette observation a
ainsi amené à considérer la PR comme une maladie auto-immune impliquant des
anticorps auto-réactifs.
Le potentiel pathogénique du FR dans la PR en tant qu'initiateur d’une
maladie causée par un complexe immun a été formulé dans les années 1960, et décrit
dans un modèle proposé en 1973 par Zvaifler (Zvaifler 1973). Dans ce modèle, les
complexes immuns formés par le FR et probablement d'autres auto-anticorps, fixent le
complément et relarguent des facteurs chimiotactiques tels que le C5a. Les cellules
inflammatoires sont par la suite recrutées au sein de l'articulation rhumatoïde où elles sont
activées et participent à la destruction locale. En particulier, l’accent est mis sur un rôle
des neutrophiles qui s'accumulent dans le liquide synovial où ils vont capter les complexes
immuns et sécréter des enzymes protéolytiques.
De nombreuses données se sont accumulées pour renforcer cette hypothèse.
Des études ultra-structurales de cartilage ont révélé la présence de complexes immuns
adsorbés sur les couches superficielles, apportant ainsi une surface solide pour faciliter
l'adhésion et l'activation des neutrophiles. Le synovium lui-même est une source importante
pour la production des protéines du complément et de facteur rhumatoïde. En dépit d'une
production abondante de complément dans la PR, ses concentrations dans le liquide
synovial sont faibles comparé à d'autres arthropathies inflammatoires en raison d'une forte
consommation intra-articulaire (Neumann et al. 2002).
Introduction
- 15 -
Bien que la « théorie » des complexe-immuns puisse expliquer de
nombreuses caractéristiques de la synovite rhumatoïde, dans les années 1980, un intérêt
majeur s'est porté sur les lymphocytes T. L'infiltration massive de ces cellules dans le tissu
synovial rhumatoïde ainsi que la découverte de l'association génétique entre PR et
molécules HLA codant pour l'épitope partagé, ont suggéré que les lymphocytes T jouaient
un rôle clé dans la physiopathologie rhumatoïde. A la fin des années 1980, de nouvelles
techniques permettant de mettre en évidence la présence de cytokines dans synovium et le
liquide synovial ont souligné le rôle important de cytokines telles que l'IL-1β et le TNF-α,
ainsi que des cellules les produisant, les macrophages, dans l'inflammation synoviale.
Enfin, très récemment, la découverte de nouveaux modèles murins
spontanés d'arthrite (souris K/BxN), l'efficacité des traitement anti-CD20 ciblant les
lymphocyte B, ainsi que la découverte d'auto-anticorps anti-protéines citrullinées chez les
patients malades, ont contribué à redonner un intérêt aux lymphocytes B, et aux rôles des
auto-anticorps et des complexes immuns dans la PR.
Dans ce chapitre, j’évoquerai plus en détail le rôle des lymphocytes T, des
macrophages et des lymphocytes B dans la physiopathologie de la PR.
2.1. Rôle des lymphocytes T
2.1.1. Généralités
C'est en 1976 que Stastny a suggéré un rôle important des lymphocytes T dans la
physiopathologie de la PR, à la suite d’expérience mettant en jeu des réactions
allogéniques lymphocytaires mixtes. Il a montré que des lymphocytes provenant de patients
atteints de PR prolifèrent normalement lorsqu'ils sont stimulés par des lymphocytes
d'individus sains, mais présentent des défauts de réponse après stimulation par des cellules
provenant d'autres patients atteints de PR (Stastny 1976). Ces expériences démontraient
des similarités génétiques entre les patients atteints de PR et ont par la suite conduit à la
découverte que certains allèles du gène HLA-DR codant pour les molécules de CMH de
classe II, étaient plus fréquemment présents chez les patients atteints de PR. Comme je l'ai
mentioné auparavant, les allèles HLA-DR de susceptibilité à la PR codent pour une
séquence en acide aminé homologue (QK/RRAA), dit épitope partagé ou épitope de
Introduction
- 16 -
susceptibilité, dans la 3ème région hypervariable de la chaîne β des molécules HLA-DR
(Gregersen et al. 1987). La position de cet épitope partagé au sein des molécules de
CMH II suggère que les molécules HLA-DR portant cet épitope pourraient être capables
de fixer et présenter aux lymphocytes T CD4+ des peptides arthritogéniques spécifiques,
responsables du développement de la PR. Cependant le rôle précis des molécules HLA-DR
dans la PR semble beaucoup plus complexe, et des peptides spécifiques capables de se
lier aux protéines HLA-DR chez les patients atteints de PR n'ont jamais pu être clairement
identifiés. D'autres hypothèses pour expliquer le rôle de l'épitope partagé dans la PR ont
été proposées. Elles sont résumées dans le (Tableau 3).
Présentation de peptides arthritogéniques aux lymphocytes T CD4+ par des molécules de CMH classe
II associées à la PR Surexpression spécifique des allèles codant pour l'épitope partagé favorisant la présentation de
peptides arthritogéniques
Liaison avec d'autres gènes présents dans ou à proximité du locus des molécules de CMH classe II
Modification dans la sélection thymique des lymphocytes T conduisant à l'expansion de populations de cellules T potentiellement arthritogéniques
Réactivité croisée entre un antigène exogène et l'épitope partagé
Différences dans l'expression de surface et dans le trafic intracellulaire d'allèles spécifiques du CMH
Signalisation anormale à travers les allèles CMH
Absence d'allèles CMH protecteurs
Modification de l'affinité de peptides (épitope partagé) pour des protéines chaperonnes, altérant le chargement de peptides antigéniques sur les molécules CMH
Stimulation directe de lymphocytes T par l'épitope partagé présent sur les cellules présentatrices d'antigène Tableau 3 : Mécanismes possibles pour expliquer l'association entre des polymorphismes des molécules de CMH classe II et la PR. D'après (Fox 2006).
Outre l'association génétique de la PR avec certains allèles codant pour les
molécules de CMH classe II, mais également un allèle PTPN22 (gène codant pour une
tyrosine phosphatase impliquée dans la régulation de l'activation des cellules T via le
TCR), de nombreux éléments ont impliqué les lymphocytes T dans la pathogenèse de la
PR. Les lymphocytes T sont par exemple détectés en très grand nombre dans le synovium
Introduction
- 17 -
rhumatoïde enflammé, bien que ce ne soit pas spécifique à la PR mais plutôt
caractéristique de lésions synoviale observées dans des arthrites inflammatoires. Les
arguments évoqués pour expliquer un rôle central des lymphocytes T dans la PR ont été
résumés dans le Tableau 4.
Un nombre important de lymphocytes T et de cellules présentatrices d'antigène sont présents dans le
tissu et le liquide synovial Expression de marqueurs d'activation et de marqueurs de cellules mémoires par les cellules T
synoviales Accumulation dans l'articulation rhumatoïde, de manière non-aléatoire, de sous-populations de
lymphocytes T, probablement de populations de lymphocytes T clonales
Association de la PR avec certains allèles codant pour des molécules de CMH classe II (HLA-DR)
Rôle central de cellules T et de populations clonales de cellules T spécifiques, dans l'induction et la régulation de l'arthrite dans des modèles animaux expérimentaux
Présence dans l'articulation rhumatoïde de cytokines produites par les lymphocytes T, telles que l'IFN-γ et l'IL-17, qui peuvent jouer un rôle important dans l'inflammation et la destruction articulaire
Présence dans le synovium rhumatoïde (à des concentrations fonctionnellement significatives) de cytokines telles que l'IL-15 et l'IL-12, qui favorisent l'activation des cellules T et leur différenciation en cellules TH1 Tableau 4 : Arguments en faveur d'un rôle central des lymphocytes T dans la PR. D'après (Fox 2006).
L'importance de cellules T a surtout été soulignée dans des modèles expérimentaux
murins d'arthrite induits (arthrite induite au collagène et arthrite induite à l'adjuvant). Des
données associées aux cellules T ont également été décrites dans des modèles d'arthrites
spontanés, provoqués par des perturbations dans le TCR ou des modifications dans la
régulation des cytokines. Par exemple, dans le modèle de souris transgéniques K/BxN (voir
détail dans chapitre concernant le rôle des lymphocytes B), l'administration d'anticorps
anti-CD4 avant l'apparition des signes cliniques d'arthrite bloque le développement de la
maladie (Korganow et al. 1999). De plus, chez ces souris K/BxN, le développement de
l'arthrite suite à une stimulation initiale de cellules T, nécessite une interaction entre
cellules T et B, restreinte par une molécule de CMH (Ag7) et dépendante de CD40.
Récemment, Sakaguchi et ses collaborateurs, ont isolé une souche de souris qui
développe une arthrite spontanée suite à l’introduction d’une mutation dans ZAP-70 ("zeta
chain-associated protein" de 70 kDa), une protéine de signalisation associée au complexe
du TCR. Cette mutation altère la fonction de ZAP-70 qui provoque une sélection
Introduction
- 18 -
inappropriée et la survie de cellules T autoréactives dans le thymus. Bien qu'il n'existe pas
de preuve de mutations similaires dans la PR, ce modèle est important car il démontre
qu'une modification génétique ayant des effets sur la maturation et la fonction des
lymphocytes T peut conduire au développement d'une maladie semblable à la PR
(Sakaguchi et al. 2003).
Cependant, des approches thérapeutiques basées sur la modulation des cellules T,
comme par exemple l'utilisation de cyclosporine (inhibiteur de l'activation des cellules T) ou
d'anticorps anti-CD4, ont été décevantes (pour revue cf (Keystone 2003)). Par contre, les
effets bénéfiques observés chez des patients traités par Abatacept, une protéine de fusion
recombinante CTLA4-Ig Fc, comprenant le domaine extracellulaire de CTLA4 et un
fragment du domaine Fc d’une IgG1 humaine, ont renforcé l'idée que la co-stimulation
des cellules T et l'activation des cellules T effectrices puissent jouer un rôle dans la PR
(Genovese et al. 2005). De plus, le rôle des cellules T dans la PR a été remis en valeur
suite à la découverte de l’existence et des propriétés de l'IL-17, cytokine pro-inflammatoire
dérivée des cellules T, impliquée dans l'inflammation et la destruction articulaire.
2.1.2. Les cellules TH17
Les cytokines régulent le phénotype des cellules T effectrices et régulatrices dans le
synovium. Il y a peu de temps encore, la réponse des cellules T CD4 effectrices était
classée en 2 types : TH1 ou TH2, selon les niveaux d'expression relatifs de certaines
cytokines, particulièrement l'IFN-γ et l'IL-4. Bien que ni les cytokines de type TH1, ni celles
de type TH2, ne soient présentes à de fortes concentrations dans l'articulation rhumatoïde,
l'IFN-γ étant plus abondante que l'IL-4, la PR a ainsi été classée comme étant une maladie
de type TH1 et donc orchestrée par une population de cellules T produisant des cytokines
pro-inflammatoires et des chimiokines, telles que l'IFN-γ, la lymphotoxine-β et le TNF
(Schulze-Koops and Kalden 2001). Récemment, le rôle des cellules T dans la PR a été
remis en question grâce à la découverte d'une nouvelle sous-population de lymphocytes T
helper, les cellules TH17, caractérisées par la production d'une cytokine pro-inflammatoire
l'IL-17.
La première démonstration du rôle pro-inflammatoire de l'IL-17 a été faite il y a
environ 10 ans, lorsque Fossiez et ses collaborateurs ont cloné l'IL-17 humaine à partir de
Introduction
- 19 -
cellules T mémoires activées et montré que l'addition d'IL-17 dans des cultures primaires
de synoviocytes fibroblastiques issus de patients atteints de PR, induisait l'expression d'IL-6,
d'IL-8, de prostaglandine E2 et de G-CSF (Fossiez et al. 1996). En outre, l'IL-17 agit en
synergie avec le TNF-α pour induire de fortes concentrations d'IL-6 et de GM-CSF.
Depuis, les effets de l'IL-17 ont été largement étudiés et de nombreux types cellulaires
cibles, ainsi que de nombreux médiateurs inflammatoires en aval ont été caractérisés. Les
activités de ces médiateurs contribuent à la physiopathologie de la PR à travers le
recrutement et l'activation de cellules inflammatoires, un feedback positif sur la réponse IL-
17 et la destruction tissulaire et osseuse (cf Tableau 5).
Tableau 5 : Molécules effectrices induites par l'IL-17. D'après (Lundy et al. 2007).
Bien que le TNF-α et l'IL-1β induits par l'IL-17, participent à la destruction
cartilagineuse et à l'érosion osseuse, l'IL-17 peut avoir de façon indépendante, des effets
Molécules de l'inflammation protéine C réactive (CRP) activation d'hépatocytes par macrophages synoviaux et fibroblastes
Tableau 6 : Etat d'activation des macrophages synoviaux et/ou des monocytes circulant dans la PR. D'après (Kinne et al. 2006).
Les macrophages n'occupent probablement pas une place indispensable dans la
phase d'initiation de la maladie, mais possèdent diverses capacités pro-inflammatoires, de
destruction et de remodelage tissulaire, et contribuent ainsi de façon non négligeable à
l'inflammation et à la destruction articulaire dans les PR (cf Tableau 7).
Fonctions Mécanismes Rôles (potentiels) dans la PR
Elimination de complexes immuns
fixation des Ig sur les recepteurs FCγR
élimination de CI, activation des monocytes/macrophages, production d'IL-1, TNF-α
activation du complément liaison des fractions du complément sur CR1 (CD35), CR3 (CD11b) et C5aR (CD88)
opsonisation des CI par le complément --> fixation sur récepteurs au complément des Mφ --> activation cellulaire, production d'IL-1, TNF-α
phagocytose de particules antigéniques
via les FcγR --> dégradation lysosomale et apprêtement antigénique sur CMH I et II
élimination de débris cellulaires et incorporation potentielle de molécules arthritogéniques; présentation Ag et activation de LT CD4+ et CD8+ --> initiation ou entretien de la maladie ?
chimiotactisme et angiogenèse
attraction de cellules inflammatoires; induction de néovascularisation
rétrocontrôle positif entre cytokines et facteurs chimiotactiques dérivés de Mφ (IL-8, MCP-1); stimulation de l'angiogenèse par l'IL-8 et des formes solubles de molécules d'adhésion
cicatrisation remodelage tissulaire via l'interaction avec les fibroblastes
recrutement de monocytes au site inflammatoire via un chimioattractant monocytaire : MIP-1α; phagocytose de débris de la MEC, production d'IL-1, TNF-α...
Tableau 7 : Fonctions des monocytes/macrophages et leur rôle dans la PR. D'après (Kinne et al. 2006).
Introduction
- 24 -
Les précurseurs de la lignée myélomonocytaire se différencient en plusieurs types
cellulaires (monocytes / macrophages, ostéoclastes ou cellules dendritiques) impliqués de
façon majeure dans la PR. En raison de la plasticité de ces précurseurs, les différentes
voies de différenciation peuvent être influencées par un déséquilibre dans la concentration
des cytokines ou des facteurs de croissance, et conduire à des modifications dans la
différenciation ou la maturation de ces cellules. Dans la PR, de tels déséquilibres existent
au sein de l'articulation enflammée, le sang périphérique et la moelle osseuse.
Dans la membrane synoviale rhumatoïde, les monocytes infiltrants se différencient
en macrophages matures et colonisent la bordure synoviale et le synovium plus profond
(Kinne et al. 2006). Localement, les macrophages synoviaux se différencient en sous-
populations stimulatrices ou inhibitrices, qui vont influencer de manière différente la
réactivité des cellules T dans l'arthrite. Dans la PR, les sous-populations de macrophages
pourraient être à la fois responsables de la synthèse de cytokines inflammatoires (comme
l'IL-1 ou le TNF-α) ou de la synthèse de cytokines régulatrices (IL-10 ou TGF-β1). Le
déséquilibre entre cytokines pro-inflammatoires et régulatrices est critique pour l'entretien
de la maladie, ainsi que pour l'induction de l'angiogenèse (Kinne et al. 2006).
Dans la moelle osseuse adjacente à l'articulation touchée, les précurseurs
myéloïdes sont plus abondant chez les patients atteints de PR que chez les patients
arthrosiques, et ceci en corrélation avec la quantité d'IL-1β (mais pas de GM-CSF ou d'IL-
6) présente dans le tissu synovial proximal (Kotake et al. 1992).
2.2.1. Activation des macrophages dans la PR
Au niveau de la membrane synoviale, les macrophages apparaissent clairement
activés, comme l'expression de plusieurs marqueurs le démontre (cf Tableau 6). Le degré
d'infiltration et d'activation des macrophages corrèle non seulement avec la douleur
articulaire et les indices d'inflammation, mais aussi avec la progression radiologique des
dommages articulaires (Mulherin et al. 1996). Une corrélation est également observée
entre la densité de macrophages synoviaux dans le sous-intima et l'amélioration clinique
qui fait suite aux traitements ce qui suggère que le nombre de macrophages synoviaux
pourrait être utilisé en tant que "biomarqueur" de l'amélioration clinique (Haringman et al.
2005).
Introduction
- 25 -
Les cellules dendritiques d'origine myéloïde sont aussi plus abondantes dans le
compartiment synovial en cas de PR. Leur capacité à présenter les antigènes ainsi que leur
localisation dans les aggrégats lymphoïdes périvasculaires constituent les conditions
préalables optimales pour la présentation d'un antigène arthritogénique potentiel aux
cellules T, et pour la régulation des cellules B (Kinne et al. 2006). D'autre part, les cellules
dendritiques peuvent se trans-différencier en ostéoclastes dans certaines conditions
cytokiniques permissives (présence de M-CSF et RANKL) (Rivollier et al. 2004), et ainsi
contribuer à la destruction osseuse.
Au site de la destruction tissulaire, les macrophages expriment des quantités
significatives de médiateurs inflammatoires comme l'IL-1, le TNF-α et le GM-CSF, et
contribuent à la production de métalloprotéinases de la matrice (MMP). Un rôle particulier
dans les dommages du cartilage semble être joué par MMP-9 (Ahrens et al. 1996) et par
MMP-12 qui est spécifique des macrophages (Wang et al. 2004). La capacité des
macrophages à détruire la matrice cartilagineuse semble toutefois réduite. Ils sont plus
considérés comme des "amplificateurs" (particulièrement via l'activation de fibroblastes)
que comme des effecteurs initiaux de la destruction tissulaire.
La contribution des cellules de type macrophagique semble assez différente à la
jonction os/pannus, où des ostéoclastes dérivés de la lignée myélomonocytaire
contribuent de façon importante à la destruction osseuse. Au niveau de ce site,
l'importance du système ostéoprotégérine/ RANKL/ RANK, est clairement reconnue; ainsi
toute forme d'interférence dans ce système pourrait devenir un traitement efficace de la PR
ou au contraire favoriser la destruction osseuse. D'autre part, l'inhibition de la fonction
ostéoclastique par un amino-biphosphonate a été décrite comme cible efficace pour
empêcher la perte osseuse dans un modèle expérimental d'arthrite et pourrait représenter
un moyen pour préserver l'articulation et la structure osseuse chez l'homme (Goldring and
Gravallese 2004).
2.2.2. Stimulation/ régulation de l'activation des macrophages dans la PR
Plusieurs mécanismes semblent réguler la fonction effectrice des macrophages,
comme la production de cytokines. Ils incluent à la fois des facteurs solubles, mais aussi
les contacts que les macrophages vont établir avec différentes cellules inflammatoires ou
Introduction
- 26 -
mésenchymateuses : les lymphocytes T, les fibroblastes, ou encore les cellules
endothéliales.
2.2.2.1. Interactions cellulaires
En réponse à une interaction avec des cellules T, les monocytes vont produire des
MMP, de l'IL-1α ou de l'IL-1β (Brennan and Foey 2002; Burger and Dayer 2002). In vitro,
des cellules T pré-activées via leur complexe TCR/CD3, stimulent la production à la fois
de TNF-α et d'IL-10 par les monocytes. Des cellules T activées en absence de stimulation
de leur TCR (indépendamment d'un antigène), régulent aussi la production de cytokines
des monocytes. L'activation de cellules T par des cytokines, IL-15 ou IL-2 seules ou en
combinaison avec du TNF-α et de l'IL-6, stimulent la sécrétion par les monocytes de TNF-
α seulement, et pas d'IL-10 (Sebbag et al. 1997). Ainsi, ce type d'interaction entre
macrophages et cellules T stimulées par des cytokines abondantes dans le synovium au
cours de l'inflammation chronique, pourrait contribuer à la production excessive de TNF-α
et rendre compte du relatif déficit en IL-10 observé dans l'articulation rhumatoïde.
En raison du nombre important de macrophages et de fibroblastes, ainsi que de
leur niveau d'activation dans le tissu synovial rhumatoïde, l'interaction entre ces cellules est
cruciale pour l'inflammation et les dommages tissulaires qui en résultent, puisqu'elle induit
la production d'IL-6, de GM-CSF et d'IL-8 (Chomarat et al. 1995). En outre, des
fibroblastes synoviaux humains purifiés et cultivés avec des cellules myélomonocytaires,
induisent la dégradation de cartilage in vitro avec la contribution essentielle d'IL-1 et de
TNF-α solubles (Scott et al. 1997).
L'interaction entre monocytes et cellules endothéliales dans la PR est essentielle
pour l'afflux de monocytes activés dans la membrane synoviale et dépend de l'expression
modifiée des intégrines et sélectines à la surface de ces cellules. Puisque l'environnement
cytokinique synovial (particulièrement le TNF-α produit par les macrophages) régule
positivement l'expression de ces molécules, il en résulte un cycle d'auto-entretien dans
lequel les macrophages eux-mêmes favorisent l'afflux et l'activation de monocytes
circulants (Kinne et al. 2006).
Introduction
- 27 -
2.2.2.2. Facteurs solubles
Outre les contacts cellulaires, de nombreuses cytokines vont moduler de manière
positive ou négative l'activité des macrophages.
2.2.2.2.1. Cytokines pro-inflammatoires
Le MIF ("macrophage migration inhibitory factor") est une des premières cytokines à
avoir été découverte. Le MIF est sécrété de manière précoce et abondante par les
macrophages, et stimule de manière autocrine de nombreuses fonctions macrophagiques
comme la sécrétion de TNF-α, la phagocytose ou encore la production d'espèces
réactives oxygénées (ROS). De plus, il confère aux macrophages et aux fibroblastes
synoviaux une résistance à l'apoptose, prolongeant ainsi la survie de cellules activées
jouant un rôle important dans la pathologie de la PR. En outre, dans la PR, MIF est
surexprimé dans le sérum et le liquide synovial en corrélation avec l'activité de la maladie
(Morand and Leech 2005).
L'IL-18, membre de la famille de l'IL-1, est exprimée dans la membrane synoviale
rhumatoïde majoritairement par des macrophages CD68+ contenus dans des agrégats
lymphoïdes. Les macrophages CD14+ du liquide synovial expriment également le
récepteur à l'IL-18 (Gracie 2004). L'IL-18, seule ou combinée avec l'IL-12 et l'IL-15,
augmente fortement la production d'IFN-γ, de TNF-α, de GM-CSF et de NO par des
cellules synoviales en culture. Cette cytokine peut également stimuler la formation
d'ostéoclastes à travers la régulation positive de production de RANKL par les cellules T au
cours de la synovite rhumatoïde (Dai et al. 2004). Enfin, l'IL-18 joue également un rôle
dans la stimulation des réponses immunes de type TH1 et TH2 (pour revue cf (Nakanishi et
al. 2001)).
L'IL-15, membre de la famille de l'IL-2, est synthétisée par les cellules de la couche
bordante (incluant les macrophages), et sa concentration est augmentée dans le liquide
synovial des patients atteints de PR (McInnes and Gracie 2004). Les cellules T circulantes
ou de la membrane synoviale, stimulées par de l'IL-15 induisent les macrophages à
produire de l'IL-1β, du TNF-α ou de l'IL-8 (Sebbag et al. 1997; McInnes and Gracie
2004), mais pas de cytokine régulatrice comme l'IL-10. L’IL-15 étant également produite
Introduction
- 28 -
par les macrophages eux-mêmes, elle pourrait (re)stimuler les cellules T et auto-entretenir
une boucle pro-inflammatoire (McInnes and Gracie 2004).
L'IL-17, a été évoquée précédemment à propos de l’activation des lymphocytes T
synoviaux. C’est une lymphokine produite dans ~90% des cultures d'explants synoviaux
rhumatoïdes (contre seulement 16% d'explants arthrosiques), qui stimule fortement la
production de TNF-α et d'IL-1 par les macrophages (Jovanovic et al. 1998). En outre, l'IL-
17 induit indirectement la formation d'ostéoclastes à partir de cellules progénitrices
(Kotake et al. 1999) et augmente la production de NO dans les chondrocytes articulaires
(Shalom-Barak et al. 1998), contribuant ainsi à la destruction cartilagineuse et osseuse. En
raison de ses effets pléiotropes sur la production de médiateurs inflammatoires et sur la
dégradation du cartilage et de l'os, l'IL-17 représente donc une autre cible thérapeutique
dans l'arthrite (Lubberts et al. 2004), en combinaison avec des anti-TNF-α ou anti-IL-1.
2.2.2.2.2. Cytokines régulatrices
L'IL-4, cytokine anti-inflammatoire de type TH2, est connue pour avoir un rôle
protecteur dans l'arthrite, bien que sa concentration soit très faible au sein de l'articulation
rhumatoïde. L'IL-4 peut moduler négativement la cytotoxicité des macrophages et la
production de cytokines comme le TNF-α ou de son récepteur (Kinne et al. 2006).
Notamment, l'IL-4 diminue la production d'IL-1β tandis qu'elle augment celle de l'IL-1Ra,
assurant ainsi une fonction anti-inflammatoire "coordonnée" (Allen et al. 1993). Enfin, l'IL-
4 réduit la résorption osseuse et la prolifération de synoviocytes in vitro (Kinne et al.
2006).
L'IL-10, est une cytokine de type TH2, synthétisée par les macrophages, qui présente
des fonctions autocrines. Elle réduit l'expression des molécules HLA-DR et la présentation
antigéniques dans les monocytes, et inhibe la production de cytokines pro-inflammatoires,
de GM-CSF et des récepteurs Fcγ par les macrophages synoviaux (Isomaki et al. 1996).
En dépit d'une augmentation de l'IL-10 dans le sérum et le compartiment synovial chez les
patients atteints de PR (Isomaki et al. 1996)), plusieurs études ont suggéré qu'il existait un
défaut en IL-10 (Kinne et al. 2006).
L'IL-13, tout comme l'IL-4 et L'IL-10, L'IL-13 a des effets immuno-suppresseurs dans
des modèles expérimentaux d'arthrite, comme dans l'arthrite induite à l'adjuvant chez le rat
Introduction
- 29 -
(Woods et al. 2002). En outre, l'incubation d'explants de tissu synovial rhumatoïde ou de
cellules mononucléées du liquide synovial avec de l'IL-13, diminue la production d'IL-1 et
de TNF-α (Woods et al. 2000).
2.2.3. Molécules effectrices des macrophages dans la PR
2.2.3.1. Cytokines pro-inflammatoires
Le TNF-α est une cytokine aux effets pléiotropes, qui augmente l'expression de
cytokines, de molécules d'adhésion, de PGE2, de collagénase et de collagène par les
synoviocytes. Dans la PR, cette cytokine est majoritairement produite par les macrophages
dans la membrane synoviale et à la jonction cartilage-pannus. Le rôle critique du TNF-α -
est supporté par plusieurs observations expérimentales :
- le TNF-α, combiné avec l'IL-1, induit une synovite (van den Berg et al. 1999)
- une expression dérégulée, transgénique de TNF-α provoque le développement
d'une arthrite chronique (Kollias 2004)
- la neutralisation du TNF-α supprime des arthrites expérimentales.
Le TNF-α existe sous 2 formes : soluble et membranaire, toutes deux agissant en
tant que médiateurs pro-inflammatoires. La forme trans-membranaire va agir localement,
par contact cellulaire en stimulant principalement le récepteur p75 (TNF-R2 : récepteur de
faible affinité). Au contraire, la forme soluble, libérée par clivage de la forme trans-
membranaire par des MMP, stimule principalement le récepteur p55 (TNF-R1, récepteur
de haute affinité), et agit à distance de façon plus transitoire (Kinne et al. 2006). En
accord avec le rôle central du TNF-a dans l'arthrite, l'administration d'anticorps
monoclonaux chimériques ou humanisés anti-TNF-a, est d'une efficacité clinique
remarquable (Feldmann and Maini 2001).
L'IL-1, est exprimée majoritairement par les macrophages CD14+ (Wood et al.
1992). Son taux dans le liquide synovial corrèle avec l'inflammation articulaire (Arend et
al. 1998). Cette cytokine est un médiateur majeur de la destruction articulaire du fait de
ses effets sur la synthèse et la dégradation des protéolycannes. L'IL-1 induit la production
des MMP-1 et -3 et favorise la résorption osseuse (Arend et al. 1998). Dans la PR, il y a
Introduction
- 30 -
un déséquilibre entre l'IL-1 et son inhibiteur physiologique l’IL1-ra (cf ci-dessous) en faveur
de l'IL-1 (Arend et al. 1998).
Les chimiokines, correspondant à une superfamille subdivisée en quatre sous-
familles (CXC, CC, C et CX3C), sont de petites protéines spécialisées dans le recrutement
de populations leucocytaires à travers un grand nombre de récepteurs trans-
membranaires. Les chimiokines favorisent non seulement l'afflux de monocytes dans le
tissu enflammé, mais jouent aussi un rôle clé dans l'activation et la fonction des
monocytes/macrophages (Mantovani et al. 2004). Dans la PR, les macrophages
synthétisent plusieurs chimiokines, CCL3, CCL5 (RANTES) ou CX3CL1 (fractalkine), et
expriment en même temps les récepteurs à ces chimiokines indiquant l'existence de
boucles autocrines (Haringman et al. 2003). En outre, les chimiokines sont régulées
positivement par le TNF-α et l'IL-1 produites également par les macrophages. Enfin,
certaines chimiokines exprimées par les macrophages (IL-8, fractalkine) sont de puissants
stimulateurs de l'angiogenèse, et constituent donc le lien entre l'activation macrophagique
et la néo-vascularisation importante du synovium rhumatoïde (Koch 2003).
Quinze années avant la découverte des AKA, Nienhuis et Mandema ont décrit des
anticorps présents dans le sérum de patients atteints de PR, marquant, en
immunofluorescence indirecte, des granules de kératohyaline périnucléaires, au sein des
cellules épithéliales de la muqueuse jugale humaine. Ces anticorps ont alors été appelés
facteur anti-périnucléaire, par analogie avec le facteur rhumatoïde (Nienhuis and
Mandema 1964). En 1995, l'antigène cible des APF a été identifié au laboratoire. Cet
antigène, reconnu par 4 anticorps monoclonaux spécifiques de différents épitopes de la
filaggrine, correspondait à une protéine de 200 à 400 kDa, apparenté à la (pro)filaggrine
épidermique humaine (Sebbag et al. 1995).
En outre, des expériences complémentaires ont révélé que les AKA, purifiés à partir
de sérum rhumatoïde, étaient aussi capables d'immunodétecter cette protéine de 200 à
400 kDa et de marquer les granules périnucléaires de cellules épithéliales buccales
humaines. Ainsi, les AKA et les APF, initialement considérés comme deux familles
différentes d'auto-anticorps, constituent en réalité deux sous-ensembles largement
recouvrants d'une seule et même famille : celle des auto-anticorps anti-filaggrine (AFA,
"antifilaggrin autoantibodies") (Sebbag et al. 1995).
Introduction
- 50 -
3.1.3. Caractérisation de la cible articulaire des AFA
3.1.3.1. Caractérisation des épitopes des AFA
Les cibles antigéniques des AKA et des APF, identifiées dans différents tissus
épithéliaux, correspondent à des formes moléculaires de (pro)filaggrine, mais, à la
différence de la filaggrine basique épidermique, elles possèdent un pI acide/neutre. De
plus, de la filaggrine humaine recombinante produite chez E. Coli n'était pas reconnue par
un pool de sérum PR présentant de hauts titres en AFA (Girbal-Neuhauser et al. 1999).
Ces résultats ont donc suggéré que les épitopes-cibles des AFA étaient générés suite à une
modification post-traductionnelle de la (pro)filaggrine. La modification biochimique
capable d'influencer la charge de pro(filaggrine) a été identifiée à la transformation de
résidus arginyl, basiques, en résidus citrullyl, neutres. Cette modification ainsi que les
enzymes qui la catalysent, les PAD, sera beaucoup plus détaillée dans le chapitre 4. Deux
études ont permis une avancée énorme concernant la nature des épitopes reconnus par
les AFA.
En 1998, l’équipe de W. van Venrooij a montré que les résidus citrullyls étaient un
constituant indispensable des épitopes reconnus par les auto-anticorps présents dans les
sérums de patients atteints de PR. En effet, ils ont synthétisé des peptides dérivés de la
séquence de filaggrine, parmi lesquels certains ont eu un ou deux résidus arginyl substitué
par un résidu citrullyl. A l'inverse des peptides non substitués, les peptides porteurs de
résidus citrullyl ont été reconnus par des sérums rhumatoïdes. En outre, les anticorps
purifiés sur une colonne greffée avec un des peptides citrullinés (cfc1, 306-324), se sont
révélés immunoréactifs en immunotransfert avec de la filaggrine extraite d'épiderme
humain. De plus, en immunofluorescence indirecte, ces anticorps ont présenté les
marquages caractéristiques réalisés par les AKA ou l’APF respectivement sur cryocoupes
d'œsophage de rat et sur frottis de cellules jugales humaines (Schellekens et al. 1998).
En 1999, au sein du laboratoire, il a été montré que les différents variants
acide/neutres de la filaggrine épidermique humaine cibles des AFA étaient reconnus par
un anticorps anti-citrulline et donc citrullinés. La désimination (citrullination) in vitro d'une
filaggrine humaine recombinante par une PAD génère les épitopes des AFA sur la
protéine. De plus, parmi 3 peptides synthétiques dérivés de la séquence de la filggrine
Introduction
- 51 -
avec une citrulline en position centrale, 2 ont été largement et spécifiquement reconnus
par des AFA purifiés à partir des sérums d'une série de patients atteints de PR. Ces résultats
indiquaient donc que les résidus citrullyls étaient des constituants essentiels des épitopes
des AFA, dans le contexte de séquences en acides aminés spécifiques présentes sur la
filaggrine (Girbal-Neuhauser et al. 1999).
3.1.3.2. Synthèse des AFA dans le tissu synovial rhumatoïde
En 2000, au sein de notre laboratoire, il a été mis en évidence que les AFA étaient
produits au sein des articulations synoviales rhumatoïdes. La comparaison des taux d'AFA
dans des échantillons appariés de liquide synovial et de sérum de 31 patients atteints de
PR n'a pas permis de mettre en évidence de différences significatives, indiquant que les
AFA n'étaient pas particulièrement concentrés dans le liquide synovial. Au contraire, les
AFA se sont avérés enrichis au sein des membranes synoviales, la concentration des AFA
dans des extraits de tissu synovial représentant une proportion des IgG totales en moyenne
7,5 fois supérieure à celle du sérum correspondant. En outre, lors de cultures d'explants de
tissu synovial de patients atteints de PR, une synthèse de novo d'AFA, dosés à partir du
surnageant de culture, a pu être mise en évidence sur une période de 5 semaines.
Ainsi, les plasmocytes responsables de la sécrétion sont présents dans le tissu
synovial rhumatoïde et les AFA représentent une proportion significative des IgG sécrétées
au sein du pannus rhumatoïde (Masson-Bessiere et al. 2000).
3.1.3.3. Identification de la cible des AFA dans le tissu synovial rhumatoïde
Les résultats précédents suggéraient l'existence d'une cible de ces auto-anticorps au
sein même des articulations rhumatoïdes. Cependant, il n'existe pas dans la PR d'atteinte
epithéliale particulière et la (pro)filaggrine n'est pas présente au sein du tissu articulaire
(Masson-Bessiere et al. 2001). Il a donc été émis l'hypothèse qu'in vivo, les AFA ne soient
pas dirigés contre la (pro)filaggrine citrullinée, mais plutôt contre une autre protéine
citrullinée, présente dans le tissu synovial rhumatoïde et reconnue de manière croisée
puisque porteuse des mêmes épitopes. L'analyse histologique de membranes synoviales
rhumatoïdes à l'aide d'un anticorps anti-citrulline a montré un marquage de dépôts
amorphes interstitiels et de cellules mononucléées de différents types. Des analyses
Introduction
- 52 -
immunochimiques d'extraits séquentiels de ces mêmes tissus ont montré qu'ils contenaient
plusieurs protéines citrullinées parmi lesquelles deux protéines, p64-78 et p55-61, étaient
spécifiquement reconnues par les AFA. Un séquençage amino-terminal a permis de les
identifier : elles correspondent à des formes citrullinées des chaînes α et β de la fibrine.
L'identité de ces protéines a été confirmée grâce à l'utilisation de plusieurs anticorps
spécifiques des chaînes Aα et/ou Bβ de la fibrine (ou du fibrinogène). De plus, les AFA
purifiés se sont montrés réactifs vis-à-vis des chaines Aα et Bβ du fibrinogène humain,
seulement après sa citrullination in vitro. Enfin, des auto-anticorps purifiés à partir d'un
pool de sérum de patients atteints de PR sur du fibrinogène citrulliné ont été réactifs vis-à-
vis de toutes les cibles épithéliales et synoviales des AFA. Les AFA et les auto-anticorps
dirigés contre les chaînes Aα et / ou Bβ du fibrinogène désiminé constituent donc des
populations d'auto-anticorps très largement recouvrantes et l’'ensemble de ces résultats a
permis d'affirmer que la cible majeure des AFA au sein des membranes synoviales
rhumatoïdes était la fibrine citrullinée (Masson-Bessiere et al. 2001).
Enfin, en 1994, un nouveau système antigène/anticorps, Sa/ anti-Sa, spécifique de
la PR a été décrit (Despres et al. 1994). Les anticorps, reconnaissaient un antigène
abondement présent dans le placenta humain. En 2000, l’hypothèse que l'antigène Sa soit
une forme citrullinée de vimentine, une protéine des filaments intermédiaires, a été émise,
(Menard et al. 2000). La preuve expérimentale que l'antigène Sa, cible des anticorps anti-
Sa, était identique à de la vimentine citrullinée a été apportée récemment (Vossenaar et al.
2004).
Ainsi, les AFA, les anti-Sa (anti-vimentine citrullinée) et les auto-anticorps anti-
fibrine citrullinée, constituent une seule et même famille d'auto-anticorps anti-protéines
citrullinées, spécifiques de la PR : la famille des ACPA.
3.1.3.4. La Fibrine
Le fibrinogène est une glycoprotéine plasmatique dimérique de 340 kDa, formée
de deux sous-unités reliées par des ponts disulfures. Chaque sous-unité est constituée de 3
chaînes polypeptidiques Aα, Bβ, et γ associées entre elles par des ponts disulfures. Au
cours de la coagulation, la thrombine (facteur IIa) permet la transformation du fibrinogène
Introduction
- 53 -
soluble en fibrine insoluble en clivant les 2 fibrinopeptides A et B à l’extrémité amino-
terminale des chaînes respectivement Aα et Bβ. Ce clivage, en modifiant la charge des
extrémités, va favoriser des interactions inoniques avec des sites de charge opposée, sur
un autre monomère de fibrine. L'ensemble des diverses molécules de fibrine alignées bout
à bout et reliées par ces liaisons non covalentes est ensuite stabilisé par le facteur XIII, qui
après son activation par la thrombine crée des liens covalents ε(γ-glutamyl)-lysine, rendant
le caillot de fibrine insoluble, très solide et stable (cf Figure 6).
Figure 6 : Structure schématique du fibrinogène et fibrinoformation. Extrait de (Boneu and Cazenave 1997).
La dégradation du caillot de fibrine est assurée par le processus de fibrinolyse sous
l'effet de la plasmine. Celle-ci résulte de l'activation du plasminogène inactif par le t-PA
Introduction
- 54 -
("tissue-plasminogen activator") ou l'u-PA ("urokinase-type plasminogen activator")
préférentiellement à la surface de la fibrine, qui offre des sites de liaison pour le
plasminogène et ses activateurs. L'action de la plasmine sur la fibrine aboutit à la
formation et à la libération de produits de dégradation de la fibrine (PDF) solubles, dont
les principaux sont appelés les D-Dimères. Dans le plasma, sont également présents des
inhibiteurs de la plasmine et des inhibiteurs des activateurs du plasminogène (PAI,
"plasminogen activator inhibitor"), qui limitent une activation non spécifique de la plasmine
à distance du caillot à éliminer (cf Figure 7).
Figure 7 : Schéma de la fibrinolyse (d'après un schéma original de Cyril Clavel)
Le t-PA, principal activateur du plasminogène, est une sérine protéase circulant
dans le plasma sanguin sous forme liée à son inhibiteur, le PAI-1. Le t-PA présente une
très forte affinité pour la fibrine mais pas pour le fibrinogène et, en l'absence de fibrine,
son affinité pour le plasminogène est négligeable. Dès que la fibrine se forme, le t-PA, le
plasminogène et la fibrine s'associent en complexe, ce qui augmente l'activité de catalyse
du t-PA.
Introduction
- 55 -
L'u-PA (ou urokinase) est une sérine protéase dont le rôle dans l'élimination de la
fibrine apparaît plus secondaire. L'u-PA se lie de façon spécifique à son récepteur
cellulaire ("u-PA receptor") et n'a par contre pas d'affinité pour la fibrine (Bachmann 1994).
3.2. Intérêt clinique des auto-anticorps anti-protéines citrullinées
3.2.1. Valeur diagnostique
En raison de la diversité des substrats initialement décrits et des découvertes plus
récentes concernant la nature des épitopes reconnus, de nombreux tests pour détecter les
ACPA ont été développés et existent encore.
Les tests initiaux de détection de ces auto-anticorps correspondaient au marquage
des APF et des AKA, réalisés en immunofluorescence indirecte, respectivement sur frottis
de cellules jugales humaines et sur cryocoupes d'œsophage de rat. Une méta-analyse de
la littérature de l’époque révèle que la détection des AKA permettait d'obtenir une
sensibilité diagnostique de 46% pour une spécificité de 97% et celle des APF, une
sensibilité diagnostique de 72 % pour une spécificité diagnostique de 92 %. Bien que les
APF soient des marqueurs sensibles de la PR, ils restaient cependant moins spécifiques que
les AKA (Vincent et al. 1999).
Progressivement, de nouveaux tests ont été développés, grâce à la caractérisation
des cibles épithéliales et synoviales des ACPA. Les premiers tests étaient basés sur la
détection, en immunotransfert, de (pro)filaggrine extraite d'épithélium d'œsophage de rat
(Gomes-Daudrix et al. 1994) ou d'épiderme humain (Vincent et al. 1998). Bien que
l'immunotransfert utilisant les antigènes de rat ait eu une meilleure performance
diagnostique que les méthodes classiques, son interprétation délicate en a limité l'usage.
Le second test, en revanche, a été plus largement utilisé et, en combinaison avec le test de
détection des AKA a permis d'obtenir une sensibilité diagnostique de 60 % pour une
spécificité haute de 99 % (Vincent et al. 1999).
La découverte du rôle clé joué par la citrullination dans la genèse des épitopes
reconnus par les AFA a conduit au développement de nouveaux tests diagnostiques qui
sont des ELISAs ("Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay") utilisant de la filaggrine
recombinante citrullinée humaine (Nogueira et al. 2001; Suzuki et al. 2003) ou murine
Introduction
- 56 -
(Vincent et al. 2002). Les performances diagnostiques de l'ELISA avec de la filaggrine
humaine recombinante désiminée in vitro sont comparables à celle des AKA. Par contre
l'ELISA utilisant de la filaggrine recombinante de rat citrullinée in vitro (ArFA-ELISA), a
montré des performances diagnostiques plus élevées, avec une sensibilité de 65 % pour
une spécificité de 99 % (Vincent et al. 2002).
D'autres tests ELISA, basés sur la reconnaissance de peptides citrullinés synthétisés à
partir de séquences de filaggrine humaine ont été développés en parallèle. Un tel ELISA a
permis de détecter les auto-anticorps dans 76 % des sérums de patients atteints de PR
avec une spécificité de 96 % (Schellekens et al. 1998). L'un de ces peptides, cfc1, a par la
suite été utilisé pour le développement d'un test ELISA après que deux de ses résidus séryl
aient été substitués par des résidus cysteyl, permettant la cyclisation du peptide ("cyclic
citrullinated peptide" : CCP) (Schellekens et al. 2000). La sensibilité de ce CCP1-ELISA
(pour test CCP de première génération) était pultôt modérée : entre 50 et 70 % pour une
spécificité de 98 % (van Venrooij et al. 2004). Des tests de seconde (CCP2-ELISA) et
même de troisième génération (CCP3-ELISA), présentant de meilleures performances
diagnostiques sont à présent disponibles (Nijenhuis et al. 2004). Le mélange de peptides
synthétiques cycliques utilisé n'est pas connu. La sensibilité diagnostique calculée du test
CCP2 était de 77 % pour une spécificité de 97 %. Ces tests, aujourd'hui largement
commercialisés, sont les plus utilisés dans les études cliniques mais aussi en usage
diagnostique.
Suite à la démonstration que les cibles synoviales des AFA (ACPA) correspondaient
à des formes citrullinées des chaînes α et β de la fibrine, un nouveau test ELISA, utilisant
du fibrinogène humain citrulliné in vitro, et détectant donc les anticorps anti-fibrinogène
humain citrulliné (AhFibA, "anti-human fibrinogen antibodies") a été développé au sein de
notre laboratoire. Cet ELISA permet de détecter 76 % des patients atteints de PR avec une
spécificité diagnostique de 98.6 % (Vincent et al. 2005).
D'autres tests basés sur la reconnaissance d'autres protéines citrullinées ont été
décrits. Par exemple, les anticorps anti-Sa, détectés après immunotransfert d'extraits de
placenta ou de rate humains, étaient décelables chez environ 40 % des patients atteints de
PR avec une spécificité de 99 % (Despres et al. 1994). Ces données ont été confirmées
par plusieurs études indépendantes et, en moyenne, les anti-Sa pouvaient être détectés
Introduction
- 57 -
dans 37 % des cas de PR avec une spécificité de 97 % (pour revue cf (Nijenhuis et al.
2004). Récemment, un test ELISA utilisant de la vimentine citrullinée modifiée a été mis au
point, avec toutefois des performances dignostiques inférieures au test ELISA CCP2
(Dejaco et al. 2006).
Enfin, une équipe italienne a très récemment mis au point un test ELISA basé sur la
reconnaissance d'un peptide synthétique citrulliné correspondant à la séquence en position
35-38 de la protéine EBNA-1 du virus d’Epstein-Barr,. Les anticorps spécifiques de ce
peptide ont été détectés dans 50 % des sérums de patients atteints de PR et dans moins de
5 % des sérums contrôles (sains ou d'autres maladies rhumatologiques) (Pratesi et al.
2006).
Ainsi, pour des spécificités diagnostiques égales, toutes les méthodes de détection
des ACPA ne présentent pas des sensibilités équivalentes, les plus élevées ayant été
obtenues pour les test ELISA, et plus particulièrement celui développé au laboratoire, le
test AhFibA (cf Tableau 9 et Figure 8) (Vincent et al. 2005).
Test Sensibilités
AhFibA 76,2 %
ArFA 69,6 %
CCP 56,9 %
AKA 42,5 %
FR 16,0 %
Tableau 9 : Sensibilités diagnostiques de différents tests de détection des auto-anticorps anti-protéines citrullinées et du facteur rhumatoïde calculées, pour une même spécificité diagnostique de 98,6 %, sur une cohorte de 617 patients atteints de PR et d’autres maladies rhumatologiques établies. Les tests sont classés par sensibilités décroissantes
Introduction
- 58 -
Figure 8 : Courbes ROC (Receiver Operating Characteristics) de 4 tests de détection des anticorps anti-protéines citrullinées tracées à partir des données de sensibilité et spécificité diagnostiques calculées sur une cohorte de 617 patients atteints de PR et d’autres maladies rhumatologiques établies. Seule la partie correspondant à de hautes valeurs de spécificité (> 90%) est représentée.
Les valeurs diagnostiques des différents tests ont été établies à partir de séries de
patients présentant des maladies établies. Or, les ACPA sont détectables chez une
proportion importante de patients à des stades très précoces de la maladie (Goldbach-
Mansky et al. 2000; van Gaalen et al. 2004) et souvent même plusieurs années avant
l'apparition des premiers signes cliniques de PR (Kurki et al. 1992; Rantapaa-Dahlqvist et
al. 2003; Nielen et al. 2004). Leur grande spécificité ainsi que leur précocité d'apparition
font de ces auto-anticorps des outils majeurs pour le diagnostic de la PR.
3.2.2. Valeur pronostique
Des études transversales ont permis d'établir des corrélations significatives entre la
présence et/ou le titre des ACPA et divers critères cliniques, radiologiques ou biologiques
d’activité et/ou de sévérité de la PR (nodules rhumatoïdes, CRP, complexes immuns
circulants, destructions articulaires…) (Vincent et al. 1989; Paimela et al. 1992). Des
Introduction
- 59 -
études longitudinales plus récentes ont confimé la valeur pronostique des ACPA et, en
particulier, leur corrélation avec l'érosion osseuse après plusieurs années d'évolution
(Forslin et al. 2001; Meyer et al. 2003; Vencovsky et al. 2003).
La détection des ACPA présente donc un intérêt clinique majeur, à la fois du fait de
leur valeur diagnostique, dès les stades précoces de PR, mais aussi de leur valeur
pronostique, permettant d'établir des stratégies thérapeutiques adaptées aux patients, dès
les stades les plus précoces de la maladie.
Introduction
- 60 -
4. Les peptidyl-arginine désiminases
4.1. Introduction
La Citrulline est un acide aminé ubiquiste chez les mammifères, dont le nom dérive
du latin Citrullis vulgaris, le melon d'eau (pastèque), contenant de très grandes quantités
de cet acide aminé. La Citrulline est un acide aminé non essentiel; il n'est pas généré au
cours de la synthèse protéique classique par traduction d'un codon spécifique mais peut
être fabriqué par l'organisme à partir d'autres acides aminés présents dans le corps. Chez
les mammifères, on distingue 2 catégories de citrullines: les citrullines libres, dont je
parlerai brièvement et les peptidyl-citrullines (présentes dans les protéines citrullinées), que
je développerai plus en détail (pour revue cf (Curis et al. 2005).
Chez les mammifères, le métabolisme des citrullines libres peut être divisé en 3
voies impliquant 3 enzymes principales. Deux de ces voies métaboliques concernent la
synthèse de citrulline libre : le cycle de l'urée et le métabolisme du monoxyde d'azote (NO,
pour "nitric oxide"), et ceci, respectivement, grâce à 2 catégories d’enzymes : l'ornithine
carbamoyltransférase (OCT, EC 2.1.3.3) et les NO-synthases (NOS, EC 1.14.13.39).
Chez l'homme, l'OCT, aussi appelée ornithine trans-carbamylase, est présente au
niveau du foie et de la muqueuse intestinale. Plus généralement, chez les eucaryotes
supérieurs tels que les mammifères, l'OCT est une enzyme située au niveau de la matrice
mitochondriale, qui joue un rôle clé au cours du cycle de l'urée en catalysant la
conversion de l'ornithine en citrulline selon la réaction suivante :
Figure 9 : Réaction de désimination ou citrullination. Transformation d'un résidu arginyl en résidu citrullyl sous l'action d'un enzyme appelée peptidyl-arginine désiminase (PAD), en présence de calcium. Au cours de la réaction, le groupement latéral guanidino chargé positivement de l'arginine (bleu), est converti en un groupement uréido non chargé de la citrulline (vert).
4.1.2. Caractéristiques générales des peptidyl-arginine désiminases
La citrulline, normalement acide aminé "libre", a pour la première fois été décrite
en tant que constituant de protéines en 1953, après isolement et purification de protéines
de la médulla des piquants de porc-épic africain ainsi que de protéines de la gaine
épithéliale interne du follicule pileux de cochon d'inde (Steinert et al. 1969). Ce n'est qu'en
1977, que Rogers et Taylor ont pour la première fois décrit une activité enzymatique
présente au niveau du follicule pileux et capable de convertir des peptidyl-arginine en
peptidyl-citrulline en présence de calcium (Rogers and Taylor 1977). La cible de cette
activité au sein du follicule pileux a par la suite été caractérisée et correspond à la
trichohyaline (cf paragraphe 4.4.2). En 1981, c'est une équipe japonaise qui a purifié et
caractérisé l'enzyme responsable de la conversion des résidus arginyl en résidus citrullyl, à
partir d'un extrait protéique d'épiderme de rat. Ils ont montré que l'activité enzymatique, en
plus de nécessiter la présence de calcium, est augmentée par l'ajout d'un agent réducteur,
le dithiothréitol. Du fait de sa spécificité pour des arginines et des dérivés d'arginine dont
les groupements alpha-carboxyl ou alpha-amino sont engagées dans une liaison
peptidique, et de son activité négligeable sur des L-arginine libres, les auteurs ont proposé
Introduction
- 63 -
de nommer cette enzyme : "peptidyl-arginine désiminase", afin de la différencier de
"l'arginine désiminase" catalysant la désimination d'arginines libres (Fujisaki and Sugawara
1981).
Dès les premières études, la présence d'une activité PAD a été mise en évidence
dans de nombreux tissus de mammifères : épiderme de rat nouveau-né (Fujisaki and
Sugawara 1981), muscle squelettique de lapin (Sugawara et al. 1982; Takahara et al.
1983) ou encore cerveau et épiderme de bœuf (Kubilus and Baden 1983; Kubilus and
Baden 1985). Une étude a également rapporté la présence d'une activité PAD dans
chacune des classes représentatives de vertébrés : poissons, amphibiens, reptiles, oiseaux
et mammifères. En effet, une activité de l'enzyme a été mise en évidence chez tous les
animaux testés (carpe, grenouille, tortue, poulet, vache et homme) mais pas au sein de
tous les tissus d'un même animal. Des activités enzymatiques élevées ont été mesurées
dans des extraits de cerveaux et de muscle squelettique de la plupart des animaux. Une
activité en quantité importante à également été retrouvée dans des extraits d'oeil et en plus
faible quantité dans des extraits d'épiderme et de nerf périphérique (Kubilus and Baden
1985). Bien que toutes ces enzymes provenant de différents tissus et espèces soient
capables de convertir des peptidyl-arginine en peptidyl-citrulline, des différences en termes
de poids moléculaire ou encore d'activité vis-à-vis de substrats synthétiques ont suggéré
que plusieurs PAD puissent exister. C'est ainsi que l'équipe japonaise de T. Senshu, grâce
à une étude à la fois biochimique et immunohistologique visant à caractériser plus
précisément les PAD présentes dans divers tissus de mammifères, a proposé l'existence
d'au moins trois types de PAD: la PAD de type "épidermique", celle de type "musculaire" et
celle du "follicule pileux" (Watanabe et al. 1988). Cependant dans cette étude, les
enzymes ont été extraites à partir de différentes espèces d'animaux (rat et boeuf) ce qui ne
permet pas d'attribuer de façon certaine les différences entre les 3 PAD à des spécificités
tissulaires. C'est en 1991 que Terakawa et col. ont enfin purifié par chromatographie
d'échange d'ion les PAD de plusieurs tissus murins et observé sur les chromatogrammes
obtenus, des variabilités dans le nombre et la position des pics d'élution d'activité PAD, en
fonction des tissus (Terakawa et al. 1991). Dans l'extrait d’épiderme, 3 pics possédant une
activité PAD ont été observés et les auteurs ont ainsi proposé de les nommer PAD de type
1, de type 2 et de type 3, en fonction de leur ordre d'apparition au cours de la
Introduction
- 64 -
purification. La PAD de type 2 apparaissait être la plus ubiquiste puisque présente dans la
plupart des tissus testés : muscle squelettique, moelle épinière, pancréas, glande salivaire,
utérus et peau. A l'inverse les PAD de type 1 et 3 présentaient des profils d'expression plus
restreints puisqu'elles n'ont été détectées que dans respectivement la peau et l'utérus ou la
peau et le follicule pileux. En plus de leurs profils d'expression tissulaire différents, les PAD
se distinguaient par leur poids moléculaire et leur spécificité vis-à-vis de substrats
synthétiques (Terakawa et al. 1991).
A ce jour, les données génomiques disponibles ont permis de révéler l'existence de
5 isotypes de PAD chez les mammifères, de 3 isotypes chez les oiseaux (Gallus gallus) et
d’un seul chez les amphibiens (Xenopus laevis) ainsi que chez les poissons (Danio rerio,
Takifugu rubripes et Tetraodon nigroviridis). Dans la suite de ce chapitre je vous parlerai
plus en détail des PAD de mammifères (homme, souris et rat).
4.2. Caractéristiques des PAD : clonage, profil d'expression,
conservation, activité.
Au moment où j’ai initié mon travail, 4 isotypes de PAD avaient été clonés chez
l'homme, la souris et le rat. Au cours de mes recherches, une cinquième PAD, la PAD6, a
été décrite au sein du laboratoire. Elle a été clonée chez l'homme (Chavanas et al. 2004)
ainsi que chez la souris (Wright et al. 2003).
Dans ce chapitre, je discuterai du clonage des isotypes murins et humains et la
terminologie suivante sera utilisée :
- PAD et Pad désigneront respectivement les peptidyl-arginine désiminases
humaines et murines
- PADI et Padi désigneront respectivement les gènes codant les peptidyl-arginine
désiminases humaines et murines.
4.2.1. Clonage et profil d'expression des Pad murines
4.2.1.1. Pad1
L'ADNc du gène padi1 de rat a été isolé par criblage d'une banque d'ADNc
construite à partir d'une lignée kératinocytaire de rat nouveau né, traitée à l'acide
rétinoïque durant 4 jours. L'ADNc contient un cadre de lecture ouvert de 1989 pb codant
Introduction
- 65 -
pour une protéine de 662 acides aminés avec un poids moléculaire théorique de 73 856
Da. Un signal de polyadénylation a été localisé aux nucléotides 3717-3723 (Ishigami et
al. 1998).
L'ADNc complet du gène Padi1 de souris a été isolé par criblage d'une banque
d'ADNc d'utérus puis cloné en utilisant la méthode de RACE-PCR. Cet ADNc contient un
cadre de lecture ouvert d’également 1989 pb codant pour une protéine de 662 acides
aminés avec un poids moléculaire théorique de 73823 Da. Un signal de polyadénylation
a été localisé au niveau des nucléotides 3730-3735 (Rus'd et al. 1999).
L'analyse comparative, par RT-PCR, de l'expression du gène Padi1 dans un panel
de différents tissus de souris a montré que le transcrit n'était présent que dans l'épiderme et
l'utérus (Rus'd et al. 1999). Ces résultats confirment ceux obtenus précédemment par la
même équipe qui suggéraient un profil d'expression de la Pad1 plutôt restreint. En effet,
une activité Pad1 avait seulement été mise en évidence dans l'épiderme et l'utérus
(Terakawa et al. 1991). De plus, l'expression de Padi1 semble sous le contrôle d'hormones
sexuelles stéroïdiennes, puisque l'administration d'œstrogène à des souris adultes ayant
subies une ovariectomie, augmente la présence de transcrits Padi1 de 3.8 kb dans l'utérus
(Rus'd et al. 1999).
4.2.1.2. Pad2
L'ADNc du gène Padi2 de rat a été isolé puis cloné par criblage d'une banque
d'ADNc construite à partir de muscle squelettique de rat. L'ADNc contient un cadre de
lecture ouvert de 1998 pb qui code pour un polypeptide de 665 acides aminés. Deux
signaux de polyadénylation ont été décrits aux nucléotides 4482-4487 et 4492-4497
(Watanabe and Senshu 1989).
L'ADNc complet du gène Padi2 de souris a été isolé par criblage d’une banque
d’ADNc d’utérus de souris et cloné en deux fois. L'ADNc contient un cadre de lecture
ouvert codant pour une protéine de 673 acides aminés avec un poids moléculaire
théorique de 76260 Da. Il contient également deux séquences de polyadénylation
localisées à 27 et 37 pb respectivement en amont de la queue poly A (Tsuchida et al.
1991; Tsuchida et al. 1993).
Introduction
- 66 -
L'analyse de l'expression du gène Padi2 de rat par Northern-blotting, a permis de
montrer la présence d'un transcrit de ~ 4.5 – 5 kb au niveau de la moelle épinière, des
glandes sous-maxillaires, du cerveau et du cervelet, ainsi que dans le muscle squelettique
mais pas au niveau du foie ou du rein (Watanabe and Senshu 1989). Une analyse par
immunotransfert réalisée par le même groupe a permis de non seulement confirmer ces
résultats au niveau protéique, mais en plus de détecter la protéine Pad2, en plus faible
quantité dans d'autre tissus/organes comme l'estomac, le thymus, l’hypophyse, ou encore
la glande surrénale. Les intensités relatives des bandes immunoréactives dans tous les
extraits de tissu et organes testés semblaient de plus concordante avec les activités Pad
relatives purifiées par immunoprécipitation avec un anticorps anti-Pad2 à partir de ces
mêmes extraits (Watanabe et al. 1988).
Enfin, tout comme pour le gène Padi1 de souris, l'expression de Padi2 semble
également sous le contrôle d'hormones sexuelles stéroïdiennes. En effet, l'ovariectomie de
souris adultes s'accompagne d'une diminution considérable de la quantité de l'enzyme
correspondante au niveau de l'utérus. Or, l'administration d'œstrogène à ces souris
s'accompagne d'une augmentation de l'activité de l'enzyme de façon dose- et temps-
dépendante au niveau de l'utérus. Des analyses par immunotransfert et Northern-blotting
ont confirmé ces résultats en montrant respectivement une augmentation graduelle de la
quantité de l'enzyme et des transcrit Padi2, suite à l'injection d'œstrogène. Ceci suggère
une régulation pré-traductionnelle par les hormones stéroïdiennes de l'expression de
l'enzyme Pad2 (Takahara et al. 1992).
4.2.1.3. Pad3
L'ADNc complet du gène Padi3 de rat a été cloné par RT-PCR et RACE-PCR à partir
d'ARN isolés d'épiderme de rat nouveau-né. L'ADNc contient un cadre de lecture ouvert de
1995 pb qui code pour une protéine de 664 acides aminés avec un poids moléculaires
théorique de 75036 Da (Nishijyo et al. 1997).
L'ADNc du gène Padi3 de souris a été cloné à partir d’ADNc d’épiderme de souris.
Le cadre de lecture ouvert de l'ADNc code pour une protéine de 664 acides aminés avec
un poids moléculaire théorique de 75098 Da (Rus'd et al. 1999).
Introduction
- 67 -
L'analyse par RT-PCR semi-quantitative d'un panel de tissus de rat a montré que le
gène Padi3 présente un profil d'expression plutôt restreint. Son transcrit n'a en effet été
retrouvé que dans l'épiderme et le follicule pileux (Nishijyo et al. 1997). Ces résultats sont
en accord avec ceux obtenus par Terakawa et col. qui n’ont détecté une activité Pad3 de
souris que dans l'épiderme, la peau ainsi que le follicule pileux (Terakawa et al. 1991).
4.2.1.4. Pad4
L'ADNc du gène Padi4 de rat a été cloné, tout comme le gène codant pour la Pad1
de rat, à partir d'une banque d'ADNc d'une lignée kératinocytaire de rat nouveaux-né
traitée à l'acide rétinoïque (Ishigami et al. 1998). Il a également été cloné en parallèle à
partir d'ADNc d'épiderme de rat (Yamakoshi et al. 1998). L'ADNc du gène Padi4 de rat
contient un cadre de lecture ouvert de 1998 pb codant pour une protéine de 666 acides
aminés avec un poids moléculaire théorique de 74466 Da (Ishigami et al. 1998;
Yamakoshi et al. 1998).
L'ADNc du gène Padi4 de souris a été cloné à partir d’ADNc d’épiderme de souris.
Cet ADNc contient un cadre de lecture ouvert qui code pour une protéine de 666 acides
aminés avec un poids moléculaire théorique de 74475 Da (Rus'd et al. 1999).
L'analyse de l'expression du gène Padi4 par RT-PCR semi-quantitative sur un panel
de plusieurs tissus de rat, a révélé la présence de transcrits dans la plupart d'entre eux. Des
niveaux d'expression significatifs ont été mis en évidence dans le pancréas, la rate, les
ovaires mais aussi dans le foie, le poumon, le rein, le derme…. Par contre les transcrits
ont été très faiblement détectés au niveau du cerveau, du cœur ou encore de l'épiderme,
tissu à parti duquel le gène a pourtant été cloné (Yamakoshi et al. 1998).
4.2.1.5. Pad6
La séparation de protéines extraites d'ovocytes de souris, et des analyses par
spectrométrie de masse ont permis d'identifier une nouvelle protéine abondante des
ovocytes avec un poids moléculaire ~ de 75 kDa et un pI de 5.5 (Wright et al. 2003). Un
ADNc de 2374 pb codant pour cette protéine a été cloné à partir d'une banque issue
d'ovaire de souris. Le cadre de lecture ouvert de 2049 pb, code pour une protéine de 683
acides aminés. La comparaison de sa séquence en acides aminés avec celles d’autres
protéines contenues dans des bases de données a montré que cette nouvelle protéine
Introduction
- 68 -
présentait ~ 40 % d'identité avec les enzymes de la famille PAD. Ainsi, du fait de son
abondance dans les ovocytes, et de sa relative conservation avec les PAD, cette protéine a
été baptisée ePAD pour "Egg and embryo-abundant peptidylarginine deiminase" (Wright et
al. 2003). Cette enzyme a par la suite été désignée comme étant le cinquième isotype de
la famille des PAD, et pour rester dans la nomenclature des PAD existantes renommée
Pad6 (Vossenaar et al. 2003) (et non Pad5, ceci pour éviter une confusion avec la Pad4
car comme nous le verrons plus loin, l’orthologue humain de la Pad4 murine —
logiquement la PAD4 humaine — avait été clonée à partir de cellules promyeloblastiques
et malencontreusement baptisée PAD5) .
Des analyses par hybridation in situ et RT-PCR ont montré un profil d'expression du
gène Padi6 restreint puisque ses transcrits détectés au sein de l'ovaire, et très faiblement
dans le testicule, n'ont pas été retrouvés dans les autres tissus et organes testés (Wright et
al. 2003). Des expériences d'immunohistochimie ont permis de préciser la localisation de
la Pad6 (ePAD) au niveau des granules corticales d'ovocytes de souris immatures et son
relargage à partir des ovocytes matures fertilisés. Après son relargage, la Pad6 a été
observée dans l'espace péri-vitellin, une certaine quantité de protéine restant associée
avec la membrane plasmique des blastomères et ce, jusqu'au stade blastocyste (Liu et al.
2005).
4.2.2. Clonage des PAD humaines
4.2.2.1. PAD1
C'est au sein du laboratoire que l’ADNc complet du gène PADI1 a été cloné à
partir d'ADNc d'épiderme humain. Cet ADNc, long de 2711 pb contient un cadre de
lecture ouvert codant pour une protéine de 663 acides aminés avec un poids moléculaire
théorique de 74.6 kDa. Cet ADNc contient également des régions 5' et 3' non traduites de
respectivement 83 pb et 639 pb (Guerrin et al. 2003).
4.2.2.2. PAD2
Afin d’isoler et caractériser la PAD exprimée dans une lignée cellulaire humaine
issue d’un carcinome basocellulaire, HSC-1 (Kondo and Aso 1981), Ishigami et col. ont
utilisé une stratégie de clonage par contruction et criblage d'une banque d’ADNc à 7 jours
Introduction
- 69 -
de culture. Après analyse de sa séquence, l’ADNc obtenu a été caractérisé, grâce à sa
forte identité avec les séquences des Pad de type 2 de rat et de souris, comme étant
l’ADNc du gène PADI2. Long de 2348 pb, cet ADNc complet se compose d'une région 5'
non traduite de 64 pb, d'un cadre de lecture ouvert de 1998 pb et d'une région 3' non
traduite longue de 286 pb. Le cadre de lecture ouvert code pour une protéine de 665
acides aminés avec un poids moléculaire théorique de 75 kDa. (Ishigami et al. 2002).
4.2.2.3. PAD3
L'ADNc complet du gène PADI3 humain (3142 pb) a été cloné à partir de
kératinocytes primaires en culture, par la méthode de RT- et RACE-PCR. Cet ADNc se
compose d'une région 5' non traduite de 41 pb, et d'une région 3' non traduite longue de
1147 pb dans laquelle un signal de polyadénylation a été localisé en position 3124-
3129. Le cadre de lecture ouvert de 1995 pb, code pour une protéine de 664 acides
aminés avec un poids moléculaire théorique de 74770 Da (Kanno et al. 2000).
4.2.2.4. PAD4
L'ADNc du gène PADI4 humain (2286 pb) a été isolé par criblage d'une banque
d'ADNc construite à partir de cellules pro-myélobastiques HL-60, différenciées en
granulocytes par traitement avec de l'acide rétinoïque durant 3 jours. Cet ADNc se
compose d'une région 5' non traduite de 26 pb, et d'une région 3' non traduite de 268 pb
contenant un signal de polyadénylation localisé aux nucléotides 2264-2286. Le cadre de
lecture ouvert de 1992 pb, code pour une protéine de 663 acides aminés avec un poids
moléculaire théorique de 74100 Da (Nakashima et al. 1999). Sur la base du profil
d’activité d’une forme recombinante de cette protéine sur différents substrats synthétiques
qui s’est avéré être différent de celui de la Pad4 murine, cette enzyme a d’abord été
considéré comme un nouvel isotype et été baptisée PAD5 alors que les analyses
phylogénétiques ultérieures l’ont clairemeent identifiée à l’orthologue de la Pad4 murine.
De nos jours on l’appelle PAD4.
4.2.2.5. PAD6
Tout comme pour la PAD1, c'est au sein du laboratoire que l'ADNc codant pour la
PAD6, cinquième istotype récemment décrit, a été cloné à partir d'une banque d'ADNc
Introduction
- 70 -
d'ovaires humains. Un cadre de lecture ouvert de 2082 pb a été décrit, et code pour une
protéine de 694 acides aminés avec un poids moléculaire théorique de 77.7 kDa
(Chavanas et al. 2004). L'ADNc codant pour la PAD6 a également été cloné par une
équipe chinoise à partir d'une banque d'ADNc de cerveau fœtal humain (Zhang et al.
2004).
4.2.3. Profil d'expression des différentes PAD humaines
Tout comme pour les Pad murines, les PAD humaines semblent exprimées dans la
plupart des tissus et organes, bien que chaque isotype présente également un profil
d'expression particulier.
4.2.3.1. Expression des gènes PADI au niveau ARNm
Des analyses par RT-PCR réalisées sur un panel de tissus, organes ou cellules
humains ont permis de mettre en évidence que chacun d'entre eux exprimaient au moins
un des gènes PADI (cf Tableau 10).
On peut remarquer que le gène PADI2 est le plus ubiquiste puisque l'ARNm
correspondant a été détecté dans tous les tissus/organes testés. De plus c'est le seul
exprimé au niveau du cerveau (Guerrin et al. 2003). Les gènes PADI1 et 4 semblent
exprimés dans de nombreux tissus à la différence des gènes PADI3 et 6 qui présentent un
profil d'expression plus restreint (Guerrin et al. 2003; Chavanas et al. 2004; Nachat et al.
2005). On peut noter que seuls 3 gènes, PADI2, 4 et 6 sont transcrits dans les leucocytes
du sang périphérique (Vossenaar et al. 2004; Zhang et al. 2004; Nachat et al. 2005;
Chavanas et al. 2006). De même dans l'épiderme, seuls les gènes PADI1, 2 et 3 sont
exprimés (Guerrin et al. 2003; Nachat et al. 2005).
L'analyse de banques d'EST (UniGene) permet de confirmer les résultats obtenus
par RT-PCR. On retrouve en effet l'expression de PAD dans un grand nombre de tissus
avec la confirmation du caractère très ubiquiste du gène PADI2 (cf Tableau 11).
Tableau 10 : Expression des 5 gènes PADI au niveau ARNm, dans différents tissus, organes ou cellules humains. (+) : détection d'un signal par RT-PCR, (-) : absence de signal par RT-PCR (d'après (Guerrin et al. 2003; Chavanas et al. 2004; Nachat et al. 2005)).
Tableau 11 : Analyse des banques d'EST chez l'homme, la souris et le rat (Analyse d’après les données sur la base de données UniGene disponibles en mai 2007).
Introduction
- 72 -
Toutefois, il est important de noter que l'expression d'un gène (présence d'un
transcrit ou EST) dans un tissu ou organe donné n'est pas l'assurance que la protéine
correspondante le soit elle aussi. En effet, par exemple, bien que dans des monocytes
humains purifiés et dans des macrophages dérivés, les transcrits du gène PADI2 soient
présents, la protéine correspondante n'a été détectée que dans les macrophages. Les
auteurs ont montré que la traduction du messager pouvait être régulée par la très longue
région 3' non traduite, par une approche gène rapporteur luciférase (Vossenaar et al.
2004). L'expression des PAD pouvant être régulée au moins au niveau traductionnel
l'étude de l'expression et de la régulation de l'expression des PAD au niveau protéique
reste donc très importante.
4.2.3.2. Expression des PAD au niveau protéique
L'expression des PAD au niveau protéique a également été décrite dans de
nombreux tissus et organes.
En dépit du fait que le gène PADI1 présente un profil d'expression assez large, les
études portant sur l'analyse de l'expression de la protéine correspondante ont surtout été
réalisées au niveau de l'épiderme et des annexes cutanées. La protéine PAD1 a ainsi été
retrouvée au niveau de toutes les couches vivantes de l'épiderme, au niveau du follicule
pileux (Mechin et al. 2005; Nachat et al. 2005), des muscles arrecteurs de poil et des
glandes sudoripares (Nachat et al. 2005).
La PAD2, tout comme cela était suggéré par la présence des transcrits du gène
PADI2 dans tous les tissus testés, est largement exprimée. On la retrouve, comme la
PAD1, dans l'épiderme au niveau des couches vivantes (Ishigami et al. 2002; Nachat et
al. 2005), dans les muscles arrecteurs de poils ou encore les glandes sudoripares (Urano
et al. 1990; Nachat et al. 2005). En accord avec les résultats obtenus au niveau
transcriptionnel, son expression a également été décrite au sein des leucocytes et plus
particulièrement de macrophages différenciés in vitro à partir de monocytes du sang
périphérique (Vossenaar et al. 2004). Elle est de plus le seul isotype exprimé au sein du
cerveau au niveau des astrocytes (Sambandam et al. 2004; Ishigami et al. 2005).
La PAD3 semble être présente dans un nombre de tissus ou organes plutôt restreint.
Son expression a seulement été rapportée dans la couche granuleuse et les couches les
Introduction
- 73 -
plus profondes de la couche cornée de l'épiderme, ainsi qu'à plusieurs couches du
follicule pileux (Kanno et al. 2000; Mechin et al. 2005; Nachat et al. 2005; Nachat et al.
2005).
La PAD4, quant à elle, est la seule parmi les 5 isotypes de PAD, a posséder une
séquence de nucléarisation. C'est ainsi que son expression au sein des noyaux de
granulocytes a été décrite (Nakashima et al. 2002). Plus généralement, l'expression de la
PAD4 a surtout été recherchée dans les cellules hématopoïétiques. Même si les résultats
des différentes études ne sont pas toujours totalement concordants, la PAD4 a été
retrouvée dans plusieurs types cellulaires et principalement dans les granulocytes,
monocytes et macrophages (Nakashima et al. 1999; Asaga et al. 2001; Vossenaar et al.
2004; Chang et al. 2005).
Enfin, concernant la PAD6, aucune donnée concernant son expression dans des
tissus ou organes humains n'avait été encore réalisée avant notre travail.
4.2.4. Conservation des différentes PAD
4.2.4.1. Organisation génomique et conservation des gènes PADI/Padi
Chez les mammifères, les cinq gènes codant pour les 5 isotypes de PAD sont tous
regroupés en un locus unique sur le chromosome 1 chez l'homme, le chromosome 4 chez
la souris et le chromosome 5 chez le rat (cf Figure 10). Chez l'homme, les cinq gènes PADI
s'étendent sur une région de 355 kb en position 1p35-36. Chez la souris et le rat, les cinq
gènes sont regroupés dans des régions d'environ 240 kb respectivement en position 4E1
et 5q36. Les positions relatives des 5 gènes PADI/Padi sont conservées selon l'ordre
L'orientation des gènes est également conservée avec le gène PADI/Padi2 à l'opposé des 4
autres PADI/Padi, en direction du télomère (Vossenaar et al. 2003; Chavanas et al.
2004).
Introduction
- 74 -
Figure 10 : Organisation génomique du locus PADI/Padi chez l'homme, la souris et le rat. Idéogramme du chromosome 1 humain, du chromosome 4 de souris et du chromosome 5 de rat montrant la localisation et l'orientation des gènes PADI/Padi. Le gène PADI/Padi2 est orienté dans la direction inverse aux quatre autres PAD. Hs : Homo sapiens, Mm : Mus musculus, Rn : Rattus norvegicus. (Vossenaar et al. 2003).
Les 5 gènes PADI/Padi qui ont été décrits, présentent une organisation semblables :
ils sont tous subdivisés en 16 exons et la position des jonctions introns/exons est
conservée. En revanche, la taille des gènes est plus variable. Les gènes PADI1 à 6
s'étendent respectivement sur 40.9, 50.7, 35.1, 55.5 et 29.5 kb. De la même façon, chez
la souris, les gènes Padi1 à 6 s'étendent respectivement sur 32.8, 46.2, 25.3, 27.4 et
15.2 kb. La taille des régions inter-génique est également plutôt hétérogène et varie de
3.1 kb (entre PADI1 et 3) à 86 kb (entre PADI 2 et 1) chez l'homme, ou de 2.5 kb (entre
Padi 1 et 3) à 62 kb (entre Padi 2 et 1) chez la souris (Chavanas et al. 2004).
Introduction
- 75 -
4.2.4.2. Conservation des séquences des PAD
La forte conservation entre les différentes PAD a été décrite dans de nombreuses
études. Chez les mammifères, les différents isotypes de PAD à l'intérieur d'une même
espèce (PAD paralogues) sont assez bien conservés et présentent 44 à 57 % d'identité en
acides aminés (cf Tableau 12).
Tableau 12 : Conservation entre les différentes PAD humaines. Les pourcentages d'identité et de similarité en acides aminés entre les différentes PAD humaines ont été calculés après alignement des séquences protéiques sur "Blast" et sont données respectivement en bleu et en rouge.
Cette conservation est encore plus élevée entre PAD orthologues puisque leurs
séquences en acide aminés présentent entre 67 et 92 % d'identité et de 82 à 96 % de
similarité (cf Tableau 13). La PAD6 humaine apparaît être l'isotype le moins conservé avec
seulement 44 % d'identité avec les autres PAD humaines et 66% d'identité avec son
orthologue chez la souris. Au contraire la PAD de type 2 semble être la plus conservée
entre les différentes espèces de mammifères, la PAD2 humaine étant conservée à plus de
90 % avec son orthologue murin (cf Tableau 13).
Comparaison des
séquences protéiques % d'identité % de similarité
PAD1/ Pad1 76 85
PAD2/ Pad2 92 96
PAD3/ Pad3 87 93
PAD4/ Pad4 73 85
PAD6/ Pad6 66 82 Tableau 13 : Comparaison des séquences protéiques des PAD humaines (PAD1-6) et de souris (Pad 1-6).
La forte homologie de séquence entre les différents isotypes de PAD, la
conservation de la structure des exons ainsi que de l'organisation en locus indiquent que
chez les mammifères, les 5 enzymes PAD sont le résultat d'une série de duplications
géniques ayant eu lieu avant la divergence des différentes espèces de mammifères
(Vossenaar et al. 2003).
La réalisation d'arbres phylogénétiques a permis de mieux comprendre les
différentes étapes de l'évolution des différentes PAD. Le gène PADI2 aurait divergé en
premier par duplication à partir de l'ancêtre commun. De plus, la longueur des branches
(corrélée au taux d'évolution des séquences) a fait ressortir que certains gènes de PAD ont
évolué plus vite que d'autres. La longueur des branches plus longue pour le groupe des
gènes PADI/Padi6 que pour le groupe des gènes PADi/Padi2 signifie que les similarités
entre espèces sont plus grandes dans le groupe "PAD-2" que dans le groupe "PAD-6" et
que le groupe PAD-2 est le plus conservé. En outre, la distance par rapport à l'ancêtre
commun est plus courte pour le groupe PAD-2 ce qui suggère que le groupe a été soumis
à une pression de sélection négative importante et a probablement conservé les fonctions
biochimiques ancestrales. Les autres PAD auraient subi une spécialisation d'expression
tissulaire ou une modification importante des propriétés biochimiques. La comparaison
des taux d'évolution des séquences (longueur des branches) avec les largeurs de profils
d'expression des différentes PAD fait ressortir une corrélation inverse entre les deux. Ceci
est d'autant plus remarquable lorsque l'on compare la taille des branches et la distribution
tissulaire de PADI2 (branches courtes et distribution tissulaire variée) et de PADI6 (branches
longues, distribution tissulaire très limitée) (cf Figure 11) (Balandraud et al. 2005).
Introduction
- 77 -
Figure 11 : Relation phylogénétique et profil d'expression au sein de la famille des PAD. Les numéros dans les carrés correspondent à différents tissus adultes : 1: os, 2: cerveau, 3: colon, 4:oeil, 5 : rein, 6: foie, 7: poumon, 8: glande mammaire, 9: pancréas, 10: placenta, 11: peau, 12: thymus, 13: utérus, 14: ovaires, 15: oreille interne et 16: tissu olfactif. Un carrés gris indique la présence ou l'expression dans le tissu correspondant (au 1er janvier 2005) et un carré blanc indique qu'aucune expression n'a été décrite dans le tissu. Les cercles ronds indiquent une duplication (Balandraud et al. 2005).
4.2.5. Substrats et spécificités des PAD
Rappelons qu’une activité PAD a été détectée chez tous les vertébrés et dans la
plupart des organes, tissus et cellules. Comparativement au caractère ubiquiste de cette
activité enzymatique , peu de substrats in vivo ont été identifiés. Il s’agit essentiellement de
protéines structurales : des protéines des filaments intermédiaires comme les kératines, la
vimentine ou encore la GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), ainsi que des protéines
associées aux filaments intermédiaires de kératine comme la trichohyaline et la filaggrine
(Rogers et al. 1977; Senshu et al. 1996; Asaga et al. 1998; Nicholas et al. 2004).
D'autres protéines cibles ont été décrites : des protéines nucléaires telles que les histones
ou la nucléophosmine/B23 (Hagiwara et al. 2002; Nakashima et al. 2002) mais
également des protéines extra-cellulaires comme la fibrine ou la fibronectine (Masson-
Bessiere et al. 2001; Chang et al. 2005), (pour plus de détail voir les paragraphes 4.4 et
4.5).
Introduction
- 78 -
Généralement, ces protéines sont des protéines relativement abondantes, elles
contiennent un pourcentage élevé de résidus arginyl dans leur séquence et sont souvent
des protéines basiques (ou contenant des domaines basiques) alors que les PAD sont
plutôt acides du fait de leur point isoélectrique (cf Tableau 14). Ceci favorise probablement
les interactions entre l'enzyme et son substrat (Mechin et al. 2007).
Tableau 14 : Point isoélectrique des différentes PAD humaines. Les points isoélectriques théoriques des différentes PAD1 à 6 humaines ont été calculés grâce à l'outil " Compute pI/Mw" sur ExPASy. Ces données ont été calculées à partir des séquences des PAD1 à 6 correspondant, respectivement, aux numéros GenBank suivants : AB033768, AB030176, AB026831, AB017919 et AT422079.
N'importe quel résidu arginyl au sein d'une protéine n'est pas la cible des PAD. En
effet, la désimination d'un résidu arginyl par une PAD dépend de plusieurs facteurs tels
que la position du résidu arginyl, la nature des résidus amino-acyl environnant ou encore
les contraintes structurales (Tarcsa et al. 1996). Quelques uns de ces facteurs ont été
résumés dans le Tableau 15 suivant.
Structure primaire
N-Arg-Glu-C citrullination lente, jusqu'à 10% d'efficacité
N-Arg-Asp-C citrullination rapide, jusqu'à 100% d'efficacité
Arg proche de N-ter faiblement citrulliné
N-Arg-Arg-C le plus proche de C-ter : faiblement citrulliné
N-Pro-Arg-Pro-C jamais citrulliné
Structure secondaire
Hélice α difficilement citrulliné
Coude β (β turn) région très sensible à la citrullination
Désordonnée citrullination rapide, jusqu'à 95% d'efficacité
Feuillet β aucune donnée disponible Tableau 15 : Quelques règles de désimination. Ce tableau révèle quelques "préférences" des PAD vis-à-vis des structures primaires et secondaires du substrat (Tarcsa et al. 1996). N : extrémité N-terminale, C : extrémité C-terminale des protéines. D'après (Gyorgy et al. 2006).
Introduction
- 79 -
Pour résumer, les données tirées de l’analyse de la désimination de la filaggrine de
souris, de la trichohyaline humaine et de peptides synthétiques (cf Tableau 15) ont permis
de montrer qu'un résidu arginyl proche de l'extrémité N-terminale est faiblement citrulliné.
Des résidus arginyl au sein de structures protéiques hautement α-hélicoïdales (comme la
trichohyaline) sont difficilement modifiés et de manière lente alors que des résidus arginyl
au sein de protéines moins structurées (comme la filaggrine) sont efficacement modifiés
par la Pad2 purifiée à partir de muscle squelettique de lapin. De plus, un résidu arginyl
suivi d'un résidu d'acide glutamique est très peu modifié dans une protéine α-hélicoïdale,
mais significativement modifié dans des protéines moins structurées. Enfin, dans des cas
rares où 2 résidus arginyl sont consécutifs, le premier est citrulliné beaucoup plus
efficacement que le second. Ainsi, l'action d'une PAD est dépendante à la fois de la
structure du substrat et des résidus amino-acyl environnant le résidu arginyl (Tarcsa et al.
1996).
Chaque isotype de PAD présente des spécificités de substrats différentes. Par
exemple, bien que les PAD1, 2 et 3 recombinantes soient capables de désiminer la
filaggrine, toutes ne le font pas avec la même efficacité. La PAD2 présente une activité
maximale après seulement 20 min d'incubation, contre 2H ou 19h pour respectivement les
PAD1 et 3 (Mechin et al. 2005). De plus, l'activité des 3 formes de PAD recombinantes
purifiées sur des substrats synthétiques dérivés de l'arginine peut également varier en
fonction de l'isotype. La PAD2, par exemple est plus active sur les substrats synthétiques
Tosyl-L-Arg-O-Me ou Benzoyl-L-Arg-O-Et que la PAD1 ou la PAD3 (cf Tableau 16)
(Mechin et al. 2007). Finalement bien que les différents isotypes de PAD semblent
présenter des activités relatives différentes sur différents substrat synthétiques, pour un
même isotype les formes recombinantes ou purifiées à partir de divers tissus semblent
posséder des activités relatives plutôt similaires (cf Tableau 16). Ceci suggère donc que les
PAD ne requièrent pas de modification post-traductionnelle spécifiques aux eucaryotes
Tableau 16 : Comparaison des activités relatives des PAD1, 2 et 3 sur des substrats synthétiques ou sur la protamine. Les différentes PAD1 à 3 ont été produites sous forme recombinante (jaune) ou bien purifiées à partir d'épiderme (bleu) ou de muscle squelettique (rose) ou encore de follicule pileux (vert). recPAD1-3 : PAD1-3 humaines recombinantes (Mechin et al. 2005). mPad1 et bPad1 : Pad1 purifiée à partir d'épiderme respectivement de souris (Takahara et al. 1989) et de bœuf (Watanabe et al. 1988). mPad2† et mPad2‡, Pad2 purifiée à partir d'e muscle squelettique, respectivement (Terakawa et al. 1991) et (Takahara et al. 1989). rPad2 et rabPad2 : Pad2 purifiée à partir de muscle squelettique respectivement de rat (Watanabe et al. 1988), et de lapin (Takahara et al. 1983). mPad3 et rPad3, Pad3 purifiée respectivement à parti d'épiderme de souris (Terakawa et al. 1991) et de follicule pileux de rat (Watanabe et al. 1988). D'après (Mechin et al. 2007).
4.3. Relations structure / fonction : structure cristallographique de la
PAD4
4.3.1. Structure générale
La structure de la PAD4 humaine a été déterminée après la réalisation de cristaux
de PAD4 humaine libre ou en complexe avec des substrats synthétiques (benzoyl-L-
arginine amide, BA) et naturels (peptides N-terminaux des histones H3 et H4) et la mesure
et l'analyse de la diffraction des rayon X à des résolutions de, respectivement, 2.8 et 2.3 Å
(Arita et al. 2004; Arita et al. 2006).
Ces données ont ainsi révélé que la chaîne polypeptidique de la PAD4 est repliée
en 2 domaines : le domaine N-terminal, des résidus methionyl 1 à prolyl 300 (Met1-
Pro300), et le domaine C-terminal, des résidus asparagyl 301 à prolyl 663 (Asn301-
Pro663) (cf Figure 12).
Introduction
- 81 -
Le domaine N-terminal est divisé en 2 sous-domaines "immunoglobulin-like" : le
sous-domaine1, composé de 9 feuillets β (β1− β9) et le sous-domaine 2 composé de 10
feuillets β (β10 −β19) et 4 hélices α courtes (α1- α4). Le domaine C-terminal possède une
structure constituée de 5 modules ββαβ circulaires et pseudo-symétriques appelés "α/β
propeller" en anglais. L’ensemble constitué par les premiers feuillets β de chacun de ces 5
modules, forme un site actif sous forme d'un sillon qui fixe le substrat au cœur des
modules. La bonne conservation de la partie C-terminale des séquences protéiques de
toutes les PAD suggère que les structures tertiaires des domaines C-terminaux sont
similaires.
4.3.2. Sites de fixation au calcium
Cinq ions Ca2+ désignés Ca1, Ca2, Ca3, Ca4 et Ca5 se fixent à la PAD4. Les
sites de fixation de ces ions calcium sont différents de ceux des protéines à main EF, qui
possèdent des motifs hélice-boucle-hélice pour lier les ions Ca2+.
Ca1 et Ca2 sont positionnés dans le domaine C-terminal. Ca1 s'organise avec 5
résidus amino-acyl (Gln349, Glu353, Glu 411, Phe407 et Leu410) et deux molécules
d'eau tandis que Ca2 s'assemble avec 4 résidus amino-acyl (Glu351, Asp 369, Asn373 et
Figure 12 Structure de la PAD4 : représentation sous forme de monomère en complexe avec un substrat synthétique. Les 5 ions Ca2+ (Ca1 – Ca5) sont indiqués sous forme de boules noires, et le substrat, benzoyl-L-arginine amide, est représenté en bleu foncé selon le modèle " boules et bâtons". Les sous-domaines N-terminaux 1 et 2 et le domaine C-terminal sont respectivement en jaune, vert et rouge. La région correspondant à la séquence de nucléarisation (NLS) est indiquée sous forme de pointillés (Arita et al. 2004).
Introduction
- 82 -
Ser370) et une molécule d'eau. Presque tous ces résidus qui servent de ligand pour Ca1 et
Ca2 sont conservés chez les autres PAD excepté PAD6. Ces résidus sont donc
probablement des ligands des ions Ca2+ dans les PAD1, PAD2 et PAD3 (cf Figure 13).
Ca3, Ca4 et Ca5 sont localisés en N-terminal dans le sous-domaine 2. Ca3 et C4
interagissent l'un avec l'autre et se coordonnent respectivement avec 6 résidus amino-acyl
(Asn153, Asp155, Asp157, Asp165, Asp176 et Asp179) et 4 résidus amino-acyl (Asp155,
Asp157, Asp179 et Asp388). Ca5 quant à lui, s'assemble avec 3 résidus amino-acyl
(Asp168, Asp165 et Glu170) et deux molécules d'eau (cf Figure 13).
349 353 407 410 411PAD 1 Q E F L D
2 Q E F L E3 Q E F L E4 Q E F L E6 Q A I L M
351 369 370 373PAD 1 E D S N
2 E D S D3 E D S N4 E D S N6 E D T A
153 155 157 165 176 179PAD 1 N D D D D D
2 N D E D D D3 N D D D D D4 N D D D D D6 N N A D E N
155 157 179 388PAD 1 D D D D
2 D E D D3 D D D D4 D D D D6 N A N G
165 168 170PAD 1 D H W
2 D D K3 D D H4 D D E6 D T K
Site Ca1 : acides aminés
Site Ca5 : acides aminés
Site Ca4 : acides aminés
Site Ca3 : acides aminés
Site Ca2 : acides aminés
Figure 13 : Sites de fixation des 5 ions Ca2+ (Ca1 à Ca5) : composition en acide aminés et conservation entre les différentes PAD paralogues humaines. D'après (Arita et al. 2004).
Introduction
- 83 -
4.3.3. Implications fonctionnelles dans le domaine N-terminal
La fixation des ions Ca2+ dans le domaine N-terminal provoque une modification
nette dans la conformation de la région comprise entre les résidus amino-acyl Asn158 et
Val171. Cette région est en effet désorganisée dans la PAD4 "libre" sans calcium mais se
structure après fixation de Ca3, Ca4, Ca5 et de 2 molécules d'eau. Ces changements
conformationnels dans le domaine N-terminal de la PAD4 pourraient être impliqués dans
un mécanisme de régulation dépendant du calcium ou dans une interaction protéine –
protéine.
La PAD4 est le seul des 5 isotypes de PAD à posséder une séquence de localisation
nucléaire (Nuclear Localisation Sequence : NLS) (56-PPAKKKST-63) et à être localisée
dans le noyau (Nakashima et al. 2002). Cette séquence NLS est positionnée à la surface
de la molécule dans une boucle située dans la région N-terminale entre β5 et β6 du sous-
domaine 1 (cf Figure 12). Cette région boucle est désorganisée quelle que soit la structure
adoptée par la PAD4 (+/- calcium ou +/- en complexe avec un substrat). Cette région
pourrait se "structurer" au cours de l'interaction de la NLS avec le récepteur du transport
nucléaire proche de l'enveloppe nucléaire. En effet, ce phénomène a été décrit dans des
analyses cristallographiques de reconnaissance d'une NLS par un facteur d'importation
nucléaire, la Karyophérine α (Conti et al. 1998).
4.3.4. Implications fonctionnelles dans le domaine C-terminal
Comme indiqué, les premiers feuillets β (β41, β22, β25, β30 et β36) de chacun
des 5 modules ββαβ du domaine C-terminal, forment ensemble un "sillon" dans la
structure de la PAD4 lorsqu'elle est liée au calcium (en complexe ou non), à l'intérieur
duquel sont situés les résidus catalytiques.
Les 5 modules ββαβ sont également présents dans d'autres enzymes de
transformation des arginines, indépendantes du calcium, telles que la L-arginine:glycine
amidinotransferase (AT; EC 2.1.4.1) (Humm et al. 1997) et la diméthylarginine
dimethylaminohydrolase (DDAH; EC 3.5.3.18) (Murray-Rust et al. 2001). Récemment, les
structures crystallographiques d'arginine désiminases (ADI; EC 3.5.3.6) de Pseudomonas
aeruginosa (Pa-ADI) et de Mycoplasma arginini (Ma-ADI) ont été déterminées
respectivement sous forme "libre" et "compléxée" à un substrat avec les différents
Introduction
- 84 -
intermédiaires de réaction. Les structures des Pa-ADI et Ma-ADI comprennaient 5 modules
ββαβ similaires à ceux retrouvés dans les AT, DDAH et dans le domaine C-terminal de la
PAD4. La comparaison des ADIs avec les domaines C-terminal de la PAD4 sous forme
liée au calcium ou complexée à un substrat montre que les résidus catalytiques des ADI se
superposent bien aux résidus Asp350, His471, asp473 et Cys645 de la PAD4. Ceci
indique que, plus généralement, les PAD appartiennent à la surperfamille des enzymes de
transformation d'arginine et que les résidus Asp370, His470, Asp473 et Cys645 situés
dans le sillon de PAD4 sont probablement les résidus catalytiques de la PAD4 et des PAD1
à 3, chez lesquelles ils sont conservés (cf Figure 14). D'ailleurs, le rôle potentiel de ces
résidus a été déterminé expérimentalement grâce à des mutants alanine (D350A, H471A,
D473A et C645A); aucun d'entre eux ne présentait une activité enzymatique détectable en
présence de calcium (Arita et al. 2004).
350 471 473 645PAD 1 D H D C
2 D H D C3 D H D C4 D H D C6 D H D A
Site catalytique : acides aminés
Figure 14 : Site catalytique : composition en acides aminés déterminés par étude cristallographique du complexe PAD4/BA et conservation chez les différentes PAD paralogues humaines 1, 2, 3 et 6. D'après (Arita et al. 2004).
4.3.5. Site actif en forme de sillon
La structure du domaine C-terminal de la PAD4 liée au calcium est presque la
même que celle de la PAD4 complexée à un substrat. Ceci indique donc que la fixation
du substrat n'a pas d'effet sur la formation du site actif en forme de sillon. Au contraire, il
existe de grandes différences conformationnelles dans le domaine C-terminal de la PAD4
"libre" (sans calcium) et celui de la PAD4 liée au calcium. Une surface concave, composée
de nombreux résidus acides, est exposée aux solvants dans la PAD4 "libre" à cause des
résidus Ile313-Ile320, pro338-Met348, Pro371-Pro387, Pro396-Gly403 et Phe633-
His644, hautement désordonnés. Ces mêmes résidus sont bien ordonnés dans l'enzyme
liée au calcium et créent le site actif en forme de sillon après fixation de Ca1 et Ca2.
Introduction
- 85 -
Les changements conformationnels qui s'opèrent autour du site actif, suggèrent
fortement que la fixation de Ca1 et Ca2 à la surface concave acide du domaine C-
terminal est cruciale à la reconnaissance du substrat. Le remplacement d'un des résidus
Gln349, Glu353, Glu411, Asp369 et Asn373, qui sont des ligands de Ca1 et Ca2, par
une alanine, abolit toute activité de l'enzyme. Par contre le remplacement par une alanine
du résidu Asp388, un ligand de Ca4 qui est le plus proche du site actif parmi tous les
autres ligands de Ca3, Ca4 ou Ca5, provoque un baisse de seulement 18% de l'activité
enzymatique. Ainsi, à l'inverse de Ca3, Ca4 et Ca5, Ca1 et Ca2 sont essentiels à la
catalyse.
Cette formation du site actif induite par la fixation de calcium n'a pas été retrouvée
dans d'autres enzymes dépendantes du calcium telles que la transglutaminase 3 ou la
calpaïne (Ahvazi et al. 2002; Khorchid and Ikura 2002), où la fixation d'ions Ca2+ induit
bien des changements conformationnels au niveau du site actif mais ne contribue pas à la
formation du site de fixation du substrat en stabilisant des régions déstructurées. La PAD4
présenterait donc un nouveau mécanisme encore inconnu d'activation enzymatique par
des ions Ca2+ (Arita et al. 2004).
4.3.6. Dimérisation de la PAD4
L’analyse crystallographique suggère que la PAD4 forme des dimères formés par
l’association du domaine N-terminal d'une première molécule avec le domaine C-terminal
de la deuxième et vice versa (cf Figure 15).
Figure 15 Structure de la PAD4 : représentationsous forme de dimère en complexe avec unsubstrat synthétique (benzoyl-L-arginine amide).Les 5 ions Ca2+ (Ca1 – Ca5) sont indiqués sousforme de ronds noirs, et le substrat est représentéen bleu foncé selon le modèle " boules et bâtons". Les sous-domaines 1 et 2 et le domaine C-terminal sont respectivement en jaune, vert etrouge. L'axe cristallographique est orientéverticalement à travers le centre du dimère (Aritaet al. 2004).
Introduction
- 86 -
De plus d'autres analyses ont montré que la PAD4 en solution possède une forme
et taille similaire à celle du dimère formé dans le cristal. Ces résultats illustrent que l'unité
fonctionnelle de la PAD4 est un dimère comme celui formé dans le cristal. La question est
maintenant de savoir si cette forme dimérique est spécifique à la PAD4 ou bien commune
à toutes les PAD, bien que les résidus impliqués dans sa formation soient partiellement
conservés.
4.3.7. Reconnaissance de substrats naturels : les histones
La reconnaissance d'un substrat synthétique artificiel, le BA, par la PAD4 étant
probablement différente de la reconnaissance de substrats physiologiques, le même
groupe a également étudié la reconnaissance moléculaire de protéines cibles naturelles
de l'enzyme, en utilisant comme substrats, les portions N-terminales des histones. Ils ont
ainsi réalisé des cristaux de la PAD4 liée au calcium et en complexe avec 3 peptides
dérivés de la partie N-terminale des histones H3 (2 peptides) et H4 (1 peptide). Les
structures respectives de la PAD4 en complexe avec chacun des 3 peptides sont similaires
les unes par rapport aux autres et également par rapport à la structure précédemment
décrite en complexe avec le BA (cf Figure 16).
Figure 16 : (A) Structure de la PAD4 liée au calcium en complexe avec un peptide de la queue N-terminale de l'histone H3. Les 5 ions Ca2+ (Ca1 – Ca5) sont indiqués sous forme de boules jaunes, et le substrat, le peptide H3, est représenté en vert selon le modèle de Dreiding. Les sous-domaines 1 et 2 et le domaine C-terminal sont respectivement colorés en vert, bleu et rouge. La région correspondant à la NLS est indiquée sous forme de pointillés. (B haut) représentation schématique de la structure montrée en (A). Les couleurs des différents sous-domaines sont les mêmes qu'en (A). Les lignes pointillées représentent les liaisons hydrogènes. (B bas) En référence, la structure de la PAD4 liée au calcium est représentée.
Introduction
- 87 -
Les portions N-terminales des histones sont connues pour être flexibles et dépasser
du cœur du nucléosome (cf Figure 17). Cependant, pour les différents peptides N-
terminaux des histones fixés à la PAD4, 5 résidus amino-acyls successifs, avec en position
centrale le résidu arginyl cible de la PAD4, adoptent une conformation courbée avec une
structure ordonnée. Sur la PAD4, l’Arg-374 établit de multiples liaisons hydrogènes avec
chacun des peptides favorisant ainsi leur courbure. Le rôle important de l’Arg-374 a été
confirmé expérimentalement : son remplacement par une peptidyl-alanine (R374A)
diminue l'activité de l'enzyme vis-à-vis des 3 peptides dérivés de l'histone et du BA à moins
de 6 % de celle de l'enzyme sauvage (Arita et al. 2006).
Figure 17 : Possible changement conformationnel de la portion N-terminale de l'histone au cours de sa citrullination. La portion N-terminale qui dépasse du cœur du nucléosome est représentée sous forme d'un ruban vert et la PAD4 est schématisée comme dans la figure précédente.
Il semble donc important, pour la reconnaissance de l'arginine ciblée par la PAD4,
que le peptide portant le résidu arginyl cible adopte une conformation hautement
désordonnée (destructurée). En effet, l'enzyme reconnait un peptide non structuré / flexible
à la surface moléculaire proche du site actif en forme de sillon, et induit une courbure
proche de celle d'un feuillet β (cf Figure 17). Il serait intéressant de savoir si la citrullination
par la PAD4 entraine le changement de cette "courbure" en une conformation de feuillet β
plus stable via la formation de liaisons (ponts ?) hydrogène provoquant ainsi le relargage
du produit citrulliné de l'enzyme (cf Figure 17).
Introduction
- 88 -
Concernant la spécificité de séquence, à l'inverse de la majorité des enzymes qui
modifient les histones, la PAD4 ne semble pas reconnaitre un résidu amino acyl particulier
de manière séquence-spécifique. D'après les résultats qu'ils ont obtenus, les auteurs ont
proposé que la PAD4 reconnaissent cinq résidus successifs avec comme séquence
consensus "φXRXX" dans laquelle φ représente un acide aminé avec une chaine latérale
petite, et X un acide aminé quelconque. L'enzyme parait en effet peu spécifique de
séquence et peut cibler plusieurs résidus arginyl différents dans les portions N-terminales
des histones.
Les études de la structure cristallographique de la PAD4 permettent donc de mieux
comprendre les interactions de la PAD4 avec ses substrats et constituent un outil très utile
pour le développement d'inhibiteurs de la PAD4 et pourquoi pas d'autres PAD, au moins
des PAD1 à 3, qui présentent des sites catalytique et de fixation au calcium assez
conservés.
4.4. PAD, désimination et processus physiologiques
Les PAD sont exprimées dans la plupart des tissus. En dépit de ce large profil de
distribution qui suggère un rôle important de ces enzymes dans de nombreuses fonctions
biologiques, comme nous l’avons dit, peu de cibles in vivo sont connues et le rôle exact
de ces enzymes reste encore assez obscur.
4.4.1. Désimination et différenciation épidermique
La peau est un organe complexe qui constitue une véritable barrière entre
l'organisme et l'environnement extérieur. L'épiderme, partie la plus externe de la peau, est
un épithélium pluristratifié constitué à 90% de cellules épithéliales, les kératinocytes. Ces
derniers vont migrer de la couche la plus profonde de l'épiderme vers la surface au cours
d'un processus complexe de différenciation qui se traduit par de nombreuses modifications
morphologiques et structurales. Dans les dernières étapes de ce processus, les
kératinocytes vont se transformer en cornéocytes, cellules anucléées, qui, par empilements
successifs, forment la couche cornée. Les différentes couches cellulaires qui composent
l'épiderme se nomment, de la plus profonde à la plus externe : couche basale ou stratum
Introduction
- 89 -
basale (SB), couche épineuse ou stratum spinosum (SS), couche granuleuse ou stratum
granulosum (SG) et couche cornée ou stratum corneum (SC) (cf Figure 18).
Figure 18 : Représentation schématique de l'ultrastructure de l'épiderme (d'après un schéma original de Christian Vincent).
4.4.1.1. Désimination et Facteur naturel d'hydratation
La couche cornée joue un rôle clé dans les fonctions de protection et de barrière
de l'épiderme. Pour assurer cette fonction, la couche cornée doit être hydratée. Le
maintien de cette hydratation dépend de deux facteurs principaux :
- la mise en place, dans les espaces inter-cornéocytaires, d'un matériel lipidique
imperméable à l'eau, ainsi que
- la formation, intra-cornéocytaire, du facteur naturel d'hydratation (FNH).
Ce FNH est formé (pour près de 50%) d'un "pool" d'acides aminés, d'acide
urocanique (dérivé de l'histidine qui participe à l'absorption des rayons ultra-violets), de
dérivés hygroscopiques de divers acides aminés et de lactate. En maintenant l'hydratation
de la couche cornée, le FNH permet à de nombreuses enzymes cornéocytaires d'être
Introduction
- 90 -
actives, et joue un rôle clé dans le maintien de la fonction barrière de l'épiderme. Les
acides aminés et dérivés qui constituent le FNH sont pratiquement tous issus de la
protéolyse d'une seule protéine : la filaggrine (Scott et al. 1982; Rawlings et al. 1994).
4.4.1.1.1. Désimination de la filaggrine et FNH
La filaggrine (filament aggregating protein) est une protéine basique, riche en
histidine, qui appartient à la famille des IFAP (Intermediate Filament Associated Protein).
Comme son nom l'indique, elle s'associe aux filaments intermédiaires de kératines et
permet leur aggrégation sous forme de macrofibrilles qui forment une matrice fibreuse
dense intra-cornéocytaire (Steinert et al. 1981; Dale et al. 1985). Chez l'homme, cette
protéine de 37 kDa est synthétisée tardivement au cours de la différenciation
kératinocytaire sous la forme d'un précurseur, la profilaggrine, constituée de la répétition
de 10 à 12 unités de filaggrine reliées entre elles par de courts peptides de liaison (Gan et
al. 1990). Le gène codant pour la profilaggrine est localisé chez l'homme en 1q21, au
niveau du "Complexe de Différenciation Epidermique" (CDE), locus regroupant plusieurs
gènes codant également pour des protéines exprimées au cours de la différenciation
terminale des kératinocytes.
Le métabolisme de la (pro)filaggrine est complexe (cf Figure 19). La profilaggrine est
une protéine insoluble de haut poids moléculaire (environ 400 kDa) et hautement
phosphorylée. Elle est synthétisée par le kératinocyte granuleux dans lequel elle s'accumule
au niveau des granules de kératohyaline. Au cours de la transition kératinocyte granuleux
/ cornéocyte, la profilaggrine va être déphosphorylée puis les peptides de liaison vont être
clivés séparant ainsi les différentes unités de filaggrine. Les monomères de filaggrine
libérés s'associent alors aux filaments intermédiaires de kératines et permettent leur
aggrégation sous forme de macrofibrilles. Plus tardivement dans la couche cornée, la
filaggrine devient la cible des PAD (Senshu et al. 1996) qui transforment les résidus arginyl
(basique) en résidus citrullyl (neutre) et modifient la charge globale de la protéine. La
filaggrine devient ainsi acide / neutre et perd son affinité pour les filaments intermédiaires
de kératines dont elle se détache. La filaggrine est par la suite totalement dégradée en un
mélange d'acides aminés, composants du FNH.
Introduction
- 91 -
Ainsi, la désimination de la filaggrine pourrait être une étape cruciale permettant sa
protéolyse et donc être indirectement impliquée dans le maintient de l'hydratation de
l'épiderme et sa fonction barrière.
Figure 19 : Représentation schématique du métabolisme de la filaggrine (d'après un schéma original de Cécile Caubet).
Introduction
- 92 -
4.4.1.1.2. PAD impliquées dans la désimination de la filaggrine
Au sein du laboratoire, des analyses par RT-PCR ont permis d'identifier au niveau
de l'épiderme humain, les transcrits de seulement 3 des 5 isotypes de PAD : les PAD1, 2 et
3. Ces résultats confirmés par l'immunodétection des enzymes correspondantes dans des
extraits protéiques d'épiderme humain, à l'aide d'antisérum spécifiques de chaque isotype
produits au sein du laboratoire, montrent que seules ces trois PAD sont exprimées dans
l'épiderme (Guerrin et al. 2003; Nachat et al. 2005). Afin de rechercher la ou les
candidates à la désimination de la filaggrine in vivo, l'activité des PAD 1, 2 et 3 produite
sous forme recombinante active a été mesurée in vitro sur de la filaggrine humaine
recombinante purifiée ou enrichie à partie d'un extrait d'épiderme. Les résultats ont montré
que les 3 isotypes sont capables de désiminer la filaggrine in vitro avec toutefois des
efficacités différentes. En effet, la PAD2 a présenté une activité maximale après seulement
20 min alors que les PAD1 et 3 après respectivement 2 et 19 heures (Mechin et al. 2005).
Des immunomarquages réalisés sur cryocoupes d'épiderme humain, à l'aide des
anticorps dirigés contre les 3 PAD épidermique et d'un anticorps anti-(pro)filaggrine ont
montré que les PAD1 et 2 sont présentes dans tous les kératinocytes vivants alors que
l'expression de la PAD3 est restreinte aux kératinocytes granuleux et aux cornéocytes les
plus profonds. De plus à la différence des PAD1 et 3 qui co-localisent avec la (pro)
filaggrine au sein des kératinocytes granuleux, la PAD2 présente une localisation
péricellulaire. Ainsi, même si la PAD2 parait être la plus efficace pour désiminer la
filaggrine in vitro, du fait de sa localisation, elle ne pourrait être active directement sur la
filaggrine in vivo (Nachat et al. 2005).
En outre, des analyses immuno-structurales ont montré que la PAD1 est présente
dans le cytoplasme des kératinocytes depuis la couche basale jusqu’à la couche
granuleuse, avec un marquage persistant jusqu'à la surface de la peau. Plus précisément,
au sein des kératinocytes granuleux, elle est retrouvée au niveau des filaments
intermédiaires de kératine et dans les granules de kératohyaline où elle co-localise avec la
(pro)filaggrine et, dans la matrice fibreuse des cornéocytes les plus profonds, elle co-
localise avec la filaggrine. Concernant la PAD3, son marquage est plus limité puisqu'elle
n'est présente que dans les kératinocytes granuleux, au sein des granules de kératohyaline,
et dans les cornéocytes les plus profonds au niveau de la matrice fibreuse. Cependant,
Introduction
- 93 -
tout comme la PAD1, elle co-localise avec la (pro)filaggrine dans les granules de
kératohyaline et avec la filaggrine au niveau de la matrice intracornéocytaire (Mechin et
al. 2005).
En conclusion, ces données suggèrent que la PAD1 et la PAD3, même si cette
dernière apparait moins active sur la filaggrine in vitro, sont les enzymes impliquées dans
la désimination de la filaggrine in vivo.
4.4.1.2. Désimination des filaments intermédiaires de kératines
Outre la filaggrine, d'autres protéines sont citrullinées dans l'épiderme. Elles ont pu
être initialement détectées au niveau de la couche cornée et plus faiblement au niveau de
la couche granuleuse de l'épiderme de rat, grâce à l'utilisation d'un anticorps anti-citrulline
particulier. Cet anticorps, développé par T. Senshu et ses collborateurs, reconnait en effet,
des citrullines modifiées chimiquement par un traitement avec du monoxime et de
l’antipiryne dans un mélange très acide (Anti-Modified Citrulline, AMC) (Senshu et al.
1992). Des analyses par gel bi-dimentionnel, ont permis d’identifier des protéines
citrullinées dans des extraits d’épiderme de rat adulte. Elles correspondent, outre la
filaggrine, à des kératines : des variants acides de kératine de 60 kDa, composant
désiminé majoritaire, ainsi qu’un spot minoritaire de kératine désiminée de 55kDa (Senshu
et al. 1995). Cependant, faute d'outils immunologiques disponibles chez le rat,
l’identification précise des kératines désiminées n'avait pu être réalisée. Par la suite, ce
même groupe s’est donc naturellement intéressé à l’analyse des protéines citrullinées
extraites à partir d’épiderme humain. Les protéines désiminées identifiées correspondaient
également à de la filaggrine et à des filaments intermédiaires de kératines :
majoritairement de la kératine K1 partiellement dégradée, liée par des ponts disulfures et,
plus minoritairement des composants dérivés de la kératine K10 (Senshu et al. 1996). Tout
comme chez le rat, ces protéines désiminées ont été détectées dans les cornéocytes, et
beaucoup plus occasionnellement dans les kératinocytes granuleux. L’utilisation d’un
anticorps dirigé contre un peptide désiminé dérivé de la séquence du sous-domaine V2 de
la kératine 1, a enfin permis de localiser plus précisément la kératine 1 désiminée au
niveau des cornéocytes les plus superficiels (Ishida-Yamamoto et al. 2002). De plus,
comme nous l’avons mentionné, les analyses immuno-structurales ont indiqué que seule la
Introduction
- 94 -
PAD1 est présente jusqu’à la surface de la couche cornée (Mechin et al. 2005). La PAD1
est donc probablement l’enzyme qui désimine la kératine 1 dans les étapes les plus
tardives de la différenciation.
Afin de mieux caractériser les sites de désimination de la kératine K1, Senshu et
col. ont analysé sa composition en acides aminés à partir d'une fraction enrichie en
kératine 1 partiellement dégradée, obtenue à partir de couche cornée d'épiderme de
souris. Deux sites préférentiels de désimination ont ainsi été identifiés dans les sous-
domaines globulaires variables V1 et V2 de la kératine 1, situés respectivement aux
extrémités N-et C-terminales. Ces deux domaines variables, très riches en sérine et glycine
pourraient s'organiser en structure "boucle glycine" et posséder des propriétés adhésives
(Steinert et al. 1991; Caubet et al. 2004). La désimination de ces domaines pourrait, via
la modification de charge et/ou de structure qu’elle induit, moduler les interactions de la
kératine 1 avec d'autres kératines par exemple, et donc moduler l'organisation ou la
compaction des filaments intermédiaires de kératine. Même si le rôle exact de la
désimination des kératines dans la différenciation épidermique n'est pas clairement connu,
des défauts de désimination de la kératine 1 ont été observés au cours de deux
pathologies cutanées : le psoriasis et l'érythrodermie congénitale ichtyosiforme bulleuse (cf
paragraphe 4.5.4).
4.4.2. Désimination et différenciation du follicule pileux
Les follicules pileux font partie des mini-organes les plus complexes du corps
humain. Caractéristiques des mammifères, ils sont chargés de produire les poils ou les
cheveux. Ils servent à la fois d'organe sensoriel mais aussi d'instruments de
communication, d'excrétion et de protection. Le follicule pileux est le seul organe des
mammifères à subir tout au long de la vie des cycles de croissance rapide (phase
anagène), de régression (phase catagène) et de repos ou latence (phase télogène) (Krause
and Foitzik 2006) (cf Figure 20).
Introduction
- 95 -
Figure 20 : Représentation schématique des trois phases du cycle du follicule pileux. Bulbe : Bulbe pileux, Bulge : renflement, GEE : Gaine Epithéliale Externe, GEI : Gaine Epithéliale Interne, GS : Glande Sébacée, Ma : Matrice, PD : Papille Dermique, TP : Tige Pilaire. D'après (Tong and Coulombe 2006).
La structure du follicule pileux anagène mature est très complexe.
Anatomiquement, une unité pilo-sébacée se compose de plusieurs couches : une gaine
conjonctive fibreuse, une gaine épithéliale externe (GEE), une gaine épithéliale interne
(GEI) et la tige pilaire (pour plus de détail cf Figure 21). Une glande sébacée et un muscle
arrecteur de poil complètent cette unité.
Introduction
- 96 -
Figure 21 : Représentation schématique de la structure du follicule pileux en phase anagène. D'après (Johnstone and Albert 2002).
La trichohyaline (THH) est la protéine structurale majeure du follicule pileux. Elle est
présente au sein de la gaine épithéliale interne (GEI) et de la médulla, mais on la retrouve
également, dans d'autres tissus épithéliaux spécialisés comme l'épiderme de prépuce
humain, le palais dur ou encore le lit de l'ongle (Tarcsa et al. 1997). La trichohyaline a été
immunohistologiquement repérées sous 3 formes différentes grâce à l'utilisation de 3
anticorps monoclonaux (O'Guin et al. 1992). Ces localisations différentes de la THH
représentent différents stades de maturation de la trichohyaline allant de son
accumumation intiale dans des petites granules de kératohyaline, en passant par le
Introduction
- 97 -
relargage de ces granules, à finalement son association avec les filaments intermédiaires
de kératine au sein de la GEI (couche de henlé et huxley cornifiées) (O'Guin et al. 1992).
Tout comme pour la profilaggrine, le gène codant pour la THH est localisé chez
l'homme en 1q21, au niveau du CDE (Lee et al. 1993) et code pour une protéine de haut
poids moléculaire (près de 248 kDa), hautement insoluble. Des prédictions de sa structure
secondaire ont montré que la THH adoptait une conformation en hélice alpha; deux
paires de courts segments alpha-hélicoïdaux ont été prédits dans les 90 premiers résidus
amino-acyl suivis par une série de segments alpha-hélicoïdaux de 50 à 600 résidus de
long qui couvrent toute la protéine à l'exception d'un domaine carboxy-terminal de 40-50
résidus amino acyl de long (Lee et al. 1993). Au cours de la cornification des différentes
couches de la GEI, la THH va s'associer à elle-même et à d'autres protéines comme les
kératines grâce à des liaisons covalentes catalysées par une transglutaminase (Steinert et
al. 2003). La THH joue en effet un rôle très important dans l'organisation des filaments
intermédiaires de kératine et assure donc le renforcement de la GEI permettant de guider
la croissance directionnelle de la tige pilaire.
La THH est une cible des PAD, et la première protéine porteuse de résidus citrullyl
décrite (Rogers et al. 1977). Des expériences d'hybridation in situ ont permis de mettre en
évidence une co-expression des ARNm de la PAD3 et de la THH à la fois au niveau de la
GEI et de la médulla du follicule pileux (Rogers et al. 1997). De plus un marquage par
immunofluorescence a montré que la PAD3 et la THH co-localisaient au sein des follicules
pileux humains (Kanno et al. 2000). Enfin, des immunomarquages sur cryocoupes de cuir
chevelus, analysés par microscopie confocale ont permis de confirmer précisément la
présence de PAD3 dans le follicule pileux au niveau de la GEI et de la médulla. La PAD1
a également été détectée au niveau de la couche de huxley et de la cuticule de la GEI.
Ces données démontrent donc que la PAD3 est l'enzyme responsable de la désimination
de la THH au niveau de la médulla et de la GEI (Nachat et al. 2005). En outre, il a été
montré in vitro, que la PAD3 humaine recombinante est capable de désiminer la THH
(Kanno et al. 2000).
L’ensemble de ces résultats indique qu'à la fois la PAD1 et la PAD3 participent au
programme de différenciation des follicules pileux (Nachat et al. 2005).
Introduction
- 98 -
Un modèle de maturation de la THH en quatre étapes a ainsi été proposé par
l'équipe de P. Steinert (Tarcsa et al. 1997) (cf Figure 22).
Dans un premier temps, la THH structurée en hélice-alpha s'accumule sous la
forme de granules insolubles (A). Par la suite, l'initiation de la modification de THH à la
périphérie de ces granules par une PAD cytosolique, entraine des modifications de la THH
en une structure "ordonnée", augmentant sa solubilité, et contribuant à la dispersion de la
THH hors des granules (B). Puis, l'augmentation de solubilité de la THH favorise son
accessibilité à la transglutaminase 3 permettant le cross-linking entre molécules de THH
ou, au niveau de la GEI, entre THH et filaments intermédiaires de kératines qui deviennent
alors plus alignés (C). Ces événements résultent en une structure rigide et hautement
insoluble (D).
Dans la médulla, en l'absence de filaments intermédiaires de kératine, le cross-
linking de THH forme des agrégats de protéines dénaturées laissant une structure
vacuolisée à l'intérieur des cellules.
Figure 22 : Modèle de maturation de la THH au sein de la GEI et de la médulla. (A) : accumulation de THH hautement insoluble sous forme de goutellettes (rouge) dispersées parmi les filaments de kératine (vert). (B) : désimination de la THH par une PAD qui augmente sa solubilité (ronds jaunes : THH soluble). (C) : action de transglutaminase sur la THH soluble (traits bleu : cross-linking de THH). (D) : formation d'une structure rigide hautement insoluble. D'après (Tarcsa et al. 1997).
Introduction
- 99 -
4.4.3. Désimination et apoptose
Les ions Ca2+ jouent un rôle important dans les événements de signalisation
précoces conduisant à l'apoptose. Ainsi, des ionophores calciques tels que par exemple la
ionomycine, facilitant l'influx de calcium du milieu extracellulaire vers le cytosol, sont
connus pour induire l'apoptose dans de nombreux types cellulaires (Tombal et al. 2002).
De façon intéressante, plusieurs études se sont intéressées aux protéines citrullinées au
cours de l'apoptose induites par influx calcique. En effet, le traitement d'une lignée de
kératinocytes de rat par la ionomycine en présence de calcium, s'accompagne de
l'apparition d'une protéine citrullinée de 70 kDa localisée à la périphérie de noyaux
apoptotiques (Mizoguchi et al. 1998). De la même façon, dans des macrophages
péritonéaux de souris, l'influx calcique provoqué après traitement à la ionomycine induit la
désimination de vimentine qui a également été localisée à la périphérie de noyaux
"arrondis", signe morphologique précoce d'apoptose (Asaga et al. 1998). Enfin, le même
traitement à la ionomycine, en présence de calcium, de monocytes humains purifiés ou de
macrophages différenciés ex vivo, active la citrullination de protéines, identifiées après
immunoprécipitation comme étant de la vimentine ou des produits de dégradation de
vimentine citrullinée (Vossenaar et al. 2004). Dans toutes ces études, la désimination de
ces protéines est probablement la conséquence de l'activation d'une PAD, causée par
l'influx calcique provenant du milieu extracellulaire. En effet, aucune désimination
significative n'a été observée dans les cellules également traitées à la ionomycine mais
dans un milieu sans calcium (Asaga et al. 1998).
Toutefois, même si l'activation des PAD et la citrullination semblent liées à l'influx
calcique, et donc étroitement à l'apoptose, l'important est de déterminer si elles en sont
une des causes ou bien simplement une conséquence. A cet égard, il est intéressant de
mentionner qu’une étude récente a évalué l’effet de la surexpression de PAD4 sur la
viabilité cellulaire (Liu et al. 2006). Ainsi, la transfection de cellules HL-60 ou jurkat par un
plasmide codant pour PAD4, entraîne une diminution de la viabilité de ces cellules de
façon dose- et temps-dépendant(e). La surexpression de PAD4 provoque l'arrêt des cellules
en phase G1 du cycle cellulaire avant leur entrée en apoptose. De plus, la PAD4
provoque une augmentation de l’expression de p53, protéine indispensable au maintien
de l’intégrité de la cellule et de ses composants, mais aussi d'autres molécules telles que
Introduction
- 100 -
p21, intervenant dans le contrôle du cycle cellulaire, ou encore Bax impliqué dans le
relargage de cytochrome c de la mitochondrie vers le cytosol, et dans l'activation de la
voie des caspases (Liu et al. 2006). Comment la surexpression de PAD4 favorise-t-elle la
mort des cellules par apoptose ? Plusieurs explications et/ou hypothèses sont possibles. La
première serait que la PAD4 via la désimination des histones et la modification de la
confomation de la chromatine (cf paragraphe 4.4.4.2), puisse provoquer des dommages
de l'ADN et ainsi l'accumulation de p53. En retour p53 pourrait contrôler l'arrêt du cycle
cellulaire, via l'activation de la transcription de gènes en aval tel que p21, ou au niveau
du cytosol interagir avec des partenaires impliqués dans les voies apoptotiques. Une autre
hypothèse serait basée sur la citrullination des filaments intermédiaires de vimentine. En
effet, la citrullination de protéines des filaments intermédiaires telle que la vimentine, mais
aussi la desmine, interfère avec leur polymérisation. De plus, la citrullination directe de
filaments intermédiaires de vimentine ou de desmine favorise leur désassemblage (Inagaki
et al. 1989). Cet effet sur la désorganisation du réseau de filaments intermédiaires
pourrait favoriser certaines manifestations morphologiques observées au cours de
l'apoptose telles que l'arrondissement des cellules ou la désorganisation de la membrane
plasmique (Byun et al. 2001).
Même si la PAD4, ou du moins sa surexpression, semble être impliquée dans des
événements apoptotiques, aucune information n'a été donnée concernant l'effet de cette
surexpression sur la désimination d'un point de vue quantitatif et qualitatif. Dans ce
modèle, l'identification exacte des protéines ciblées par l'enzyme ainsi que leur implication
dans la cascade apoptotique restent encore à préciser.
4.4.4. Désimination et régulation génique
4.4.4.1. Généralités
Chez les eucaryotes, l'ADN est compacté
sous forme de chromatine à l'intérieur d'un
compartiment séparé de la cellule (le noyau).
L'unité de base fondamentale de ce compactage
est le nucléosome, dans lequel environ 146 pb
Introduction
- 101 -
d'ADN double hélice s'enroulent (1 tour ¾) autour d'un octamère protéique composé de 2
copies de chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4. A l'aide d'une cinquième histone,
H1, des états chromatiniens encore plus condensés peuvent se former allant jusqu'au
chromosome mitotique, compact et individuel. Dans les cellules en interphase, la
chromatine apparaît distribuée dans le noyau et organisée en régions "condensées"
(Hétérochromatine) et en régions plus ouvertes, "décondensées" (Euchromatine). Ces
différents états de la chromatine modulent l'accessibilité de la chromatine à diverses
réactions biochimiques telle que la transcription par exemple (Felsenfeld and Groudine
2003). Deux types de complexes protéiques peuvent être recrutés pour modifier la
structure de la chromatine :
- les complexes ATP-dépendant qui peuvent faire déplacer les nucléosomes et ainsi
exposer ou cacher des séquences ADN en les rendant donc plus ou moins accessibles et
- les complexes qui modifient de façon covalente les nucléosomes, notamment
certains résidus des extrémités amino-terminales des histones, ce qui aboutit à une
chromatine plus ouverte ou plus condensée selon le type de modifications subies (Narlikar
et al. 2002). Il a été proposé que la nature et la combinaison des modifications post-
traductionnelles que subissent les histones formaient un "code", le code des histones, qui
serait traduit en un état chromatinien particulier (actif, permissif, restrictif ou inactif) et
pourrait donc être impliqué dans la régulation de l'expression génique (Jenuwein and Allis
2001). Les principales modifications connues des histones sont : l'acétylation, la
méthylation, la phosphorylation et l'ubiquitinylation (cf Figure 23)
Introduction
- 102 -
Figure 23 : Modifications des histones. Ce schéma illustre les portions N-terminales à la surface ou à l'intérieur du cœur du nucléosome, de chacune des histones (H2A, H2B, H3 et H4). Chaque modification post-traductionnelle est représentée par une couleur et est annotée à coté de la position de l'acide aminé concerné. On note que les histones peuvent être acétylée (Ac), ubiquitinylées (Ub), méthylées (Me) et phosphorylées (P). D'après (Felsenfeld and Groudine 2003).
4.4.4.2. Rôle de la PAD4 dans la régulation transcriptionnelle
Les modifications des portions N-terminales des histones sont dynamiques. Par
exemple, les niveaux d'acétylation et de phosphorylation des histones dans la cellule sont
le résultat d’un équilibre entre réactions contraires catalysées respectivement par, des
couples d’enzymes acétylase/désacétylase et kinase/phosphatase. De même, la
méthylation de résidus arginyl et lysyl est également régulée de manière dynamique bien
que jusqu'en 2004 aucun mécanisme antagoniste à la méthylation n'ait encore été mis en
évidence (Bannister et al. 2002). La découverte très récente que la PAD4, isotype
nucléaire, était capable de désiminer les histones H2A, H3 et H4 (Nakashima et al. 2002)
a fortement suggéré que cette enzyme pourrait agir en tant que que co-régulateur de la
transcription. Ainsi, la combinaison de techniques protéomiques a permis de déterminer
les sites, in vivo, de la citrullination qui s'opère dans les portions N-terminales des histones
H2A, H3 et H4 : il s’agit de l’Arg3 des histones H2A et H4, et des Arg2, 8, 17 et 26 de
Introduction
- 103 -
l'histone H3 (Cuthbert et al. 2004; Wang et al. 2004; Hagiwara et al. 2005). De plus,
deux des études correspondant à ces résultats ont confirmé l'action de co-régulateur de la
transcription de PAD4. Par exemple, Wang et col. (Wang et al. 2004) ont mesuré les effets
de la transfection de quantités croissantes de constructions codant pour la PAD4 dans des
cellules MCF7, cellules épithéliales d'adénocarcinome de glandes mammaires, sur la
transcription d'un gène rapporteur codant pour la luciférase en aval d’un promoteur activé
par les oestrogènes. Dans ces expériences, la PAD4 agit clairement en tant que répresseur
transcriptionnel de façon dose-dépendante, l'activité catalytique de l'enzyme étant
nécessaire à cette fonction. De plus, Cuthbert et col. (Cuthbert et al. 2004) ont montré,
dans la lignée de cellules épithéliales rénales transformées 293T, que la PAD4 pouvait
également agir comme co-répesseur transcriptionnel sur un promoteur endogène, celui du
VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A). En effet, à l'inverse d'un mutant inactif, la
PAD4 "sauvage", ciblée sur le promoteur VEGF-A, peut réprimer l'activation
transcriptionnelle de ce gène induite en réponse à une hormone ovarienne (oestradiol) ou
thyroïdienne (T3).
Dans ces deux études, des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP)
ont été réalisées dans des cellules MCF-7 traitées à l'oestradiol et exprimant la PAD4. Les
résultats obtenus ont permis de démontrer que la PAD4 est constitutivement associée au
promoteur pS2, son niveau augmentant après l'ajout d'oestradiol pour revenir par la suite
à des taux basaux. Avec la même cinétique, la quantité de citrulline présente dans les
portions N-terminales des histones H3 et H4 augmente puis diminue. Les niveaux de PAD4
et des histones citrullinées sur le promoteur pS2 corrèlent aussi avec sa fonction présumée
de corépresseur transcriptionnel puisque les niveaux de RNA polymérase II sur ce
promoteur sont élévés quand les taux de PAD4 et d'histones citrullinées sont bas et vice
versa. Ces résultats démontrent donc que la PAD4 est un corégulateur de la transcription.
Ses effets répresseurs sur la régulation génique sont probablement dus à sa capacité à
catalyser la désimination de résidus spécifiques présents dans les portions N-terminales
des histones H3 et H4 (et probablement H2A).
Les récepteurs hormonaux nucléaires, activent la transcription via le recrutement de
multiples coactivateurs au niveau des promoteurs de gènes cibles spécifiques. La méthyl-
transférase CARM1, outre l'histone H3, est capable de méthyler, entre autres, le
Introduction
- 104 -
coactivateur p300. En plus de la région N-terminale de p300, CARM1 cible également
l’Arg-2142, située dans son domaine C-terminal de fixation à GRIP1 (GRIP1 binding
domain, GBD). Dans ce GBD, à la fois l’Arg-2088 et l’Arg-2142 sont importants pour la
fixation de GRIP1. La méthylation de l’Arg-2142 empêche l'interaction bi-moléculaire de
GRIP1 à p300 in vitro et in vivo. La PAD4 est capable, in vitro, de catalyser la citrullination
du GBD de p300, et donc d'avoir un effet antagoniste sur la méthylation de ce domaine
en favorisant l'interaction de p300 à GRIP1. Ceci suggère que, en plus de la citrullination
des histones, la désimination de corégulateurs transcriptionnels pourrait participer à la
fonction de "corépresseur transcriptionnel" de la PAD4 (Lee et al. 2005).
4.4.4.3. La PAD4 catalyse-t-elle la déméthylimination?
En plus de la citrullination, les résidus arginyl des portions N-terminales des
histones H3 et H4 sont alternativement monométhylées et diméthylées de façon
asymétrique. Ces méthylation sont catalysées par des protéines-arginine-methyl-
transférases (PRMT) de type I : PRMT1 et CARM1 (PRMT4), capables de former des
peptidyl-arginines monométhylées (mono-methylarginine, MMA) et des peptidyl-arginines
diméthylées de façon asymétrique (asymmetric dimethylarginine, ADMA). Les PRMT de
type II, quant à elles, catalysent la formation de peptidyl-MMA et de peptidyl-arginines
diméthylées de façon symétrique (symmetric dimethylarginine, SDMA) (cf Figure 24).
Introduction
- 105 -
Figure 24 : Méthylation de peptidyl-arginine (Peptidyl-Arg). Structure moléculaire des peptidyl-Arg, peptidyl-arginine monométhylée (peptidyl-MMA), peptidyl-arginine diméthylée de façon asymétrique (peptidyl-ADMA) et symétrique (peptidyl-SDMA). Les protéines-arginine-méthyl-transférases (PRMT) de type I et II catalysent respectivement la formation de peptidyl-ADMA et peptidyl-SDMA. D'après (Thompson and Fast 2006).
De façon intéressante, les sites de désimination par la PAD4, se superposent aux
sites de méthylation des arginines. Par exemple, CARM1 méthyle les résidus Arg2, 17 et
26 dans l'histone H3 et PRMT1 méthyle le résidu Arg3 dans l'histone H4. Ces enzymes
agissent en tant que co-activateurs transcriptionnels pour de nombreux facteurs de
transcription (comme par exemple le récepteur aux œstrogènes), et leur activité
méthyltransférase est nécessaire à cette fonction.
Cette superposition des sites de désimination et méthylation renforce l'idée de
Bannister et col. (Bannister et al. 2002) selon laquelle la PAD4 pourrait contrecarrer la
fonction de "coactivateur transcriptionnel" assurée par les methyltransférases en
convertissant des peptidyl-MMA en peptidyl-citrulline avec relargage de méthylamine (cf
Figure 25). Cette réaction, catalysée par la PAD4, et qualifiée de réaction de
"déméthylimination", nécessite la reconnaissance d'arginines méthylées comme substrats,
mais ne constitue pas une "réelle" modification inverse puisque le produit final n'est pas
une peptidyl-arginine mais une peptidyl-citrulline. La véritable réversibilité par une arginine
Introduction
- 106 -
déméthylase n'a jamais encore été découverte, mais la PAD4 est capable de supprimer
toute marque de méthylation introduite par une méthyltransférase.
Figure 25 : Réaction de déméthylimination.
Dans les expériences de ChIP réalisées dans les cellules MCF-7 en réponse à
l’oestradiol, l'apparition de citrulline sur à la fois l'histone H3 et l'histone H4 au niveau du
promoteur pS2 corrèle avec des quantités décroissante d’ADMA. De la même façon, les
quantités d'histones méthylées : H3 Arg 17 et H4 Arg3 sont réduites dans les granulocytes
HL60 (connus pour exprimer la PAD4), après traitement avec un ionophore calcique
(Wang et al. 2004). La disparition de ces épitopes corrèle avec l'apparition de citrulline sur
les histones H3 et H4.
Bien que in vivo les résultats apparaissent être en faveur d'une activité de
déméthylimination de la PAD4, les études in vitro le sont moins, et dans la plupart des cas,
même contradictoires. Par exemple, Kearney et col. (Kearney et al. 2005) ont évalué la
capacité de plusieurs petites molécules et peptides contenant des MMA, ADMA et SDMA à
être des substrats de la PAD4. Même si ces composants sont déméthyliminés par la PAD4,
la vitesse de la réaction est beaucoup plus lente que celle de désimination des peptidyl-
arginines correspondantes non méthylées, de l'ordre de 150 à 20 000 fois plus. En outre,
la réaction de déméthylimination catalysée par la PAD4 in vitro est ~ 1000 fois plus lente
que la réaction de méthylation de résidus arginyl dans l'histone H3 catalysée par CARM1
(Schurter et al. 2001); ceci fait donc de la PAD4 une déméthyliminase relativement peu
efficace. Des résultats similaires ont été rapportés par différents groupes. Hidaka et col.
(Hidaka et al. 2005) ont démontré que des dérivés synthétiques de l'arginine sous forme
méthylée ne sont ni de bons substrats ni de bons inhibiteurs de PAD4. De même Cuthbert
Introduction
- 107 -
et col. (Cuthbert et al. 2004) ont montré que des peptides contenant des ADMA ou SDMA
ne sont pas déméthyliminés par la PAD4. Enfin, Raijmakers et col. (Raijmakers et al. 2007)
ont étudié l’activité de déméthylimination de plusieurs PAD, in vitro, sur des peptides
synthétiques dérivés des histones H3 et H4, de la protéine MOG (Myelin oligodendrocyte
glycoprotein) et de la filaggrine, contenant des peptidyl-Arg, ou des peptidyl-MMA,
peptidyl-SDMA ou encore peptidyl-ADMA. Ils ont montré que, les hPAD2, hPAD3 et
hPAD4 recombinantes ne pouvaient convertir en peptidyl-citrulline que des peptidyl-
arginine non méthylées. Ils ont obtenu des résultats similaires avec des extraits préparés à
partir de plusieurs échantillons de tissus murins (muscle, rate et cerveau) connus pour
contenir une activité PAD. En outre et de la même façon, les auteurs ont examiné la
composition en acides aminés d’échantillons d’histones bovines totales, après incubation
avec les différentes hPAD recombinantes. A l’inverse des niveaux d’arginine qui diminuent
significativement et ceci de façon concomitante à des quantités croissantes des niveaux de
citrulline, les taux de peptidyl-MMA ne varient pas après traitement avec une PAD.
Ainsi, la méthylation des peptidyl-arginines semble interférer avec la désimination
puisque les PAD ne semblent pas être capables de convertir des peptidyl-MMA en
peptidyl-citrulline dans le contexte de peptides synthétiques ou d’extraits d’histones. Ainsi,
la citrullination des histones observée dans les cellules vivantes pourrait avoir une fonction
antagoniste à la méthylation, non pas par "déméthylimination" mais par le simple fait
qu’elles privent les méthyltransférase de leur substrat en transformant les peptidyl-arginines
en peptidyl-citrullines.
4.5. PAD, désimination et pathologies autres que la PR
Les PAD ou certains de leurs substrats protéiques ont été associés à des maladies
humaines. Dans ce chapitre nous discuterons de l'implication ou du rôle des PAD et de la
désimination dans différentes pathologies parmi lesquelles la sclérose en plaque, la
maladie d'Alzheimer ou encore le cancer.
4.5.1. Maladies neurodégénératives
Le système nerveux de tous les mammifères est divisé en deux parties : le système
nerveux central (SNC) et le système nerveux périphérique (SNP). Le SNC comprend les
Introduction
- 108 -
parties du système nerveux enfermées dans des structures osseuses : l'encéphale (cerveau,
cervelet et tronc cérébral) et la moelle épinière. Dans ce paragraphe, je traiterai de 2
maladies neurodégénératives touchant le SNC : la sclérose en plaque et la maladie
d'Alzheimer.
4.5.1.1. La Sclérose en plaque
La sclérose en plaque (SEP) est une affection inflammatoire démyélinisante du SNC.
Elle est un peu plus fréquente chez la femme que chez l'homme et débute généralement
entre 20 et 40 ans. Habituellement, la SEP évolue par poussées donnant lieu à des lésions
disséminées dans le temps et dans l'espace. Elle s'accompagne de troubles sensitifs,
moteurs ou sensoriels pouvant conduire à un handicap important. Le déclenchement de la
SEP semble dépendre de nombreux facteurs à la fois génétiques, environnementaux
(viraux) et immunologiques. Toutefois, même si l'origine précise de la maladie n'est pas
vraiment connue, la cause des troubles moteurs ou sensoriels est tout à fait claire. La SEP
affecte en effet, la gaine de myeline qui entoure certains groupes d'axones situés dans la
substance blanche au niveau du SNC.
La conduction de l'influx nerveux est plus rapide dans les axones de gros diamètre.
Ces axones prenant beaucoup de place, les vertébrés ont développé une autre façon
d'augmenter la vitesse de conduction de l'influx nerveux : en isolant l'axone au moyen
d'une gaine de myéline. Cette gaine n'est pas continue sur toute la longueur de l'axone.
Elle est interrompue à intervalles réguliers tous les 0.2 à 2 mm (selon le diamètre de
l'axone) par les nœuds de Ranvier où se concentrent les canaux sodiques dépendant du
potentiel d'action (cf Figure 26).
Introduction
- 109 -
Figure 26 : Représentation d'un oligodendrocyte.
La myéline est constituée de plusieurs enroulements de membranes produits par
des cellules gliales : les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. La distinction entre
oligodendrocytes et cellules de Schwann est essentiellement due à leurs localisations
différentes (SNC et SNP respectivement) et au fait qu'un oligodendrocyte contribue à la
formation de la myéline de plusieurs axones, alors que la cellule de Schwann ne myélinise
qu'un seul axone (Mark F. Bear 2002).
La myéline est un composant essentiel de la substance blanche au sein du SNC.
Elle est constituée en majorité de lipides (cholestérol, phospholipides et glycolipides) et de
protéines qui représentent respectivement ~ 70% et 30% du poids sec de la myéline. Les
deux catégories de protéines majoritaires au sein de la gaine de myéline dans le SNC, les
Introduction
- 110 -
protéolipoprotéines (PLP) et la protéine basique de la myéline (MBP) constituent 80% des
protéines totales (50% et 30 % respectivement).
La MBP est traduite à partir de différents ARNm produits par de nombreux
épissages alternatifs d'un seul ARNm. Chez la souris, le gène de la MBP comprend 7
exons numérotés de I à VII, et il existe 5 isoformes provenant de différents épissages. Chez
l'homme la structure du gène est similaire à celui de la souris et 4 isoformes sont formées
de 21.5, 20.2, 18.5 et 17.2 kDa (cf Figure 27)(Harauz et al. 2004)
Figure 27 : Variants d'épissage du gène codant pour la MBP chez la souris (A) et chez l'homme (B) et isoformes correspondantes. (Harauz et al. 2004).
Le terme de "MBP" désigne généralement l'isoforme de 18.5 kDa, qui est l'une des
protéines les plus abondantes des gaines de myéline du SNC chez l'adulte. Cette isoforme
comprend 170 acides aminés dont 19 résidus arginyl et 12 résidus lysyl qui lui confèrent
son caractère extrêmement basique (pI>10). Elle n'a jamais pu être cristallisée du fait
qu'elle existe sous forme de très nombreux isomères de charge, résultant d'une myriade de
modifications post-traductionnelles telles que l'acétylation (en N-terminal), la
phosphorylation, la méthylation, l'ADP-ribosylation, la déamidation ou encore la
citrullination, qui ajoutent encore de la diversité à la famille "MBP". Ces isomères de
charge, ou composants de charge de la MBP humaine (hMBP) ont été isolés à partir des
protéines basiques extraites de cerveau humain sain puis séparés par chromatographie sur
colonne échangeuse de cations (CM52) et nommés de C1 à C8 (Wood and Moscarello
1989). L'isomère C1 (hMBP/C1) est le plus cationique et aussi le moins modifié
Introduction
- 111 -
contrairement au composant C8 (hMBP/C8) qui est le plus modifié et le moins cationique
et les composants C1 à C5 diffèrent par la perte successive d'une charge positive.
Une modification post-traductionnelle qui semble jouer un rôle important au cours
de la SEP est la citrullination. La présence de citrulline au sein d'un extrait brut de MBP,
obtenu à partir de myéline humaine saine, fut pour la première fois décrite par l'équipe de
Moscarello en 1971 (Finch et al. 1971). A chaque isomère de charge correspond un état
de citrullination: hMBP/C1 correspond à l'isoforme non-citrullinée (hMBP-Cit0) et
hMBP/C8 correspond à l'isoforme comprenant au moins 6 résidus citrullyl (Wood and
Moscarello 1989). Durant le développement du cerveau humain, la proportion de MBP
citrullinée (C2 à C8) par rapport à la MBP totale (C1 à C8) varie. Ainsi, jusqu'à l'âge de 2
ans, 100% de la MBP est citrullinée. A partir de 4 ans ce pourcentage diminue à 20% et
reste stable jusqu'à l'âge adulte. Ce taux varie de nouveau au cours de la SEP, où 45% de
la MBP totale est citrullinée voire même 100% au cours du syndrome de Marburg, un cas
rare de SEP aiguë (Moscarello et al. 1994). Ainsi, chez un individu sain adulte, la forme
citrullinée majoritaire comprent 6 résidus citrullyl (hMBP-Cit6) et le ratio de C8/C1 est de
0.82 alors que, chez un patient atteint de SEP, ce ratio atteint 2,45, un ratio similaire à
celui observé dans un cerveau de très jeune enfant, ce qui a conduit à qualifier
d’" immature " la myéline des patients atteints de SEP (Moscarello et al. 1994). Au cours
du syndrome de Marburg, une hMBP presque totalement citrullinée (18/19 résidus arginyl
affectés), nommée hMBP-Cit18 est observée et représenterait une forme de MBP encore
plus immature. Le ratio C8/C1 est alors égal à 6,7 soit près de 8 fois plus qu'en situation
adulte normale (Wood et al. 1996).
Au cours du modèle de SEP que constitue l’encéphalomyélite auto-immune
expérimentale chez la souris, aucune hausse du taux de MBP citrullinée n'a été constatée,
laissant suggérer que l'inflammation cérébrale elle-même n'est pas la cause de la
désimination de la MBP (Mastronardi et al. 1996). Par contre, dans un autre modèle de
SEP, obtenu spontanément dans une lignée de souris transgéniques (ND4) comportant 70
copies d'un transgène codant pour une PLP (DM20) (Mastronardi et al. 1993), une
augmentation de la quantité de PAD associée à la myéline précèdant une augmentation
de la citrullination de la MBP ainsi que les premiers signes cliniques de démyélinisation a
été mise en évidence (Moscarello et al. 2002). Il a ainsi été proposé par Moscarello et
Introduction
- 112 -
col., que cette apparition de MBP citrullinée chez les patients atteints de SEP, ne soit pas
liée à une augmentation d'une activité PAD existante mais plutôt associée à une
augmentation de la quantité d'enzyme PAD présente.
Les effets de la désimination sur la structure protéique et les interactions protéines-
lipides au sein de la myéline sont divers. La citrullination de la MBP réduit sa charge
positive nette, perturbant ainsi ses interactions avec elle-même et avec les phospholipides
(phosphatidylsérine) chargés négativement. En effet, la citrullination de la MBP diminue sa
capacité à agréger in vitro des vésicules lipidiques (Wood and Moscarello 1989;
Mastronardi et al. 1996; Boggs et al. 1997), causant même leur fragmentation, en ce qui
concerne la forme MBP-Cit18 (Boggs et al. 1999). De même, les propriétés d'auto-
assemblage et d'organisation ou d'interaction de la MBP citrullinée avec des couches
lipidiques sont altérées (Beniac et al. 2000; Ishiyama et al. 2001). De plus, la MBP
citrullinée est plus sensible à la digestion par des protéases telles que la Cathepsine D,
une metalloprotéinase clivant les liaisons Phe-Phe au sein des protéines. En effet, la forme
MBP-Cit18 est digérée 45 fois plus vite que la MBP-Cit0 par la Cathepsine D,
probablement parce que la citrullination influe sur la conformation de la MBP et lui
confère une structure plus ouverte et plus accessible à la protéase (Pritzker et al. 2000).
Les auteurs ont alors proposé que la citrullination en favorisant la dégradation de
la MBP, participe à la genèse de peptides qui sensibiliseraient des lymphocytes T et
permettrait le développement d'une réponse auto-immune anti-MBP dans la SEP. Des
auto-anticorps et des lymphocytes T dirigés contre la MBP avaient déjà été décrits dans le
sérum et le liquide céphalorachidien de patients atteints de SEP (Ota et al. 1990; Reindl et
al. 1999). Des lymphocytes T spécifiques des formes citrullinées de MBP ont également été
décrits mais ces résultats n'ont jamais été reproduits (Tranquill et al. 2000). Enfin, aucune
différence significative n’existe entre les titres d'auto-anticorps anti-MBP citrullinée dans la
SEP et ceux retrouvés chez des individus contrôles sains ou atteints d'autres désordres
neurologiques (de Seze et al. 2001).
A noter aussi que le taux de GFAP citrullinée augmente chez les patients atteints de
SEP (Nicholas et al. 2004) bien qu’on n’ait pas encore à ce jour une idée précise de la
façon dont ce phénomène pourrait avoir une incidence sur la maladie.
Introduction
- 113 -
Au sein du cerveau, la seule PAD mise en évidence au niveau ARNm et protéique
est la PAD2 (Ishigami et al. 2005; Nachat et al. 2005). La PAD2 semble donc être
l'isotype impliqué dans la désimination de la MBP (et de la GFAP) au sein du SNC. Chez
le rat, son expression est augmentée dans les cellules microgliales activées suite à une
neurodégénérescence induite par le kainate, un analogue cyclique du glutamate (Asaga et
al. 2002). II a été montré que le paclitaxel (ingrédient actif du taxol) est capable d'inhiber
l'activité de la PAD2 isolée et purifiée à partir cerveau de bœuf dans des essais in vitro
(Pritzker and Moscarello 1998). Or, dans le modèle de souris transgénique DM20 décrit
auparavant, un traitement par du paclitaxel atténue les signes cliniques de démyélinisation
spontanée et induit même une remyélinisation (Moscarello et al. 2002). Des thérapies
visant à inhiber la PAD2 pourraient donc présenter un grand intérêt dans la SEP.
Tout comme dans la PR, les gènes PADI sont des gènes candidats pour la
prédisposition à la SEP. En effet, Deux analyses systématiques du génome (études de
liaisons) ont révélé l'existence possible d'une facteur génétique de la SEP dans la région du
chromosome 1 où se situe le locus des gènes PADI (en 1p36) (Dyment et al. 2004;
Kenealy et al. 2004). Une seul étude familiale portant exclusivement sur le gène PADI4 a
été effectuée, mais n'a pas permis de mettre en évidence une quelconque implication de
ce gène dans la prédisposition à la SEP (Tommasi et al. 2006). Cependant des études
réplicatives et des études portant sur les autres gènes codant pour les autres isotypes de
PAD et en particulier PADI2 doivent être réalisées afin de pouvoir conclure définitivement
sur l'implication ou non d'un ou plusieurs gène(s) PADI dans la susceptibilité à la SEP.
4.5.1.2. Maladie d'Alzheimer
La démence correspond à une altération progressive de la mémoire et de
l'idéation, suffisamment marquée pour handicaper les activités de la vie quotidienne. La
prévalence de la démence est ~ 1% chez des individus âgés de 60 à 64 ans et augmente
de façon quasi-exponentielle avec l'âge puisque chez les sujets âgés de 85 ans ou plus, la
prévalence est ~ 24%. La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de
démence (50 à 60% des cas). La MA est une démence neurodégénérative qui résulte de
l'installation progressive, et irréversible, de 2 types de lésions dans l'ensemble du cortex
cérébral : les plaques séniles (PS) et les dégénérescences neurofibrillaires (DNF).
Introduction
- 114 -
Les PS sont des lésions extracellulaires constituées de dépôts d'une protéine amyloïde
colorable au rouge Congo : la protéine bêta-amyloïde (Aβ). Les DNF, quant à elles,
correspondent à des inclusions intraneuronales formées par l'agglutination de
neurofibrilles du cytosquelette sous la forme de filaments hélicoïdaux, le principal
constituant étant une isoforme anormalement phosphorylée de la protéine TAU (tubuline
associated units). Ces lésions caractéristiques mais non spécifiques de la MA conduisent
progressivement à la mort des neurones, entraînant ainsi l'apparition des signes cliniques
de perte de mémoire, puis de démence (Blennow et al. 2006).
Dans des extraits de cerveaux humains d’individus sains, les protéines citrullinées
sont faiblement détectables alors que la PAD2 est bien présente. Par contre, dans des
extraits de cerveaux de patients atteints de la MA, des protéines citrullinées s'accumulent,
et ceci en parallèle d'une activation également anormale de la PAD2 (Ishigami et al.
2005). L’analyse par électrophorèse 2D et spectrométrie de masse des protéines
citrullinées de la région hippocampe du cerveau de patients a permis d'identifier 2
protéines citrullinées : la vimentine et la GFAP. Les auteurs de ce travail ont également
montré la présence de MBP citrullinée en quantité nettement accrue par rapport à la
même zone provenant de cerveaux sains (Ishigami et al. 2005). Il apparaît donc que
l’acroissement du niveau citrullination observé au cours de la SEP correspond à un
évènement non spécifique, probablement commun aux phénomènes de
neurodégénérescence.
Ces résultats sont concordants avec les travaux précédemment évoqués et réalisés
par le même groupe, où l’administration systémique de kainate à des rats induisait une
neurodégénérescence. En effet, dans ces conditions, diverses protéines citrullinées
apparaissent dans les régions de neurodégérescence ce qui laisse suggérer que la PAD2 y
est localement activée (Asaga and Ishigami 2001). Dans ce même modèle, la PAD2
semble activée très tôt dans le processus de neurodégénérescence : elle est
spécifiquement et abondamment exprimée dans les cellules microgliales activées. Par
contre elle est absente des astrocytes hyperplasiques qui s’installent secondairement au
site lésionnel, suggérant une régulation négative ou une suppression de son expression
(Asaga et al. 2002).
Introduction
- 115 -
Le ou les mécanisme(s) par le(s)quel(s) la citrullination de protéines a lieu au sein
de l'hippocampe de patients atteints de la MA n’a pas été encore formellement exploré.
Au vu des résultats obtenus chez le rat, l'hypothèse la plus probable serait que la PAD2
soit présente de façon abondante et fonctionnellement active seulement chez les patients
avec la MA. En effet, au cours de la MA, l’expression de PAD2 augmente de façon
notable au niveau de l'hippocampe et, bien que la PAD2 soit également présente dans
des extraits hippocampaux de sujets sains, l'enzyme semble y être inactive. Chez les
patients atteints de la MA, cette activation est probablement liée à une augmentation de la
concentration calcique intracelullaire provoquée par un influx calcique extracellulaire dû
aux dommages astrogliaux, cet influx ayant été décrit in vitro dans des cultures primaires
d'astrocytes (Haun et al. 1992).
4.5.2. Glaucome primaire à angle ouvert
Le terme de glaucome regroupe un ensemble de neuropathies optiques ayant
comme caractéristique commune une dégénérescence lente et progressive des cellules
ganglionnaires de la rétine et de ses axones. La forme de glaucome la plus commune est
le glaucome chronique ou glaucome primaire à angle ouvert (GPAO). Les bases
biologiques de la maladie ainsi que les facteurs contribuant à sa progression ne sont pas
complètement caractérisés. Le seul facteur de risque connu traitable est une pression intra-
oculaire pouvant être plus élevée et conduire à des dommages du nerf optique. Le
glaucome en général affecte environ 66 millions d'individus dans le monde, dont au
moins 6,8 millions atteints de cécité bilatérale. En effet, le glaucome est la seconde cause
de cécité, la perte de vision associée à cette maladie étant irréversible (Weinreb and Khaw
2004). Afin d'avoir un aperçu moléculaire plus précis du GPAO, une étude protéomique a
été réalisée qui comparait les nerfs optiques d'individus sains et atteints de glaucome
(Bhattacharya et al. 2006). Initialement, les auteurs avaient, par des méthodes de
protéomiques classiques, détecté la PAD2 dans des nerfs optiques de patients atteints de
GPAO mais pas de donneurs sains. Des analyses plus « quantitatives » complémentaires
par immunotransfert et immunohistochimie, réalisées sur des échantillons supplémentaires
ont permis de confirmer ce résultat et de montrer par ailleurs que le niveau d’expression
de la PAD2 est élevé et que ceci est associé à la présence de protéines citrullinées dans
Introduction
- 116 -
des nerfs optiques. La PAD2 a également été mise en évidence dans un modèle spontané
de glaucome chez la souris : les souris DBA/2J âgées de 8 à 12 mois développent un
glaucome avec présence de PAD2 au niveau du nerf optique alors que, chez les même
souris plus jeunes ou dans des souris contrôles C57BL6J du même âge, la pression intra-
oculaire est normale et la PAD2 n’est pas détectable (Bhattacharya et al. 2006). Chez
l’homme, par immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-citrulline suivi d’une
identification par spectrométrie de masse, la MBP s'est avérée être la protéine citrullinée
majeure du nerf optique atteint de glaucome, parmi d'autres protéines telles que la PLP ou
une glycoprotéine associée à la myéline.
En conclusion, que l'expression de PAD2 et la citrullination de protéines
composantes de la myéline, soient des causes de la neurodégénerescence observée chez
les patient atteints de GPAO, ou simplement une conséquence des dommages du nerf
optique, ces données montrent que les phénomènes de citrullination dans le nerf optique
sont impliqués dans la physiopathologie du glaucome.
4.5.3. Cancer
Dans les années 80, une étude par immunofluorescence indirecte a, pour la
première fois, mis en évidence l'expression de la PAD2 dans diverses tumeurs. En effet,
l'utilisation d'un antisérum dirigé contre une PAD purifiée à partir de cerveau d'origine
bovine (Pad2) (Kubilus and Baden 1985) également réactif avec une ou plusieurs PAD de
l'épiderme humain à permis de marquer diverses tumeurs épidermiques, bénignes ou
malignes (Kvedar et al. 1986). Quelques années plus tard, au cours d'une étude
immunohistologique sur cryocoupes de divers tissus humains, Urano et col., ont identifié la
PAD du muscle squelettique (qui aujourd’hui a été identifiée à l’isotype PAD2), comme
nouveau marqueur potentiel des néoplasmes de la peau présentant une différenciation
caractéristique des glandes sudoripares (Urano et al. 1990). Pour cela, les auteurs ont
utilisé un antisérum de lapin dirigé contre la PAD du muscle squelettique de rat (Watanabe
et al. 1988), réagissant de manière croisée avec la PAD du muscle squelettique humain.
Avec ce même anticorps et dans la même étude, dans des prélèvements cutanés
provenant de deux patients atteint de maladie de Paget extra-mammaire (un neoplasme
cutané du sujet âgé), l'expression de la PAD2 a été mise en évidence au niveau de cellules
Introduction
- 117 -
néoplasiques, avec des intensités de marquage différents dans chacun des cas (Urano et
al. 1990).
De plus, comme décrit auparavant, l'ADNc correspondant à la PAD2 humaine a
été cloné à partir d'une lignée cellulaire issue d'un carcinome épidermoïde humain (HSC-
1). En outre, dans des extraits protéiques de ces mêmes cellules, cultivées entre 3 et 10
jours en présence de calcium, des quantités croissantes de protéines citrullinées ont été
immunodétectées, ce qui témoigne de la présence d'une activité PAD (Ishigami et al.
2002).
Enfin, plus récemment, des expériences d'immunohistochimie ont permis de mettre
en évidence l'expression significative de PAD4 dans de nombreuses tumeurs, plus
particulièrement dans différents types d’adénocarcinomes, en comparaison des tissus sains
correspondants (Chang and Han 2006). Sur des coupes de tissus adjacentes, des
protéines citrullinées ont également été détectées dans la plupart des tumeurs exprimant la
PAD4, alors qu’elles sont absentes dans les tissus normaux contrôles.
Ainsi l'expression de la PAD2 et celle de la PAD4, ainsi que la présence de
protéines citrullinées ont été mises en évidence dans diverses tumeurs. La question d’un
rôle des PAD et de la citrullination dans la pathologie cancéreuse reste ouverte.
4.5.4. Psoriasis et érythrodermie congénitale ichtyosiforme bulleuse
Le Psoriasis est une dermatose inflammatoire qui affecte environ 2% de la
population. La caractéristique la plus commune de cette pathologie est l'apparition en
plaques de lésions cutanées rouges et squameuses généralement au niveau du cuir
chevelu, des coudes ou genoux, pouvant même être associée à une arthrite sévère
(arthrite psoriasique) (OMIM #177900). Même si l'étiologie exacte du Psoriasis est encore
inconnue, l'infiltration du derme et de l'épiderme par des cellules inflammatoires ainsi que
la prolifération et la différenciation anormale des kératinocytes semblent jouer un rôle
important dans la physiopathologie de cette maladie (Lebwohl 2003).
L'érythrodermie congénitale ichtyosiforme bulleuse ou hyperkératose
épidermolytique est une génodermatose autosomique dominante rare. Elle se caractérise
par la formation de cloques et d'érythèmes à la naissance, puis par le développement
d'hyperkératoses s'aggravant avec l'âge. Des analyses ultrastructurales révèlent des
Introduction
- 118 -
agrégations anormales des filaments de kératines (K) au sein des kératinocytes
suprabasaux. Cette maladie est causée par des mutations dans les gènes codant pour K1
et K10 (Cheng et al. 1992; Rothnagel et al. 1992).
Dans ces deux pathologies cutanées, des défauts de désimination ont été constatés.
En effet, des immunomarquages ont révélé une diminution du taux de protéines citrullinées
et plus particulièrement de la K1, au sein de l'épiderme hyperprolifératif correspondant aux
lésions psoriasiques, en comparaison à de l’épiderme sain ou psoriasique non-lésionnel
(Ishida-Yamamoto et al. 2000). Ce même groupe a également montré que l'agrégation
anormale des kératines observée au cours de l'érythrodermie congénitale ichtyosiforme
bulleuse fait intervenir un domaine spécifique de K1 qui est également impliqué dans sa
désimination et interfère donc avec cette dernière. Une désimination aberrante de K1 ainsi
que d'autres protéines est observée (Ishida-Yamamoto et al. 2002).
A noter qu’un traitement par de la vitamine D (1,25-dihydroxyvitamine D3)
permettant la différenciation de cellules HL-60 en monocytes/macrophages augmente
simultanément l'activité PAD de ces cellules (Nakashima et al. 1999) . Cette même
vitamine augmente aussi l'expression des gènes PADI1-3 (dès 6h de traitement) dans des
kératinocytes humains, primaires ou immortalisés en culture (Lu et al. 2005). Quand on
sait par ailleurs que des analogues de la vitamine D sont utilisés en traitement topique du
psoriasis chez l'homme (Nagpal et al. 2001), il est tentant de proposer qu’une stratégie
visant à augmenter l'activité des PAD épidermiques (PAD1, 2 et 3) pourrait avoir un effet
thérapeutique sur le psoriasis. Mais de façon étonnante, dans une étude pilote prospective
de phase II, le traitement de patients atteints de psoriasis sévère, par du paclitaxel,
ingrédient actif du taxol, a permis de diminuer la sévérité de la maladie (Ehrlich et al.
2004). Or, du fait de sa capacité à inhiber non spécifiquement les PAD, et notamment la
Pad2 purifiée à partir de cerveau de bœuf (Pritzker and Moscarello 1998), on aurait pu
s'attendre à un effet nul ou aggravant du taxol sur le psoriasis. Cependant, le taxol est plus
généralement connu pour ses propriétés anti-prolifératives et anti-inflammatoires qui
compensent probablement son action négative indirecte sur la citrullination et pourraient
expliquer que l'effet net de la molécule est bénéfique.
Introduction
- 119 -
4.5.5. Néphropathie obstructive
Les reins occupent une position rétropéritonéale dans la région lombaire
supérieure. Une coupe frontale de rein révèle trois parties distinctes. La partie la plus
externe, le cortex, recouvre la médulla. En position latérale par rapport au hile se trouve le
pelvis rénal, ou bassinet, cavité aplatie en forme d'entonnoir. L’uretère, qui transporte
l'urine jusqu'à la vessie, communique au niveau du hile avec le pelvis qui se prolonge vers
l'intérieur du rein par deux ou trois calices rénaux chargés de recevoir l'urine. La formation
de l'urine est assurée par les néphrons, unités structurales et fonctionnelles des reins.
Chaque rein en contient plus d'un million. Chaque néphron est formé d'un corpuscule
rénal associé à un tubule rénal. Le corpuscule rénal est une vésicule constituée de la
capsule glomérulaire rénale ou capsule de Bowman et d'un bouquet de capillaires
artériels appelé glomérule de rein. La capsule de Bowman entoure complètement le
glomérule (comme un gant de baseball entoure une balle) et est formée de 2 feuillets
séparés par une cavité – la chambre glomérulaire ou lumière de la capsule – qui se
prolonge par le tubule rénal.
Dans des expériences d'obstruction unilatérale de l'uretère réalisées chez le rat,
l'expression des 4 isotypes de PAD (PAD1 à 4) a été recherchée au niveau du rein, et seul
l'ARNm du gène PADI2 y a été détecté. Au niveau protéique, les auteurs ont montré que
l'expression de la PAD2 ainsi que la quantité de protéines citrullinées augmentent
considérablement dans le rein ayant subit la ligation de l'uretère en comparaison du rein
controlatéral ou de reins ayant subi une opération factice. Les analyses
immunohistochimiques ont en outre révélé que la PAD2 est préférentiellement exprimée
dans les cellules épithéliales pariétales au sein de la capsule de Bowman où des protéines
sont citrullinées. De plus, la présence de la PAD2 ainsi que la citrullination sont
significativement diminuées suite à la levée de l'obstruction de l'uretère. Enfin des analyses
par électrophorèse 2D et spectrométrie de masse des protéines citrullinées ont permis
d'identifier une protéine du cytosquelette de 40 kDa : l'actine (Feng et al. 2005).
Ainsi, ces résultats mettent en évidence que la PAD2 ainsi que les protéines
citrullinées pourraient non seulement être des marqueurs appropriés de la capsule de
Bowman où elles sont préférentiellement exprimées mais en plus pourraient refléter des
dommages causés à son niveau. Il est connu que la citrullination des protéines modifie
Introduction
- 120 -
leur charge et interfère avec leur structure. La citrullination de protéines du cytosquelette
au niveau de la capsule de Bowman pourrait ainsi être un mécanisme de "défense" ou
d'adaptation de cette capsule en réponse à un stress mécanique provoqué au niveau du
glomérule rénal.
Introduction
- 121 -
5. Objectifs
Lorsque nous avons présenté l’autoimmunité anti-protéines citrullinées, nous avons
fait état d’un certains nombre d’éléments qui suggèrent que, très vraisemblablement, elle
a un rôle très important dans la physiopathologie de la PR. Rappelons, que parmi tous les
autres auto-anticorps présents chez les patients atteints de PR, les ACPA sont les plus
spécifiques de la maladie, qu’ils apparaissent très précocement, parfois même avant
l'apparition des premiers signes clinique, et qu’ils sont associés aux PR sévères et actives
(pour revue consulter(Vincent et al. 2005)). Nous avons aussi mentionné qu’ils sont
sécrétés et concentrés au sein du tissu synovial rhumatoïde (Masson-Bessiere et al. 2000),
où leur cible antigénique, la fibrine citrullinée est présente (Masson-Bessiere et al. 2001).
Ainsi, mon laboratoire a proposé un modèle de l’implication physiopathologique des
ACPA dans la synovite rhumatoïde dans lequel ils contribueraient de façon majeure à son
auto-entretien et où la génération de fibrine citrullinée jouerait un rôle essentiel (cf Figure
28).
Dans le tissu synovial rhumatoïde, après sa désimination, la fibrine devient la cible
des ACPA, produits par des plasmocytes locaux. Via l'activation de mécanismes effecteurs
impliquant très probablement le complément et/ou les récepteurs Fcγ, ce conflit
antigène/anticorps va nécessairement avoir des effets pro-inflammatoires. Ces effets vont
favoriser l'extravasation de plasma et de fibrinogène et donc la formation de nouveaux
dépôts de fibrine dans le tissu synovial, qui constituent la cible d'une ou plusieurs PAD
exprimée(s) et activée(s) localement. La fibrine citrullinée nouvellement formée, alimente
alors à nouveau le conflit antigène/anticorps ce qui permet l’entretien de l'inflammation
rhumatoïde.
Introduction
- 122 -
Figure 28 : Modèle d'auto-entretien de la synovite rhumatoïde. Hypothèses concernant l'implication des ACPA et de la fibrine citrullinée dans la physiopathologie de la PR, et questions faisant l'objet de mon travail de thèse.
La validation de cette hypothèse physiopathologique passe par la résolution de
nombreuses questions sur l'origine et les conséquences physiopathologiques du conflit
immunologique associant fibrine citrullinée et ACPA.
Celles qui ont fait l'objet des investigations de mon travail de thèse sont les suivantes :
- la désimination est-elle spécifique des membranes synoviales rhumatoïdes ou
survient-elle au cours d'autres synovites?
- chez l’animal, peut-on apporter une preuve du rôle pathogène de l’autoimmunité
anti-protéines en montrant que la fibrine citrullinée autologue est immunogène et
arthritogène ?
- parmi les 5 isotypes de PAD, lesquelles sont exprimées dans le tissu synovial
rhumatoïde et impliquées dans la désimination de la fibrine ?
RRÉÉSULTATS SULTATS EXPEXPÉÉRIMENTAUXRIMENTAUX
DISCUSSION GÉNÉRALE
BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
DISCUSSION GÉNÉRALE
INTRODUCTION
DISCUSSION GÉNÉRALE
Résultats expérimentaux
- 123 -
Publication N°1 :
Fibrin deimination in synovial tissue is not specific for rheumatoid arthritis but commonly
occurs during synovitides.
The Journal of Immunology, 174:5057-5064, 2005.
Chapuy-Regaud S, Sebbag M, Baeten D, Clavel C, Foulquier C, De Keyser F, Serre G.
Le but de ce travail a été de rechercher si la présence de fibrine citrullinée dans le tissu
synovial était spécifiquement associée à la PR, ce qui pourrait expliquer l'étroite
association qui existe entre ACPA et PR.
Chez 13 patients atteints de PR et 19 patients atteints d’autres maladies
rhumatologiques inflammatoires ou non, des biopsies synoviales de genou ont été
réalisées dans des aires tissulaires inflammatoires identifiées par arthroscopie. Une analyse
histopathologique a confirmé la synovite dans tous les échantillons. Par immunotransfert,
en utilisant des anticorps anti-fibrine, des anticorps spécifiques des résidus citrullyl et des
auto-anticorps anti-fibrinogène citrulliné purifiés à partir de sérums de patients atteints de
PR, la fibrine citrullinée a été détectée dans les extraits synoviaux de tous les patients. De
plus, des variations dans le degré de citrullination de la fibrine ont été observées, sans
relation avec la maladie. Des analyses immunohistochimiques sur coupes sériées de tissu
synovial, utilisant des anticorps anti-résidus citrullyl et un antisérum anti-fibrine, ont
confirmé les résultats en montrant une co-localisation des protéines citrullinées avec la
fibrine chez les patients atteints de PR mais également chez les patients contrôles.
Ainsi la citrullination de la fibrine dans le tissu synovial est un phénomène associé à
l’inflammation synoviale qui n’induit pas nécessairement une réponse auto-immune
humorale avec production d’ACPA.
Fibrin Deimination in Synovial Tissue Is Not Specific forRheumatoid Arthritis but Commonly Occursduring Synovitides1
Sabine Chapuy-Regaud,* Mireille Sebbag,* Dominique Baeten,† Cyril Clavel,*Celine Foulquier,* Filip De Keyser,† and Guy Serre2*
Autoantibodies to deiminated (citrullinated) proteins are the most specific serological markers of rheumatoid arthritis (RA).Deimination is critical in generating the peptidic epitopes they recognize. In the synovial tissue (ST), deiminated forms of the �-and �-chains of fibrin are their major autoantigenic targets (anti-human fibrin(ogen) autoantibodies (AhFibA)). We investigatedwhether the presence of deiminated fibrin in the ST was specific for RA, because this could explain why AhFibA are RA specific.In 13 patients with RA and 19 patients with various other rheumatological disorders, knee ST biopsies were collected in macro-scopically inflamed areas identified under arthroscopy. Synovitis was histopathologically confirmed in all of the biopsies. Byimmunoblotting, using antisera to fibrin, Abs to citrullyl residues, and AhFibA purified from RA sera, deiminated fibrin wasevidenced in ST extracts from all of the patients. Moreover, variations in the degree of fibrin deimination were observed that werenot related to the disease. Immunohistochemical analysis, using Abs to citrullyl residues and an antiserum to fibrin on adjacentserial sections of ST, confirmed the results because deiminated proteins colocalized with fibrin in RA as well as in control patients.Therefore, fibrin deimination in the ST is a general phenomenon associated to any synovitis, which does not necessarily induce aB autoimmune response with production of AhFibA. The Journal of Immunology, 2005, 174: 5057–5064.
A utoantibodies to deiminated (or citrullinated) proteinsare highly specific for rheumatoid arthritis (RA).3 Theywere first referred to as antifilaggrin autoantibodies
(AFA), which encompass two IgG autoantibody families, the so-called antikeratin Abs and the antiperinuclear factor. Indeed, sev-eral decades after their initial, independent descriptions, weshowed that both anti-keratin Abs and antiperinuclear factor rec-ognize diverse forms of the squamous epithelium protein, filag-grin, or of its precursor, profilaggrin (1–3), and demonstrated thatthey constitute largely overlapping autoantibody families (3). Wealso showed that the filaggrin-related targets of AFA correspond to
deiminated proteins, of which arginyl residues have been post-translationally transformed into citrullyl residues by a peptidyl-arginine deiminase (PAD) (4). Moreover, we and others estab-lished that citrullyl residues are indispensable elements of theepitopes recognized by AFA, but only in the context of specificamino acid sequences (4–6).
We also showed that AFA are produced by plasmocytes of therheumatoid pannus and concentrated in the synovial tissue (ST)interstitium (7). This suggested the presence of a target for theseautoantibodies in diseased synovial joints. However, because ep-ithelial tissues do not correspond to the sites of rheumatoid in-flammation and we showed that (pro)filaggrin is not expressed inarticular tissues (8), we speculated that deiminated (pro)filaggrinwas not the in vivo target of AFA in RA, but rather an Ag cross-recognized in vitro. Indeed, we showed that rheumatoid synovialmembranes contain several deiminated proteins, among which de-iminated forms of the �- and �-chains of fibrin were identified as themajor synovial targets of AFA (8). These results constitute a strongargument for the involvement of AFA/anti-human fibrin(ogen) au-toantibodies (AhFibA) in the pathophysiology of RA because thesimultaneous presence of these autoantibodies and of their targetsin the ST is bound to lead to an immunological conflict thatstimulates rheumatoid tissue inflammation. Moreover, the rolethat this immunological conflict plays in the disease develop-ment and/or maintenance is most probably important because:1) among RA-associated autoantibodies, autoantibodies to de-iminated proteins are largely the most disease specific (9 –11);2) they appear early (12–16), often before clinical symptoms(17–19); and 3) they are positively linked to disease activity andseverity (20 –24).
Fibrin was described for the first time as a PAD substrate whenwe identified its deiminated form as the synovial target of AhFibA(8). Protein deimination, mediated by a family of five PAD iso-forms (25–29), is a posttranslational modification described more
*Laboratory of Epidermis Differentiation and Rheumatoid Autoimmunity, UniteMixte de Recherche 5165 Centre National de la Recherche Scientifique-Toulouse IIIUniversity, Institut Fedératif de Recherche 30 (Centre National de la Recherche Sci-entifique-Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale-Universite PaulSabatier-Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse), Toulouse, France; and †De-partment of Rheumatology, Ghent University Hospital, Ghent University, Ghent, Bel-gium
Received for publication June 2, 2004. Accepted for publication January 11, 2005.
The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of pagecharges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordancewith 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.1 This study was supported by grants from the Universite Paul Sabatier-Toulouse III,the Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, the Centre National dela Recherche Scientifique, and the Association pour la Recherche sur la Polyarthrite,and by a postdoctoral fellowship from the Societe de Secours des Amis des Sciences(to M.S.) and a postdoctoral fellowship from the Institut National de la Sante et de laRecherche Medicale (to S.C.-R.). D.B. is a Senior Clinical Investigator of Fonds voorWetenschoppeljk Onderzoek-Flanders.2 Address correspondence and reprint requests to Dr. Guy Serre, Unite Differen-ciation Epidermique et Autoimmunite Rhumatoıde, Unite Mixte de Recherche5165 Centre National de la Recherche Scientifique-Universite Paul Sabatier, Ho-pital Purpan, Place du Dr. Baylac, 31059 Toulouse Cedex, France. E-mail address:[email protected] Abbreviations used in this paper: RA, rheumatoid arthritis; AFA, antifilaggrin au-toantibody; AhFibA, anti-human fibrin(ogen) autoantibody; AMC, Ab to modifiedcitrullyl residues; AS, ankylosing spondylitis; MM, multiple myeloma; PAD, pepti-dylarginine deiminase; PsA, psoriatic arthritis; ST, synovial tissue.
than 50 years ago (for review, see Ref. 30). Moreover, PADs areexpressed in a wide variety of vertebrate tissues. Nonetheless, onlyvery few physiological PAD substrates have been characterized todate, and the probably very numerous and important biologicalconsequences of this posttranslational modification have not yet allbeen elucidated. In the rheumatoid synovium, deimination of fibrincould make it immunogenic, the deiminated fibrin eliciting or atleast sustaining production of the RA-specific autoantibodies. Tofully consider this hypothesis, it was essential to know whether thepresence of deiminated fibrin was, or was not, specific for therheumatoid ST. Indeed, a close association to RA would explainwhy AhFibA are so highly specific for the disease.
To answer this question, we analyzed synovial biopsy samplesfrom a series of 32 patients with RA or with non-RA rheumato-logical disorders (control patients). The presence of deiminatedfibrin in the ST was analyzed by immunoblotting and immunohis-tology, using Abs directed to citrullyl residues (targeting any de-iminated proteins) and to fibrin, and also AhFibA, immunopurifiedfrom a pool of RA sera.
Materials and MethodsPatients
Among consecutive patients undergoing needle arthroscopy for knee painand/or arthritis in the Department of Rheumatology of Ghent UniversityHospital, 32 were selected who exhibited synovitis as asserted by macro-scopical examination under arthroscopy. Thirteen patients were diagnosedas having RA, according to the American College of Rheumatology clas-sification criteria (31). The other 19 patients (control patients) included 13patients with spondylarthropathies (classified in 4 ankylosing spondylitis(AS), 4 psoriatic arthritis (PsA), 1 reactive arthritis, 4 undifferentiatedspondylarthropathy, according to the criteria of the European Spondylar-thropathy Study Group (32)); 1 patient with systemic lupus erythematosus(33); 4 patients with osteoarthritis of the knee, classified according to theAmerican College of Rheumatology criteria (34); and 1 patient with amultiple myeloma (MM) presenting a synovial extension. All patients gavetheir informed consent as approved by the Ethics Committee of the GhentUniversity Hospital.
Tissues
ST biopsies were obtained during arthroscopy, as previously described(35). Briefly, after careful inspection of the joint cavity, the biopsies (14 perpatient) were collected from the macroscopically inflamed areas using2.7-mm biopsy forceps (Karl Storz). For histological and immunohistolog-ical analyses, 8 biopsies were fixed in 3% formaldehyde and then embed-ded in paraffin. For immunochemical analyses, the remaining 6 biopsieswere snap frozen and stored at �80°C until ST extraction was performed.
Histology and immunohistology
Histological analyses were performed after staining with H&E. To evaluateST inflammation, histological parameters were scored by two independentobservers unaware of the diagnosis and clinical data, as previously de-scribed (36) (see Table I). To assess the presence of fibrin, sections wereprobed with a rabbit antiserum directed to the B�-chain of human fibrinogen(1:4000; Cambio), followed by Abs to rabbit IgG coupled to a peroxidase-based polymer backbone (EnVision reagent; DakoCytomation). On adja-cent sections, the presence of deiminated proteins was probed using an Abto modified citrullyl residues (AMC; purified rabbit IgG, a generous gift ofT. Senshu, Graduate School of Integrated Science, Yokohama City Uni-versity, Yokohama, Japan) (37). AMC was used at 0.66 �g/ml after Agretrieval by a 40-min incubation in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) in aboiling water bath and in situ modification of citrullyl residues, as previ-ously described (38). This procedure was also applied to sections of form-aldehyde-fixed and paraffin-embedded skin, which served as positive con-trols. AMC binding was visualized using biotin-coupled goat IgG to rabbitIgG (H � L specific; Southern Biotechnology Associates), followed bybiotinyl tyramide- and peroxidase-based amplification using the TyramideSignal Amplification Biotin System (PerkinElmer Life and Analytical Sci-ences), as suggested by the manufacturer. Finally, whatever the Ag de-tected, the peroxidase activity was visualized using 3-amino-9-ethylcarba-zole, and all of the sections were counterstained with hematoxylin. In bothstaining procedures, a normal rabbit antiserum was used as negativecontrol.
Sequential protein extraction from synovial tissues
ST biopsies (median wet weight 28.5 mg; range 8–119 mg) were sequen-tially extracted with an Ultra-Turrax homogenizer (T25 basic; IKALabortechnik) in 500 �l of ice-cold 40 mM Tris-HCl-based buffers (pH7.4; three times in each buffer), containing first 150 mM NaCl (TBS ex-tract), then 8 M urea, deionized by incubation with a mixed bed resin (AG501-X8; Bio-Rad), (urea extract), then 8 M deionized urea and 50 mMDTT (urea-DTT extract). All buffers were supplemented with 40 mMEDTA, 0.02% sodium azide, 2 �g/ml aprotinin, 10 mM N-ethylmaleimide,and 1 mM PMSF (all from Sigma-Aldrich). After each extraction, thehomogenate was clarified by centrifugation at 4°C for 7 min at 15,000 �g. The three urea-DTT extracts were chosen for further analysis and pooledbecause, according to our previously published results, they were expectedto be enriched with deiminated fibrin (8). Then concentration and bufferexchange against 50 mM EDTA were performed using disposable ultra-filtration devices with a 3-kDa molecular mass cutoff (Centricon YM-3;Millipore). After concentration so that the total suspension volume equaled2.5 �l/mg ST sample, the protein solution was placed in SDS-PAGE sam-ple buffer.
Immunoblotting
Whenever possible, equal amounts of total proteins from all of the 32urea-DTT ST extracts (as adjusted by visual examination of Coomassieblue-stained gels) were separated by SDS-PAGE on 7.5% polyacrylamidegels and then electrotransferred onto reinforced nitrocellulose membranes(Hybond-C extra; Amersham). Each membrane was successively detected
Table I. Histological evaluation of ST inflammation
a RA and control patients were coded according to their diagnosis: AS; PsA; ReA,reactive arthritis; USpA, undifferentiated spondylarthropathy; SLE, systemic lupuserythematosus; OA, osteoarthritis; and MM with knee localization.
b Mean lining thickness was evaluated by counting the number of cell layers in sixrandomly selected regions and semiquantitatively scoring the mean (0:1–2; 1:3–4;2:5–6; 3:�7 cell layers), as previously described (36).
c Vascularity was evaluated by the number of blood vessels. Infiltration of thesublining layer by inflammatory cells was evaluated by the global number of infil-trating cells. Both parameters were semiquantitatively scored from 0 (representing thelowest level) to 3 (representing the highest level), as previously described (36).
d Values of p refer to comparisons between the groups of RA and control patients.
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by several primary probes diluted in 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)containing 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, and 2.5% powdered skimmedmilk (blotting buffer). To make sure that the signals observed were actuallydue to binding of the probing primary Ab used, each time that the mem-brane was probed, the process was preceded by an Ab removal procedurethat included a 5-min wash in 0.2 M glycine-HCl (pH 2.7) and then a30-min incubation at 50°C in blotting buffer containing 14 mg/ml SDS and0.2 M 2-ME. The primary probes used were: AhFibA purified from a poolof RA sera (10 �g/ml), then the antiserum to the �-chain of human fibrin-(ogen) (1:800,000), then a sheep antiserum to the �-chain of human fi-brin(ogen) (1:4,000; Cambio), and, finally, after chemical modification ofcitrullyl residues (37), AMC (0.8 �g/ml). Peroxidase-conjugated secondaryprobes were used for detection of all the primary Abs: protein A (Sigma-Aldrich), goat Abs to rabbit IgG (H � L) (Zymed Laboratories), and rabbitF(ab�)2 to sheep IgG (Southern Biotechnology Associates) for the detectionof human, rabbit, and sheep IgG, respectively. Peroxidase activity wasvisualized using ECL reagents (Amersham), as suggested by the manufac-turer. Negative controls included probing with the secondary probe only.The specificity of the staining obtained with AhFibA was further checkedusing human IgG purified from healthy individuals (Sigma-Aldrich). Fi-brinogen, purified from human plasma, and a urea-DTT extract from arheumatoid ST sample previously demonstrated to contain deiminated fi-brin (8) were used as controls and systematically included in the SDS-PAGE gels for simultaneous immunoblotting.
Fibrinogen deimination
Plasminogen-depleted human fibrinogen (95% pure; Calbiochem) was fur-ther purified, as suggested by manufacturer, by affinity chromatography ona protein G column (HiTrap protein G, 1 ml; Amersham) to eliminateresidual contamination by IgG. Deimination was then performed at 0.86mg of fibrinogen/ml with rabbit skeletal muscle PAD (Sigma-Aldrich; 7U/mg fibrinogen) in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM CaCl2, and 5 mMDTT for 2 h at 37°C.
Autoantibody purification
AhFibA were purified, as previously described, from the IgG fraction of apool of 38 high-titered RA sera (8). Briefly, the IgG were loaded onto a5-ml N-hydroxysuccinimide HiTrap column (Amersham) coupled with14.4 mg of deiminated human fibrinogen. After a 2-h incubation at 4°C, thecolumn was washed with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 2 MNaCl, and then bound Abs were eluted with 0.2 M glycine-HCl (pH 2.7)and immediately neutralized by addition of 2 M Tris. This purificationprocedure was repeated several times, and the fractions corresponding tothe eluted AhFibA were pooled and concentrated using affinity chroma-tography on protein G.
AhFibA assay
The titer of AhFibA in the serum was evaluated with a recently developedELISA using in vitro deiminated human fibrinogen as immunosorbent (11).Sera were classified as positive for the presence of AhFibA when the titerwas greater than the 98.6% diagnostic specificity threshold titer.
Statistical analyses
Median differences were tested with the Mann-Whitney U test. The p valueadjustment for multiple comparisons was done by the Holm (sequentialBonferroni) correction method (39). Values of p less than or equal to 0.05were considered significant.
ResultsHistopathological examination confirms the existence ofsynovitis in all RA and control patients
Clinical data of the patients are shown in Table II. Knee synovitiswas arthroscopically asserted in all of the patients. All but one(RA13) had an associated synovial fluid effusion. As expected,upon histological examination of the ST (Table I), the individualscores obtained for mean lining thickness, vascularity, and infil-tration by cells of hematological origin clearly indicated that all ofthe synovial membranes were actively inflamed, even though, oncomparison, the groups of RA and control patients tended to showdifferences reflecting disease-related features (36).
Fibrin and deiminated fibrin are biochemically detectable in thesynovial tissue of both RA and control patients
The presence of fibrin and deiminated fibrin in the ST was assessedin all of the 32 patients by immunoblotting analysis of urea-DTTextracts obtained after sequential extraction of the ST biopsies us-ing a TBS, then a urea, and finally a urea-DTT buffer. Indeed, wepreviously described that when applied to rheumatoid ST, this se-quential extraction method enriches the urea-DTT extract in de-iminated fibrin (8). Two antisera specific for the A�- and the B�-chains of human fibrinogen, respectively, probed for the presenceof fibrin, deiminated or not. AMC allowed the detection of all ofthe deiminated proteins. Lastly, AhFibA, affinity purified from apool of rheumatoid sera on in vitro deiminated fibrinogen, assessedthe presence of their own target, deiminated fibrin.
The results are illustrated in Fig. 1, showing the ST analysis of13 representative patients, including 6 RA and 7 control patients.As expected, the reactivities of the antisera to the �- and to the�-chain of human fibrin(ogen) were found to be correlated, a stron-ger reactivity being systematically observed using the antiserum tothe �-chain. A reactivity with the latter antiserum was observed inall of the 32 ST extracts. Therefore, the presence of fibrin wasevidenced in the ST of all the patients, whatever their disease.Moreover, a high degree of interindividual variation in the ratio offibrin to total proteins was noted, with no obvious relationshipswith the disease (data not shown).
The staining intensities obtained with AMC and with AhFibAwere globally related. In all of the extracts, a faint to intense re-activity of AMC and of AhFibA with the �- and the �-chains offibrin was noted, indicating that, for all patients, at least part of theST fibrin was deiminated. The degree of fibrin deimination of theextract varied from patient to patient, high, medium, or low de-grees being observed in both RA and control patients (for example,in Fig. 1, compare staining intensities of the antisera to fibrinchains vs AMC or AhFibA in patients RA 13 and PsA 4, high; inpatients RA 12 and MM 1, medium; and in patients RA 5 and AS2, low degree of deimination).
Therefore, immunoblotting analyses indicate that the presenceof the synovial target of AhFibA is not restricted to the rheumatoidST, but can also be observed in the ST from patients with variousother rheumatological disorders. Moreover, they show that no ob-vious differences in the degree of fibrin deimination exist betweenrheumatoid and control ST.
The assay of serum AhFibA was performed in 9 of the 13 RApatients and 12 of the 19 control patients (Table II). As expected,AhFibA were absent from the serum of control patients, whereas7 of 9 RA patients were AhFibA positive. In those patients, noclear relationships were found between the AhFibA titer and the
Table II. Patients: clinical and serological data
RAn � 13
Control patientsn � 19
Sex ratio (F/M) 9/4 7/12Age, median (range) 64.4 (31.6–77.7) 37.9 (20.8–77.1)Disease duration, median
(range)8 (1–17) 1 (0.2–17)
Swollen joints, median(range)
5.5 (0–31) 2 (1–17)
AhFibAa, no. positive/no.negative
7/2b 0/12b
a AhFibA measured by ELISA, using in vitro deiminated human fibrinogen asimmunosorbent.
b p � 10�3.
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amount of deiminated fibrin assessed by immunoblotting in the STbiopsies (data not shown).
Deiminated proteins and fibrin are histologically colocalized inthe synovial tissue of both RA and control patients
The presence of deiminated fibrin in the synovial membrane wasalso indirectly assessed in 19 of the 32 patients by immunoperox-idase staining of adjacent serial sections of synovial biopsies withthe antiserum to the �-chain of fibrin(ogen) and with AMC (illus-trated in Fig. 2). In 12 patients (corresponding to 6 RA and 6control patients), the anti-fibrin Ab stained interstitial amorphousdeposits of varying abundance located in the lining layer and/or inthe deep synovium. In 2 of these 12 patients (RA 9 and RA 11),AMC did not stain the fibrin deposits, whereas in the other 10patients, fibrin deposits were labeled. The labeling intensity of thefibrin deposits was variable from one patient to another, but also,in each ST sample, within a given fibrinous zone. As illustrated inFig. 2, high, medium, or low degrees of deimination of the fibrindeposits were observed in both RA and control patients.
Therefore, unlike with immunochemical analysis, the less sen-sitive immunohistological methods did not allow detection of de-iminated fibrin in all of the ST samples. Nevertheless, the resultsof both analyses are in perfect agreement to confirm that the pres-ence of deiminated fibrin in the ST is not specifically associated toRA. Moreover, the deiminated fibrin deposits did not appear moreprominent in RA than in other synovitides.
DiscussionUsing an Ab directed to citrullyl residues, produced by immuni-zation of rabbit with L-citrullin coupled to keyhole limpet hemo-cyanin (in this work referred to as anti-L-Cit), we previously ex-plored, by immunohistology, the association between RA and thepresence of deiminated proteins in the ST (40). With this Ab, de-iminated proteins were evidenced in the ST of RA patients, located
in the cytoplasm of rare cells (2–5/biopsy section) of the lining andsublining layers, these labelings being totally absent from the STof patients with other rheumatologic disorders, including spondy-larthropathy and osteoarthritis (40). However, the presence of de-iminated fibrin could not be reliably investigated because anti-L-Cit did not allow reproducible staining of deiminated extracellularfibrin deposits to be obtained. Moreover, anti-L-Cit is unable torecognize deiminated proteins in immunochemical techniques be-cause, by ELISA as well as immunoblotting, it fails to detect manydeiminated proteins such as the deiminated �- and �-chains ofhuman fibrinogen, and deiminated filaggrin purified from humanepidermis (our unpublished results). Therefore, in the presentstudy, AMC, an Ab to citrullyl residues developed by Senshu et al.(37) and known to be reactive with deiminated fibrin both by im-munohistology and immunoblotting (8), was used to assesswhether the presence of deiminated fibrin in the ST was specificfor RA or not. The results clearly demonstrate that the presence ofdeiminated fibrin in the synovial membrane is not specific for RA.Moreover, as already observed (8), AMC decorated the cytoplasmand/or the nucleus of often quite numerous cells that morpholog-ically evoked macrophages and fibroblasts (data not shown). Thiscellular labeling was not confined to RA patients, but was also seenin two cases of ankylosing spondylitis, one case of psoriatic ar-thritis, one case of undifferentiated spondylarthropathy, and onecase of osteoarthritis. In contrast, when the ST samples of thepresent study were probed with anti-L-Cit according to our proto-col (40), the results obtained were very consistent with those of ourprevious study: rare citrulline-positive cells were detected in 7 of13 RA patients and in none of the 19 control patients (data notshown). Therefore, the two Abs to citrullyl residues, AMC andanti-L-Cit, obviously do not recognize the same sets of deiminatedproteins. Anti-L-Cit defines a subset of intracellular deiminatedprotein(s) that is specific for RA. The molecular characterization ofthese proteins is therefore of great interest for RA pathogenesis.
FIGURE 1. Immunoblotting analysis of ST demonstrates the presence of deiminated forms of the �- and �-chains of fibrin in RA as well as controlpatients. After Ponceau red staining, immunodetections of membrane blots of the urea-DTT extracts of the ST samples of RA and control patients weresuccessively performed following the sequence described in Materials and Methods. Anti-�, antiserum to the �-chain of human fibrin(ogen); anti-�,antiserum to the �-chain of human fibrin(ogen); AhFibA, purified autoantibodies to human deiminated fibrin(ogen). Only the zones corresponding to thelocation of the �- and the �-chain of fibrin are presented. Control ST, positive control corresponding to a urea-DTT extract of ST from a RA patient,previously identified as containing deiminated fibrin. Fibrinogen, undeiminated human fibrinogen. Reactivity with the anti-� antiserum indicates thepresence of fibrin in all of the ST biopsies. In all of the samples, reactivity with AMC and AhFibA demonstrates that this fibrin is at least partly deiminated.
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Nevertheless, to date, anti-L-Cit is the only Ab showing such spec-ificity, but it does not work in immunochemical techniques. There-fore, it cannot help the characterization. This exciting future chal-lenge is beyond the scope of the present study.
Because the presence of fibrin deposits is linked to tissue in-flammation, to check the association between RA and deiminatedfibrin, we had to compare the ST of RA patients with other in-flamed ST. The controls were therefore chosen among patientswith non-RA inflammatory rheumatological disorders. Patientswith osteoarthritis and one with knee localization of a multiplemyeloma were also included in our study because even thoughthey are not classified as inflammatory disorders, these diseasescan also lead to intense local synovitis. Accordingly, all of thecontrol ST samples in our study, including those from osteoarthri-tis and multiple myeloma patients, as well as the rheumatoid STsamples, exhibited local synovitis, as indicated by arthroscopy andhistology. Therefore, the presence of deiminated fibrin that weobserved in all the ST is probably a consequence of their inflam-matory state. In agreement with this hypothesis, and with our re-sults, is the fact that the presence of deiminated fibrin in the ST hasrecently been demonstrated in two mouse arthritis models, namelyacute streptococcal cell wall-induced arthritis and chronic destructivecollagen-induced arthritis, whereas the synovial membrane of naivecontrol mice was devoid of fibrin and of deiminated proteins (41).Although it remains to be established, it is also highly conceivable thatdeimination of fibrin may not be restricted to ST inflammation, butalso may be observable during every tissue inflammation in whichfibrin deposition is prominent, such as, for example, glomerulonephri-
tis or acute lung injury. More generally, deimination of fibrin duringinflammation could occur in numerous organs and play a major rolein the physiology of inflammation. Confirmation of this hypothesiswould have a wide impact in human pathology.
As mentioned earlier, PADs are expressed in a wide variety oftissues, but in most of them, the biochemical nature of their sub-strate(s) and hence their function still remain to be unraveled. My-elin basic protein (42), type I and type II cytokeratins (38), filag-grin (43), and trichohyalin (44) are among the few proteins thathave been demonstrated to be in vivo PAD substrates. A commonconsequence of deimination of these proteins is a decrease of theirnet charge that, in vitro, has been shown to modify intermolecularinteractions (45–47). These modifications probably play a role inphysiological processes such as terminal differentiation of epider-mis (48), and skin and brain development (49, 50). Concerningpathophysiological processes, in multiple sclerosis, the associatedincrease in the relative amount of deiminated forms of myelinbasic protein was proposed to be involved in the disease-charac-teristic instability of myelin sheaths (51). Deimination of fibrincould hamper its cleavage by plasmin, arginyl residues being in-cluded in the cleavage sites of this enzyme. The subsequent defectin fibrinolysis could have a role in perpetuating inflammation be-cause fibrin accumulation in the ST has been demonstrated to playa pathogenic role in various animal models of arthritis (52–54). As,in this work, we demonstrate the presence of deiminated fibrin inother rheumatic diseases associated with synovitis, a deimination-related defect in fibrinolysis could constitute a general phenome-non contributing to the maintenance of ST inflammation.
FIGURE 2. Immunohistological analysis shows that deiminated fibrin is present in the ST of RA as well as control patients. Deiminated fibrin wassearched in the ST biopsies by immunoperoxidase staining of adjacent serial sections (panel pairs) with the Ab to the �-chain of human fibrin(ogen) (Fibrin,left panels) and with AMC (Deiminated proteins, right panels). In the synovial membranes of RA (RA 6, RA 13, RA 7) and control patients (PsA 4, AS2, MM 1), the presence of fibrin deposits can be evidenced by staining of interstitial amorphous zones of varying abundance. These zones are stained toa varying extent and intensity by AMC, in both RA and control patients. The degree of staining indicates the degree of deimination of the fibrin deposits,a high (RA 6, PsA 4), medium (RA 13, AS 2), or low (RA 7, MM 1) degree of deimination being observable in both patient groups. Bars � 50 �m.
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When the presence of deiminated fibrin in the ST was investi-gated by immunoblotting, in both RA and control samples, wenoted that the intensities of AMC staining were generally higherfor the �- than for the �-chain of fibrin. This suggests that the�-chain is more accessible to PAD than the �-chain. The stainingintensities of the �-chain obtained with AMC and with AhFibAwere well correlated with each other, whereas a high degree ofdeimination of the �-chain evidenced with AMC did not alwayscorrelate with strong staining by AhFibA. This suggests that whilethe in vivo deimination of the �-chain seems more effective thanthat of the �-chain, this does not necessarily lead to the generationof a higher number of AhFibA epitopes on the �- than on the�-chain. Moreover, the fact that the staining intensities of the�-chain obtained with the antiserum to the �-chain of human fi-brin(ogen) and with AhFibA appeared inversely correlated in allsamples tested is also noteworthy. One possible explanation forthis observation is that while generating citrulline-containingepitopes on the �-chain of fibrin targeted by AhFibA, deiminationat the same time disrupts arginine-containing epitopes targeted by theantiserum to the �-chain of human fibrin(ogen). This hypothesis is inagreement with the decreased intensity that we observe with this an-tiserum when probing in vitro deiminated human fibrinogen in com-parison with an equal amount of its undeiminated form.
Even though the presence of deiminated fibrin is not specific forRA, the autoantibody response to it is tightly associated to thedisease. The reason for this association therefore remains to beelucidated.
In this study, whatever the disease we analyzed, deiminated fi-brin of the ST was recognized by AhFibA. This shows that theepitopes produced in the nonrheumatoid ST are either the same orlargely overlap or are at least cross-reactive with those produced inrheumatoid ST. However, one cannot exclude that one or moreimmunogenic epitopes could be specifically generated during RA.Such epitope(s) could initiate an autoimmune response that wouldtherefore be disease specific. Secondarily, epitope spreading couldlead to the production of Abs directed to epitopes common torheumatoid and nonrheumatoid ST. Generation of such RA-spe-cific epitopes could be due to the activity of one or several RA-specific PAD isoform(s) exhibiting variations in their fine substratespecificity. Interestingly, in a Japanese population, it was recentlyfound that a haplotype of the gene encoding isoform 4 of PAD(PAD4) was associated with an increased susceptibility to RA, andthat individuals homozygous for this haplotype were more likely tobe AFA positive (55). This haplotype was found to be associatedwith the production of a PAD4 mRNA with increased in vitrostability, suggesting that the amount of PAD4 and, consequently,the amount of deiminated proteins and particularly of deiminatedfibrin could be higher in rheumatoid than in nonrheumatoid ST.However, in our study, we could not evidence quantitative differ-ences in the amount of deiminated fibrin between RA and controlpatients. This could be related to differences in the populationsanalyzed because the association between susceptibility to RA andthe described haplotype of the PADI4 gene has not been confirmedin a Caucasian population from United Kingdom (56). Alterna-tively to an increased total amount of PAD enzyme, the describedRA-associated haplotype could rather encode a PAD4 whose finesubstrate specificity leads to the generation of the above mentionedRA-specific immunogenic epitopes on deiminated fibrin. Finally,another possible source of RA-specific immunogenic epitopes cor-responds to the still uncharacterized RA-associated intracellulardeiminated protein(s) defined by the anti-L-Cit Ab. Indeed,some of these proteins seem to correspond to targets of theRA-associated autoantibodies to deiminated proteins because in
some cells, anti-L-Cit and AFA reactivities were histologicallycolocalized (40).
An alternative to the above hypotheses would be that reactivityto deiminated proteins bearing epitopes that mimic epitopes tar-geted in deiminated fibrin is not subsequent to the appearance ofRA-specific epitopes, but genetically determined. The Ab responsecould indeed be dependent on a T cell response restricted by theMHC class II molecules bearing the so-called shared epitope thatcharacterizes the HLA-DR haplotypes associated with an in-creased susceptibility to RA. Supporting this hypothesis is the factthat we found that the titers of AFA are significantly higher inpatients with susceptibility alleles (57) and that an association be-tween the presences of autoantibodies to deiminated proteins andof shared epitope-bearing alleles was also described by othergroups (13, 20, 21). The deiminated proteins eliciting the Ab re-sponse could either be expressed by infectious agents or be en-dogenous. Such an endogenous immunogen could be the RA-as-sociated deiminated protein(s) recognized by the anti-L-Cit Ab ordeiminated vimentin, which moreover could correspond to thesame single Ag. Indeed, this Ag was recently demonstrated to bethe target of the anti-Sa autoantibodies (58), another family ofRA-associated autoantibodies that therefore belongs to the familyof autoantibodies to deiminated proteins and probably overlapswith the other members of the family. Interestingly, although Tlymphocytes specific for deiminated fibrin have not been describedyet, a recent study showed that, in a given vimentin-derived pep-tide, the conversion from arginine to citrulline at the peptide side-chain position interacting with the shared epitope increases theaffinity of the interaction with the MHC molecule (59). Althoughthese results remain to be confirmed with a larger set of peptides,they open a very interesting road toward the understanding of howshared epitope-bearing DRB1 alleles could contribute to the auto-immune response to deiminated self Ags in RA patients.
Be that as it may, in our study, the presence of susceptibilityalleles was investigated in 10 of the 13 RA patients and 8 of the 19
FIGURE 3. Schematic view of the role played by the autoimmune re-sponse to deiminated fibrin in the pathophysiology of RA. In the rheuma-toid ST, after deimination, fibrin becomes the target of the disease-specificAhFibA, locally produced by ST plasmocytes (Pc). This leads to an Ag/Abconflict that, via activation of effector mechanisms probably involvingcomplement and/or Fc receptors, has proinflammatory effects. In turn,these effects lead to plasma extravasation and fibrinogen polymerization,and therefore provoke the formation of new fibrin deposits in the tissue,which become the substrate of one or several locally expressed PAD. Thiscloses a vicious circle that could account for the self-maintenance of rheu-matoid inflammation. In the ST of control patients, even if deiminatedfibrin is present, the absence of AhFibA prevents establishment of thisself-maintenance loop. Fg, fibrinogen.
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control patients (data not shown). The results were consistent withthe largely reported association between RA and these alleles, be-cause 10 of 10 RA patients had a genotype containing at least onesusceptible allele. They also confirmed the association betweenthese alleles and the Ab response to deiminated proteins because,among the 7 of the 10 shared epitope-positive RA patients inwhom the presence of AhFibA was investigated, 6 were AhFibApositive. However, none of the control patients had detectableAhFibA, indicating that even if they possibly play an importantrole to generate the AhFibA response, deiminated fibrin, present inall control patients, and shared epitopes bearing HLA-DR alleles,present in 4 of the 8 analyzed control patients, are not the onlyfactors involved.
Although our results exclude a direct relationship between au-toantigen expression and specific autoimmune response, we cannotexclude that a large overproduction of deiminated fibrin contrib-utes to drive the AhFibA response in RA. Interestingly, some tar-get autoantigens of systemic sclerosis-associated autoantibodieswere found to be selectively overexpressed in the dermal fibro-blasts of diseased patients (60). It has been reported that fibrindeposits are particularly abundant in the rheumatoid synovium vsthe ST from patients with osteoarthritis or joint trauma (61). How-ever, in the present work, we could not detect that the amount offibrin per gram of ST was increased in RA patients vs other rheu-matological disorders. This apparent discrepancy may be related todifferences in the inflamed character of the control ST analyzed,because, in our study, no bias relative to the inflammatory status ofthe synovial membranes was introduced when the RA and controlpatients were compared. Nonetheless, generally, in RA comparedwith other rheumatological disorders, the ST is particularly morehyperplastic, and the number of joints inflamed is higher; there-fore, the global amount of fibrin in the body is higher. Because wedid not find any particular decreases in the ratio of deiminatedfibrin to fibrin in the rheumatoid compared with nonrheumatoidST, that means that the global amount of deiminated fibrin is prob-ably often greater in RA patients. Although, in our study, we couldnot evidence a relationship between the serum AhFibA titer of RApatients and the amount of deiminated fibrin in the ST of oneinflamed joint, this does not exclude that a positive correlation mayexist with the total body amount of deiminated fibrin.
In conclusion, even if to date the specific presence of AhFibA inRA remains unexplained, we think that the role of the autoimmuneresponse to deiminated fibrin in the disease pathophysiology isundoubtedly important. We propose that fibrin deimination in theST is a key element of the disease-characteristic perpetuation ofsynovitis because it feeds an immunological conflict that hasproinflammatory effects that promote the formation of new fibrindeposits in the tissue, which are secondarily deiminated (Fig. 3).The precise biological pathways leading to fibrin deimination inthe human ST are currently the object of investigations in ourlaboratory, in particular, determination of which isoforms of thePAD are expressed in the ST and what their cellular origin is.
AcknowledgmentsWe thank Dr. T. Senshu (Graduate School of Integrated Science, Yoko-hama City University, Yokohama, Japan) for providing us with his veryvaluable AMC. We thank B. Fournie (Rheumatology Department, HopitalPurpan, Toulouse, France), B. Mazieres, and A. Cantagrel (RheumatologyDepartment, Hopital Rangueil, Toulouse, France) for providing patientdata and sera. We also thank M. Mansat and P. Bonnevialle, and Dr. M.Rongieres (Traumatology and Orthopedics Department, Hopital Purpan)for providing samples of human synovial membranes and J.-P. Chavoin(Plastic Surgery Department, Hopital Rangueil) for providing samples ofhuman skin. The skillful technical assistance of M. P. Henry and M. F.Isaıa is gratefully acknowledged.
DisclosuresThe authors have no financial conflict of interest.
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5063The Journal of Immunology
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5064 AUTOIMMUNITY TO DEIMINATED FIBRIN
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Résultats expérimentaux
- 133 -
Publication N°2 :
In the rat, citrullinated autologous fibrinogen is immunogenic but the induced autoimmune
response is not arthritogenic.
Clinical and Experimental Immunology, 145:502-512, 2006.
Duplan V, Foulquier C, Clavel C, Al Badine R, Serre G, Saoudi A, Sebbag M.
Le but de cette étude a été d'apporter une preuve expérimentale du caractère pathogène
de l’auto-immunité anti-fibrine citrullinée.
Dans cette étude, nous avons évalué l’immunogénicité et l’arthritogénicité du
fibrinogène citrulliné autologue chez les rat Lewis et Brown Norway qui présentent des
sensibilités différentes aux maladies auto-immunes. Ces rats ont été inoculés soit avec du
fibrinogène de rat citrulliné (C-rFBG), soit avec du fibrinogène de rat non citrulliné (NC-
rFBG). Dans le groupe de rats ayant reçu du NC-rFBG, aucune réponse IgG n’a été
induite. Au contraire, après la première injection de C-rFBG, les animaux ont développé
une réponse immune spécifique du C-rFBG que la seconde injection d’antigène n’a pas
permis d’amplifier. Cependant, cette réponse auto-immune n’était pas associée à
l’induction d’une arthrite puisque, suivis pendant 3 mois après la première sensibilisation
au C-rFBG, les rats sont restés dépourvus de signes cliniques ou histologiques
d’inflammation articulaire.
Pour tenter de démontrer le caractère pathogène de la réponse auto-immune au
C-rFBG, nous avons évalué sa capacité à aggraver une inflammation articulaire, induite
par injection intra-articulaire d’adjuvant incomplet de Freund (IFA). Nous avons observé
que chez le rat Lewis femelle, l’inflammation aiguë transitoire évolue de manière identique
en présence ou en absence d’une réponse immune dirigée contre la fibrine citrullinée. En
outre, chez ces rats, l’injection intra-articulaire d’IFA n’a pas permis d’induire la présence
de fibrine citrullinée dans le tissu synovial.
Notre étude a confirmé que la citrullination du fibrinogène autologue le rendait
immunogène mais que la réponse immune correspondante n’était pas spontanément
arthritogène. Sa capacité à aggraver une arthrite associée à la présence de dépôts de
fibrine citrullinée intra-articulaires reste à étudier.
Clinical and Experimental Immunology doi:10.1111/j.1365-2249.2006.03168.x
In the rat, citrullinated autologous fibrinogen is immunogenic but the induced autoimmune response is not arthritogenic
V. Duplan,* C. Foulquier,* C. Clavel,* R. Al Badine,* G. Serre,* A. Saoudi
†
and M. Sebbag*
*Laboratory of ‘Epidermis Differentiation and
Rheumatoid Autoimmunity’, Unité Mixte de
Recherche 5165, Centre National de la Recherche
Scientifique (CNRS)-Université Paul Sabatier
(Toulouse III University), Institut Fédératif de
Recherche (IFR) 30 (CNRS-Institut National de la
Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)-
Toulouse III University-Centre Hospitalier
Universitaire (CHU) de Toulouse), Toulouse,
France, and
†
Centre de Physiopathologie de
Toulouse Purpan, Unité Mixte de Recherche en
Santé 563, INSERM-Toulouse III University,
IFR30, Toulouse, France
Summary
Conversion of arginyl to citrullyl residues (citrullination) is essential for theformation of the epitopes recognized by rheumatoid arthritis (RA)-associatedautoantibodies to citrullinated proteins (ACPA). ACPA are secreted by plasmacells of the rheumatoid synovial tissue where their major target, citrullinatedfibrin, is abundant. Although numerous arguments suggest that ACPA play animportant role in RA, their pathological relevance remains to be established.In the present study, we assessed the immunogenicity and arthritogenicity ofcomplete Freund’s adjuvant-emulsified autologous citrullinated (C-rFBG) ornon-citrullinated (NC-rFBG) fibrinogen in Lewis (LEW) and Brown–Norwayrats, which exhibit drastic differences in their susceptibility to inducedautoimmune diseases. NC-rFBG induced no antibody response. In contrast, asingle injection of C-rFBG induced an IgG response directed mainly to citrul-linated determinants of rFBG. However, all rat strains remained devoid ofclinical and histological signs of arthritis up to 3 months after C-rFBG inoc-ulation. Next, in LEW rats, we tested whether autoimmunity to C-rFBG couldaggravate acute ankle arthritis triggered by intra-articular injection of incom-plete Freund’s adjuvant (IFA). However, such arthritis evolved identically inthe presence or absence of anti-C-rFBG autoantibodies. However, IFA-injected joints were devoid of citrullinated fibrin deposits. Therefore, citrul-lination allows breakdown of immunological tolerance but the autoimmuneresponse developed is not spontaneously arthritogenic. Whether or not it canaggravate arthritis with citrullinated fibrin deposits remains to be evaluated.
Keywords:
anti-citrullinated protein autoantibodies, citrulline, fibrin, post-translational modification, rheumatoid arthritis
Introduction
Rheumatoid arthritis (RA), essentially characterized bychronic inflammation of synovial joints with frequentextra-articular manifestations, is the most common humanautoimmune disorder. In the serum of
∼
80% of affectedindividuals, IgG autoantibodies to ‘citrullinated’ (deimi-nated) proteins are present and constitute a highly specificserological marker of the disease. These autoantibodies,described initially as two independent autoantibody fami-lies, the so-called ‘anti-keratin antibodies’ and the anti-perinuclear factor, were both shown to recognize epitopesborne by several molecular variants of the epithelial differ-entiation protein filaggrin and thus to constitute a uniquefamily of autoantibodies referred to thereafter as antifilag-
grin autoantibodies (AFA) [1–3]. Secondly, it was demon-strated that protein ‘citrullination’ (deimination), i.e. post-translational conversion of arginyl residues into citrullylresidues mediated by a peptidylarginine deiminase (PAD),was crucial for the formation of the epitopes recognized byAFA [4,5]. In addition we demonstrated that citrullinatedforms of the
α
- and
β
-chains of fibrin correspond to majorantigenic targets of AFA in the rheumatoid synovial tissue[6]. Finally, the recent demonstration that citrullinatedvimentin corresponds to the target of the RA-associatedanti-Sa antibodies [7] showed that anti-Sa antibodies andthe AFA/anti-citrullinated fibrin autoantibodies belong to asingle family of autoantibodies that can henceforth begenerally named ACPA (autoantibodies to citrullinatedproteins).
- 135 -
Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen
The existence of the RA-like joint disorder of the K/B
×
NT cell receptor (TCR) transgenic mouse line that dependscritically on the development of a B cell reaction to glucose-6-phosphate isomerase [8,9] suggests that the role played byB cells in human RA needs careful consideration. Moreover,sustained clinical improvement obtained following the use ofan anti-CD20 antibody (rituximab) as a therapy for RA indi-cates an important role for B cells in the pathophysiology ofthe disease [10]. ACPA-producing B cells could thereforeplay a significant role in RA pathophysiology. Indeed, notonly are ACPA largely the most disease-specific of the RA-associated autoantibodies, but also numerous studies haveestablished clearly that a significant positive correlationexists between the titre of these autoantibodies in the serumand clinical, biological and radiological data related to RAactivity and/or severity (for a review see [11] and [12]). Inaddition, several studies have demonstrated that the appear-ance of ACPA in the serum occurs very early in the course ofthe disease, before arthritis becomes clinically perceptible(reviewed in [12]). Secretion and concentration of ACPA inthe rheumatoid synovial membrane [13] and the presencetherein of their specific antigenic target, citrullinated fibrin,constitute a strong additional argument for the involvementof ACPA in the pathophysiology of RA via a disease-specificimmunological conflict occurring precisely in the disease-targeted tissue.
The existence of an arthritis model using intra-articularinjection of fibrin into rabbits immunized previously withhuman (heterologous) fibrin supports the idea that immu-nization against an inflammation product can play a signif-icant role in maintaining a synovitis [14]. However, recentstudies performed in mice to investigate the role of theautoimmune response to citrullinated fibrin in RA patho-physiology were disappointing. In these studies, mice wereinoculated either with a heterologous antigen, humanfibrinogen (hFBG) or with autologous mouse FBG(mFBG), both in either native or citrullinated forms[15,16]. Immunization with hFBG induced an antibodyresponse independently of the state of citrullination of theAg [15]. In contrast, only inoculation of the citrullinatedform of mFBG was associated with production of specificIgG [16]. However, no arthritis signs appeared in the ani-mals that developed an autoimmune response against FBG[15,16].
Mice and rats often exhibit differences in their suscepti-bilities to stimuli designed to trigger autoimmune disorders.For instance, compared to mice, rats are more susceptible toexperimental autoimmune encephalomyelitis [17], experi-mental autoimmune myasthenia gravis [18] or adjuvant-induced arthritis [19]. This prompted us to evaluate theimmunogenic and arthritogenic properties of autologouscitrullinated FBG (rFBG) in the rat. In particular, we usedLewis (LEW) and Brown–Norway (BN) rats, which are pow-erful models of human immunopathological disordersbecause they show an inverse polarization of their immune
responses and susceptibility to experimentally inducedimmunological disorders [20,21].
Materials and methods
Rats
Female LEW and BN rats (8–9 weeks old) were obtainedfrom the Centre d’Élevage R. Janvier (Le Genest St Isle,France) and maintained in our animal house facilityunder specific pathogen-free conditions. All procedures werein accordance with national regulations on animalexperiments.
In vitro
citrullination of rat fibrinogen
Rat FBG (rFBG) (purified from plasma and containing atleast 90% of clottable protein; Sigma, Saint Quentin Fallavier,France) was further purified to eliminate residual contami-nation by IgG using affinity chromatography on a protein-Gcolumn (HiTrap® protein G, 5 ml; Amersham Biosciences,Orsay, France) according to the manufacturer’s protocol.After that purification step, the percentage of IgG contami-nation was estimated as 0·1% or less. Citrullination was thenperformed with rabbit skeletal muscle PAD enzyme (PAD2,7 U/mg rFBG, Sigma) in 0·1 M Tris-HCl (pH 7·4), 0·5 MNaCl, 10 mM CaCl
2
and 5 mM DTT for 2 h at 37
°
C at anrFBG concentration of between 1·8 and 3·8 mg/ml (varyingfrom batch to batch). Citrullinated rFBG is designated as C-rFBG. Control non-citrullinated rat fibrinogen (NC-rFBG)was incubated in citrullination buffer alone. After citrullina-tion, buffer exchange to phosphate-buffered saline (PBS)pH 7·4 containing 0·5 M NaCl was performed in regeneratedcellulose dialysis tubing (Spectra/Por®3, 3500 MWCO; Spec-trum Laboratories, Inc., Interchim, Montluçon, France).Dialysis was pursued until complete reassembly of the sixconstitutive chains of the rFBG molecule (two A
α
-, two B
β
-and two
γ
-chains), monitored by sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under non-reducing conditions. Efficient citrullination was checked byimmunoblotting using an antibody able to recognize any cit-rullinated protein (purified rabbit IgG to modified citrullylresidues, a generous gift from Dr T. Senshu, Graduate Schoolof Integrated Science, Yokohama City University, Yokohama,Japan), as described previously [6].
Inoculation of rats with autologous fibrinogen
Rats were injected subcutaneously on the back with 10
µ
g or50
µ
g of C-rFBG or NC-rFBG emulsified in completeFreund’s adjuvant (CFA) containing 1 mg/ml heat-killed
Mycobacterium tuberculosis
H37Ra (Difco Laboratories Inc.,Detroit, MI, USA). A second inoculation was performed4 weeks after the first, either intraperitoneally or intrader-mally with 50
Induction of ankle joint inflammation and clinical evaluation
Female LEW rats were injected with 50
µ
l IFA into the rightankle joint. PBS (50
µ
l) was injected into the left ankle jointas control. The clinical severity of hind paw inflammationwas monitored using a macroscopic scoring system from 0 to3 according to changes in redness and swelling (0
=
nochanges; 1
=
detectable; 2
=
moderate; 3
=
severe redness andswelling of the entire paw).
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) detection of serum antibodies to C-rFBG, to NC-rFBG and to PAD
Rats inoculated with C-rFBG or NC-rFBG were bled fromthe retro-orbital sinus at regular intervals after the first inoc-ulation and sera were collected individually. For the detec-tion of Ig specific for C-rFBG, NC-rFBG or PAD enzyme inthese sera, microtitre plates (MaxiSorp; NUNC, VWRInternational, Fontenay-sous-Bois, France) were coatedovernight at 4
°
C with 5
µ
g/ml of PBS-diluted C-rFBG orNC-rFBG or rabbit skeletal muscle PAD, respectively. Theplates were then blocked with PBS containing 2% bovineserum albumin (BSA) (Sigma; PBS–BSA) and 100
µ
l/well ofrat serum diluted to 1 : 50 in PBS–BSA containing 2 M NaClwas added. Bound total IgG or IgM were detected using per-oxidase-conjugated in-house-produced polyclonal sheepantibodies to rat IgG (kindly provided by E. Druet, InstitutNational de la Santé et de la Recherche Médicale U28, Tou-louse, France) or polyclonal goat antibodies to rat IgM(SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA), respectively. Todetect IgA, plates were incubated with a mouse monoclonalantibody (MoAb) to rat IgA (clone MARA-1) (LO/IMEX;University of Louvain, Brussels, Belgium) then with peroxi-dase-conjugated goat anti-mouse IgG (H
+
L) (Zymed Lab-oratories, San Francisco, CA, USA). Alternatively, boundIgG1, IgG2a or IgG2b were detected using biotinylatedmouse MoAb to rat IgG1 (clone MARG1-2), to rat IgG2a(clone MARG2a-1) or to rat IgG2b (clone MARG2b-3),respectively (LO/IMEX), followed by incubation with per-oxidase-conjugated streptavidin (Amersham, Little Chal-font, Bucks, UK). All incubations were performed for 1 h at4
°
C and followed by three washes in PBS containing 0·1%(v/v) Tween-20 (Sigma). Peroxidase activity was revealed by2 mg/ml orthophenylene diamine dihydrochloride, 0·03%H
2
O
2
in 35 mM trisodium citrate, 40 mM Na
2
HPO
4
at a pHadjusted to 5 with orthophosphoric acid. The reaction wasstopped by 6 N H
2
SO
4
and the OD at 492 nm was measuredwith an automated plate reader (VersAmax; MolecularDevices, Menlo Park, CA, USA).
In competition experiments, the ELISA IgG reactivity toC-rFBG of two representative sera of LEW rats inoculated
with C-rFBG (day 53) was assayed in the presence of PADenzyme. ELISA was performed exactly as mentioned above,except that the sera were tested at a dilution resulting in anOD of
∼
1·0 on C-rFBG (1 : 150). PAD enzyme was added tothe serum dilution 1 h prior to the ELISA testing, at a 0·5, 1,2, 5 or 10
µ
g/ml final concentration. As control, one of thesera incubated with increasing concentrations of PADenzyme was also tested simultaneously by ELISA on PAD.The IgG reactivities obtained in the presence of soluble PADwere expressed as the percentage of those obtained withoutPAD (considered as 100%).
Immunoblotting
C-rFBG and NC-rFBG were separated by SDS-PAGE onover-migrated 12% polyacrylamide gels. Over-migrationwas monitored using pre-stained molecular weight stan-dards (low range, Bio-Rad Laboratories, SA, Marnes LaCoquette, France) and performed until the ovalbuminstandard reached the bottom of the gel. The gels werethen electrotransferred onto reinforced nitrocellulosemembranes (Hybond
™
C extra, Amersham) and mem-brane strips (
∼
1·36
µ
g antigen/strip) were cut and immu-nodetected by several primary probes diluted in 40 mMTris-HCl buffer (pH 8·0) containing 150 mM NaCl, 0·05%Tween-20 and 2·5% powdered skimmed milk (blottingbuffer). The primary probes included the sera of ratsinoculated with C-rFBG or with NC-rFBG (all diluted to1 : 1000), a pool of ACPA-positive sera or individualACPA-positive sera from human patients with RA (alldiluted to 1 : 1000), a sheep anti-serum directed to theA
α
-chain of hFBG and cross-reactive to the A
α
-chain ofrFBG (1 : 250; Cambio, Cambridge, UK), a rabbit anti-serum directed to the B
β
-chain of hFBG and cross-reactive to the B
β
-chain of rFBG (1 : 100 000; Cambio), asheep anti-serum directed to the
γ
-chain of hFBG andcross-reactive to the
γ
-chain of rFBG (1 : 500; Cambio),an antibody reactive to rabbit PAD2 (1
µ
g/ml, purifiedrabbit Ig raised against peptides derived from thesequence of human PAD2 22 and the purified rabbit IgGto modified citrullyl residues. On the membrane stripsthat were probed with the latter antibodies (0·02
µ
g/ml),citrullyl residues were chemically modified previously, asdescribed elsewhere [6]. Peroxidase-conjugated secondaryprobes were used for the detection of all the primary anti-bodies: sheep polyclonal antibodies to rat IgG, protein-A(Sigma), goat antibodies to rabbit IgG (H
+
L) (Southern-Biotech, Inc., Clinisciences, Montrouge, France) and rab-bit F(ab
′
)2 fragments to sheep IgG (Southern Biotech.Inc.) for the detection of rat, human, rabbit and sheepIgG, respectively. Peroxidase activity was visualized usingECL
™
reagents (Amersham), as suggested by the manufac-turer. Negative controls included probing with the second-ary probe only.
- 137 -
Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen
Rat hind paws were collected immediately after killing byaorta sectioning under anaesthesia. After removal of the skin,ankles were fixed for 48 h in Bouin’s solution, then decalci-fied in 0·5 M disodium ethylene diamine tetraacetate, pH 7·4and embedded in paraffin. After sectioning (5-
µ
m), thespecimens were stained with haematoxylin and eosin.
Statistical analysis
Results are shown as the mean
±
s.d. and overall differencesbetween medians were evaluated by the Mann–Whitney
U
-test.
Results
Inoculation of LEW and BN rats with autologous citrullinated fibrinogen induces production of specific autoantibodies
To investigate the effect of citrullination on the immuno-genic property of autologous FBG, LEW and BN rats were
inoculated with 50
µ
g of C-rFBG or of NC-rFBG emulsifiedin CFA (at day 0) followed, 32 days later, by a second chal-lenge with 50
µ
g of antigen emulsified in IFA. The same anti-genic preparations were used in both rat strains. The sera ofthese animals were collected at different time-points andanalysed by ELISA for the presence of Ig directed to C-rFBGor to NC-rFBG (Fig. 1). The sera of rats inoculated with NC-rFBG did not recognize NC-rFBG or C-rFBG, even after thesecond inoculation of this antigen. In contrast, following asingle injection of C-rFBG, all rats developed an IgG, IgMand IgA autoimmune response directed mainly to the citrul-linated form of rFBG (Fig. 1a–c). Although the IgG responseto C-rFBG was higher in LEW than in BN rats, the time-course of this response was very similar in both rat strains.Maximal levels of IgG reactive with C-rFBG were obtainedaround day 30, i.e. before the second antigenic challenge.Surprisingly, the second immunization with C-rFBG did notinduce a secondary humoral immune response. Indeed, insera collected after the second inoculation (at days 42, 53 and67), IgG reactivity to C-rFBG was similar to that obtained atday 32, suggesting that the first challenge with antigen failed
Fig. 1.
Citrullination of autologous fibrinogen induces breakdown of tolerance to this autoantigen in Lewis (LEW) and Brown–Norway (BN) rats.
Rats were inoculated subcutaneously with citrullinated rat fibrinogen (C-rFBG) (white bars; LEW: five rats, BN: four rats) or non-C-rFBG (NC-rFBG)
(black bars; LEW: four rats, BN: five rats) in complete Freund’s adjuvant (CFA) (day 0). A second inoculation was performed intraperitoneally with
antigen emulsified in incomplete Freund’s adjuvant (IFA), 32 days after the first injection. The titres of total IgG (a), IgM (b) and IgA (c) reactive to
C-rFGB and NC-rFBG were measured by enzyme-linked immunosorbent assay at different times after the first inoculation as indicated. Results
(LEW rats: left panels, BN rats: right panels) are expressed as the mean OD at 492 nm obtained with the different rat sera diluted to 1 : 50 (
to induce the generation of memory immune cells. Interest-ingly, the IgM and IgA response followed the same courseand did not rise following the second antigenic challenge.Moreover, in another independently conducted experimentthere was no difference in the mean maximal IgG reactivityto C-rFBG between groups that were re-inoculated or notwith C-rFBG at day 32 (data not shown). In LEW rats severalprotocols of immunization were tested using different dosesof antigen at the first inoculation (10
µ
g or 50
µ
g) and dif-ferent adjuvants (IFA or Alum) or different sites of injection(intraperitoneally or intradermally) at the second inocula-tion. None of these conditions allowed the development of asecondary antibody response after re-inoculation with 50
µ
gof C-rFBG (data not shown).
The IgG reactivity to C-rFBG and to NC-rFBG was alsotested by immunoblotting using sera of LEW rats inoculatedwith C-rFBG or with NC-rFBG obtained from two indepen-dent experiments (Fig. 2). With the sera of rats inoculatedwith NC-rFBG, we did not find antibodies reactive with C-
rFBG or NC-rFBG. In contrast, the sera of rats inoculatedwith C-rFBG, exhibited reactivity with the citrullinatedforms of the A
α
- and of the B
β
-chain of rFBG. Similarly towhat is generally observed with ACPA-positive human RAsera [6], the rat sera tested exhibited no reactivity to the cit-rullinated form of the
γ
-chain. Using these immunoblottingconditions, no reactivity to NC-rFBG was detected. Overall,the results of this immunoblotting analysis are in accordancewith those of the ELISA analyses.
Because the C-rFBG preparation contained the rabbitskeletal muscle PAD enzyme that was used for citrullination(representing
∼
1% of the total protein content), the IgGimmune response to this PAD was also evaluated by ELISA.In the sera of LEW rats inoculated with C-rFBG, IgG reactivewith PAD were clearly detected while, as expected, they wereabsent from the sera of rats inoculated with NC-rFBG(Fig. 3a). IgG reactivity to PAD enzyme was also detectableby immunoblotting (Fig. 2). Interestingly, the IgG responseto PAD increased rapidly after day 32 corresponding to the
Fig. 2.
The serum of Lewis (LEW) rats inocu-
lated with citrullinated rat fibrinogen (C-rFBG)
is strongly reactive to the A
α
- and B
β
-chains of
C-rFGB. LEW rats were inoculated with C-rFGB
or with non-C-rFBG (NC-rFGB). The serum of
these rats, obtained from two independent
experiments at around day 45 after inoculation,
was analysed by immunoblotting on NC-rFBG
(a) and on C-rFBG (b). The rabbit skeletal mus-
cle peptidylarginine deiminase (PAD) enzyme
present in the C-rFBG preparation was detected
using PAD2-specific antibodies (anti-PAD2). An
antibody able to recognize any citrullinated pro-
tein (anti-citrulline) was used to check efficient
citrullination of the three A
α
- B
β
- and
γ
-chains
constitutive of rFBG. These three constitutive
chains (and bands probably corresponding to
their degradation or polymerization products)
were identified using specific anti-sera (anti-A
α
,
anti-B
β
and anti-
γ
) and are shown with filled
diamonds, vertical bars and filled arrowheads,
respectively. Identification of the three A
α
- B
β
-
and
γ
-chains constitutive of C-rFBG was con-
firmed using a pool of anti-citrullinated protein
autoantibody (ACPA)-positive sera from human
rheumatoid arthritis (RA) patients reactive with
both the A
α
- and the B
β
-chain of
in vitro
citrul-
linated human fibrinogen (hFBG), and individ-
ual sera from three ACPA-positive RA patients
characterized previously as being differently
reactive to the A
α
-, B
β
- and
γ
-chains of citrulli-
nated hFBG [6]: a serum reactive only to the A
α
-
chain (A
α
+
B
β
-
γ
- RA serum), a serum reactive
only to B
β
-chain (A
α
-B
β
+
γ
- RA serum) and a
serum reactive to both the A
α
- and the
γ
-chain
(A
α
+
B
β
-
γ +
RA serum). Apparent molecular
masses (kDa) are indicated on the left.
g-chain
Aa-chainBb-chainAa-chaing-chainAa-chain
170
(a)
NC
-rF
BG
116
97
76
66
53
45
g-chain
PAD2
Aa-chain
Bb-chain
g-chain
170
(b)
C-r
FB
G
116
97
76
66
53
45
Ant
i-citr
ullin
e
Ant
i-PA
D2
Ant
i-Aa Serums of rats
inoculatedwith C-rFBG
Serums of ratsinoculated
with NC-rFBGAnt
i-Bb
Aa+
Bb-g-
RA
ser
um
Poo
l of R
A s
erum
s
Aa-
Bb+
g- R
A s
erum
Aa+
Bb-g+
RA
ser
um
Ant
i-g
- 139 -
Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen
second inoculation of C-rFBG (Fig. 3a) showing that, in thiscase, the first inoculation led to the development of PAD-specific memory B cells. In order to assess the contributionof the reactivity to PAD in the OD obtained in the ELISA
using C-rFBG as immunosorbent, PAD enzyme was used asa competitor. Whereas the addition of PAD in sera of LEWrats inoculated with C-rFBG was able to strongly inhibit theIgG reactivity against PAD, it virtually did not affect the reac-tivity against C-rFBG (Fig. 3b).
On the whole, the results obtained demonstrate clearlythat inoculation of C-rFBG induces production of IgG anti-bodies directed mainly to citrullinated determinants ofrFBG, but that antigen-specific mechanisms regulate anti-body production.
In LEW and BN rats, autologous citrullinated fibrinogen induces production of different IgG subclasses
In the rat, IgG1 and IgG2a production are associated withtype 2 cytokines while IgG2b depends on type 1 immuneresponses [20,23,24]. Because LEW and BN rats differ mark-edly in the polarization of their autoimmune responses[20,21], we determined the isotype profile of the IgG reactivewith C-rFBG obtained in both strains after inoculation ofthis antigen. As shown in Fig. 4, at day 32 after the first chal-lenge with 50 µg of C-rFBG the titres of IgG1 and IgG2adirected to C-rFBG were similar in both strains, whereas thetitres of Ag-specific IgG2b were higher in LEW rats. Similarprofiles of IgG subclasses were obtained at different timesafter the second inoculation of C-rFBG (days 42, 53 and 67)(data not shown). These results demonstrate that C-rFBGinduces a different polarization of the immune response inLEW and BN rats: in LEW rats, both Th1- and Th2-typeimmune responses were generated, whereas in BN rats aTh2-type immune response was preferentially induced.
The autoimmune response to autologous citrullinated fibrinogen is not spontaneously arthritogenic
LEW (n = 28) and BN (n = 5) rats that had been inoculatedwith C-rFBG following our ‘standard’ immunization proto-col (50 µg of C-rFBG emulsified in CFA followed, 32 daysafter, by a second challenge with 50 µg of antigen emulsifiedin IFA) were examined daily for clinical signs of arthritis(redness and swelling of the paws). All these animals were stillfree of arthritis 3 months after the first sensitization with C-rFGB. Moreover, none of the other different immunization
Fig. 3. The peptidylarginine deiminase (PAD) included in the citrulli-
nated rat fibrinogen (C-rFBG) preparation induces primary and sec-
ondary IgG responses that do not significantly contribute to the OD
obtained by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using C-
rFBG as immunosorbent. Lewis (LEW) rats were inoculated subcutane-
ously with C-rFGB (grey diamonds; five rats) or non-C-rFBG (black
squares; four rats) in complete Freund’s adjuvant (CFA) (day 0). A
second inoculation was performed intraperitoneally with antigen emul-
sified in incomplete Freund’s adjuvant (IFA) 32 days after the first injec-
tion. The titres of IgG reactive to PAD enzyme were measured by ELISA
on days 12, 21, 32, 42, 53 and 67 after the first inoculation (a). Results
are expressed as OD at 492 nm of serum diluted to 1 : 50. The sera of
two LEW rats obtained at day 32 after inoculation of C-rFGB were also
tested in a competition assay using PAD enzyme as competitor (b). The
ELISA plates were coated with C-rFBG (also containing minute amounts
of PAD) (grey diamonds) or PAD enzyme (white triangles, only one
serum tested). Results are expressed as the percentage of the OD
obtained in the absence of competing PAD enzyme (considered as
100%).
3
IgG reactivity to PAD(a)O
D (
492
nm)
2
1
00 10 20 30 40 50
Days after first inoculation
60 70
(b)
0
40
80
120
0 2 4
PAD (mg/ml)
IgG reactivity to C-rFBG or PADin the presence of competing PAD
% B
indi
ng
6 8 10
Fig. 4. In Lewis (LEW) and Brown–Norway
(BN) rats, inoculation of citrullinated rat fibrin-
protocols that were tested in LEW rats (see above) inducedclinical signs of joint inflammation within the 2–3 monthsfollowing the first sensitization. We also looked for histolog-ical signs of inflammation by examination of haematoxylinand eosin-stained sections of the hind paw of four LEW andfour BN rats, 3 months after immunization with C-rFBG fol-lowing our standard protocol. This histological approachconfirmed that no signs of inflammation were induced inanimals immunized with C-rFBG. Together, these findingsshow that the autoimmune response to C-rFBG is not spon-taneously arthritogenic both in LEW and in BN rat strains.
The autoimmune response to autologous citrullinated fibrinogen is not able to aggravate acute arthritis
We then tested the capacity of the autoimmune response toC-rFBG to aggravate non-specifically induced joint inflam-mation. A previous study had shown that intra-articular
injection of mineral oils such as squalene (50 µl) or IFA(10 µl) in female DA rats induced moderate joint inflamma-tion by day 6, with oedema of synovial tissues containingmany polymorphs and monocytes/macrophages, followed byinduction of a severe arthritis, reaching a peak on day 21,with marked hyperplasia of the synovial tissue and recruit-ment of pathogenic T cells [25]. We tested the effect of intra-articular injection of IFA in female LEW rats. This rat strainwas chosen because, in comparison with the BN rats, LEWrats exhibited a higher IgG response when challenged with C-rFBG (Fig. 1). IFA (50 µl) was injected into the right anklejoint and, as control, PBS was injected into the left anklejoint. Intra-articular injection of IFA induced very transitoryacute inflammation: the first clinical signs, including rednessand swelling of the injected paw, occurred 1 day after injec-tion, with maximal severity at days 2–5, then progressiverecession and complete disappearance at around day 18(Fig. 5a). Animals were followed-up until 25 days after the
Fig. 5. Intra-articular injection of incomplete Freund’s adjuvant (IFA) in the ankle of Lewis (LEW) rats induces a very transitory acute inflammation.
Naive LEW rats (n = 7) were injected with 50 µl of IFA into the right ankle joint (day 0). As a control, phosphate-buffered saline (PBS) (50 µl) was
injected into the left ankle joint. The right and left hind paws of all animals were examined daily for clinical signs of inflammation. The results are
expressed in (a) as the mean daily clinical score (± s.d.) of the IFA-injected and of the PBS-injected ankles (white and black symbols, respectively) and
correspond to one representative out of two independent experiments. Three days after the intra-articular injections, the left (PBS) and right (IFA)
hind paws of the rats were photographed (b) and analysed histologically after haematoxylin and eosin staining of tissue sections (c, scale bars = 50 µm).
0
1
2
Mea
n cl
inic
al s
core
s 3
4
0 2 4 6 8Days after IFA injection
Time-course of arthritis in IFA-injected paws
10 12 14 16
(b)
(a)
PBS
IFA
(c)
PBS
IFA
- 141 -
Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen
intra-articular injection and no signs of joint inflammationrelapse were observed. The presence of severe inflammation(redness and swelling) at day 3 after IFA injection can be seenclearly in the right ankle photographs presented in Fig. 5b. Atthat time-point, histological analysis after haematoxylin andeosin staining indicated marked hyperplasia of the synovialtissue with thickening of the lining layer and dense infiltra-tion with polynuclear cells, macrophages and lymphocytes(Fig. 5c). In contrast, intra-articular injection of PBS inducedno clinical or histological signs of inflammation (Fig. 5).
Intra-articular injection of IFA was also performed in ratsinoculated previously with C-rFBG when the titre of autoan-tibodies had reached the maximal level (at day 38 after theinoculation). As controls, the intra-articular injection of IFAwas performed on age-matched naive rats or on age-matched rats inoculated previously with NC-rFBG. Thetime-course of inflammation was very similar between naiverats and age-matched rats inoculated previously with CFAonly (data not shown), indicating that previous exposure tothe mineral oil that enters into the composition of both theCFA and IFA emulsions has no effect on the kinetics of theinflammation it induces when injected into the ankle joint.The course of ankle inflammation in rats inoculated with C-rFBG was similar to that observed in control rats (Fig. 6).These data show that the transitory inflammation inducedby intra-articular injection of IFA in female LEW rats followsan identical course in the absence or presence of an immuneresponse to citrullinated fibrin.
Discussion
In the present study, we have shown that FBG can becomeimmunogenic upon citrullination, allowing the develop-ment of an IgG autoimmune response directed essentially tocitrullinated determinants. In comparison with the mousestudies already mentioned, it should be stressed that in therat, much lower amounts of autologous citrullinated FBG
were immunogenic as a single injection of 50 µg of antigeninduced a specific IgG reactivity detectable 12 days afterinoculation. This can be compared with four inoculations of50 µg of citrullinated mFBG in CFA that did not induce anysignificant antibody response in B10.S mice [15] and with50 µg per week during 10 weeks in the presence of adjuvant(CFA or LPS), necessary for efficient immunization of Balb/c mice [16]. Moreover, whereas the majority of the autoan-tibodies cross-reactive with mFBG obtained after immuni-zation of mice with hFBG are IgG1 [26], a Th2-dependentIgG subclass that cannot activate the classical pathway ofcomplement [27,28], in both LEW and BN rats, both com-plement- and FcγR-fixing C-rFBG-reactive IgG were gener-ated, holding the prospect of multiple potentially pathogeniceffector mechanisms. This is similar to what is observedin human RA where ACPA are mainly IgG1 [29], i.e. canboth activate FcγR- and classical complement-dependentpathways.
Another recent study showed that, in rats, citrullination ofan abundant circulating autologous protein, albumin, madeit able to elicit an IgG antibody response upon inoculationwith IFA whereas the native form was not immunogenic[30]. The ability of FBG or albumin to break tolerancedepending on whether it is or is not citrullinated is probablyrelated to differences in the degree of exposure of theimmune system to these two molecular forms. The nativeforms are very abundant (in mammals the blood FBG andalbumin concentration is in the range of g/l and of 101 g/l,respectively) and the very important physiological functionsthey fulfil call for immunological tolerance. On the otherhand, in the case of albumin the conditions necessary forgenerating the citrullinated forms of these proteins are eithertotally unknown (its in vivo occurrence actually remains tobe established), or in the case of fibrin are thought to be asso-ciated with tissue inflammation [31,32]. This suggests amuch lower pressure for tolerance of the citrullinated formsof these autoantigens.
Fig. 6. In Lewis (LEW) rats, pre-immunization with citrullinated rat fibrinogen (C-rFBG) does not aggravate the arthritis induced by intra-articular
injection of incomplete Freund’s adjuvant (IFA). Age-matched naive LEW rats (grey symbols or bars; 12 rats) and LEW rats inoculated with C-rFGB
(white symbols or bars; 14 rats) or with non-C-rFBG (black symbols or bars; 12 rats) were injected with IFA into the ankle joint 38 days after the first
antigen inoculation, and examined daily for clinical signs of inflammation. The results are expressed as the mean daily clinical score of the right hind
paw in each experimental group (a), and as the mean cumulative clinical score ± s.d. (calculated as the sum of the daily clinical scores from day 1
to day 13) in each experimental group (b). Results represent the pooled data of three independent experiments.
Even though we were able to readily induce an autoim-mune response to C-rFBG, we could not find a way to elicita secondary immune response to it. This probably arisesfrom the existence of mechanisms able to exert strong neg-ative control on the developing immune response. Theestablishment of such mechanisms could be related to theconcomitant development of a response to NC-rFBG, asindicated by the presence of a low reactivity to this antigen inthe sera of LEW rats inoculated with C-rFBG. It was indeedshown that memory cells able to mount a strong secondaryresponse do not persist in mice, where the immune responseelicited with hFBG is the most strongly cross-reactive withautologous FBG [26]. This was shown to be due to anunknown antigen-specific regulation process, apparently notrelated to exhaustion of autoimmune reactive T cells or tothe presence of antigen-specific regulatory T cells [26]. Inour study, the absence of a secondary response following thesecond antigenic challenge concerned only C-rFBG and notthe PAD present in the antigen preparation. This also pointsto the existence of antigen-specific down-modulation mech-anisms. Alternatively, it could be that a secondary B cellresponse to C-rFBG cannot be generated because of the lackof appropriate cognate T cell help, even though the genera-tion of IgG and IgA reactive to C-rFBG following the firstimmunization is highly suggestive of specific T cell helpavailable at least in the primary response.
Concerning the arthritogenic character of C-rFBG, thestudy we performed in the rat agrees with the mouse studiesin finding that the autoimmune response to native or citrul-linated autologous FBG cannot induce joint inflammationspontaneously. Fibrin deposition in the synovial tissue is sec-ondary to the inflammation. Citrullination of fibrin depositsin the tissue also occurs as a consequence of the synovitis[31,32]. We proposed recently that ACPA play an importantrole in the chronic character of human rheumatoid synovitisarguing that, in the synovial tissue, the immunological con-flict between ACPA and citrullinated fibrin is self-fuelling, asthe inflammation it induces leads to the formation of newfibrin deposits that will become citrullinated secondarily bya locally expressed PAD enzyme [32]. Following this hypoth-esis, one can speculate that the lack of arthritogenicity of theautoimmune response to C-rFBG is related to the absence ofits antigenic target, citrullinated fibrin, in the synovial tissueof the immunized rats. We tested whether the presence of anautoimmune response to citrullinated fibrin would aggra-vate joint inflammation induced by intra-articular injectionof IFA. Injection of 50 µl of IFA into the ankle joints offemale LEW rats, however, induced arthritis that followed anidentical course in the presence or absence of autoantibodiesto C-rFBG. However, immunochemical analysis of proteinextracts of the synovial tissue of IFA-injected ankle jointsobtained at the time of maximal arthritis severity (3 daysafter the intra-articular injection) actually showed the pres-ence of small amounts of fibrin but not of its citrullinatedform (data not shown). This observation is probably related
to the short duration of the arthritis we induced, briefer thanthat obtained by intra-articular injection of 5-times loweramounts of IFA into the ankle joint of female Dark Agouti(DA) rats [25]. Indeed, it was shown that the presence of cit-rullinated proteins in the joints of DA rats with arthritisinduced by autologous collagen type II (CII) is correlatedwith the degree of joint inflammation, appearing only atleast 7 days after the onset of clinical and histological signs ofarthritis and still rising 24 days after and paralleling theincrease in arthritis severity [30]. On the other hand, in ourarthritis model 7 days after onset, the arthritis is alreadymarkedly waning and, 24 days later, it has disappearedcompletely.
Interestingly, in the rat strain LEW.1AV1 it was shown thatthe arthritis induced by autologous citrullinated CII had anearlier onset and a higher incidence than that induced by thenon-citrullinated form of this antigen [30]. Moreover, it wasshown very recently that mice with CIA develop IgG anti-bodies specific for the citrullinated forms of proteins andpeptides (notably the citrullinated form of the β-chain ofhFBG), appearing early after immunization with bovine CII,even before joint swelling is observed [33]. This is in drasticcontrast with previous reports on the absence of such citrul-line-specific antibodies in the same strain of mice with CIAand could be related to subtle differences in the immuniza-tion protocols [31,34]. Moreover and importantly, althoughthe biochemical nature of the autoantigen(s) that these anti-bodies recognize in arthritic mice is still elusive, their arthri-togenic role was demonstrated clearly. First, mice tolerizedwith a citrulline-containing peptide fail to develop theseautoantibodies upon challenge with CII and demonstratereduced severity and incidence in their CIA. Secondly,murine MoAbs reactive with citrullinated hFBG derivedfrom mice with CIA enhance arthritis when co-administeredwith a submaximal dose of a pool of anti-CII antibodies[33]. However, it remains to be evaluated whether the coursetaken by arthritis presenting abundant citrullinated fibrindeposits is influenced by previous immunization with autol-ogous C-FBG. For instance, if DA rats can develop anautoimmune response to C-rFBG, it would be interesting touse this strain to evaluate the influence of this response onthe arthritis induced by intrarticular injection of IFAbecause, as mentioned, in comparison with the LEW ratstrain, DA rats develop an arthritis that lasts longer [25] andis therefore associated more probably with formation of cit-rullinated fibrin deposits. Evaluation of the effect of previoussensitization with C-rFBG on collagen-induced arthritis(CIA) can also be proposed. Indeed, although it has not beendemonstrated formally, it is highly probable that at least partof the extracellular citrullinated proteins present in the jointsof DA rats with arthritis induced with autologous CII corre-spond to citrullinated fibrin [30]. Moreover, the presence ofcitrullinated fibrin-related proteins in the arthritic joints ofmice with CIA or streptococcal cell-wall-induced arthritishas been demonstrated clearly [31].
- 143 -
Immunogenicity and arthritogenicity of autologous citrullinated fibrinogen
In conclusion, our study has shown for the first time in therat that an autoimmune response to autologous fibrinogencan be induced by specific immunization with its citrulli-nated form but that this response is neither spontaneouslyarthritogenic nor able to aggravate arthritis that is not asso-ciated with the formation of citrullinated fibrin deposits.However, the pathogenic role of an induced autoimmuneresponse to citrullinated fibrin in animal models with citrul-linated fibrin deposits remains to be established formally.This would strongly support the hypothesis of the role ofACPA in the maintenance of human rheumatoid synovitis.Moreover, such models should prove very useful not only fordissection of the pathophysiological pathways involved butalso for the assessment and validation of new therapeuticapproaches for human RA.
Acknowledgements
This study was supported by grants from the Toulouse IIIUniversity, the CNRS, the INSERM and the ‘Associationpour la Recherche sur la Polyarthrite’. The technical assis-tance of Ms R. Llobera is gratefully acknowledged. We alsothank M. Calize, P. Aregui and A. Boyer (Service de zootech-nie, IFR-30, Toulouse) for taking care of the animal houseand Dr T. Al Saati and Ms F. Capilla (Plateau technique d’his-topathologie expérimentale, IFR-30) for their assistance inhistological analyses.
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- 226 -
Annexes
- 227 -
Annexe 2
Communications à Congrès
1. Congrès Régionaux
1. Foulquier C. Peptidyl-arginines désiminases du tissu synovial rhumatoïde. 4° Journée d’Immuno-Rhumatologie du Grand Sud, GEMENOS, juin 2006.
2. Foulquier C, Sebbag M, Clavel C, Chapuy-Regaud S, Al Badine R, Méchin M-C, Vincent C, Nachat R, Michiyuki Yamada M, Takahara H, Simon M, Guerrin M, Serre G. Dans le tissu synovial rhumatoïde, seules les peptidyl-arginine désiminases 2 et 4 sont exprimées ; leur expression est corrélée à l’intensité de l’inflammation. 5° Journée d’Immuno-Rhumatologie du Grand Sud, SEILH, juin 2007.
2. Congrès Nationaux
1. Chapuy-Regaud S, Foulquier C, Sebbag M, Méchin M-C, Nachat R, Baeten D, Senshu T, Yamada M, Takahara H, Guerrin M, Simon M, De Keyser F, Serre G. Isoformes de peptidyl-arginine désiminase exprimées dans les membranes synoviales rhumatoïdes. 14ème Journée de l’Association pour la Recherche sur la Polyarthrite, PARIS, octobre 2003.
2. Foulquier C, Chapuy-Regaud S, Nachat R, Méchin M-C, Guerrin M, Simon M, Senshu T, Yamada M, Takahara H, Serre G, Sebbag M. Peptidylarginine deiminase isoforms expressed in the synovial membrane of rheumatoid arthritis patients. Congrès 2005 de la Société Française d’Immunologie et du Club Francophone des Cellules Dendritiques, TOULOUSE, novembre 2005.
3. Duplan V, Foulquier C, Clavel C, Serre G, Saoudi A, Sebbag M. Chez le rat, la citrullination du fibrinogène autologue le rend immunogène mais la réponse auto-immune induite n'est pas spontanément arthritogène. 16ème Journée de l’Association pour la Recherche sur la Polyarthrite, PARIS, novembre 2005.
3. Congrès Internationaux Anglophones
1. Chapuy-Regaud S, Sebbag M, Nachat R, Baeten D, Foulquier C, Simon M, Senshu T, Yamada M, Takahara H, De Keyser F, Serre G. Peptidylarginine deiminase isoforms expressed in the synovial membrane of rheumatoid arthritis patients. 23rd European Workshop for Rheumatology Research, MARSEILLE, February 2003. Arthritis Res 5, Suppl 1:A5, 2003.
2. Duplan V, Foulquier C, Clavel C, Serre G, Saoudi A, Sebbag M. In the rat, citrullination of autologous fibrinogen makes it immunogenic, but the induced autoimmune response is not spontaneously arthritogenic. 26th European Workshop for Rheumatology Research, HERAKLION, February 2006. Ann Rheum Dis 65, Suppl 1, A19, 2006.
3. Foulquier C, Sebbag M, Clavel C, Chapuy-Regaud S, Méchin M-C, Yamada M, Takahara H, Simon M, Guerrin M, Serre G. Peptidylarginine deiminase 6 does not contribute to the generation of the synovial targets of the rheumatoid arthritits-specific autoantibodies to citrullinated proteins. 27th European Workshop for Rheumatology Research, FIRENZE, February 2007.
BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIEDISCUSSION GÉNÉRALE
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
DISCUSSION GÉNÉRALE
RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX
INTRODUCTION
DISCUSSION GÉNÉRALE
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