This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Centro de iotecnolo-a &/dica de andon-, Laor3ara iotecnolo-a de !ro-as del &inisterio de alud,Clae de En4ermedades Raras e Inusuales, +os3ital de andon-, 6inan, Cina.
"3o7ado 3or la %undaci8n Nacional de Ciencia Natural %undaci8n de Ciencia Natural de la Proincia de Pro-rama Nacional de Inesti-aci8n Elemental de Cinde Inesti-aci8n de Ciencia 7 #ecnolo-a de an-on.
Primera 3ulicaci8n: 01/12/14. doi:10.9;;<=reum.1>0
La "R es una en4ermedad autoinmune sist/mica carac
in4lamaci8n cr8nica de la sinoial e i3er3lasia de lossinoiales. Esta in4lamaci8n 3uede erosionar el cartlad7acente, causando 3osterior destrucci8n de las articul
El 3roceso destructio 3uede ser mediado en 3arte 3oti3o 4irolasto ?%L@ de la memrana sinoialA en un mde inmunode4iciencia cominada seera 3ueden unirsenormal e inadirlo.
Los %L son =u-adores 3otentes en la 3ato-/nesis de
am3liamente considerados a-resios 7 3roli4eratios, cartla-oA 3oseen caractersticas similares a las trans4ormadas, tales como: crecimiento inde3endienteinsensiilidad a la a3o3tosis, 7 3roli4eraci8n aumentada.
Los %L cultiados e3resan -randes cantidades de 3ro3ueden de-radar com3onentes de la matriz etracelucol-eno. Una 4amilia de 3roteinasas e3resada 3or lmetalo3roteinasa de matriz ?&&P@.
IN#R'!UCCI(N La 4urina muestra altos nieles de e3resi8n en la
3acientes con "R 7 3uede 3rote-er contra la en4ermedad
La PCHF desem3ea un 3a3el im3ortante en la 3rom3ro-resi8n de los tumores de 3r8stata a un estado a-resi
El te=ido tumoral 7 la sinoial en "R com3arten cainclu7endo la an-io-/nesis etrema, de3osici8n de 4ir3roli4eraci8n celular desordenada 7 alta actiidad coa-u
IN#R'!UCCI(N "s, la PCHF =ue-a un 3a3el im3ortante en la "R Due di4
4urina.
Una ariante de PCHF 4ue 4uertemente asociada con la dolor en '" de rodilla, o4reciendo al-unas ideas sore3resencia del mismo dao estructural, al-unosdesarrollaron dolor cr8nico 7 otros estuieron 3rote-idos
Estudios en ratones sin PCHF tami/n im3licaron a ladolor. in emar-o, el 3a3el 3ara esta 3rotena en "R are3ortado.
IN#R'!UCCI(N En este estudio, se analiz8 cuantitatiamente la e3res
en te=idos sinoiales de 3acientes con "R 7 en indiidtanto a niel de transcri3ci8n como traducci8n.
Los casos 7 controles tami/n se -enoti3aron 3ara G1 3de un solo nucle8tido ?NP@ de PCHF 3ara identi4icar lade ariantes -en/ticas a la "R.
La disminuci8n en la e3resi8n ?JnocJdoKn@ de PCHF 4irolastos sinoiales de "R ?R"%@ aislados 3ara identien la 3roli4eraci8n, mi-raci8n, ca3acidad de inasi8n 7 3ciclo celular.
La 3ro3rotena conertasa sutilisina<Jein?PCHF@ es una 3roteinasa im3licada en la a3roteoltica de arias 3rotenas 3recurinolucrada en la re-ulaci8n de la madura3rotenas.
Evaluar el efecto de la PCSK6 en los fibrobsinoviales de AR.
La e3resi8n de PCHF 4ue detectada en el te=ido sinoial de 10 "R, 10 controles con '" 7 10 controles con E" usando ester
cuantitatia en tiem3o real. e realiz8 -enoti3i4icaci8n de FG 3olimor4ismos de nucle8tidos
utilizando microarre-los en un estudio de casos 7 controles Du3acientes con "R 7 1F0 controles sanos.
El -enoti3ado de otros > NP se realiz8 utilizando el ensa7o #aDcontroles sanos 7 1.151 3acientes con "R.
%irolastos sinoiales de "R ?R"%@ cultiados 4ueron trans4ect3eDueo de inter4erencia ?si"RN@ contra PCHF 3ara estudiar c3roli4eraci8n, inasi8n, ca3acidad de mi-raci8n, secreci8n din4lamatorias, ciclo celular, 7 3er4iles de e3resi8n de los R"%.
e reco-ieron te=idos sinoiales durante ciru-as de reem3lazo3acientes con "R, '", 7 E". Las muestras sinoiales 4ueron dite=idos conectios 7 almacenadas inmediatamente a O0C asta su
#odos los 3acientes con "R ?n Q 10@, '" ?n Q 10@, 7 E" ?n Q 10@, reude clasi4icaci8n del "CR.
Una se-unda coorte de 3acientes con "R ?n Q 2FG@ 7 controles ?seleccionados 3ara el -enoti3ado con la 3lata4orma Illumina.
Para el ensa7o de sonda #aD&an, se seleccion8 otra coorte de "-ru3o control ?n Q 1.05F@.
El "!N -en8mico 4ue etrado de leucocitos de san-re 3eri4/rica utHit de "!N de 'me-a. La concentraci8n de "!N 4ue medida.
Selecci"n de S$P
Ensa7os de Illumina )olden )ate se realizaron en el -enoti3o decontra PCHF en 2FG 3acientes con "R 7 1F0 controles.
Un total de ;F NPs sirieron como candidatos 7 4ueron 3resent3ara el diseo de un 3unta=e de ealuaci8n. La erramienta 4iltr83ara su 3lata4orma, tales como inserciones<deleciones, NPs triO 77 NPs Due no 4ueron localizados de manera Bnica.
FG NPs con 3untuaci8n de diseo de 1 4ueron seleccionados, aardel cromosoma, 7 curiendo com3letamente el -en PCHF.
La -enoti3i4icaci8n se realiz8 a tra/s de microarre-los VeraCode
Illumina. e utiliz8 un lector ead3ress usando el Hit de ensa7total de 500 n- de la muestra de "!N 4ueron utilizados 3or ensa7o7 selecci8n de -enoti3o se realizaron utilizando el so4tKare eadt
&enotipificaci"n utili'ando el ensao de S$P a*an
Para los 2; NPs no incluidos en la 3lata4orma Illumina, se estim83oder de la muestra necesario 3ara su 3osterior anlisis. 8lo > etiDueta reunieron los criterios 7 4ueron -enoti3ados utilizandosonda #aD&an en una coorte de 3acientes con 1.151 indiiduos controles.
&enotipificaci"n utili'ando el ensao de S$P a*an (continuaci"n
Los ensa7os se realizaron en el Instrumento Li-tC7cler >0. La
llearon a cao en un olumen total de 10 Sl utilizando el si-uienam3li4icaci8n: desnaturalizaci8n a ;5C durante 10 min, lue-desnaturalizaci8n a ;5C durante 10 se-, se-uido de recocido a min, 7 etensi8n a G2C durante 1 se-.
e otuo la seal de 4luorescencia en el 3rocedimiento de etensi e determin8 el -enoti3o de cada muestra midiendo la 4luor
es3ec4ica mediante el so4tKare ! 2.9 3ara discriminaci8n al/lica
&uestras du3licadas 7 controles ne-atios se inclu7eron 3araeactitud del -enoti3ado.
El "RN total se etra=o de las c/lulas cultiadas 7 del te=ido uma"RN #otal 7 la transcri3ci8n inersa se realiz8 usando el eDui3o ReR#OPCR.
La R#OPCR se realiz8 utilizando el Li-tC7cler >0 con el si-uien
am3li4icaci8n: desnaturalizaci8n a ;5C durante 10 min, lue-desnaturalizaci8n a ;5C durante 10 s, se-uido de recocido a F0C7 etensi8n a G2C durante 1 s.
Las muestras de te=ido de 3acientes con "R, '" 7 E" 7 las c/lu
omo-eneizaron en tam38n de lisis de radioinmuno3reci3itaci8n co3roteasa 3ara etraer las 3rotenas.
La 3re3araci8n se centri4u-8 7 la concentraci8n de 3rotena se midde ensa7o de 3rotenas ioORad. 25 - de 3rotena total 4ueron 4electro4oresis, 7 lue-o sometidos a inmunotrans4erencia con anticu
es3ec4icos: "ntiOPCHF umano, antiO)"P!+ umano, antiO&&PantiO32GHIP1. !es3u/s de laada, la memrana se incu8 con csecundario.
La detecci8n se realiz8 utilizando un Jit ECL de Duimioluminiscen4ue escaneada 7 analizada con el so4tKare martVieK.
Los R"% se semraron a una densidad de 9X10 c/lulas<3ocillo 7
9GC con 1F0 nmol<l de si"RN durante en la cmara su3er#ransKell. La cmara in4erior se llen8 con 20T de % en !&E& dura
Las c/lulas no inadidas se retiraron con iso3osA las c/lulas inacon )iemsa. El nBmero de c/lulas Due inadieron 4ue cuanti4icadoazar a ma-ni4icaci8n 100. El 3romedio de los cam3os 4ue calculado
Un ensa7o de Ycuraci8n de eridaZ se realiz8 3ara 3roar lami-raci8n de los R"%. Las c/lulas se semraron en 3lacas de cultiaron a 9GC. Las 3lacas se ras3aron linealmente en mBlti3lelas c/lulas se trataron con 1F0 nmol<l de si"RN contra PCHF o con2> , el nBmero de c/lulas Due mi-r8 a la lnea 4ue calculado.
Los 3er4iles de e3resi8n -/nica 4ueron analizados en los R"
JnocJdoKn de PCHF en un Ci3 )/nico 3ara )enes +umanos. Locomo &ocJ se utilizaron como control.
*edici"n de +2345 +23 $78 !ediante E2+SA
Los R"% 4ueron tratados con 1F0 nmol<l de si"RN durante 2> cultio se reco-i8 7 centri4u-8.
!es3u/s de 9 laados con P, los anticuer3os contra ILO1[, ILO1\4ueron a3licados a la 3laca de incuaci8n durante la noce.
La 3laca se la8, loDue8, trat8 con anticuer3o antiOI-) de cone=o teida 7 la asorancia a >50 nm se midi8 con un lector de 3lacasms el reactio de trans4ecci8n 4ueron utilizados como control.
La e3resi8n de m"RN 7 3rotena de PCHF 4ue si-ni4icatien los te=idos sinoiales de los 3acientes con "R Due en control. Un NP, rs02;G;G, se asoci8 si-ni4icatiamente0,011@.
El JnocJdoKn de PCHF mediante si"RN redu=o si-ni4ic3roli4eraci8n, inasi8n, 7 la mi-raci8n de R"%. Estos cam
3arecen estar relacionados con la secreci8n de #N%O[, arrla e3resi8n alterada de diersas 3rotenas inclu7eim3licadas en la an-io-/nesis, i3oia, 3roli4eraci8n e in4l