UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA Tesis “IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE EN PACIENTES FEBRILES QUE HABITAN EN EL ESTADO DE COLIMA” Para obtener el grado de MAESTRA EN CIENCIAS MÉDICAS PRESENTA: Q.F.B. RUTH RENDÓN RAMÍREZ ASESORES: DRA. ELENA MARGARITA CASTRO RODRÍGUEZ DR. FRANCISCO ESPINOZA GÓMEZ COLIMA, COL; JUNIO DEL 2006.
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
Tesis
“IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL DENGUE EN PACIENTES
FEBRILES QUE HABITAN EN EL ESTADO DE COLIMA”
Para obtener el grado de
MAESTRA EN CIENCIAS MÉDICAS
PRESENTA:
Q.F.B. RUTH RENDÓN RAMÍREZ
ASESORES:
DRA. ELENA MARGARITA CASTRO RODRÍGUEZ
DR. FRANCISCO ESPINOZA GÓMEZ
COLIMA, COL; JUNIO DEL 2006.
ESTA INVESTIGACIÓN FUE DESARROLLADA CON:
� Financiamiento CONACyT 34543. � Financiamiento del Fidecomiso Dr. Ramón Álvarez Buylla de Aldana
de la Universidad de Colima 374/05. � Financiamiento CONACYT 186719, del Fidecomiso Institucional
para el fomento de la tecnología y el fomento, desarrollo y consolidación de científicos y tecnólogos.
ESTA INVESTIGACIÓN FUE PRESENTADA EN:
� El IV Congreso Nacional de Virológica en la sesión de Carteles con el titulo: “Dengue virus en pacientes febriles sin cuadro de infección aparente”.
� En las CVIII Jornadas Nacionales de Ciencias Farmacéuticas y IV jornadas estudiantiles de Fármacobiología con el título de: “Identificación de los Serotipos el virus del dengue en el Estado de Colima”.
Se envió el manuscrito: “Dengue virus detection in serum simples from febrile patients”, a la revista Emerging Infectious Diseases donde se encuentra en revisión.
I.- RESUMEN
El Estado de Colima está reportada como una zona endémica para dengue y los casos
reportados anualmente se basan en casos sintomáticos con cuadro clínico claro, sugestivos de
dengue.
En el Estado de Colima hay un porcentaje considerable de pacientes febriles sin
cuadro clínico sugestivo de dengue o atípico, a los cuales no se les descarta infección por
dengue. Además desde el año 1997 no existe un estudio que describa que serotipos están
circulando actualmente.
El presente estudio es un estudio descriptivo transversal, con muestreo por
conveniencia, donde se captaron pacientes febriles (igual o mayor 38.5 ºC), que acudían a los
centros de atención médica del Estado de Colima en el periodo de julio/2004 a
septiembre/2005. A estos pacientes se les solicitó su participación con carta de consentimiento
informado. Se tomó una muestra sanguínea de la cual se obtuvo el suero. En el que se
determinó la presencia del virus del dengue (búsqueda de cada uno de los 4 serotipos), por la
Técnica de Retrotrascripción y Reacción en Cadena de la Polimerasa. De las 215 muestras
procesadas, resultaron 28 positivas para dengue (2 para DEN1 y 26 para DEN3). Como
controles positivos se utilizaron muestras de RNA para cada serotipos de dengue
proporcionados por el Dr. Farfán Ale de la Universidad Autónoma de Yucatán.
Los resultados muestran que en el Estado de Colima la incidencia de dengue en
pacientes febriles fue de 13.02 % en un periodo de 15 meses y que actualmente se encuentran
circulando al menos 2 serotipos (DEN1 y DEN3).
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II.- ABSTRACT
Colima State was reported as endemic zone for dengue virus infection and the cases of
dengue infection reported every year were only those referred with dengue symptoms as is
classified for the Worth Health Organization (WHO).
In Colima State there are a considerable numbers of febrile patients without dengue
symptoms or with symptoms atypical, and all those cases are not supported with a lab test.
Also since 1997 there are not a descriptive study of the dengue serotypes circulating in
Colima.
The present study is transversal descriptive. Sample were captured for convenience, we
included febrile patients (equal or more than 38.5 º C) admitted at emergency department of
several hospitals of Colima State in the period of july/2004 to Septembre/2005. Informed
consent was obtained for blood sample. Serum specimens were analyzed for dengue virus
presence (DEN1, DEN2 DEN3 and DEN4), with Reverse Transcription - Polymerase Chain
Reaction assay (RT-PCR); we analyzed 215 samples, 28 were positive for dengue virus: 26
(92.85 %) for DEN3 and 2 (7.1%) for DEN1. Positive controls were donated for Dr. Farfán
Ale from Autonomous University of Yucatán.
The results of the present study indicated that the incidence of dengue infections in
febrile patients at Colima State is 13.02 % in 15 months and there are at least two setotypes of
dengue virus (DEN1 and DEN3) in this State.
ii
III.- AGRADECIMIENTOS
Al equipo de trabajo de campo conformado por José María Maya, Arturo Aguillón Zamora+, Beatriz Orozco Calleja y Lourdes Juárez Romero.
A mis compañeros de laboratorio de regulación génica por su ayuda y compañía;
haciendo ameno el trabajo de laboratorio.
Al todo el personal (familiares, amigos y conocidos) que de alguna manera colaboró en la captura de las muestras por mencionar algunos de ellos: Q.F.B. Irma P. Gutiérrez Hernández, Alejandro González, Q.F.B. Aarón González Torres, Q.F.B Víctor Suárez Bravo, Q.F.B. Adriana Mariscal Luna, Lic. Enf. Isela Herrera Barbosa, M.P.S.S Yureli Téllez, M.P.S.S Dianilla Portillo Lozano, Q.F.B. Rocío, Q.F.B Carlos Curiel, Q.F.B Esther, Q.F.B. Mara, a las laboratoristas: Dorian, Beatriz, Sandra Anguiano y a la Trabajadora Social, Claudia Preciado.
A los integrantes del Subcomité de Investigación de Salud en el IMSS: Dra. Alicia Martínez Contreras, Dr. Benjamín Trujillo Hernández, Dra. Rebeca Millán Guerrero, M.C. Carlos Enrique Tene Pérez y al Lic. Enf. Oscar López Ramírez por sus correcciones y su apoyo.
Al Dr. Gabriel Ceja Espíritu, Dr. Sergio Barreto Torres, Q.F.B. Maria Dolores Chávez Sánchez, Dr. Cesar Ramírez Hernández, Dr. Carlos Hernández Dávila, Dr. Pedro Hernández, Dr. Jesús Francisco Calvillo Vázquez, Dr. Ruelas y a la Dra. Judith Hernández García, por su desinteresada colaboración.
A la Dra. Elena Castro Rodríguez por toda su paciencia, enseñanzas y su invaluable
ayuda. Al Dr. Francisco Espinoza Gómez y Dr. Oscar Newton Sánchez por su apreciable
apoyo en el desarrollo de este trabajo y en el temple de mi carácter. Al Dr. Ernesto Reynoso Zúñiga y a la M.C. Celina Gutiérrez por su apoyo, consejos y
desinteresada colaboración en el desarrollo de esta investigación. Al Dr. José Arturo Farfán Ale investigador de la Universidad Autónoma de Yucatán
que donó los controles positivos para cada serotipo del virus del dengue. Al Dr. Clemente Vázquez Jiménez por sus correcciones y su tiempo. A toda la población del Estado de Colima y muy especialmente a la gente de Cofradía de Juárez y Tecomán que me facilitaron el trabajo en campo. Al Fidecomiso Dr. Ramón Álvarez Buylla de Aldana y CONACYT por su apoyo económico, ya que sin este, esta investigación no hubiese sido posible.
iii
IV.- DEDICATORIAS
A Dios que le debo todo lo que tengo y soy.
A mis padres, Orfanel Rendón y Eloisa Ramírez, y a mis hermanos, Mely, Orfa, Orbe y Migue, que son mi inspiración.
A mis familiares y amigos que siempre me apoyan en cada una de mis locuras.
6.1 Definición del problema ...............…………..……………..………....…...........1 6.2 Antecedentes……………………..………………………..………..........….........2
6.2.1 Enfermedad .…………………………………….…………...................4 5.2.1.1 Dengue Clásico (trancazo o quebrantahuesos)....……............................5 5.2.1.2 Dengue hemorrágico (DH) y Síndrome de Choque por dengue (ShCD)…..5
7.1 Diagrama de flujo de la metodología………....………….…………….………...23 7.2 Universo de Trabajo……………………………………………………….……..24
7.3 Diseño del estudio………………………………………………………….…….24 7.4 Obtención de datos……………………....………………………………….……24
7.5 Definición de las variables…………………………………………………….…25 7.6 Análisis estadísticos de datos……………………………………………….……26 7.7 Metodología...............…………………………………………………...……….27 7.8 Aspectos éticos………………………………………………………..………….32 VIII.- RESULTADOS.………… ............................................................................................33 IX.- DISCUSIÓN….………….….......................................................................................37 X- CONCLUSIONES…………………………………..………………………….……….44 XI.- PERSPECTIVAS……………………………………..……………………….………...45 XII.- BIBLIOGRAFÍA…………………………………..……………………….…......…...46 XIII.- ANEXOS
13.1 Carta de consentimiento informado……………………………………..…..….50 13.2 Colección de la muestra para el diagnóstico del virus del dengue..……………51
13.3 Formato de recolección de datos del procesamiento de muestras..….................52
vi
1
VI.- MARCO TEÓRICO
6.1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Actualmente, las epidemias por dengue son uno de los problemas de salud pública más
relevantes en la mayor parte de las comunidades urbanas de los países tropicales1,2.
Actualmente, dos y medio billones de personas en el mundo que habitan dichas áreas están en
riesgo de contraer la enfermedad.3
Los virus del dengue han sido agrupados en cuatro serotipos: DEN1, DEN2, DEN3 y
DEN4. 4,5 Los cuatro serotipos son capaces de producir infección asintomática, enfermedad
febril y cuadros severos (dengue hemorrágico y síndrome de choque por dengue), que pueden
conducir hasta la muerte.
Las encuestas seroepidemiológicas en México indican que varios millones de personas
han sido infectadas por uno o más de los serotipos desde 1978. En México el Estado de
Colima ocupa el segundo lugar de casos de dengue hemorrágico desde 1984 al 2002. 6
El Estado de Colima, es una zona permanentemente infestada por Aedes aegypti (vector
del dengue), con brotes epidémicos de dengue clásico y hemorrágico desde 1997 al 2002. 1 La
incidencia anual reportada en el estado se basa en la población que presenta cuadros febriles
con cuadro clínico claro sugestivo de dengue a los cuales se les corrobora enfermedad por
dengue con la búsqueda de anticuerpos (IgM) por la técnica de ELISA.
Está reportado que un porcentaje considerable de infección por dengue presenta cuadros
atípicos, fácilmente confundibles con otras virosis (hepatitis, rubéola, enterovirosis, etc.) o
con infecciones bacterianas (leptospirosis, tifoidea, etc.)7,8 En Colima hay un porcentaje
considerable de pacientes febriles que no presenta un cuadro clínico que claramente sugiera
infección por dengue a estos pacientes no se les descarta la presencia de enfermedad por virus
del dengue.
Por lo que en este estudio nos enfocaremos a tratar de responder las siguientes preguntas:
¿Qué porcentaje de la población con cuadro febril agudo con o sin sintomatología
sugestiva de dengue presenta virus de dengue circulante en suero? y ¿A que serotipo del
virus del dengue pertenecen las muestras positivas?
2
6.2 ANTECEDENTES
La Organización Panamericana de la Salud (OPS) ha considerado al dengue como el
mayor problema de salud pública de América luego del Síndrome de Inmunoindeficiencia
adquirida (SIDA), encontrándose dos tercios de la población mundial en zonas propicias para
el desarrollo de enfermedad por dengue. Es posible que cada año 80,000.000 personas
contraigan la enfermedad.
El dengue es una enfermedad de carácter agudo febril, con frecuencia epidémico. Es la
infección humana más prevalente de las causadas por un virus de la familia Flaviviridae,
siendo propia de regiones subtropicales y tropicales donde es trasmitida por mosquitos del
género Aedes.
Existen cuatro serotipos del virus (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4), que producen
anticuerpos contra antígenos específicos, la inmunidad cruzada no es permanente, pudiéndose
constatar infecciones por varios serotipos simultáneamente. 9
Durante más de una década, DEN1, DEN2 y DEN4 han circulado ampliamente en el
Continente Americano, pero desde 1994 se detectó la presencia de DEN3 en Centroamérica.10
En nuestro país, los cuatro serotipos han sido identificados en algún momento y en la
actualidad el serotipo predominante es DEN2 (ver Tabla I). Debido a las facilidades que
existen hoy en día para viajar, así como el movimiento migratorio alrededor del mundo, la
distribución geográfica de este virus se ve modificada continuamente. 6
Tabla I. Porcentaje de Serotipos de Dengue en México desde 1995-2002
SEROTIPOS 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002
DEN1 16.7 27 6.5 5 3 0.7 - 0.7
DEN2 38.6 2 1.6 2 13.4 55.2 75 65.6
DEN3 8.8 60 88.3 93 81.7 44.1 25 33.7
DEN4 35.9 11 3.6 - 1.9 - - -
Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica (InDRE) 6.
En México como en otras partes del mundo, la presencia del dengue está condicionada
a la existencia del vector, quien habita en áreas bien determinadas (ver fig 1). Los estados de
la República Mexicana que tienen menor riesgo a tener dengue son: Baja California,
Chihuahua, Durango, Zacatecas, Aguascalientes, Guanajuato, Querétaro, Tlaxcala y el Distrito
Federal (D.F). 6
3
Figura 1. Distribución de Aedes aegypti y áreas de transmisión de Dengue, 2002. Se muestra como el patrón de distribución del mosquito vector y la presencia de la transmisión de dengue están ligadas. OMS (Organización Mundial de la Salud)6
Los estados con mayor riesgo para la enfermedad son: Sonora, Nuevo León,
Oaxaca, Chiapas, Tabasco, Campeche, Yucatán y Quintana Roo. Esto se ve reflejado
en la figura 2 donde se muestran los casos de dengue hemorrágico en los estados mas
afectados de 1984 al 2002. 6
Figura 2. Distribución Nacional de los Casos de DH de 1984 al 2002. El territorio nacional se muestra divido en zonas con base al número de casos de dengue ocurridos en el periodo. En las zonas rojas se señalan los estados que presentan mayor número de casos de dengue hemorrágico (DH), entre las cuales se encuentra Colima. Al mismo tiempo se visualiza, que la mayor parte de la extensión territorial nacional, presenta casos de dengue hemorrágico. Remarcando así que la enfermedad del dengue en nuestro país es un problema de salud pública. OMS
6.
4
6.2.1 ENFERMEDAD
El dengue es una enfermedad que se manifiesta de manera e intensidad variable en
relación con los factores del huésped y determinadas características de la cepa viral. 11
Los cuadros clínicos que se presentan por los 4 serotipos del virus pueden ser
idénticos; pero la inmunidad desarrollada por cada serotipo no es protectora entre ellos; es
decir la infección por uno de ellos producirá anticuerpos específicos para el serotipo que la
originó. 9
El diagnóstico del dengue, se realiza con la integración de las características clínicas de
la enfermedad y el estudio serológico para confirmar la presencia de anticuerpos y la
identificación del serotipo del virus del Dengue. El 40 % de infecciones por dengue son
asintomáticas o presentan un cuadro clínico atípico de dengue. 6 En zonas endémicas, la
presencia de fiebre aguda sin origen claramente identificable sugiere fuertemente viremia por
dengue. Esto es lo que algunos autores denominan “alerta de fiebre”. 1
La enfermedad sintomática puede presentarse (ver figura 3) en forma leve como
dengue clásico, en forma más severa como dengue hemorrágico o en su presentación más
grave, síndrome de choque por dengue. 6
Infección viral por dengue Asintomática Sintomática
Fiebre Síndrome de Fiebre Indiferenciada fiebre por dengue hemorrágica (Síndrome viral)
Sin Con Extravasación hemorragia hemorragia de plasma inusual Sin choque Síndrome de choque por dengue Dengue Clásico Dengue hemorr ágico
Figura 3. La enfermedad por dengue puede presentarse de manera asintomática o sintomática. Las sintomáticas suelen presentarse como cuadros clínicos inespecíficos, dengue clásico (con hemorragias o sin ellas), dengue hemorrágico (con síndrome de choque por dengue o sin él.). OMS 8
5
6.2.1.1 Dengue Clásico (trancazo o quebrantahuesos).
Se caracteriza por la presencia de enfermedad febril (más de 38.5º C) de inicio brusco,
caracterizada por cefalea intensa (generalmente frontal), mialgias, artralgias y dolor de ojos
(retrocular) que se incrementa con los movimientos oculares. En diferentes proporciones se
pueden presentar otros datos, como exantema transitorio, petequias y equimosis, fotofobia,
pueden presentarse en más del 50% de los casos); hiperestesia, linfadenopatía, dolores
generalizados, congestión faríngea, bradicardia relativa y conjuntivitis; pueden observarse
leucopenia y trombocitopenia. La fiebre y los demás signos y síntomas pueden ser recurrentes
(gráfica en silla de montar) y por lo general hay un verdadero ataque al estado general; este
cuadro dura de tres a siete días, el paciente permanece con astenia y en ocasiones con estados
depresivos por semanas. En menores de cinco años puede presentarse sólo como una
enfermedad febril exantemática.
La fiebre dura aproximadamente 5 días, durante los cuales también está el periodo de
contagio y la presencia del virus en la sangre. 6,12
6.2.1.2 El Dengue Hemorrágico (DH) y Síndrome de Choque por Dengue (SChD).
El DH pueden aparecer precedido o no de un dengue clásico. En el DH hay fiebre y
malestar general, se pueden presentar hemorragias, éstas pueden ser leves o intensas, externas
o internas. Hay trastornos en la sangre y los líquidos corporales que pueden manifestarse como
sangrado por alteraciones en la coagulación, observándose sangrado nasal, sangrado en las
encías, vómito con sangre, aparición de moretones o enrojecimiento de la piel. En las mujeres
puede ocurrir un incremento en la cantidad o duración del periodo menstrual. 12
El dato cardinal para el diagnóstico clínico de la pérdida de plasma en el dengue
hemorrágico es la presencia de trombocitopenia y hemoconcentración. Para la vigilancia
epidemiológica de DH y SChD se considera trombocitopenia al conteo de plaquetas igual o
menor a 100 000/ µl de sangre. 12
6
Para determinar la hemoconcentración, se recomienda observar uno o más de los
criterios que se mencionan a continuación, aunque no todos son aceptados en la mayor parte
de las publicaciones: 12
1. Incremento del hematocrito en 20% o más (por ejemplo de 40 a 48%) durante la fase
crítica de la enfermedad.
2. Decremento del hematocrito en 20% o menos (por ejemplo de 48 a 40%) entre la fase
crítica y la convalecencia.
3. Tendencia del hematocrito (por ejemplo 40, 43, 45 en muestras subsecuentes).
4. Valor de la relación hematocrito/hemoglobina: el valor normal es de 3.0 o 3.1; si la
relación es de 3.2 a 3.4 se considera sugestiva, si es de 3.5 o mayor es indicativa de
hemoconcentración.
5. Presencia de derrame pleural o ascitis.
6. Hipoalbuminemia.
Otros datos que suelen acompañar al DH son: dolor en área hepática, dolor abdominal,
derrame pleural, ascitis, edema en diversos órganos, hepato y esplenomegalia, tiempos
prolongados de coagulación, leucopenia inicial y leucocitosis posterior, hiponatremia,
hipoalbunemia, hipotensión con tendencia al acortamiento en el intervalo sistólico/diastólico.
Suelen presentarse además los siguientes datos: niveles elevados de aspartato sérico,
aminotransferasa, nitrógeno y urea en sangre, hipoproteinemia, albuminuria, y en algunos
casos, reducción de los factores de coagulación y factores fibrinolíticos como fibrinógeno,
protrombina, tiempo prolongado de protrombina y parcial de tromboplastina; la radiología
puede revelar un derrame pleural o líquido libre en cavidad abdominal. Durante el cuadro
pueden presentarse complicaciones graves, como choque, insuficiencia hepática y renal; el
daño hepático puede ser severo, por lo que deberá monitorizarse el funcionamiento del hígado
en forma sistemática; asimismo se puede encontrar un cuadro de encefalopatía por hipoxia,
edema cerebral, daño hepático, hemorragia intracraneal o alteraciones hidroelectrolíticas;
también es frecuente un cuadro respiratorio no cardiógeno. Por su lado, la insuficiencia renal
suele ser consecuencia de la hipovolemia, especialmente en el SChD, por lo que deberá
tenerse especial cuidado en el manejo de líquidos. 12
El síndrome de choque por dengue suele presentarse en el curso de un cuadro de DH,
por lo general entre el tercero y quinto días de evolución; sin embargo, puede hacerlo
7
inmediatamente a dos o tres días después de un dengue clásico y excepcionalmente en
pacientes asintomáticos o con cuadros febriles inespecíficos de dengue. 12
Como en todo cuadro de choque, hay manifestaciones de insuficiencia circulatoria: piel
fría y congestionada, cianosis peribucal o de las extremidades, vómito, llenado capilar lento,
taquicardia, tensión arterial disminuida o imperceptible, o bien reducción de la tensión
diferencial (sistólica/diastólica) a menos de 20 mm/Hg, pulso rápido y débil o imperceptible,
oliguria; puede haber además inquietud, agitación y alteraciones en el estado de conciencia,
como letargo o confusión. 12
Si el cuadro no se corrige en forma oportuna puede conducir a acidosis metabólica,
sangrados severos, falla orgánica múltiple y coagulación intravascular. La muerte o
recuperación ocurre por lo regular en un lapso de 12 a 48 horas, por lo que el manejo
durante esta fase es crítico para el pronóstico del paciente. 8, 12
Para el diagnóstico de DH y SChD es básico observar la secuencia de los
acontecimientos clínicos y de laboratorio, por tanto es imprescindible realizar un monitoreo
con valoración y toma de muestras periódicas. 12
Se han identificado signos de alarma que hacen inminente el cuadro de choque en un
paciente de DH y permiten el inicio oportuno del manejo (canalización y administración de
líquidos intravenosos): 8, 12
- Dolor abdominal intenso y sostenido, que pasa de ser uno de los componentes sintomáticos
del cuadro al dato cardinal.
- Vómito persistente.
- Caída brusca de la temperatura, de hipertermia a hipotermia, con frecuencia acompañada de
sudoración, adinamia y lipotimias.
- Inquietud o somnolencia. 12
El espectro clínico en el DH/SChD es amplio, causado por una alteración
inmunológica sistemática y que depende de los órganos más afectados y los signos y síntomas
predominantes, por lo que el diagnóstico diferencial debe incluir desde cuadros infecciosos
inespecíficos, graves y que se deterioran rápidamente, incluyendo exantemas, hemorragias sin
causa aparente a cualquier nivel, cuadros purpúricos, de abdomen agudo, hasta cuadros de tipo
psicótico; por tanto el médico debe tener siempre presente la posibilidad de DH. 6,12
6.2.2 HOSPEDERO.
8
El humano es el único hospedero conocido del virus de dengue11, la susceptibilidad es
universal y la exposición depende básicamente de los hábitos de la población, la circulación de
los distintos serotipos y la presencia y densidad del vector en la comunidad. Dentro de los
factores asociados a la presentación de formas hemorrágicas, destaca el antecedente de una
infección por virus de dengue por otro serotipo, los padecimientos concomitantes (diabetes
mellitus, anemia, asma, y otros estados que causan compromiso inmunológico) y la virulencia
de la cepa viral. 6
Existe una fuerte relación entre la respuesta secundaria de anticuerpos y el dengue
hemorrágico o el síndrome de choque por dengue (SChD). 13 La teoría más aceptada para
explicar el SChD, dice que los anticuerpos formados durante infecciones previas al paso del
tiempo alcanzan niveles subneutralizantes que, durante una nueva infección por otro serotipo,
no destruyen al virus y forman un complejo antígeno-anticuerpo que al ser fagocitado por el
monocito favorece la replicación viral (amplificación inmunológica). Los monocitos
sensibilizados facilitan la formación de complejos inmunes, presentando una respuesta
aberrante del tipo del fenómeno de Arthus, con liberación y estimulación de diversas
sustancias y mecanismos vasoactivos, como anafilotoxinas, factor de permeabilidad,
activación de la cascada del complemento y otros; que provocan aumento de la permeabilidad
vascular, lisis linfoblástica y de plaquetas, alteraciones en los mecanismos de coagulación,
disminución de linfocitos, derrames cavitarios, edema en diversos órganos, sangrados en
distintos niveles y de intensidad variable, que pueden llegar hasta el estado de choque.6,13,14
El aspecto más importante de este cuadro es que se trata de un fenómeno autolimitado
en donde los linfocitos no sensibilizados permiten restablecer la homeostasis en el curso de 48
a 72 horas, por lo que el papel del médico es mantener al paciente durante este tiempo y
vigilar el ingreso de líquidos intravenosos, ya que los líquidos extravasados permanecen en el
organismo y una vez controlado el cuadro se reabsorberán, lo cual representa un riesgo para
complicaciones graves, como el edema pulmonar. 6,12
Como ya se mencionó anteriormente el humano es el único hospedero que desarrolla
infección por dengue; existen otros hospederos que no desarrollan la infección pero participan
en el ciclo de transmisión del virus en forma rural; estos son los Macacos y los Chimpancés.
9
Debido a que no existe un modelo animal que desarrolle la infección por dengue como
en el humano, el estudio de la inmunopatogénesis del dengue actualmente tiene muchas
lagunas. 15 Esto se refleja en que hasta el momento no se dispone de una vacuna efectiva ni de
tratamiento específico para la enfermedad.15, 16
La tasa de reproducción y mortalidad del virus, una vez dentro del humano, que es su
hábitat natural, son inalterables por las condiciones del entorno, no importa cual sea su cepa
(variante genética) o serotipo.
6.2.3 VECTOR.
Varias especies de mosquitos Aedes son capaces de transmitir el virus, sin embargo, el
Aedes aegypti es el vector más común y efectivo para el dengue, el mosquito adulto tiene un
dorso con bandas color plateado o amarillo blanquecino sobre un fondo obscuro o un dibujo
característico en forma de lira en el dorso del tórax, las patas se presentan conspicuamente
bandeadas y el último artero de las patas es blanco; el abdomen de la hembra tiende ha ser
puntiagudo (figura 4). 7, 11, 13, 17, 18
Figura 4. Fotografía del Aedes aegypti.
Este género está extremadamente distribuido dentro de las latitudes 40° S y 40º N y es
altamente susceptible a temperaturas extremas. Sus nichos ecológicos están localizados a
10
altitudes no mayores a 1000 m sobre el nivel del mar .7 Existen estudios que reportan, en las
zonas tropicales y subtropicales altitudes menores de 600 m sobre el nivel de mar como
indicativos de una alta proliferación del vector.19
En México, el Aedes aegypti es la única fuente de infección para el hombre, y a su vez
el hombre infectado es el único reservorio para el mosquito. El Aedes aegypti es un mosquito
de actividad diurna, que se ha asociado a todas las epidemias urbanas y suburbanas de
dengue.6
Los machos nacen un poco antes que las hembras ya que deben madurar sexualmente y
se alimentan de azúcares presentes en la naturaleza.7 Las hembras son las que además de
ingerir azúcares necesitan ingerir sangre, el contenido de isoleucina en la sangre humana es
usada para la vitelogénesis (formación y maduración de huevos) y síntesis de energía de
reserva7, 17. El mosquito hembra, realiza su primera ingesta de sangre 24 horas después de
haber emergido y de esa manera, cuando pica sobre una persona infectada, adquiere el virus;
existe un periodo de incubación entre 8-12 días, durante el cual el virus se multiplica en el
epitelio intestinal, en los ganglios nerviosos, en el cuerpo graso y las glándulas salivales. En
estas condiciones el mosquito permanece infectado y asintomático, siendo capaz de transmitir
la infección y funcionar como vector el resto de su vida7 (en promedio de 30 días) 6, en dicho
periodo puede transmitir la infección al humano (transmisión indirecta) o a su progenie
(transmisión directa o trasovárica8); los huevos pueden resistir condiciones de desecación. 21
El Aedes aegypti, tiene dos etapas bien diferenciadas en su ciclo de vida: fase acuática
con tres formas evolutivas diferentes: (huevo, larva y pupa) y fase aérea o de adulto (ver figura
5). El horario de actividad de picadura de los mosquitos es en horas de baja intensidad de la
luz solar; en general, se inicia al amanecer (6:00 a 8:00 horas) o antes del anochecer (17:00 a
19:00 horas). La alimentación puede estar condicionada a la posibilidad de obtener sangre de
los habitantes de las casas, pudiendo modificar su actividad y picar aún en horas de la noche y
en el día. 6
El Aedes aegypti en condiciones naturales sobrevive un promedio de entre 15 y 30
días, su ciclo para poner huevecillos es de aproximadamente cada tres días (figura 5). Su
alimentación es en cualquier momento de acuerdo a la disponibilidad (puede picar varias
veces a las personas de una casa). Las proteínas contenidas en la sangre le son indispensables
para la maduración de los huevecillos. Para poder completar el ciclo de vida del mosquito, las
11
hembras tienen que alimentarse aproximadamente cada tres días, antes de alimentarse buscan
el sitio donde pondrán los huevecillos (oviposición).6 Prefieren depositar sus huevecillos en
recipientes artificiales de color obscuro y de diámetro ancho, especialmente los que se
localizan en áreas sombreadas y con agua limpia. Se sabe que los dos ovarios de la hembra
producen hasta 100 ó 120 huevecillos por ciclo, los cuales se depositan de 30-50 por cada
oviposición, justamente por arriba del nivel de agua y son capaces de resistir la desecación;
tienen la longitud de un milímetro y al principio son de color blanco pero después de dos horas
se tornan obscuros.7 Entre cada ciclo gonotrófico (ciclo de reproducción), el Aedes aegypti
pica o se alimenta varias veces de uno o varios huéspedes, hasta satisfacer sus necesidades
alimenticias, lo que representa un factor de importancia en su capacidad como transmisor de
enfermedades. 17
Suele encontrarse cerca de las habitaciones humanas o en el peridomicilio, posado en
lugares oscuros y protegidos, como armario, bajo los muebles y en áreas con vegetación
abundante (macetas, jardines interiores).6
Figura 5. Ciclo Biológico del Vector. La hembra adulta ya fecundada, deposita sus huevos en recipientes adecuados, de los cuales emergen las larvas que pasan por 4 estadios de madurez. Posteriormente pasa a la etapa de pupa, en la cual ocurre la metamorfosis a mosquito adulto. SNVE6
12
Debido a la importancia de los mosquitos en el ámbito de la salud se han establecido
las claves de Darsie & Mitchell. 20 Estas claves, dan a cada parte del mosquito un nombre (ver
figura 6). Dependiendo de la morfología se les da una clave única, que permite identificar así a
cada uno de los mosquitos de las diferentes especies. 20
Figura 6. Partes del mosquito hembra del género culicidae. Ap: lóbulo antepronotal; aPo: área postespiracular; ApR: área preespiracular; C-1, C-2, C-3: coxa anterior, media y posterior, respectivamente; Ce: cercos; E: espiráculo; Esc: escutelo; Est: esterito abdominal; Fe: fémur; Ha: halterio; Mks: mesokatepisterno; Mm: mesanepimero; Mpn: mesoposnoto; Ms: mesómero; Ppn: postpronoto; Ta1, Ta2, Ta3, Ta4, Ta5: tarsómeros 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente; Te: tergito abdominal; Ti: tibia (los números romanos indican el segmento abdominal correspondiente). Darsie & Mitchell. 20 6.2.4 VIRUS.
El agente causal es un virus de la familia Flaviviridae,16,22 del grupo de los arbovirus
(arthopod-borne-virus). Se trata de virus esféricos con envoltura, de 40-50 nm de diámetro con
cápside icosaédrica y genoma de ácido ribonucleico (RNA) monocatenario, no segmentado, de
polaridad positiva (ver figura 7A).14 El genoma opera directamente como RNA mensajero
13
policistronico. El virión consiste de una nucleocápside con simetría cúbica, encerrada en una
estructura lipoproteíca procedente de la célula hospedera. El poseer esta estructura lo hace
lábil a la inactivación por solventes orgánicos, cambios de pH y temperatura.7,23
A
B
Figura 7. A. Estructura general del virus del dengue. B. Organización del genoma del virus del dengue. El genoma del virus del dengue se representa como un fragmento (parte superior de la figura), el cual es traducido en una poliproteína (parte media de la figura) que codifica 10 proteínas: C, pM , E y 7 NS (encargadas de la replicación viral). La respuesta antigénica de anticuerpos y células T para cada proteína es presentado en la parte inferior con signos de (+) dependiendo de la capacidad de respuesta de cada proteína. 6A. SNVE6 y 6B. Modificada de bibliografía 14.
14
El genoma (figura 7B), está compuesto por una sola molécula de RNA de cadena
sencilla lineal de 10 703 nucleótidos y de alta variabilidad genómica. Por si mismos, los
ácidos nucléicos genómicos del virus, son infecciosos, por lo que las autoridades de salud
recomiendan manejar este virus en el nivel de bioseguridad 2.6
El virus se adhiere a las células, se replica en el citoplasma y se ensambla en el retículo
endoplasmático. Su genoma codifica una poliproteína que luego es procesada en 10
polipéptidos: 3 estructurales (una proteína de nucleocapside C o V2, una membranosa prM, o
V1 y una glicoprotéina de envoltura E: hemaglutinante y de adherencia, o V3) y 7 no
estructurales, de los cuales destacamos NS1 (++), que puede inducir, como E (+ + +) y prM
(+), una respuesta inmune protectora (figura 7B).14
Se reconocen 4 serotipos antigénicos llamados DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 sobre la
base de ensayos de neutralización del efecto citopático.11,23 Estas respuestas antigénicas que
diferencian a cada serotipo, se encuentran relacionadas con variantes en su genoma (proteínas
C y prM), esto permite en la actualidad el uso de técnicas moleculares como es la
Retrotranscripción y Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR), para la determinación
de estos serotipos sin recurrir a las técnicas mas laboriosas antes utilizadas (Ver apartado
5.2.6.).16
Existe heterogeneidad de cepas dentro de cada serotipo que se correlacionan con
variantes en las secuencias de RNA, cuya identificación en las proteínas prM, E y NS1 tiene
utilidad epidemiológica.22
En la actualidad la secuencia completa de la región NS1 fue publicada en el banco de
genes con el siguiente número de acceso gi: 25059131 y está siendo analizada para compararla
con diferentes cepas ya referenciadas.25
Como ya fue mencionado anteriormente, cualquiera de los serotipos tiene la capacidad
de causar dengue hemorrágico. Aunque estudios recientes en el sureste de Asia demuestran
que el serotipo 2 es más agresivo que los otros. Esto llevó a la clasificación de las cepas del
serotipo 2 en diferentes genotipos y cada una con diferentes asociaciones epidemiológicas. El
genotipo selvático comprende las cepas del oeste de África y mantiene su ciclo de vida en
primates no-humanos (hospedero) y mosquitos residentes de la selva (vector). Este genotipo
parece no estar involucrado en la enfermedad en humanos. 22
15
Entre las cepas epidémicas del serotipo del virus 2 podemos encontrar los siguientes
genotipos: Americano, SE Asiático y Subcontinental Indiano. 22
El genotipo Americano fue detectado en el oeste del hemisferio en 1950 y en el sur del
Océano Pacífico en 1970; este ha sido aislado de pacientes que presentan fiebre por dengue.
El genotipo SE Asiático es el más agresivo capaz de causar dengue hemorrágico, se detectó en
América en 1980. Este genotipo parece haber desplazado al genotipo Americano a través del
oeste del hemisferio, sugiriendo que el genotipo asiático se transmite más eficientemente.22
Los mecanismos de transmisión pueden variar dependiendo de la cepa, por lo que se
propone que:
� Algunas cepas pueden infectar y replicarse más eficientemente en las células
blanco, reflejando esto una viremia más fuerte en el humano y permitiendo así
infectar más mosquitos.
� Algunas cepas pueden infectarse o transmitirse al mosquito vector más
eficientemente que otras cepas. Esto fue demostrado en las cepas de un mismo
serotipo. Un análisis de virus de la cepa de DEN2 del genotipo SE Asiático y del
genotipo Americano mostró que el genotipo SE Asiático es más eficiente para
infectar el mosquito Aedes aegypti que el genotipo Americano. 22
El patrón heterogéneo entre cepas de dengue se ha demostrado serológicamente y
molecularmente, pero no está claro cuales cambios genómicos se relacionan con la virulencia
en una cepa en particular. De aquí se deduce que los cambios genéticos se relacionan con la
expresión de alguna propiedad biológica del virus y que, la identificación de tales cambios
pudiera ser de utilidad en el establecimiento de nuevas estrategias de control de esta
enfermedad. 11
6.2.5 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
Debido a la variedad de cuadros clínicos que presenta la enfermedad por dengue, es
confundible fácilmente con otras enfermedades virales, respiratorias y gastrointestinales, por
lo que es importante realizar diagnóstico diferencial. Entre las enfermedades más comunes que
se confunden con dengue, están: 26
16
Dengue clásico: Dengue Hemorrágico:
Influenza Sepsis bacteriana
Rubéola Meningococemia
Sarampión Leptospirosis
Enterovirosis Hepatitis
Tifoidea Otras fiebres hemorrágicas virales
Leptospirosis
Hepatitis viral
Otras Arbovirosis: fiebre amarilla o virus que producen encefalitis.
6.2.5. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
La extensión geográfica de la enfermedad hacia nuevas áreas, su incremento en el
número de brotes y situaciones endémicas, así como en su severidad, han conducido al
desarrollo de sistemas de vigilancia para su prevención y control, donde la confirmación de la
presencia del virus en el laboratorio, ocupa un papel prioritario. 16
El diagnóstico de laboratorio puede brindar información temprana y precisa a las
autoridades de salud, lo que favorece a la toma inmediata y oportuna de las medidas
adecuadas para el control. Dada la emergencia y reemergencia del dengue y del DH, su
diagnóstico se convierte de primer orden, lo que permitirá diferenciar el dengue de otras
enfermedades y así poseer mayor soporte de la vigilancia epidemiológica de la
enfermedad.16
Para la determinación de la presencia del virus y la identificación del serotipo se
dispone del aislamiento viral en cultivos celulares (observación del efecto citopático inducido)
y la técnica de reacción en cadena de polimerasa o RT-PCR (detección de componentes virales
(ácidos nucleicos)). 9
La RT-PCR es una técnica ampliamente utilizada en el diagnóstico del dengue porque
permite la detección del agente de forma directa en muestras de suero, células infectadas,
sobrenadantes celulares, mosquitos y larvas infectadas, así como las muestras de tejidos
17
frescos y embebidas en parafina en fallecidos por DH. También se ha empleado en el estudio
genómico de cepas de dengue, lo que ha permitido clasificar los genotipos en cepas.16
La RT-PCR ha permitido diagnosticar dengue desde el primer día de la
enfermedad. Con esta técnica el RNA viral es detectado en casi un 90%. La especificidad y
sensibilidad de cualquier sistema inmunoenzimáico no es comparable con la RT-PCR,
durante los primeros 5 días de la enfermedad. 25
Ya que la presencia del virus en la sangre es fugaz, para estas pruebas se requiere que
las muestras sean tomadas antes del tercer día de haber iniciado el cuadro clínico (para
aislamiento viral) y dentro de la primera semana para PCR. El resultado positivo confirma
de manera irrefutable el diagnóstico.
A partir del aislamiento viral es factible realizar la tipificación del genotipo, determinar
su origen geográfico (topotipo) y la virulencia de la cepa. El tiempo de almacenamiento y
traslado de la muestra para estas técnicas no debe pasar de 3 días. 6
6.2.6.1 Pruebas serológicas
Cuando no es posible realizar el aislamiento viral, existe el recurso de las pruebas
serológicas. Estas nunca son específicas como el aislamiento del agente, pero en cambio son
muy sensibles y aunque no permiten una identificación microbiológica exacta, es decir, no
permite identificar el agente infectante, son frecuentemente el único medio disponible para
confirmar el diagnóstico clínico. La especificidad de la serología llega sólo hasta evidenciar el
hecho de una infección reciente por flavivirus. Existen varias técnicas serológicas: 16
• La inhibición de la Hemoaglutinación (IH)
• Fijación del complemento (FC)
• Prueba de Neutralización de placa (NT)
• Las técnicas inmunoenzimáticas: ELISA IgM e IgG. Actualmente esta es la técnica
serológica de referencia.
• Inmunocromatografia Rápida (ICR o PanBio-test)
De acuerdo con la prueba usada, el diagnóstico serológico inequívoco lo da el aumento
significativo de cuatro veces o más en los títulos de anticuerpos específicos entre las muestras
séricas de la fase aguda y la fase de convalecencia. La batería antigénica de la mayoría de
18
estas pruebas, incluye los cuatro serotipos del dengue, otros flavivirus como el virus de la
fiebre amarilla, de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis de San Luis, o flavivirus
como el virus Chikungunya y el virus de la encefalitis equina. Idealmente estas pruebas deben
contener un antígeno no infectado de control. 27
La prueba de IH, es la más frecuentemente usada, es sensible, fácil de realizar, requiere
un equipo mínimo, pero los anticuerpos IH pueden persistir por tiempos prolongados, de hasta
48 años o más, por lo que esta prueba es ideal para estudios seroepidemiológicos. 27
La prueba FC, no es usada rutinariamente en el diagnóstico serológico de dengue. Es
más difícil de realizar, requiere personal altamente capacitado, se basa en el principio de que
el complemento es consumido durante las reacciones antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos FC
aparecen posteriores a los anticuerpos IH, son específicos de infección primaria, y persisten
por períodos cortos.27
La NT es la más específica y sensible prueba serológica para los virus de dengue. Esta
técnica también permite la identificación del serotipo del virus del dengue.
ELISA, es una prueba rápida y sencilla que requiere equipo poco sofisticado. El
desarrollo de anticuerpos IgM anti dengue, puede presentarse para el día quinto de la
enfermedad. Cerca del 93% de los pacientes desarrollan anticuerpos IgM detectables entre los
6-10 días del inicio de la enfermedad. La prueba Indirecta IgG-ELISA, es comparable con la
prueba IH, y es usada para diferenciar una infección primaria o secundaria por dengue. Esta
prueba es simple y fácil de realizar. No es específica y tiene reacciones cruzadas con otros
flavivirus. 27
Inmunocromatografía rápida (ICR PanBio-test) es más rápida y más sencilla ya
que determina simultáneamente la IgG e IgM con una simple adición de suero problema no así
para la prueba de Inhibición de la Hemoaglutinación7
Con esta técnica los anticuerpos IgM séricos son detectados en pacientes con
infección primaria de dengue de 3-5 días de infección y generalmente persisten niveles
detectables a los 30-90 días y detecta IgG hasta 8 meses después de haber presentado la
enfermedad. La ICR presenta reacción cruzada con otras infecciones por flavivirus como son
la encefalitis Japonesa, Fiebre amarilla, West Nile y encefalitis de San Luis. 7
El fundamento de esta prueba se basa en que los anticuerpos séricos del tipo IgM e
19
IgG, cuando están presentes se combinan con antihumanos IgG e IgM, lo cuales están
inmovilizados en la líneas trazadas del test. Las proteínas recombinantes del dengue son
rehidratadas con el buffer y reaccionan con los anticuerpos monoclonales, formando
complejos, los cuales se ponen en contacto con las inmunoglobulinas, capturadas en la
membrana del test y forman una franja púrpura/rosa. Es una técnica, relativamente sencilla y
rápida; posee una alta sensibilidad, se recomienda utilizarla en el diagnóstico de dengue
reciente (IgM). 7
6.2.7 TRATAMIENTO 8
En los casos de deshidratación como consecuencia de fiebre alta, anorexia y vómito,
se recomienda proporcionar abundantes líquidos por vía oral. Se puede utilizar la
solución de rehidratación oral que recomienda la OMS, para el tratamiento de cuadros
3. El diseño fue rectificado comparando las secuencias de los primers con todas las
secuencias del banco de genes mediante la herramienta informática “Blast”
nucleótido a nucleótido, para eliminar la posibilidad de reacciones inespecíficas.
29
TABLA III.- Oligonucleótidos iniciadores.
PRIMERS VIRUS FRAGMENTOS (pb)
F-5´- AACATCCATCACCCAGAAAGG -3´
R-5´- GAGCTTGAGGTGTTATGATTGC -3´
DEN1 568 pb
F-5´-TCAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACC-3´
R-5´-CCAAGICCCTTCIGAIGACATCCA-3´
DEN2 656 pb
F-5´- CACTTCCTTGACCCAGAAAGTG -3´
R-5´- CTTCCTTAGGGTCGCCAATTG -3´
DEN3 237 pb
F-5´- TCAACGATAACATTGCTGTGCT -3´
R-5´- GTTCGCTGGATTCCTGTTTGC -3´
DEN4 496 pb
Estos “primers” fueron diseñados en el laboratorio de regulación génica del CUIB de la U de C, con base en las secuencias de nucleótidos de virus del dengue publicadas en banco de genes.
4. Se preparó una reacción por muestra, utilizando un cóctel de primers para DEN1,
DEN3 y DEN4; aparte una reacción para DEN2, esto debido a las diferentes
temperaturas de alineamiento y la observación previa de no haber obtenido
productos de amplificación inespecíficos con primers de otro serotipo. La técnica
para preparar las reacciones fue la siguiente:
TÉCNICA DE RETROTRANSCRIPCIÓN Y REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA. 28, 36, 37
• Para llevar a cabo esta técnica se utilizó el Kit para RT-PCR One step
Platinum Taq siguiendo las indicaciones de la casa comercial (ver tabla
IV).
Tabla IV. Instrucciones para la preparación del cóctel.
COMPONENTES VOLUMEN/ 25 µµµµl CONCENTRACIÓN
FINAL
Mezcla de reacción 2X
(Buffer, dNTPs)
12.5µl 1X
RNA problema 9µl 1 µg/µl
F-primer 1 µl 1 µg/100µl
R-primer 1 µl 1 µg/100µl
RT/Platinum Taq Mix 0.5 µl Desconocida
MgSO4 5mM 1µl 1.6µM
30
• Se agitó el cóctel gentilmente y se centrifugó suavemente.
• Las muestras fueron sometidas al siguiente protocolo de amplificación
(tabla V).
Tabla V. Protocolo de amplificación para RT-PCR.
A: síntesis de cDNA y
pre-desnaturalización
B: Amplificación por
PCR
C: Extensión
final
D: Conservación
Un ciclo de:
50º C por 30 minutos
94º C por 2 minutos
35 ciclos de:
Desnaturalización:
94º C / 15 segundos
Alineamiento:
(esta temperatura
cambia para cada
serotipos)
DEN2
63º C/ 45 segundos
DEN1, DEN3 y DEN4:
57º C/ 30 segundos
Extensión:
72º C por 30 segundos
Un ciclo de:
72 º C / 10 min.
Un ciclo de:
4º C al infinito.
• Una vez terminado este paso las muestras se refrigeraron o se procedió a su
análisis por electroforesis.
4. Una vez amplificado el cDNA, los productos se sometieron a electroforesis
en geles de agarosa al 2.2%, los cuales se prepararon de la siguiente manera:
TÉCNICA DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 2.2% . 28 ,33
• Se preparó el gel de Agarosa al 2.2%.
o Se prepararon 100 ml de agarosa al 2.2% en TBE 1X (ver tabla VI).
La agarosa se fundió con calor y se colocó en un molde para su
gelificación.
31
Tabla VI. Preparación de soluciones patrón.
Soluciones COMPONENTES
BUFFER TBE 5X (Tris-Boratos-
EDTA)
54g de Tris + 27.5g ácido bórico + 20 ml de EDTA 0.5 M
(pH 8.0) y aforar a un litro
BUFFER DE CARGA 0.25% de azul de bromofenol + 0.25% de xilen-cianol +
30% de glicerol en agua.
• El gel se colocó en una cámara para electroforesis horizontal (B3 Owl) con
TBE 0.5X como buffer de corrimiento.
• Los marcadores de peso molecular (100 pb y 50 pb DNA ladder;
Invitrogen), las muestras y los controles positivos fueron colocados en los
pozos del gel acompañados de buffer de carga (tabla VI)
• El corrimiento se realizó a 100 V durante 2 horas.
5. Después del corrimiento, los geles fueron teñidos con solución acuosa de
bromuro de etidio (0.5µg/ml) 28. En el gel teñido se buscó identificar las bandas
(del tamaño que indica la tabla VII), para cada uno de los serotipos del virus del
dengue, con ayuda de luz ultravioleta. Se obtuvo una imagen digital de cada gel
mediante un documentador de geles Gel-Doc (Bio-Rad).
Tabla VII. Número de pares de bases de cada uno de los fragmentos amplificados de virus del dengue.
SEROTIPO TAMAÑO
DEN1 568 pb
DEN2 656 pb
DEN3 237 pb
DEN4 496 pb
5. Para llevar el control del procesamiento de las muestras se utilizó un formato de
recolección de datos (Ver anexo 12.3).
32
7.8 ASPECTOS ÉTICOS
Este estudio fue realizado respetando los puntos sugeridos por la Ley General de Salud
y la declaración de Helsinki.
Este estudio está clasificado con riesgo mínimo según la ley General de Salud
(Reglamento de la Ley General de Salud en materia de investigación para la salud, Título
segundo, capitulo I, artículo 17, inciso II); se sometió al comité institucional de ética en
investigación del CUIB donde fue aprobado en el acta número 1/2004 y al comité de ética del
Instituto Mexicano del Seguro Social aprobado con el número 0601.
En las instituciones que no contaban con un comité de ética, fue evaluado por el
comité de enseñanza y epidemiología en donde fue aprobado.
Con todas las instituciones involucradas se estableció un convenio para el respeto de
los derechos de los pacientes, se solicitó participación con consentimiento informado (ver
anexo 12.1) y se aseguró la confidencialidad de los datos.
Con respecto al agente infeccioso que se trabajó (virus del dengue) este estudio está
clasificado en el nivel 2 de bioseguridad 38 y en el laboratorio de trabajo del CUIB se cuenta
con el equipo e instalaciones necesarias para el manejo de este.
33
VIII.- RESULTADOS
Se analizaron 215 muestras para identificar la presencia de RNA de virus de dengue
mediante RT-PCR. De las muestras analizadas 28 muestras resultaron positivas para dengue,
de estas 26 muestras fueron positivas para el DEN3 y 2 para DEN1.
La incidencia acumulada de infección por dengue en pacientes febriles es = 13.02% en 15
meses de muestreo.
La figura 8 muestra una imagen del corrimiento de los controles positivos donados por
el Dr. Farfán Ale de la Universidad Autónoma de Yucatán. La figura 9 es una imagen de los
geles con muestras positivas.
Figura 8. Controles del virus del dengue para cada uno de los serotipos. DEN1 =568 pb, DEN2 = 656, DEN3= 237 y DEN4= 496. CN= control negativo (sin RNA), M = marcador de peso molecular: 50pb ladder.
34
Figura 9. Electroforesis de muestras positivas para dengue. Los carriles 1-9 DEN3, carriles 10 y 11 DEN1. M= marcador de peso molecular: 100pb ladder.
El serotipo DEN1, solo se detectó circulando en el municipio de Tecomán, por lo tanto
éste fue en el único municipio donde se identificaron 2 serotipos circulando (tabla VIII). En la
tabla VIII se describen las características demográficas de los municipios estudiados en el
Estado de Colima39, ya que está reportado que los parámetros de altitud , población y
servicios públicos juegan un papel importante en la dinámica de transmisión del dengue.
Tabla VIII. Características demográficas de los municipios del Estado de Colima38. Casos y serotipos identificados en cada uno de los municipios.