ESTUDIO DE LOS PRINCIPALES FACTORES CINETICOS DE LA FOSFATASA ACIDA. Experimento 1: Efecto del tiempo. Tubo Nº B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 Buffer acetato 0.1 M pH 5 p-Nitrofenilfosfato 1x10 -2 M. Agua destilada Preincubar 2 min a 37 o C (min) Enzima Incubar a 37 o C (min) NaOH 1N 1.0 0.2 0.8 - 1 3.0 1.0 0.2 0.7 0.1 1 3.0 1.0 0.2 0.8 - 2 3.0 1.0 0.2 0.7 0.1 2 3.0 1.0 0.2 0.8 - 5 3.0 1.0 0.2 0.7 0.1 5 3.0 1.0 0.2 0.8 - 10 3.0 1.0 0.2 0.7 0.1 10 3.0 UK Tubo UK Neta Ab Tiempo (min) Concentración (µmol) Velocidad (µmol/min) 102 195 103 236 107 320 105 405 B1 1 B2 2 B3 3 B4493 133 213 300 0.186 0.266 0.426 0.600 1 2 5 10 10.33 14.77 23.66 33.33 0.051 0.0740.133 0.166 La medida de la rapidez de reacción implica la medida de la concentración de uno de los reactivos o productos a lo largo del tiempo, esto es, para medir la rapidez de una reacción necesitamos medir, bien la cantidad de reactivo que desaparece por unidad de tiempo, o bien la cantidad de producto que aparece por unidad de tiempo. 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0 2 4 6 8 10 12 V l o c i d a d Tiempo (min)
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Experimento 2: Efecto de la Concentración de enzima.
Tubo Nº B1 1 2 3 4
Buffer Acetato 0.1 M pH5
p-Nitrofenilfosfato
1X10
2
mAgua destilada
Preincubar 2 min a 37oC
Enzima
Incubar 3 mina 37OC
NaOH 1N
1.0
0.2
0.8
-
3.0
1.0
0.2
0.75
0.05
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
3.0
1.0
0.2
0.65
0.15
3.0
1.0
0.2
0.6
0.2
3.0
Tubo Uk UK neta Ab [E] Concentración
(µmol)
Velocidad
(µmol/min)
B1
12
3
4
65
14
5224
248
380
80159
183
315
0.1600.318
0.366
0.630
0.050.1
0.15
0.2
8.8917.67
20.33
35.00
0.014
70.0295
0.0339
0.0583
La velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier
concentración de substrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es disminuida a la mitad, la velocidadinicial de la reacción (v0) es reducida también a la mitad de la original
Con respecto a la concentración de la enzima la grafica obtenida expresa que la máxima velocidad de reaccion
obtenida en la experimentación realizada se nota cuando agregamos de .4 a .5 así observamos con nuestro
fundamento que también se cumple con lo esperado donde la mayor velocidad de reaccion es cuando hay una
Las velocidades de reacción son generalmente sensibles a la temperatura. En el caso de las reacciones
biomoleculares, un aumento de 10º C incrementa su velocidad entre 1,5 y 5 veces. Para explicar este hecho se
postuló que al acrecentar la temperatura aumenta la fracción de moléculas capaces de tener una energíasuficiente para alcanzar un "estado activado" que luego se transforme en producto de la reacción por formación
1. Describa el mecanismo de la reacción de la fosfatasa acida.
Como sustrato de la fosfatasa alcalina utilizaremos un compuesto artificial: p-Nitrofenil-fosfato que, al
poseer un resto orgánico con un grupo fosfato unido, puede ser reconocido por la enzima.
El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-Nitrofenol, compuesto coloreado que en soluciónalcalina absorbe a una longitud deonda de 405 nm, por lo que su aparición en el transcurso de la
reacción puede seguirse colorimétricamente. Para detener la reacción se añadirá fosfato, ya que el
exceso de este producto de la reacción inhibe la actividad enzimática.
2. Cuál es el Km, Vmax y pH óptimo obtenido para la fosfatasa acida. Cuál es su significado.
V max = 0.029µmol/min
Km= 1.395 µmol
pH optimo 8
Estos datos nos indican las condiciones a las cuales la enzima tiene mejor eficiencia
3. Se ha determinado la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente para diversas
concentraciones de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes:
[S] (µmol/L) V [(µmol/L)min] 1/[S] 1/V
5
10
20
50
100
200
22
39
65
102
120
135
0.2
0.1
0.05
0.02
0.01
0.005
0.045
0.026
0.015
0.009
0.008
0.007
a) Estime Vmax y Km usando las representaciones graficas de Michaellis-Menten