Farmaceutska hemija - vežbe

~ 1 ~

FARMACEUTSKA HEMIJA – VEŽBE

UVOD

Lekovita supstanca je hemijski jedinstvena supstanca koja u naučno utvrđenim dozama može da služi za lečenje ili za

odbranu od bolesti. Lekovita supstanca poseduje

određene fizičko-hemijske osobine

potrebnu čistoću

određeni sadržaj aktivne materije

Lek (farmakon – grč., medikamenta – lat.) je hemijska supstanca male molekulske mase koja reaguje sa velikim molekulima u

organizmu pri čemu nastaje biološki efekat. Lekovi su čiste supstance ili smeše supstanci koje kada se primene u

odgovarajućim količinama i pod određenim uslovima služe za sprečavanje, uklanjanje, ublaživanje i isceljenje bolesti ili

simptoma bolesti i štetnih pojava u ljudskom ili životinjskom organizmu.

Lekovi u odnosu na poreklo

organskog porekla – znatno zastupljeniji u terapiji

sintetski

polusintetski

dobijeni izolovanjem iz prirodnih sirovina

neorganskog porekla – manje zastupljeni

prirodne mineralne supstance (čišćenje: kristalizacija, sublimacija, destilacija, hromatografija)

dobijeni sintezom iz čistih sirovina ili regeneracijom

biotehnološki lekovi – razvojem tehnologije sve više zastupljeni u terapiji

Lekovi u odnosu na primenu

lekovi za kauzalnu terapiju

primarna terapija, npr. kod bakterijskih ili parazitarnih infekcija

pomoćna terapija, npr. anestetici ergometrin i oxitocin u porodiljstvu

lekovi za simptomatsku terapiju

antihipertenzivi, antidijabeteci, antiepileptici, antiastmatici, antitusici ili analgetici

preventivni (profilaktički lekovi

kontraceptivi

kinin u profilaxi malarije...

Klasifikacija lekova

prema hemijskoj strukturi

Slične strukturne osobine – često slično farmakološko dejstvo

β-laktamski prsten kod svih penicilina – ubijanje bakterija istim mehanizmom

sulfonamidi sa antibakterijskim delovanjem imaju isti mehanizam, ali ima sulfonamida koji poseduju

antidijabetsko delovanje

steroidi imaju zajedničku steroidnu tetracikličnu strukturu ali različito delovanje

~ 2 ~

prema farmakološkom dejstvu

Koristan je za lekare, brzo snalaženje u velikoj paleti lekova. Nije sasvim pogodan za farmeceute jer unutar iste

farmakološke grupe različiti lekovi deluju različitim mehanizmima, npr. aspirin i morfin deluju na različita ciljana

mesta i hemijski su nesrodni.

analgetici – lekovi protiv bolova

anestetici – lekovi za anesteziju

antidijabeteci – lekovi za snižavanje nivoa glukoze u krvi

diuretici – lekovi koji povećavaju diurezu (izlučivanje urina)

prema delovanju na određeni biohemijski proces

prema delovanju na ciljani molekul

Najkorisnija klasifikacija jer omogućava racionalizaciju uključenih struktura: npr. antiholinesteraze, lekovi koji

inhibiraju delovanje enzima acetilholina imaju isti mehanizam delovanja. U ovoj klasifikaciji lekva moguće je

odreditiopšte strukturne osobine i upoređivati ih.

Otkriće i razvoj novog leka:

otkrivanje vodećeg molekula

preklinička ispitivanja

mehanizam dejstva leka

bioraspoloživost

apsorpcija, distribucija, metabolizam, eliminacija

experimenti sa životinjama (različitim dozama testira se efikasnost i štetnost novog leka)

optimizacija procesa sinteze od laboratorijske sinteze do proizvodnje velikih razmera

farmakološke studije (in vitro, ex vivo i in vivo)

toxičnost i bezbednost leka (karcinogenost, mutagenost, teratogenost...)

razvoj doziranog oblika

testovi stabilnosti (rok trajanja i način čuvanja leka)

klinička ispitivanja – testiranja efikasnosti i bezbednosti lekova na ljudima

faza 1: na zdravim volonterima, testiranje bezbednosti leka na ljude, farmakokinetika, interakcije lek-lek i

lek-hrana)

faza 2: na manjem broju pacijenata obolelih od određene bolesti, farmakodinamika i bezbednost leka

faza 3: tokom 3 godine 1000-2000 pacijenata , dokazuje se efikasnost leka na pacijente pre nego što lek

registruje FDA

faza 4: skupljanje podataka o korisnosti i sporednim efektima leka, dodatne kliničke studije

odobrenje

Idealan lek?

efikasan i bezbedan, hemijski i metabolički stabilan

visoka specifičnost delovanja, bez sporednih efekata i toxičnosti

određene fizičko-hemijske osobine: rastvorljivost da bi mogao da se apsorbuje bez taloženja u GIT-u, lipofilnost da

bi mogao da prođe kroz biološke membrane

prijatnog mirisa i ukusa, tako da može da se aplikuje na odgovarajući način, npr. oralno

~ 3 ~

Metode otkrivanja novog leka

slučajna otkrića (penicilin, aspirin)

screening metode (prontozil) – testiranja velikog broja molekula

hemijske modifikacije molekula (sinteza analoga, cimetidin – ranitidin)

racionalno dizajniranje leka (kaptopril...)

FARMAKOPEJA

Farmakopeja je najviši službeni akt kojim se određuju propisi za izradu lekova, potvrdu identiteta, ispitivanja kvaliteta

lekova i njihovo doziranje i čuvanje. Propisi savremenih farmakopeja, ICH smernice (International Conference on

Harmonisation Guidelines), koje u sebi sadrže principe GLP, GMP, GCP, helskinške deklaracije SZO, Direktive Evropske

Unije, i drugi propisi imaju za cilj da omoguće dobijanje, razvoj, proizvodnju i distribuciju bezbednih i efikasnih lekova, što

podrazumeva praćenje, ispitivanje i kontrolu kvaliteta leka kroz sve faze njegovog razvoja: od sinteze, prekliničkih i

kliničkih ispitivanja do distribucije i šire primene leka u kliničkoj praxi.

GLP = Good Laboratory Practice

GMP = Good Manufacturing Practice

GCP = Good Clinical Practice

WHO = World Health Organisation

Svi faktori koji utiču na kvalitet konačnog leka obuhvaćeni su farmakopejom. To su:

kvalitet polaznih lekovitih supstanci i pomoćnih lekovitih supstanci za izradu lekova

opšte procedure i tehnološki procesi u toku proizvodnje lekova

kvalitet materijala za izradu primarne i sekundarne ambalaže

uslovi čuvanja

Farmaceutski preparat odnosno farmaceutska sirovina mora da odgovara svim zahtevima ispitivanja koje propisuje

farmakopeja u toku celog roka trajanja (upotrebe). O naznačenom roku trajanja bilo kog preparata odlučuje ovlašćena

ustanova na osnovu ogleda koji se pre svega odnose na stabilnost farmaceutskog preparata.

U našoj zemlji danas se zvanično koristi prilagođen prevod III Evropske Farmakopeje (Ph.Eur. III) pod nazivom

Jugoslovenska Farmakopeja 2000 (Ph.Jug. V). Farmakopeja se sastoji iz dva dela:

Knjiga 1

opšte napomene

metode analize

o aparature

o fizičke i fizičko-hemijske metode

o identifikacija

o limit testovi

o metode kvantitativne analize

o biološki testovi, biološka određivanja

o metode u farmakognoziji

o farmaceutsko-tehnološki postupci ispitivanja

materijali za izradu ambalaže i kontejneri

reagensi

~ 4 ~

opšta poglavlja

o metode sterilizacije i mikrobiološka čistoća

o statistička analiza

lekoviti preparati

Knjiga 2 i 3

oficinalne monografije i materije medike

MONOGRAFIJE

Uputstva i zahtevi dati u monografijama obavezno moraju biti ispunjeni osim ako nije drugačije naglašeno. Opšta poglavlja

su takođe obavezna kada se na njih poziva određena monografija ukoliko se u textu jasno ne navode kao informacija ili

sugestije. Farmaceutski preparat je farmakopejskog kvaliteta jedino u slučaju kada ispunjava sve zahteve navedene u

odgovarajućoj monografiji. Opisna ispitivanja i određivanja se smatraju oficinalnim metodama na kojima se zasnivaju

standardi farmakopeje.

Oficinalne monografije farmaceutskih supstanci su urađene po jedinstvenom principu, tj. sadrže skoro identičan raspored

podnaslova koji ne moraju svi biti sadržani u svakoj monografiji.

Podnaslovi monografije

1. Naslov monografije je na srpskom jeziku, a podnaslov na latinskom. Umesto prvog naziva koji je na srpskom jeziku

koristi se latinski naziv u poglavlju Droge, a kod nekih monografija i sinonim.

2. Definicija sadrži sve relevantne podatke koji se odnose na odgovarajuću farmaceutsku supstancu, preparat

odnosnopredmet oficinalne monografije. Obavezno navodi pun hemijski naziv farmaceutske supstance.

3. Izrada sadrži podatke koji se odnose na pojedine aspekte proizvodnog procesa koji nisu sveobuhvatni već pretstavljaju

sastavni deo instrukcija proizvođaču. Farmaceutske supstance se proizvode po principima GMP.

4. Osobine koje se navode su organoleptičke, zavise od velikog broja faktora i ne treba ih striktno shvatiti. Ne pretstavljaju

zahtev farmakopeje. Od organoleptičkih osobina zastupljenih u ranijim farmakopejama Ph.Jug. V ne navodi ukus i miris.

Rastvorljivost navedena u poglavlju data je opisnim terminima:

opisni termin približna zapremina rastvarača

[ml] po 1g rastvorka vrlo lako rastvorljiv <1

lako vrastvorlji 1 – 10 umereno rastvorljiv 10 – 30 slabo raastvorljiv 30 – 100 teško rastvorljiv 100 – 1000

vrlo teško rastvorljiv 1000 – 10000 gotovo nerastvorljiv >10000

Termin „delimično rastvorljiv“ se koristi da se opiše smeša u kojoj se samo jedna od komponenata rastvara. Termin „može

da se meša“ se koristi da se opišu tečnosti koje se u svim zapreminskim odnosima mešaju u navedenim rastvaračima.

5. Identifikacija ima za cilj da sa određenim stepenom sigurnosti može da se potvrdi da uzorak odgovara deklarisanom opisu

u definiciji. U određenim monografijama identifikacija je podeljena na prvu i drugu identifikaciju.

~ 5 ~

„Prva identifikacija“ je:

IR spektroskopija (uvek)

temperatura topljenja (vrlo često)

UV spektrofotometrija

pH rastvora

optička rotacija....

„Druga identifikacija“ je:

bojene i taložne reakcije

temperatura topljenja

TLC

UV spektrofotometrija...

6. Ispitivanje stepena čistoće

7. Određivanje

8. Čuvanje

9. Označavanje

10. Upozorenje

11. Nečistoće

12. Kritične fizičke osobine

13. Referentne supstance, preparati i spektri

FIZIČKO HEMIJSKE OSOBINE SUPSTANCI

1. RASTVORLJIVOST SUPSTANCE

Rastvori su homogene smeše supstanci koje imaju isti sastav u svakom delu svoje zapremine. Uobičajeno je da se jedna

komponenta rastvora naziva rastvarač, a druga rastvorak ili rastvorna supstanca.

Rastvaranje supstanci (čvrstih, tečnih ili gasovitih) u tečnim rastvaračima predstavlja dispergovanje jona ili molekula među

molekule rastvarača, što podrazumeva da moraju biti savladane međujonske ili međumolekulske privlačne sile između jona

ili molekula supstance, kao i privlačne sile između molekula rastvarača. Uzajamnim delovanjem jona ili molekula rastvorne

supstance sa molekulima rastvarača dobija se određena energija, i ukoliko je ona dovoljna, supstanca će se rastvoriti. Razlika

između potrebne energije i energije koja se pri rastvaranju dobija određuje rastvorljivost jedinjenja. Rastvorljivost supstance

zavisi i od karakteristika čvrstog stanja (kristalni oblik, veličina kristala...).

Rastvarači mogu biti polarni i nepolarni, a supstance koje se rastvaraju elektroliti (jonska i polarna kovalentna jedinjenja) i

neelektroliti. Elektroliti pri rastvaranju disosuju na jone, dok se molekuli neelektrolita pri rastvaranju samo međusobno

razdvajaju, ali ne disosuju. Elektroliti se dobro rastvaraju u polarnim rastvaračima, a neelektroliti u nepolarnim

rastvaračima (slično se u sličnom rastvara), mada i ovo pravilo ima izuzetaka.

Polarni rastvarači – molekuli polarnih rastvarača imaju pozitivan i negativan pol i grade tzv. dipol. U ove rastvarače

spadaju voda, alkohol, tečni amonijak... Najznačajniji i najpolarniji rastvarač je voda zbog svoje visoke polarnosti,

sposobnosti građenja vodonične veze i donorskih osobina, kao i zbog mogućnosti građenja koordinacionih veza sa nizom

metalnih jona. Rastvorljivost organskih jedinjenja u vodi se povećava sa povećanjem broja polarnih grupa (-OH, -COOH, -

NH2...) u molekulu, a opada sa porastom sadržaja ugljenika.

~ 6 ~

Nepolarni rastvarači – centri pozitivnog i negativnog naboja se podudaraju, npr. benzen, n-pentan, n-hexan,

ugljendisulfid... S obzirom da nepolarni rastvarač ne utiče na velike elektrostatičke sile između jona u kristalnoj rešetki,

jonska jedinjenja se u takvim rastvaračima ne rastvaraju.

2. pH VREDNOST

Disocijacija vode

pH vrednost je definisana kao –log[H+], gde je [H+] koncentracija vodonikovih jona u rastvoru. U čistoj void je ta

koncentracija određena ravnotežom:

H2O → OH- + H+

Konstanta ravnoteže može da se prikaže jednačinom:

Kw = [H+][OH-] / [H2O] Kw = [H+][OH-]

Experimentalno je utvrđeno das u koncentracije hidronijum i hidroxidnih jona jednake u destilovanoj vodi I da na 25oC

iznose:

[H3O+] = [OH-] = 10-7 mol/dm3 pH = -log[H3O+] mol/dm3

Iz čega sledi da je sredina neutralna, a pH=7. Vodeni rastvor u kojem je pH<7 reagovaće kiselo, a kada je pH>7 bazno.

Analogno izražavanju pH, koncentracija hidroxidnih jona se izražava jednačinom:

pOH = -log[OH-] mol/dm3 pH + pOH = pKw = 14

Kiseline i baze

Prema protolitičkoj teoriji kiseline su supstance koje otpuštaju protone (donori protona), a baze su supstance koje primaju

protone (akceptori protona). Koja će se od prisutnih supstanci ponašati kao kiselina, a koja kao baza zavisi od afiniteta

prema proton. Supstanca sa većim afinitetom (nukleofilna) ponašaće se kao baza, a ona sa manjim afinitetom, koja otpušta

proton, kao kiselina. Stoga, klasifikacija jedinjenja nije jednoznačna, tj. u zavisnosti od sredine supstanca se može ponašati i

kao kiselina i kao baza. Jake kiseline i baze su potpuno disosovane. Slabe kiseline su u vodenom rastvoru u ravnoteži sa

nedisosovanim oblikom:

HA ↔ H+ + A- Ka = [H+][A-]/[HA] pKa = -logKa

Bazna konstanta je obrnuto proporcionalna kiselinskoj konstanati Ka konjugovane kiseline:

Kb = Kw/Ka pKb = pKw - pKa

pKa vrednost molekula

Većina supstanci koje se koriste u medicini su slabe kiseline i baze. Važno je zapamtiti da pKa ne daje nikakve informacije

da li je supstanca kisela ili bazna. To je negativan logaritam od konstante disocijacije za razliku od pH vrednosti koja

direktno govori o koncentraciji H+ jona. Jedino razumevanje hemijske strukture i uticaja funkcionalnih grupa može pomoći u

korektnom predviđanju kisele ili bazne bazne prirode nekog molekula.

Jonizacija leka

Jonizacija leka je veoma važna sa stanovišta apsorpcije i distribucije u različita tkiva tela. Kada je slabo kiseo ili bazan, lek

će jonizovati u manjoj ili većoj količini u zavisnosti od vrednosti njegove pK i pH telesne tečnosti u kojoj se rastvara. pH u

telu široko varira, ali najznačijniji biološki rastvor je krv koja ima pH vrednost 7,4.

Iz prethodnih jednačina:

HA ↔ H+ + A- A- - jonizovana frakcija leka

Ka = [H+][A-]/[HA] pKa = pH – log([A]/[HA]) pH = pKa + log ([A]/[HA])

~ 7 ~

Nakon izvođenja sledi za

slabo kiseo lek: jonizovano % = 100 / [1 + antilog (pKa – pH)]

slabo bazan lek: jonizovano % = 100 / [1 + antilog (pH – pKa)]

3. TEMPERATURA TOPLJENJA Tt

Temperatura topljenja supst nce je ona temperatura na kojoj su čvrsta supstanca i njen rastop u ravnoteži. Predstavlja

fizičku konstantnu karakteristiku za svaku supstancu. Određivanje Tt predstavlja jednostavnu metodu za utvrđivanje

identiteta supstanci, kao i za proveru stepena čistoće. Čiste supstance imaju uzan interval Tt. Onečišćenja, čak i u

neznatnim količinama, dovode do proširivanja intervala topljenja i sniženja Tt, čak i u slučaju primesa sa višom tačkom

topljenja.

Između Tt i molekulske strukture supstance postoji veza, npr. kod stereoizomernih oblika se trans izomer obično topi na

višoj temperaturi od cis oblika. Tt se povišava sa stepenom asocijacije molekula, npr. estri kod kojih nema vodoničnih veza sa

tope na mnogo nižoj temperaturi od odgovarajućih karboxilnih kiselina.

Mnoge organske supstance se ne tope već se raspadaju (supstanca se najčešće oboji i razvije se gas). Temperatura raspadanja

nije tačno definisana i zavisi od brzine zagrevanja. Neke supstance nemaju karakterističnu preobražajnu tačku i ugljenišu

pri jačem zagrevanju.

Ph.Jug. V propisuje određivanje Tt na tri načina:

metodom kapilare

metodom otvorene kapilare

metodom trenutnog topljenja

4. POLARIMETRIJA

Stereohemija neke supstance određuje njen prostorni raspored, tj. geometriju. Farmakološka aktivnost leka u velikoj meri

zavisi od njegove stereohemije, tj. njegovog specifičnog polažaja u prostoru. Optički izomeri supstance mogu imati veoma

različite farmakološke efekte. Postoje tri tipa izomerije:

geometrijska izomerija

cis (Z) i trans (E) oblici

optička izomerija

diastereoizomerija

Optička izomerija je veoma rasprostranjena kod farmaceutskih proizvoda. Optički aktivne ili hiralne supstance su one koje

poseduju hiralni centar. Hiralni molekul sadrži ugljenikov atom za koji su vezana 4 različita supstituenta. Takav C atom se

zove asimetrični atom ili stereocentar. Molekuli sa jednim asimetričnim atomom su uvek hiralni. Da bi molekul bio hiralan

ne sme imati ravan simetrije. Adrenalin – enantiomeri R i S imaju identične fizičke i hemijske osobine, obrću ravan

polarizovane svetlosti u suprotnom smeru, (-) enantiomer ima jači biološki efekat kao kardiostimulator.

Enantiomeri su parovi molekula koji se odnose kao predmet i njegov lik u ogledalu i ne mogu se poklopiti jedan sa drugim.

Većina fizičkih osobina enantiomera je identična, ali ukoliko se planarno polarizovana svetlost propusti kroz uzorak,

enantiomere je moguće razlikovati na osnovurotacije ravni polarizovane svetlosti. Enantiomeri rotiraju planarno

polarizovanu svetlost za istu vrednost ali u suprotnim smerovima. Enantiomer koji rotira ravn svetlosti u smeru kazaljke na

satu je desnogiri, a jedinjenje se obeležava (+) enantiomer, dok je enantiomer koji rotira u suprotnom smeru levogiri i

~ 8 ~

označava se kao (-) enantiomer. Zbog ove interakcije sa svetlošću enantiomeri se nazivaju i optički izomeri, a pojava je

optička aktivnodt. Smeša jednakih odnosa enantiomera je optički neaktivna i zove se racemska smeša ili racemat.

Ispitivanje optički aktivnih jedinjenja

Optički aktivne supstance imaju osobinu da obrću ravan polarizovane svetlosti za određen ugao. Specifična rotacija optički

aktivnog molekula je fizička konstanta karakteristična za taj molekul, kao što su i Tk, Tt, n, ρ...

Optička rotacija se određuje polarimetrom koji mora obezbediti očitavanje sa tačnošću do ±0,01o . Skala se obično baždari

korišćenjem sertifikacionih kvarcnih ploča, a njema linearnost se proverava standardnim rastvorom saharoze.

Izmerena optička rotacija uzorka (u stepenima) zavisi od strukture optički aktivnog jedinjenja, koncentracije, vrste

rastvarača, dužine polarimetarske cevi, talasne dužine svetlosti i temperature.

Ugao optičke rotacije tečnosti je ugao rotacije α, izražen u stepenima [o], za koji tečnost obrne ravan polarizacije

polarizovanog svetlosnog zraka D-linije natrijumovog spektra (λ = 589,3 nm), pri njegovom prolasku kroz sloj debljine od

1dm, na 20oC. Postupak pripreme je propisan u monografiji.

Specifična optička rotacija [α]20D ratvorene supstance je ugao rotacije α, izražen u stepenima [o], za koji rastvor koji sadrži

1 g/ml date supstance, obrće ravan polarizovane svetlosti talasne dužine D-linije natrijumovog spekra izmeren na 20oC,

izračunatog za sloj debljine 1 dm. Specifična optička rotcija čvrstih supstanci se uvek izražava u odnosu na dati rastvarač i

koncentraciju.

za tečnosti: [α]20D = αlρ20

za čvrste supstance: [α]20D = 1000α / lc

α – ugao rotacije u stepenima na 20±0,5oC

l – dužina polarimetrijske cevi u dm

ρ20 – gustina na 20oC u g/cm3 (za potrebe farmakopeje gustina se zamenjuje relativnom gustinom)

c – koncentracija supstance u g/l

U određenim sliučajevima, navedenim u monografiji, ugao se može izmeriti i na drugim temperaturama, osim na 20oC, kao i

na drugim talasnim dužinama.

5. INDEX REFRAKCIJE

Index refrakcije (ntλ ) nekog medijuma u odnosu na vazduh jednak je odnosu sinusa ugla upadnog zraka svetlosti i sinusa

ugla prelomljenog zraka u datom medijumu. Predstavlja fizičku konstantu, karakterističnu za pojedine farmaceutske

supstance. Postoje apsolutni i relativni index refrakcije.

Apsolutni index refrakcije (n) predstavlja odnos brzine prostiranja svetlosnog zraka u vakuumu (c) i medijumu (v).

Relativni index refrakcije (n1,2) predstavlja odnos brzine prostiranja svetlosnog zraka u medijumu 1 (najčešće vazduhu) i

medijumu 2.

n = c/v n1,2 = sinα / sinβ

α – upadni ugao svetlosnog zraka u odnosu na normalu na graničnu površinu

β – prelomni ugao svetlosnog zraka u odnosu na normalu na graničnu površinu

Ukoliko nije drugačije propisano, index refrakcije se meri na 20±0,5oC, propuštanjem D-linije Na spektra (λ = 589,3 nm), a

označava se sa n20D.

Priprema Abbe-ovog refraktometra

Odvrnuti zavrtanj koji spaja prizme i podići gornju prizmu. Vatom natopljenom etanolom obrisati obe prizme.

Sačekati da se prizme osuše isparavanjem etanola. Pasterovom pipetom naneti analiziranu tečnost na celu površinu

prizme, ne dodirujući prizmu da se ne bi oštetila. Gornju prizmu spustitina donju i prčvrstiti zavrtnjem.

~ 9 ~

Merenje indexa refrakcije

Gornjim zavrtnjem na desnoj strani aparata izoštriti granicu tamno-svetlo u gornjem delu vidnog polja. Donjim

zavrtnjem podesiti granicu što je moguće preciznije na presek končanica (dveju unakrsnih crnih linija). Index

refrakcije se očitava u donjem delu vidnog polja sa tačnošću do 10-4.

Napomena: Postupak pripreme aparata i merenja ponoviti za svaki ispitivani rastvor

HROMATOGRAFIJA

UVOD

Hromatografija je separaciona analitička metoda koja obuhvata veliki broj tehnika. Za otkriće ove analitičke metode

zadužen je botaničar Cvet koji je 1903. razdvojio biljne pigmente lišća i ovaj proces nazvao hromatografija. Cvet je

pretpostavio da boja zelenog lišća nije jednostavna materija, te je pokušao da je razdvoji na jednostavne komponente na

osnovu razlike u adsorpciji na stubu CaCO3 u staklenoj cevi. Naknadnim propuštanjem čistog rastvarača kroz kolonu,

dobijeni prstenovi su se međusobno razdvajali da bi se smeša razdvojila u niz žutih i zelenih zona. Otud i potiče naziv ove

metode: shroma – boja i grafeien – pisati. Hromatografija se danas koristi za razdvajanje, identifikaciju, prečišćavanje i

izdvajanje komponenti iz smeše.

PRINCIP HROMATOGRAFIJE

Hromatografija se zasniva na migraciji analita kroz stacionarnu fazu (najčešće silikagel), pod uticajem mobilne faze (smeša

organskih rastvarača) koju pokreću kapilarne sile. Pređena razdaljina analita je određena njegovim relativnim afinitetom

prema mobilnoj tj. stacionarnoj fazi. Uzorak nanet na jedan kraj stacionarne faze se kontinualno ispira svežom mobilnom

fazom. U zavisnosti od vrste i stepena interakcija komponenata uzoraka sa mobilnom fazom, dolazi do njihovog različitog

zadržavanja na stacionarnoj fazi.

Prema fizičko-hemijskim procesima koji se odigravaju na dodirnoj površini dveju faza, hromatografija se može podeliti na:

adsorpciou hromatografiju – razdvajanje se vrši naosnovu različite adsorpcione sposobnosti komponenata

deobnu (podeonu) hromatografiju – razdvajanje se vrši na osnovu različite raspodele komponenata između

stacionarne i mobilne faze (2 tečne faze)

hromatografiju pomoću jonskih izmenjivača

gel-hromatografiju – stacionarnu fazu čini porozni polimer čije su pore dostupne samo određenim molekulima

(efekat sita)

Na razdvajanje komponenata iz smeše najčešće utiču kombinovani procesi adsorpcione i podeone hromatografije.

HROMATOGRAFSKE METODE

Razvitak hromatografije je doveo do formiranja različitih tehnika. Danas su poznate sledeće hromatografske tehnike:

hromatografija na stubu (jonoizmenjivačka hromatografija)

hromatografija na papiru

hromatografija na tankom sloju (TLC – Thin Layer Chromatogrphy)

gasna hromatografija (GC)

visokoefikasna tečna hromatografija (HPLC – High Performance Liquid Chromatography)

Kapilarna elektroforeza (CE)

~ 10 ~

HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU

Hromatografija na tankom sloju je separaciona tehnika, u kojoj se stacionarna faza koju čini pogodni materijal, nanosi u

ujednačenom tankom sloju i fixira na podlogu (ploča ili folija) od stakla, metala ili plastike. Razdvajanje se vrši migracijom

rastvorene supstance u rastvaraču ili pogodnoj smeši rastvarača (mobilna faza) kroz tanak sloj. Metoda tankoslojne

hromatografije se veoma često koristi za kvalitativnu i kvantitativnu analizu aktivnih supstanci, ispitivanje stabilnosti,

stepena čistoće, kao i u preparativne svrhe.

Prednosti ove tehnike, kao što su jednostavnost izvođenja, brzina razdvajanja i mogućnost ispitivanja više uzoraka

istovremeno, čine je vrlo ekonomičnom i jednom od često korišćenih metoda u analitičkim laboratorijama. Međutim,

osetljivost i rezolucija ove metode su manje u odnosu na druge hromatografske metode. Takođe je nepogodna za lako

isparljiva jedinjenja, a i „ljudski faktor“ u velikoj meri utiče na uspešnost.

Za razdvajanje supstanci na tankom sloju od značaja su:

jonske sile

po svojoj prirodi su elektrostatičke i dolaze do izražaja na kiselim ili alkalnim adsorbensima i na adsorbensima

impregniranim solima.

koordinativne sile

nastaju između visokoaktivnih tankih slojeva koji sadrže atome Al, Si, Ca, Mg, Fe i pojedinih funkcionalnih grupa

jedinjenja koja se razdvajaju.

sposobnost građenja komplexa

imaju adsorbensi koji na površini čestica sadrže atome sa nepopunjenom elektronskom strukturom (Al2O3, FeO,

Mg(OH)2, CaSO4) i jedinjenja koja su po strukturi α ili β – aminoalkoholi, hidroxialdehidi i oxikiseline

asocijacija dipola

ove sile dolaze do izražaja između adsorbensa impregniranog polarnim rastvaračem i jedinjenja sa dipolnim

momentom (alkoholi, ketoni, halogenovana jedinjenja)

vodonične sile

intermolekulske vodonične veze između jedinjenja sa aktivnim vodonikom i funkcionalnih grupa sa slobodnim

elektronskim parom su veoma značajne za hromatograafiju natankom sloju. Prema sposobnosti građenja vodonične

veze sva jedinjenja se mogu podeliti na:

donore vodonika

akceptore vodonika

donore i akceptore vodonika u zavisnosti od uslova (alkoholi, fenoli, imidi...)

jedinjenja koja grade intermolekulske vodonične veze

jedinjenja bez sposobnosti građenja vodonične veze

disperzione sile (Van der Waals-ove sile)

značajne su za razdvajanje u najslabije su po svom intenzitetu. Ovoj grupi pripadaju 3 vrste nejonskih,

međumolekulskih, slabih sila koje se razlikuju po tipu interakcije:

dipol – dipol

dipol – indukovani dipol

indukovani dipol – indukovani dipol

~ 11 ~

Kod TLC metode, kao i kod svake druge hromatografske metode, prisutne su 3 komponente: stacionarna faza, ispitivani

uzorak i mobilna faza. Polarnost stacionarne faze određuje vrstu TLC. Ako je mobilna faza manje poalrna od stacionarne

faze to je TLC sistem normalnih faza i obeležava se sa NP-TLC. Ako je mobilna faza polarnija od stacionarne faze, onda je

to hromatografski sistem reversnih faza i obeležava se kao RP-TLC.

STACIONARNA FAZA

Stacionarnu fazu u TLC predstavljaju razni adsorbensi (nosači), koji su naneti u obliku tankog sloja na ploče (staklene ili

plastične), ili na folije (Al ili plastične). Većina laboratorija danas koristi gotove ploče na koje je već nanešen sloj adsorbensa.

Debljina sloja adsorbensa varira od 0,1 do 0,3 mm. Adsorbensima se često dodaju vezivna sredstva, npr. gips, skrob ili soli

poliakrilnih kiselina u količini od 0,1 do 10 % (w/w) čime se povećava čvrstina sloja i obezbeđuje bolje vezivanje za ploču-

Dodatak malih količina UV-andikatora omogućava vizuelno otkrivanje jedinjenja na hromatogramu.

Strukturu adsorbensa sačinjavaju mikročestice uglavnom sferičnog ili nekog drugog, modifikovanog oblika. Osnovne fizičke

karakteristike koje definišu sloj su specifična površina adsorbensa (m2/g) i zapremina pora adsorbensa.Specifična površina

adsorbensa je funkcija veličine čestica – ako su dimenzije čestica manje, sloj adsorbensa je homogeniji, putovanje mobilne

faze je sporije i postiže se bolje razdvajanje komponenata.

Najčešći neorganski adsorbensi koji se koriste u tankoslojnoj hromatografiji su:

silikagel

je hemijski delimično dehidratisana silicijumova kiselina (SiO2*H2O) i izuzetno je polaran adsorbens. Polarnost

silikagela se objašnjava prisustvom hidroxilnih grupa (silanolnih), koje se nalaze na njegovoj površini.

Postoji više vrsta silikagela:

H – bez vezivnnog sredstva

HF245 – sadrži oko 1,5 % fluorescentnog indikatora koji ima optimalni intenzitet na 245 nm

G – sadrži 13 % kalcijumsulfata hemihidrata

GF245 – sadrži 13 % kalcijumsulfata hemihidrata i oko 1,5 % fluorescentnog indikatora

DS – sadrži 5 % gipsa

aluminijum-oxid

je drugi najčešće primenjivani adsorbens. Joni kiseonika i aluminijuma na površini obrazuju jako elektrostatičko

polje koje je odgovorno za mehanizam adsorpcije. U poređenju sa silikagelom, aluminijum-oxid je manje polaran i

razdvajanje smeše duže traje. Može se koristiti za razdvajanje alkaloida, steroida i šećera.

keiselguhr

dobija se od prirodne dijatomejske zemlje. Po hemijskoj strukturi predstavlja onečišćen silicijum-dioxid (90%) jer

sadrži Al, Fe i druge metalne oxide. Manje je aktivan od silikagela.

prirodna ili mikrokristalna celuloza

često se koristi kao adsorbens za razdvajanje vrlo polarnih jedinjenja (ugljeni hidrati, karboxilne kiseline,

aminokiseline, fosfati...). Celulozu čine polisaharidi opšte formule (C6H10O5)n u obliku dužih (prirodna) ili kraćih

vlakana (mikrokristalna). Razdvajanje komponenata se postiže na osnovu njihovog različitog particionog

mehanizma.

~ 12 ~

RAZDVAJANJE IZOMERA

Metoda tankoslojne hromatografije može se koristiti i za razdvajanje enantiomera, ali je osnovni nedostatak ove metode

mali broj raspoloživih hiralnih stacionarnih faza. Enantioseparacija se može postići impregniranjem sloja silikagela nekim

hiralnim agensima (npr. (+)-vinska kis. ili (+)-askorbinska kis.), dodavanjem hiralnih aditiva mobilnoj fazi ili korišćenjem

gotovih reversno-faznih ploča koje su mpregnirane bakar-acetatom ili nekim hiralnim selektorom (prolin).

HPTLC

Savremeni tehnološki postupci dobijanja tankih slojeva doveli su do razvoja visoko efikasne tankoslojne hromatografije

(High Performance Thin Layer Chromatography) koja u odnosu na konvencionalnu TLC ima niz prednosti:

smanjuje prečnik polazne mrlje

smanjena je zapremina uzorka koji se nanosi

povećana je efikasnost i osetljivost metode

MOBILNA FAZA

Mobilnu fazu čini smeša dva, tri ili više rastvarača pomešanih u različitim zapreminskim odnosima. Mobilna faza se

pomoću kapilarnih sila ascedentno kreće preko stacionarne faze na ograničenom prostoru od starta do fronta. Mobilna faza

ne sme da reaguje sa supstancama koje se razdvajaju

što manje da je toxična

višekomponentna mobilna faza mora biti homogena

rastvarači moraju biti čisti, lako isparljivi i što jeftiniji

Rastuća polarnost (eluotropni niz)

hexan < heptan < ciklohexan < ugljenohorid < benzen < hloroform < etar <

< etilacetat < piridin < aceton < etanol < metanol < voda

Hemijske i fizičke osobine supstanci koje se razdvajaju diktiraju izbor mobilne i stacionarne faze. Pre svega, treba

razmatrati polarnost i rastvorljivost supstanci, zatim mogućnost građenja vodoničnih veza sa adsorbensom, pKa vrednost...

Na izbor mobilne faze utiču i hemijske osobine.

Ako se kao mobilna faza koristi smeša rastvarača različite polarnosti, polarniji rastvarač se vezuje za adsorbens, imregnira

ga i na hromatogramu se javlja tzv. drugi front, često teško uočljiv. Ova polava se naziva demixija (autohromatografisanje

rastvarača), a može se izbeći posavljanje trake filter papira niz zid kade za hromatografiju da bi se obezbedilo ravnomerno

zasićenje kada parama rastvarača.

TEHNIKE RAZDVAJANJA

Linearno – kada se uzorak nanosi duž jedne ivice ploče (kao mrlja ili traka) a mobilna faza putuje od te ivice ka suprotnoj.

Kružno cirkulaciono – ako je položaj ispitivanog uzorka u cenru ploče a mobilna faza putuje od centra ka periferiji ploče.

Anticirkularno – uzorak se nanosi na periferiji spoljnog kruga i razvija prema centru ploče.

U kontinualnom razvijanju mobilna faza putuje kroz sloj sve dok ne postigne jednu, unapred određenu poziciju na ploči.

Tehnika višestrukog razdvajanja se koristi za razdvajanje smeše širokog opsega polarnosti koju nije moguće razdvojiti

~ 13 ~

korišćenjem jedne mobilne faze. U jednodimenzionalnom višestukom razvijanju, hromatogram se razvija do određenog

rastojanja, ploča se izvadi iz kade za hromatografiju, mobilna faza otpari i proces razvijanja se ponovi. U svakom

ponovljenom procesu razvijanja može se promeniti dužina razvijanja hromatograma, vreme razvijanja hromatograma, sastav

mobilne faze, a proces se može ponavljati sve dok se ne postigne zadovoljavajuća razdvajanje.

U dvodimenzionalnoj hromatografiji uzorak se nanosi na jedan kraj ploče, hromatogram razvija duž jedne ivice, ploča se

nakon otparavanja mobilne faze vrati u kadu pod uglom od 90o u odnosu na smer prvog razdvajanja.

DETEKCIJA ZONA NA HROMATOGRAMU

Sve metode za detekciju hromatograma mogu se podeliti na:

optičke metode

sastoje se u posmatranju hromatograma na običnoj (vidljivoj) svetlosti ili pod Uvsvetlosti. Obojena jedinjenja (biljni

pigmenti su vidljivi na hromatogramu i na običnoj svetlosti. Jedinjenja koja apsorbuju svetlost u UV oblasti

uočavaju se kao tamne mrlje na 254 nm, pod UV-lampom. Jedinjenja koja imaju nativnu fluorescenciju razdvajaju

se na adsorbensima bez fluorescentnog indikatora i otkrivaju se pod UV-lampom na 366 nm. Optičke metode

detekcije zona koriste se u kvantitativnoj analizi.

hemijske metode

izvode se na reagensima koji sa supstancama daju bojene ili taložne reakcije. Ovakav način otkrivanja položaja

mrlja na hromatogramu dovodi do hemijskih promena ili degradacije jedinjenja te se ne mogu koristiti u

preparativnoj hromatografiji (npr. detekcija mrlja kofeina parama joda ili barbitona prskanjem sa HgNO3)

biološke metode

podrazumevaju da jedinjenja poseduju specifične fiziološke ili mikrobiološke efekte (saponini i antibiotici)

Izazivanje hromatograma – detekcija

Izazivanje hromatograma pomoću rastvora hromogenih reagenasa ili sumporne kiseline se izvodi (obavezno u digestoru)

nanošenjem ovih rastvora pomoću raspršivača (staklena prskalica). Izazivanje boje nakon prskanja hromatograma se

najčešće postiže zagrevanjem isprskane ploče na temperaturi koja zavisi od vrste primenjenog reagensa.

RETENCIONE VREDNOSTI

Položaj mrlja supstanci na hromatogramu se karakteriše Rf vrednošću (ratio of fronts). Rf vrednost je odnos dužine puta

koji je prešla supstanca i dužine puta koji je prešla mobilna faza na adsorbensu. U slučaju linearnog razvijanja

hromatograma, Rf vrednost je definisana izrazom

AC / AB = Rf

AC – rastojanje od startne linije do centra mrlje

AB – rastojanje koje pređe rastvarač od startne linije do njegovog fronta

Često se Rf rednost izražava koa hRf vrednost (Rf * 100)

Rf je neimenovan broj koji ima vrednost od 0 do 1. Kada je Rf = 1 uzorak putuje sve do fronta mobilne faze. Iako se Rf

vrednost često koristi za identifikaciju supstanci, postoje izvesne poteškoće u tačnom određivanju ove vrednosti, pre svega

zbog nemogućnosti da se tačno odredi položaj fronta mobilne faze. Osim toga, kretanje supstance na adsorbensu odvija se

samo dok je ploča u mobilnoj fazi, pa je Rf vrednost srazmerna vremenu razvijanja hromatograma. Ukoliko je vreme

zadržavanja supstance u mobilnoj fazi duže, migracija zona će biti veća, a prema tome i Rf vrednost.

~ 14 ~

Jedinjenja se mogu identifikovati poređenjem experimentalne vrednosti sa tabelarnom Rf vrednosti. Pouzdaniji način

određivanja Rf vrednosti je određivanje relativne Rf vrednosti (rRf):

rRf = pređeni put ispitivane supstance / pređeni put standarda

Rf vrednost na datom adsorbensu i na datoj mobilnoj fazi zavisi od načina rada, kvaliteta i aktivnosti adsorbensa, debljine

sloja, količine nanetog uzorka, položaja starta i dužine putovanja mobilne faze. Da bi Rf vrednost bila konstantna,

potrebno je standardizovati uslove određivanja i održavati temperaturu u intervalu 20 – 25oC.

IZVOĐENJE TLC

Primena tankog sloja nosača

Tanak sloj nosača (npr. silikagel) najčešće se nanosi na staklene ploče dimenzija 5*10; 10*20; 20*20 cm, kao i na pločice

manjih dimenzija (2,5*7,5 cm). Staklene ploče se prvo peru četkom pod mlazom vode, ostave u hromosumpornoj kiselini

(3-4h), a zatim se dobro isperu vodom, destilovanom vodom i osuše. Ako se ne koriste odmah, moraju se zaštititi od prašine i

drugih zagađivača, naročito organskih jedinjenja. Najčešće se čuvaju u exikatoru.

Priprema tankog sloja silikagela

Nanošenje tankog sloja silikagela na staklene pločice dimenzija 2,5*7,5 cm se izvodi na sledeći način: silikage (8 g)

se prenese u erlenmajer sa šlifovanim zatvaračem od 100 ml, doda se destilovana voda (20 ml) i sadržaj erlenmajera

se kratkotrajno intenzivno promeša. Dobijena suspenzija sa nanese na 16 pločica postavljenih na jednu ploču

dimenzija 20*20 cm, na koju je prethodno nanešen tanak sloj vode. Nakon sušenja sloja silikagela na vazduhu i

aktiviranja (105oC, 15 min), pločice se čuvaju u exikatoru do momenta upotrebe.

Silikagel za tankoslojnu hromatografiju (30 g) se prenese u erlenmajer od 250 ml sa brušenim zatvaračem, doda se

destilovana voda (60 ml) i sadržaj erlenmajer intenzivno izmeša (30 sec). Dobijena suspenzija se nanese na pet ploča

dimenzija 20*20 cm (debljina sloja 0,25 mm). Nakon sušenja na vazduhu na sobnoj temperaturi tokom 2 h, ploče se

aktiviraju zagrevanjem u sušnici na temperaturi od 120oC tokom 30 min. Pripremljene ploče sa slojem silikagela se

čuvaju u exikatoru do momenta upotrebe.

Nanošenje uzorka

Uzorci (supstsnca ili smeša supstanci) određene koncentracije u pogodnom raastvaraču se nanose pomoću mikropipete, šprica

ili staklene kapilare u vidu tačke (prečnika 2-3 mm). Nanošenje se vrši na ratojanju od 2,5 cm od donje ivice ploče, duž

zamišljene startne linije i 2,5 cm od bočnih ivica na međusobnom rastojanju ne manjem od 1 cm.

Razvijanje hromatograma

Za razvijanje hromatograma se koriste staklene kade-komore različitih dimenzija i konstrukcija, u zavisnosti od dimenzija

ploča i primenjenog metoda hromatografije. U staklenu sipa se pokretna faza (50 -100 ml) koja se obavezno priprema u

menzuri sa šlifom ako je višekomponentna. Uz šire unutrašnje zidove komore stavi se filter papir (18*18 cm) natopljen

pokretnom fazom.

Razvijanje hromatograma se izvodi u zatvorenoj hromatografskoj kadi, zasićenoj parama mobilne faze, postavljanjem ploče

u vertikalan položaj i to pažljivim uranjanjem donje ivice vodeći računa da se mrlje ili trake nalaze iznad površine mobilne

faze. Mobilna faza putuje kaapilarnim silama kroz sloj adsorbensa pri čemu se komponente uzorka razdvajaju u zavisnosti

od fizičko-hemijskih osobina i interakcija sa slojem stacionarne faze. Kada pokretna faza, nakon određenog vremena pređe

određen put (oko 15 cm za ploču dimenzija 20*20 cm), skine se poklopac sa kade, izvadi ploča i ostavi da se osuši na

vazduhu. Nakon uparavanja mobilne faze, dobijene mrlje se detektuju na određeni način.

~ 15 ~

Preparativna hromatografija

Preparativna hromatografija se koristi za izolovanje i prečišćavanje jedinjenja iz smeše. Izvodi se na tankim slojevima veće

debljine od uobičajenih (0,26 mm) i za detekciju se koriste metode koje ne izazivaju hemijsku promenu (npr. UV – detekcija

ili prskanje vodom). Nakon razvijanja hromatograma i detekcije, zone koje odgovaraju jedinjenjima koja se izoluju se označe

i eluiraju sa silikagela pogodnim rastvaračem. Nakon filtriranja (ili centrifugiranja) rastvarač se otpari a dobijeni kristali

analiziraju. Kvantitativna analiza se može izvesti primenom odgovarajuće instrumentalne metode.

ADSORPCIONA HROMATOGRAFIJA U KOLONI

TEORIJSKE OSNOVE ADSORPCIONE HROMATOGRAFIJE

Da bismo potpunije shvatili proces razdvajanja supstanci pomoću adsorpcione hromatografije moramo se upoznati sa

Langmuir-ovom jednačinom koja nam pokazuje kako se na određenoj temperaturi povećava adsorpija neke supstance iz

rastvora s povećanjem njene koncentracije.

Ako deo ukupne površine adsorbensa koji je pokriven adsorbovanom supstancom obeležimo sa θ (stepen pokrivenosti), onda

možemo pisati da je:

θ = a / a∞

tj. stepen pokrivenosti površine adsorbensa jednak je količniku između adsorbovane supstance (a) i maximalne količine

supstance koja se u datim uslovima može adsorbovati (a∞).

U koloni za hromatografiju se paralelno odvijaju dva suprotna procesa – adsorpcija i desorpcija supstance sa odgovarajućeg

adsorbensa. Brzina adsorpcije u koloni se može prikazati jednačinom:

v1 = k1 Cr (1 – θ)

gde je Cr koncentracija supstance u rastvoru

Jednačina za brzinu desorpcije glasi: v2 = k2 θ

Po uspostavljanju adsorpcione ravnoteže brzine oba procesa moraju biti jednake:

U slučaju kada je Cr < (k2/ k1) možemo Cr u imeniocu zanemariti, pa nalazimo da je adsorbovana količina supstance (a)

proporcionalna koncentraciji supstance u rastvoru (Cr):

∞

Grafički predstavljena zavisnost a = f (Cr) je prava koja polazi iz koordinatnog početka. To je tzv. idealna adsorpciona

izoterma.

~ 16 ~

U slučaju kada je Cr > k2 / k1, vrednost količnika k2/k1 se u imeniocu jednačine može zanemariti pa dobijamo da je a = a∞.

Ova jednačina je horizontalni deo na tzv. ravnoj adsorpcionoj izotermi. Analiza Langmuir-ove jednačine, prema tome

pokazuje da je pri malim vrednostima Cr adsorpcija upravo proporcionalna koncentraciji supstance u rastvoru, a pri velikim

vrednostima za Cr adsorpcija ima konstantnu vrednost koja odgovara zasićenju površine adsorbensa.

Idealan slučaj odvajanja faza A i B pomoću adsorpcione hromatografije imamo kada:

komponente imaju linearne adsorpcione izoterme

momentalno se uspostavlja adsorpciona ravnoteža

u okviru tečne faze ne dolazi do difuzije

Prema načinu izvođenja analize razlikujemo sledeće hromatografske metode:

frontalna analiza

metoda istiskivanja

metoda eluiranja

TEHNIKA ADSORPCIONE HROMATOGRAFIJE

Razdvajanje pomoću adsorpcione hromatografske metode se zasniva na dinamičkoj raspodeli supstance između dve faze koje

se ne mešaju, od kojih je jedna faza pokretna (mobilna) a druga nepokretna (stacionarna). Jedinjenja sa većim afinitetom se

zadržavaju na adsorbensu, i obrnuto. Prednost ove tehnike odvajanja jeste u tome što ne zahteva komplikovanu opremu i

uređaje, veoma je efikasna, relativno brza, na zahteva ve liku experimentalnu veštinu i najekonimičnija je metoda za

preparativna odvajanja.

Pored obične hromatografije u koloni koja se izvodi običnim ceđenjem, poznate su i modifikacije ove metode pri kojima se

prolaz eluenta kroz kolonu ubrzava povišenjem pritiska iznad eluenta (Flash Chromatography) ili sniženjem pritiska u

recipientu (Dry Flash Chromatography).

STACIONARNA FAZA

Stacionarna faza ili adsorbens je čvrsta porozna supstanca koja može da adsorbuje rastvarač i rastvorenu supstancu.

Najčešće se kao stacionarna faza primenjuju: silikagel (SiO2), aluminijum-oxid (Al2O3), aktivni ugalj, celuloza... Za

standardnu hromatografiju na koloni upotrebljavaju se adsorbensi čija je veličina čestica od 0,08 do 0,2 mm, dok adsorbensi

za tankoslojnu hromatografiju moraju biti finije sprašene čestice i ne mogu se upotrebiti za hromatografiju na koloni.

MOBILNA FAZA – ELUENTNI RASTVOR

Hromatografija u koloni na koju je nanet materijal za razdvajanje, razvija se tako što se rastvarač propušta (filtrira) kroz

čvrstu stacionarnu fazu, bilo pod uticajem gravitacije ili pritiska. Ovaj proces se naziva eluiranje. Rastvarači za eluiranje

različite polarnosti imaju različitu sposobnost da zamene adsorbovanu supstancu na aktivnom delu adsorbensa. Uopšteno

govoreći, polarni rastvarači efikasnije zamenjuju supstancu na aktivnim centrima adsorbensa od nepolarnih, pa se eluiranjem

polarnim rastvaračima supstanca brže kreće niz kolonu. Ove osobine rastvarača su međusobno upoređene pa su tako

rastvarači poređani u eluotropni niz, koji je identičan kao i kod tankoslojne hromatografije.

(najbrže) alkani > alkeni > aromatični ugljovodonici > etri > disupstituisani amidi > estri > ketoni > aldehidi > primarni

amini > alkoholi > primarni amidi > karboxilne kiseline > sulfonske kiseline (najsporije eluiranje)

~ 17 ~

UREĐAJ ZA OBIČNU HROMATOGRAFIJU NA KOLONI

Sastoji se od obične staklene cevi na čijem se jednom kraju nalazi slavina (najbolje je upotrebljavati kolone sa teflonskim

slavinama jer se one ne podmazuju). Staklene slavine se obavezno moraju podmazivati i u tom slučaju, mast za

podmazivanje se pri hromatografiji rastvara, pa posle uparavanja rastvarača ispitivana supstanca može biti zaprljana

mašću. Iznad slavine najbolje je postaviti poroznu sinterovanu pločicu ili se umesto toga na dno kolone stavi tampon vate.

Pre početka odvajanja na koloni potrebno je odrediti sistem rastvarača za eluiranje, a to se postiže određivanjem najboljeg

sistema rastvarača pri odvajanju supstanci pomoću hromatografije na tankom sloju. .

Realno je očekivati da se odvajanje na koloni može efikasno izvršiti ako je razlika u Rf vrednostima između dve komponente

između 0 i 0,3. Pošto je adsorbens na koloni manje finoće nego ne ploči to se obično za odvajanje na koloni upotrebljava

nešto nepolarniji sistem rastvarača. Tako npr. ako je najbolji sistem rastvarača za tankoslojnu hromatografiju petrol-etar /

etar 1:1, onda se za hromatografiju na koloni može upotrebiti sistem petrol-etar / etar 3:2.

PUNJENJE KOLONE

Kolone za hromatografiju obično se pune adsorbensom suspendovanim u najnepolarnijem rastvaraču kojim se vrši eluiranje.

Ovaj postupak poznat je kao vlažno punjenje jer se kolone mogu puniti i suvim adsorbensom. Odmeri se količina adsorbensa

koja je 25-50 puta veća od količine suvog uzorka za odvajanje. Za složenije smeše, kao i za odvajanje uzoraka manjih od

100 mg upotrebljava se veći odnos adsorbensa prema uzorku. Veličina kolone se odabere tako da adsorbens ispuni oko 2/3

kolone. Dužina kolone može se proceniti iz sledećih formula:

L – dužina kolone u cm

d – prečnik kolone

Tako npr. za 50 g silika-gela potrebna je kolona prečnika 3 cm i dužine 35-40 cm, dok je za istu količinu aluminijum-oxida

potrebna kolona prečnika 2 cm i dužine 25 cm. Za hromatografiju na stubu najbolje je upotrebiti kolonu sa odnosom

dužina/prečnik od oko 15:1 do 10:1.

NANOŠENJE UZORKA I ELUIRANJE

Osnovni cilj je da se ispitivana smeša nanese na stub adsorbensa u što manjem sloju, što znači da uzorak treba rastvoriti u

što manjoj zapremini rastvarača. Za rastvaranje je najbolje upotrebiti rastvarač za eluiranje ili najpolarniji rastvarač u smeši

za eluiranje.

Kolona se najbolje razvija tako što se rastvarač za eluiranje lagano propušta kroz adsorbens. Maximalno dozvoljena brzina

protoka ne sme biti veća od 1 kapi na 2 sekunde, a za složenije smeše brzina eluiranja mora biti manja. Frakcije se skupljaju

u pravilnim intervalima pri čemu složenije smeše zahtevaju manje frakcije. Sadržaj frakcije se kontroliše pomoću tankoslojne

hromatografije ili UV- VIS-spektrofotometrijom, ali u intervalima, tako što se svaka peta frakcija analizira da bi se pratio

tok hromatografije.

Idealno je da se jednom započeta hromatografija u koloni završi bez prekidanja, mada se proces može zaustaviti na kratko

vreme (npr. 1h). Ukoliko dođe do stvaranja pukotina u adsorbensu i do difuzije traka sa rastvorenim supstancama, dolazi do

poništavanja prethodnog razdvajanja. Kada se hromatografijoma na tankom sloju ustanovi koje frakcije sadrže jednu istu

supstancu, onda se one spoje i rastvarač se odvoji destilacijom pomoću rotacionog uparivača, pri čemu se dobija prečišćeni

proizvod.

~ 18 ~

BRZA HROMATOGRAFIJA U KOLONI (Flash Column Chromatography)

Kod fleš hromatografije se primenjuje pritisak iznad eluenta što rezultuje povećanjem njegovog protoka. Ovom tehnikom se

za samo 15 min može postići dobro razdvajanja komponenti čije su razlike u Rf vrednostima 0,1.

ODREĐIVANJE FARMAKOLOŠKI AKTIVNIH SUPSTANCI VOLUMETRIJSKOM ANALIZOM

ODREĐIVANJE SADRŽAJA KOFEINA TITRACIJOM U NEVODENOJ SREDINI

Metoda kiselo-bazne titrcije u nevodenoj sredini se široko primenjuje u analitici jer omogućava dovoljno precizno određivanje

ne samo jakih kiselina i baza, nego i slabih kiselina i baza i njihovih soli.Ova metoda omogućava određivanje supstanci koje

su veoma slabo rastvorne u vodi. Titracija alkaloida može da se ostvari u kiselim nevodenim rastvaračima (glacijalna

sirćetna kiselina, mravlja kiselina, smeša sa anhidridom sirćetne kiseline, benzolom, hloroformom) u prisustvu indikatora

(kristal violet, tropeolin-00, metiloranž, sudan) i potenciometrijski. Kao titraciono sredstvo koristi se rastvor perhlorne

kiseline u glacijalnoj sirćetnoj kiselini.

Rastvaranje alkaloida u nevodenom rastvaraču može se prikazati sledećom jednačinom:

→

alkaloid rastvarač kiselina baza

Titraciono sredstvo reaguje sa rastvaračem po sledećoj jednačini:

↔

kiselina baza baza kiselina

Reakcija neutralizacije:

Sumarno:

Kofein sa teofilinom i teobrominom spada u grupu purinskih alkaloida. U osnovi sadrže purinski skelet koji nastaje

kondenzacijom pirimidinskog i imidazolovog prstena.

R1 R2 R3 metilxantin -H -H -H

kofein -CH3 -CH3 -CH3 teofilin -CH3 -CH3 -H

teobromin -H -CH3 -CH3

~ 19 ~

Purinski alkaloidi imaju široku primenu u medicini u nizu preparata koji se koriste kao analgetici, vazodilatatori i diuretici.

Kofein stimuliše CNS, prouzrokuje vazokonstrikciju i povišenje arterijskog pritiska, ubrazava srčani rad, pojačava krvotok

u bubrezima i istovrremeno sprečava tubularnu resorpciju Na i na taj način deluje diuretički. Kofein zajedno sa

ergotaminom se koristi u analgetičkim i antipiretičkim mešavinama.

Postupak rada

Odmeri se oko 0,1 g uzorka (tačno izmerena masa) i ratvori uz zagrevanje na vodenom kupatilu u 10 ml anhidrida sirćetne

kiseline. Nakon hlađenja doda se 5 ml benzola i 1 kap 1 % rastvora kristal-violeta u glacijalnoj sirćetnoj kiselini. Zatim se

rastvor titriše rastvorom perhlorne kiseline (0,1 mol/dm3) u glacijalnoj sirćetnoj kiselini do prelaza boje rastvora u

plavozelenu. Sadržaj kofeina se računa prema izrazu:

X = 100 * V * 0,01942 / m

X – sadržaj kofeina (%)

V – utrošak 0,1M rastvora perhlorne kiseline

m – masa uzorka (g)

0,01942 g – masa bezvodnog kofeina koja odgovara 1 ml perhlorne kis. (prema farmakopeji)

napomena: posuđe koje se koristi mora biti čisto i suvo

HClO4 je 2o standardni rastvor. U farmakopeji naći propis o pripremi i standardizaciji 0,1M HClO4

Dokazna reakcija za kofein je murexidna reakcija. Oxidativnim degradacijom molekula stvara se purpurna kiselina koja sa

NH4OH gradi amonijum so purpune kiseline (murexid) karakterističene ljubičaste boje.

Izvođenje: U nekoliko mg ispitivane supstance, na sahatnom staklu, doda se 2-3 kapi koncentrovanog H2O2 i nekoliko kapi

razblažene HCl. Uparava se na vodenom kupatilu sve dok se ne dobije žućkastocrveni ostatak. Kada se doda 2-3 kapi

razblaženog amonijaka ostatak promeni boju u ljubičastocrvenu.

β – LAKTAMSKI ANTIBIOTICI (PENICILINI)

Antibiotici su jedinjenja koja najčešće nastaju u mikroorganizmima (ređe u nižim ili višim biljkama) i koja su u stanju da

inhibiraju ili spreče rast drugih mikroorganizama. Dinamičan razvoj u oblasti antibiotika otpočeo je 30-ih godina prošlog

veka, nakon pronalaska praktično netoxičnog penicilina.

Antibiotici pripadaju različitim klasama materija i deluju po različitim mehanizmima. Za neke antibiotike je utvrđeno

postojanje sinergetskog delovanja. Antibiotici se u prvom redu koriste u tretmanu bakterijskih infekcija, pri čemu kod

dovoljnog sadržaja u krvi mogu delovati baktericidno. Neki od antibiotika se koriste zbog njihovog antimikotičkog,

kancerostatičkog ili virustatičkog delovanja.

Mehanizam dejstva antimikrobnih lekova:

inhibicija sinteze ćelijskog zida

inhibicija funkcije citoplazmatske membrane

inhibicija sinteze nukleinske kiseline

inhibicija sinteze proteina

inhibicija metaboličkih puteva

~ 20 ~

Podela antibakterijskih lekova:

baktericidni

penicilini

cefalosporini

monobaktami

karbapenemi

vankomicin

aminoglikozidi

hinoloni

metronidazol

Prirodni penicilini – penicilin G ili benzilpenicilin i penicilin V ili fenoximetilpenicilin

Penicilini rezistentni na penicilinaze – nafcilin, oxacilin, kloxacilin, meticilin; razvijeni u cilju prevazilaženja aktivnosti

penicilinaza kod Staphylococcus aureus koja inaktiviše prirodne peniciline.

β – LAKTAMSKI ANTIBIOTICI

U ovu grupu spadaju penicilini i cefalosporini (monobaktami i karbapenemi). Oni se vezuju za penicilin-vezane proteine

(PVP), pojedini PVP imaju transpeptidaznu aktivnost, time onemogućuju ukršteno povezivanje gradivnih jedinica

peptidoglikana. Benzil-penicilin je bio prvi antibiotik koji je u većem obimu primenjen u terapiji.

Sem benzilpenicilina, drug prirodni penicilini (koji se u Americi označavaju kao X, K, F a u Britaniji sa III, IV i I) nemaju

većeg značaja. Benzilpenicilin se u terapiji uglavnom koristi u obliku Na i K soli. Slobodna kiselina je higroskopna i

nestabilna.

Svi penicilini imaju kao osnovni skelet dva kondenzovana heterociklična sistema: petočlani tiazolidinski i na njega

prislonjen četvoročlani β-laktamski prsten. Oni se međusobno razlikuju samo po acil ostatku vezanom za amino grupu.

Osnovna struktura penicilina (u kojoj je acil ostatak zamenjen sa H atomom) zove se 6-APK odn. 6-aminopenicilanska

kiselina. Prednosti benzilpenicilina su u njegovoj baktericidnoj aktivnosti i extremno maloj toxičnosti, koja omogućava

njegovu primenu u vrlo velikim dozama. Nedostaci su mu mala hemijska stabilnost (naročito prema kiselinama) usled koje se

mora čuvati pod posebnim uslovima i ne može se upotrebljavati peroralno, zatim brza eliminacija, ograničen spektar

delovanja (samo prema G+ mikroorganizmima i G- kokalnim oblicima bakterija), relativno široko razvijena rezistencija i

pojave alergije.

Benzilpenicilin je u rastvorima najstabilniji na pH = 6,5 – 7,5, ali se i na ovim vrednostima pH i na sobnoj temperaturi

postepeno raspada. Bitno brže se raspada u kiseloj i alkalnoj sredini. Alkalne soli benzilpenicilina se čuvaju u ampulama u

suvom stanju i na hladnom. Hemijska nestabilnost, jednim delom pojave rezistentnosti, sklonost ka nastajanju alergija ali i

samo delovanje posledica su reaktivnosti β-laktamskog prstena. Ako se on razgradi dobijaju se jedinjenja koja nemaju

nikakvog delovanja.

U baznoj sredini inaktivacija penicilina počinje nukleofilnim napadom jona hidroxida na karbonilnu grupu laktamskog

prstena. Zatim sledi hidrolitička razgradnja prstena uz nastajanje peniciloinske kiseline.

Proširenje spektra primene penicilina ostvareno je razvojem jedinjenja koja su promenjena na acilnom delu. Na ovaj način su

dobijeni ariloximetil- i alkil- odn.ariltiometil- penicilini (npr. fenoximetilpenicilin i almecilin). Veći značaj zbog većih širina

varijacija s obzirom na proizvodnju penicilina imaju parcijalne sinteze kojima se pod blagim uslovima acilovanja dobija

6-APK.

bakteriostatski

eritromicin

kindamicin

tetraciklini

sulfonamidi

hloramfenikol

~ 21 ~

R naziv

hemijski trivijalni

–CH2 –

benzilpenicilin penicilin G

– O – CH2 –

fenoximetilpenicilin penicilin V

HO – – CH2 –

p-hidroxibenzilpenicilin penicilin X

CH3 (CH2)5 CH2 – n-heptilpenicilin penicilin K CH3 (CH2)4 – n-pentilpenicilin dihiropenicilin F

CH3 CH2 CH = CH CH2 – 2-pentenilpenicilin penicilin F

UV / VIS SPEKTROSKOPIJA

Apsorpcione spektroskopske metode imaju veliki značaj u kvalitativnoj i kvantitativnoj analizi farmakodinamskih aktivnih

supstanci. U rutinskim analizama lekova najčešće se primenjuju UV, VIS i IR spektroskopske metode, koje se zasnivaju na

interakciji aktivne supstance i elektromagnetskog zračenja određene talasne dužine. Neki atomi ili molekuli imaju

sposobnost da apsorbuju energiju elektromagnetnih zraka, što dovodi do promene energetskog nivoa nekog molekula,

odnosno do prelaska iz osnovnog u excitovano energetsko stanje, kao i do smanjenja intenziteta svetlosti koja prolazi kroz

rastvor neke supstance.

Hromofore su grupe koje su odgovorne za apsorpciju elektromagnetnog zračenja talasnih dužina od 200 do 380 nm.

Auxohromne grupe apsorbuju UV zrake u spektralnoj oblasti od 190 do 200 nm, a obojene supstance apsorbuju zrake u

vidljivom delu spektra koji obuhvata obalst talasnih dužina od 380 do 900 nm. Konvencionalno je sačinjen elektromagnetni

spektar koji obuhvata više spektralnih oblasti u zavisnosti od talasne dužine i energije zračenja:

γ zraci X zraci vakuum

UV bliska UV

vidljiva (VIS)

bliska IR IR

osnovna daleka

IR mikrotalasi radiotalasi

0,1 nm 0,1-1 nm 1-190 nm 190-380

nm 380-900

nm 900-2500

nm 2,5-26

μm 25-400

μm 400 μm -

25 cm > 25 cm

Sa porastom talasne dužine opada energija elektromagnetnog zračenja. Deo elektromagnetnog spektra koji obuhvata UV i

VIS spektralne oblasti naziva se elektronski spektar, jer energija UV i VIS zračenja izaziva pobuđivanje elektrona (σ, π ili

n-nevezanih elektrona) koji iz višeg prelaze u niži energetski nivo unutar molekula. Elektroni jednostruke kovalentne veze

su σ-elektroni i oni apsorbuju elektromagnetne zrake u vakuumskoj UV spektralnoj oblasti. Nevezani elektroni su elektroni

koji ulaze u sastav slobodnih elektronskih parova na kiseoniku, azotu, sumporu ili halogenima. Oni imaju nižu energiju

excitiranja od σ-elektrona i apsorbuju elektromagnetne zrake u bliskoj UV spektralnoj oblasti. π-elektroni su elektroni

dvostrukih i trostrukih veza i oni apsorbuju elektromagnetne zrake u UV i VIS spektralnoj oblasti.

Energija IR zračenja je dovoljna da izazove vibracije veza i funkcionalnih grupa u molekulu, pa se spektri u delu

elektromagnetnog zračenja od 900 nm do 25 μm nazivaju vibracioni spektri. IR spektroskopske metode imaju najznačajniju

ulogu ukvalitativnoj analizi aktivnih supstanci.

Grafički prikaz zavisnosti apsorpcije svetlosti od talasne dužine svetlosti koja prolazi kroz analizirani rastvor naziva se

elektronski ili apsorpcioni spektar. Apsorpcioni spektar daje informaciju o položaju i broju maximuma apsorpcije, kao i o

~ 22 ~

intenzitetu apsorpcije. Položaj i broj maximuma apsorpcije zavisi od vrste i broja hromofora. Na položaj maximuma

apsorpcije u elktromagnetnom spektru nekog molekula ima uticaj vrsta rastvarača i pH vrednost.

UV i VIS spektrofotometrijske metode mogu da budu direktne ili indirektne. Kod UV direktnih metoda meri se apsorbancija

rastvora aktivne supstance. Kod VIS direktnih metoda se isto meri apsorbancija obojenih rastvora ili extrakata. Indirektne

UV i VIS metode se primenjuju posle hemijske modifikacije molekula aktivne supstance. Najčešće se izvodi hemijska reakcija

između aktivne supstance i nekog reaktiva koji sadrži UV hromofornu grupu i u daljem postupku se meri apsorbancija

nagrađenih jedinjenja u UV spektralnoj oblasti. Indirektne kolorimetrijske metode zasnivaju se na merenju apsorbancija

hemijski modifikovane aktivne supstance, koja predstavlja obojeno jedinjenje.

UV spektar je karakterističan za dato jedinjenje u datom rastvaraču. Poređenjem nepoznatog jedinjenja sa standardnim

spektrom moguće je izvršiti identifikaciju. U tu svrhu postoje kolekcije UV spektara. UV spektri su po količini informacija

koje sadrže siromašniji od IR spektara, te se više koriste za dobijanje dopunskih informacija, kada već postoji dosta

informacija o jedinjenju, a ne kao metode potpune identifikacije jedinjenja. UV spektrofotometrija se može primeniti kada je

potrebno odlučiti između nekoliko mogućih struktura, u slučaju razlikovanja cis/trans izomera, proučavanja ravnoteže u

ratvorima i sl.

PRIMENA UV I VIS SPEKTROSKOPIJE U KVANTITATIVNOJ ANALIZI

Zasniva se na promeni intenziteta svetlosi koja ulazi u rastvor neke supstance (Io), i intenziteta svetlosti koja izlazi iz

rastvora (I), koja zavisi od debljine sloja rastvora (l) i koncentracije rastvora (c). Ovaj odnos je definisan Lambert-Beer-ovim

zakonom:

I = Io 10-klc tj. log (Io/I) = klc = A

gde je A apsorbancija rastvora neke supstance.

U kvantitativnoj analizi neke supstance može se koristiti i transmisija T, koja predstavlja količinu propuštene odn.

transmitovane svetlosti određene talasne dužine, i ona je obrnuto srazmerna apsorpciji a može se prikazati sledećom

relacijom:

A = log (1/T) T = I/Io

Određivanja pomoću poredbene (standardne) supstance

Pripremi serastvor supstrata, kako je to opisano u pojedinoj monografiji, i izmeri njegova apsorbancija (A1) na propisanoj

talasnoj dužini u kiveti pri debljini sloja od 1 cm, uz rastvarač odn. slepu probu. Na isti način i pod istim uslovima se

pripremi rastvor poredbene (standardne) supstance tako da vrednost apsorbancije (Ao) bude približna vrednosti apsorbancije

(A1). Rezultat određivanja se izračunava prema izrazu:

A1 – apsorbancija rastvora koji se ispituje

A0 – apsorbancija rastvora poredbene supstance

C1 – koncentracija supstance u preparatu koji se ispituje (%, m/v)

C0 – koncentracija standardne supstance (%, m/v)

a – odmerena masa preparata (g)

~ 23 ~

Određivanje metodom standarnog dodatka

Izmeri se apsorbancija ispitivanog rastvora (A1) a zatim apsorbancija istog rastvora uz dodatak poznate količine ispitivane

supstance (A1+dod.). Koncentracija ispitivane supstance (C1) se izračunava na osnovu izraza:

A1+dod. – apsorbancija ispitivanog rastvora uz dodatak poznate količine supstance

Cdod – koncentracija dodatka (%, m/v)

Određivanje pomoću specifičnog koeficijenta apsorbancije

Specifični koeficijent apsorbancije (A1%1cm) predstavlja apsorbanciju rastvora koji sadrži 1 g supstance u 100 ml rastvora, pri

debljini sloja od 1 cm. Na određenoj talasnoj dužini i uz određene uslove, ova vrednost predstavlja fizičko-hemijsku

konstantu za datu supstancu.

A1%1cm = A/Cl

A – apsorbancija rastvora supstance

C – koncentracija supstance (g/100 ml)

l – debljina sloja u kiveti, 1 cm

Pripremi se rastvor supstance određene koncentracije i izmeri se apsorbancija rastvora (A) na propisanoj talasnoj dužini u

sloju od 1 cm, ako nije drugačije propisano. Prethodno se spektrofotometar, pomoću rastvarača (slepa proba) podesi na 0 i

100% propustljivosti. Koncentracija supstance mora biti takva da se vrednost odgovarajuće apsorbancije nalazi između

0,200 i 0,600. Na osnovu očitane vrednosti apsorbancije izračunava se specifični koeficijent apsorbancije. Sadržaj

ispitivanog uzorka u preparatu (X,%) se izračunava prema izrazu:

A – apsorbancija rastvora preparata

F – ukupna zapremina rastvora (ml) u kojoj bi trebalo da bude m grama analiziranog preparata da bi se dobila korektna

vrednost apsorbancije

m – masa preparata (g)

Određivanja pomoću standarnog dijagrama

Pripremi se serija (5-8) rastvora supstance rastućih koncentracija, izmeri njihova apsorbancija i konstruiše dijagram

zavisnosti apsorbancija od različitih koncentracija (masa) supstance. Zatim se izmeri apsorbancija ispitivanog rastvora, na

osnovu koje se interpolacijom sa ordinate na apscisu prvo dolazi do koncentracije (mase) ispitivane supstance, a zatim se

izračunava sadržaj supstance u preparatu. Standardni dijagram treba povremeno proveravati, a pri korišćenju drugog

instrumenta ii drugog reagensa mora se konstruisati novi dijagram.

A

c (ili m)

~ 24 ~

REFRAKTOMETRIJA

Refraktometrija (određivanje indexa prelamanja odn. refrakcije) je metoda koja ima široku primenu u identifikaciji supstanci

i u određivanju njihove čistoće. Upoređivanje izmerene vrednosti indexa refrakcije sa podatkom iz literature ili

kompjuterskih baza podataka, omogućava potvrdu identiteta datog jedinjenja ili potvrdu njegove čistoće. S obzirom da je

index refrakcije bezdimenziona veličina čija brijčana vrednost zavisi od talasne dužine upadne svetlosti veoma je važno da

indexi refrakcije koji se upoređuju budu određeni na istoj talasnoj dužini. Index refrakcije se uglavnom određuje upotrebom

natrijumove D-linije na 589,3 nm (refraktometri koji koriste belu svetlost su konstruisani tako da izmereni index refrakcije

odgovara onom na 589,3 nm).

Index refrakcije takođe zavisi i od temperature, tako da je najbolje određivati na istoj temperaturi na kojoj je dobijena

vrednost indexa refrakcije sa kojim ga želite uporediti. Najčešće je to temperatura od 20oC. Index refrakcije po pravilu raste

ukoliko se smanjuje talasna dužina upadne svetlosti, a opada sa porastom temperature. Za mnoge organske tečnosti index

refrakcije se smanjuje za približno 0,00045±0,0001 za svako povećanje temperature od 1oC. Index refrakcije za vodu je

najmanje zavisan od temperature.

Ako se index refrakcije određuje na temperaturama koje su različite od onih u literraturi, potrebno je izvršiti korekciju pre

nego što se te dve vrednosti uporede. Korekcija se izračunava na sledeći način:

n(t2) = n(t1) – (t1-t2)*0,0045

Index refrakcije zavisi od prirode supstance, njenog hemijskog sastava, strukture, agregatnog stenja, čistoće. Male količina

nečistoće mogu da prouzrokuju značajne promene u indexu refrakcije. Strukturni faktor koji utiča na index refrakcije je

polarnost jedinjenja, pa supstance koje sadrže polarnije grupe imaju veći index refrakcije od supstanci sa manje polarnim

grupama. U najvećem broju slučajeva index refrakcije je u linearnoj (ili skoro linearnoj) zavisnost od procenta rastvorene

čvrste supstance u rastvoru. Pomoću standardne kalibracione krive i izmerene vrednosti indexa refrakcije rastvore može da

se odredi procentna koncentracija rastvora sa dosta dobrom tačnošću.

UPUTSTVO ZA RAD SA ABBE-OVIM REFRAKTOMETROM

Refraktometar je instrument koji služi za merenje indexa prelamanja (refrakcije) svetlosti. Apsolutni index refrakcije n

predstavlja odnos brzine kojom se svetlost prostire kroz vakuum i neki drgi medijum, dok relativni index refrakcije

predstavlja odnos brzine svetlosti kroz vazduh i neku drugu sredinu. Index refrakcije može da se definiše i kao odnos sinusa

upadnog i prelomnog ugla zraka svetlosti koji prelazi iz jedne u drugu sredinu.

Refraktometri najčešće mere ugao totalne reflexije. To je ugao za koji je upadni ugao tačno 90o. Ako je prelomni ugao veći od

graničnog ugla zrak se totalno reflektuje. Index refrakcije se računa iz graničnog ugla prema jednačini:

n = 1 / sinβ(granični)

Index refrakcije je funkcija talasne dužine i temperature, pa se radi sa žutim svetlom natrijumove D linije na temperaturi

20oC, nD20.

Abbe-ov refraktometar sadrži dve kompenzacijske Amičijeve prizme međusobno zaokrenute tako da propuštaju samo zrake

čija talasna dužina odgovara Na D liniji, pa se kao izvor svetlosti ne mora koristiti natrijumova lampa. Abbe-ovim

refraktometrom može se meriti index refrakcije u rasponu nD 1,3000-1,7000 sa tačnošću ±0,0002, uz održavanje stalne

temperature (±0,2oC), što se postiže spajanjem prizme sa ultratermostatom.

~ 25 ~

Uzorak se ravnomerno nanese na površinu prizme i prizma se brzo zatvori. Levim vijkom se pomera granica refrakcije dok se

ne uđe u vidno polje i namesti tačno na presek dve dijagonale (kosi krst), dok se desnim vijkom po potrebi izoštrava. U

slučaju slabog kontrasta između svetlog i tamnog polja može da se upotrebi ogledalo na dnu donje refrakcijske prizme. Ako

granica između tamnog i svetlog polja ne može da se izoštri, potrebno je dodati još uzorka ili bolje očistiti površine obe

prizme. Abbe-ov refraktometar ima skalu za direktno očitavanje indexa refrakcije i za očitavanje vodenog rastvora saharoze

u masenim udelima. Skala je vidljiva kada se posmatra kroz okular.

Marina Rajic