UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y TOXICOLÓGICA LABORATORIOS DE BIOELECTROQUÍMICA Y FARMACOQUÍMICA “Estudio de estabilidad hidrolítica de N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol y N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol” PATROCINANTE: Dr. ALEJANDRO ÁLVAREZ LUEJE Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica DIRECTORES: Dr. ALEJANDRO ÁLVAREZ LUEJE Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica Dr. HERNÁN PESSOA MAHANA Departamento de Química Orgánica y Fisicoquímica Memoria para optar al titulo de Químico Farmacéutico MARÍA JOSÉ ORELLANA BUSTOS ‐ 2009 ‐
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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y TOXICOLÓGICA LABORATORIOS DE BIOELECTROQUÍMICA Y FARMACOQUÍMICA
“Estudio de estabilidad hidrolítica de N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol y N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol”
PATROCINANTE: Dr. ALEJANDRO ÁLVAREZ LUEJE
Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica
DIRECTORES: Dr. ALEJANDRO ÁLVAREZ LUEJE
Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica
Dr. HERNÁN PESSOA MAHANA Departamento de Química Orgánica y Fisicoquímica
Memoria para optar al titulo de Químico Farmacéutico
MARÍA JOSÉ ORELLANA BUSTOS
‐ 2009 ‐
Dedicatoria
~ 1 ~
A mi familia humana
y también a mi familia felina
María José Orellana Bustos
~ 2 ~
Agradecimientos
A mis padres por su apoyo y paciencia en este largo camino recorrido, por tolerar mi mal genio, por despertarme para estudiar y por sobretodo por hacer de mí la mujer que soy. A mis hermanas Jany y Paty, por ayudarme siempre, sobretodo en los momentos difíciles. Al Profesor Alejandro Álvarez Lueje por darme la oportunidad de realizar esta memoria bajo su supervisión y permitirme conocer lo “lindo” que es hacer ciencia. A mi codirector de memoria Henan Pessoa Mahana. A Manuel Bravo, por su colaboración el la realización de esta memoria que fue siempre oportuna y útil en este nuevo mundo que es la quimiometría. A mi gran amiga Elena Salazar Beltrán, por siempre tener la visión perfecta de la situación y servirme de luz en los momentos cuando todo se ve oscuro. A mi gran amiga Karina Navarrete Méndez, simplemente por estar, por ayudarme con la síntesis, entre otras muchas cosas. A mis grandes amigas de la U (Natalia Notari, Daniela Núñez, Catherine Osorio, Natalia González, Claudia Fernández, Ximena Gómez, y a las que se me quedaron en el tintero también) porque formaron parte importante de esta larga estadía en la universidad y le dieron el toque alegre y hermoso a mis años de universidad. A mi gran amigo Eduardo Miño Guerrero, por se como es, siempre alegre, y a pesar de la distancia y las diferencias siempre estar. A mis sobrinos regalones todos (Cote, Smiky, Alan), por ser siempre fuente de alegría. A mis amigas de siempre, las del colegio (Pepa, Carola, Dany y Aileen), que están ahí aunque pase el tiempo y las distancias se hagan más grandes. A los que ya no están… Y por ultimo agradecer a Fondecyt por financiar esta memoria. POR FIN!!!!!
This Memory presents development and implementation of an electroanalítical
methodology using differential pulse polarography with application of multivariate
calibration PLS, to quantify two new compounds with activity on Trypanosoma cruzi:
N-(p-chlorobenzoyl)-2-(o-nitrophenyl)-benzimidazole (PCNB) and N-(p-fluorbenzoyl)-
2-(o-nitrophenyl)-benzimidazole (PFNB) in presence of its degradation product 2-(o-
nitrophenyl)-1H-benzimidazole (NB). Polarographic signals from the main compound
(PCNB and PFNB) are partially overlapping with signal of its degradation product
(NB), being excellent candidates for implementation of multivariate calibration. Ideal
conditions for studying both compounds were acetonitrile: Britton-Robinson buffer
(30:70) at pH 6.8 to PCNB and pH 7.0 for PFNB.
Three compounds studied (PCNB, PFNB and NB) showed a well-defined
main signal generated by the nitro group reduction present in its structure. This
signal is pH dependent on a wide range of pH (1-9), moving into more catholically
potentials when pH increases. Evolution of the potential peak exhibits a linear
dependence with regard to the pH of medium, with a break in signal at pH 8 for
PCNB, at pH 4 for PFNB and pH 9 for NB.
Multivariate calibration model used was built based on a set of 14 binary
mixtures of PCNB and NB in a concentration range from 1×10-3 M to 1×10-6 M. This
model was validated using cross-validation, assessing relative error of prediction
(REP = 5.4%), for a standard error of prediction of 6.5×10-6 M (r2 = 0.97038) for a
number of components A = 4. To PFNB was used the same model, because extent
of degradation is similar to that of PCNB, determining their degree of overlapping at
concentration of 5×10-4 M for both separated compounds (PFNB and NB). Then we
proceeded to use 9 binary mixtures made through application of experimental design
of varied composition at intervals of concentration from 1.57×10-4 M to 8.68x10-6 M
for PFNB and 1.4×10-4 M to 6.54×10-6 M for NB. Once mixtures were obtained, merit
Summary
~ vii ~
figures corresponding to multivariate calibration were calculated being obtained
values within acceptable analytical ranges.
This methodology was applied to studies of accelerated degradation for both
compounds (PCNB and PFNB), obtained values of kobs for each condition tested. We
obtained further values of kinetic constants that describe pH profile of each of
compounds. In addition it was determined behavior of these compounds at different
temperatures, calculated value of Ea for each one and, in case of PFNB, it was
analyzed the influence of the composition of the solution in the rate of degradation.
To determine if methods are statistically similar, we compared data obtained
in initial concentrations of each experience, by applying statistical t test for paired
samples, with data obtained by HPLC, showing no statistical difference significant
between them. To compare application of methods set out in stability studies, testing
was conducted regression curve in each experience, comparing kobs data obtained
by both methods.
This report was funded by Project Fondecyt 1061144
Introducción
~ 1 ~
1. INTRODUCCIÓN
Al desarrollar un nuevo compuesto con posible actividad farmacológica, es
necesario entre otras caracterizaciones fisicoquímicas, evaluar su estabilidad. Los
estudios de estabilidad tienen como fin establecer el comportamiento de una
sustancia, bajo ciertas condiciones extremas (pH, temperatura, etc.) y en
consecuencia, analizar su grado de inestabilidad en las condiciones estudiadas.
La forma más estudiada de inestabilidad es la pérdida de cantidades de la
especie activa bajo análisis, a través de reacciones químicas que resultan en una
disminución de su potencia. Esta disminución en la potencia es una causa
reconocida como pobre calidad del producto obtenido y por ende es de suma
importancia establecer los parámetros a los cuales la sustancia o fármaco sufre su
degradación, las reacciones químicas que están involucradas y los productos que se
generan en el proceso de degradación1.
En este sentido, un fármaco puede degradarse en una sustancia tóxica, lo
que implica la importancia de no sólo determinar cuanto fármaco se pierde en el
proceso de degradación, sino que también qué productos son los que se generan.
Por otra parte, la degradación del fármaco puede producir un producto
estéticamente inaceptable que haga presumir que ha sido adulterada (cambio de
color, de olor en el tiempo) o que se ha descompuesto y ya no es útil. Y por último,
el fármaco estudiado debe mostrar estabilidad a pH fisiológicos, para establecer
cual seria su comportamiento en el caso de que la droga se administrada a un
organismo vivo.
La técnica analítica más utilizada durante años para establecer el
comportamiento del fármaco estudiado y su producto de degradación frente a las
condiciones analizadas, ha sido la cromatografía líquida acoplada a un detector
selectivo. Esta técnica analítica permite cuantificar y separar los compuestos de
interés farmacéutico de forma directa, sin utilizar ningún procedimiento analítico
para lograrlo.
Aún cuando algunos fármacos son electroactivos, las técnicas
electroquímicas han sido escasamente utilizadas para estos fines, debido a la
María José Orellana Bustos
~ 2 ~
similitud estructural existente entre el principio activo y sus productos de
degradación, lo cual permite que los procesos electroquímicos tengan lugar a
potenciales muy cercanos, produciendo un solapamiento de las respuestas en
corriente obtenidas, sin que sea posible su cuantificación por una medición directa
utilizando una curva de calibrado unidimensional.
En el último tiempo la aplicación de herramientas quimiométricas, tales como
la calibración multivariada, han sido utilizadas para la resolución de mezclas donde
las señales instrumentales de sus componentes se encuentran fuertemente
solapadas. Los algoritmos más comunes son PCR (principal component regression),
PLS (partial least-squares), entre otros; no obstante lo anterior, aún cuando la
aplicación de estas herramientas a señales espectroscópicas ha sido extensa, el
uso de datos electroquímico ha sido escasamente reportado.
Dos nuevos compuestos sintéticos con actividad sobre Trypanosoma cruzi2:
N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (PCNB) y N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-
nitrofenil)-benzimidazol (PFNB), han sido estudiados en esta Memoria, cuyas
estructuras químicas se presentan en la figura 1.
Figura 1. Estructuras químicas de PCNB y PFNB.
Estos compuestos incluyen en su estructura un núcleo benzimidazólico y un
sustituyente nitroaromático, ambos de reconocida y variada actividad biológica. El
núcleo benzimidazólico se encuentra presente en distintos fármacos para el
tratamiento de patologías muy diversas, por ejemplo en el tratamiento de algunas
parasitosis3, como antibacterianos4, antifúngicos5 antivirales6 y antineoplásicos7,
entre otros. Por otra parte, los compuestos nitroaromáticos han sido ampliamente
R = -Cl (PCNB), -F (PFNB)
Introducción
~ 3 ~
usados como productos farmacéuticos, pesticidas y explosivos8-11. Estas
características los hacen interesantes como candidatos de estudios de estabilidad,
con el fin de establecer parámetros concretos para posibles estudios biológicos.
Tanto PCNB como PFNB, al ser analizados en conjunto con su producto de
degradación (NB) por medio de PPD (polarografía de pulso diferencial), presentan
señales solapadas entre si, lo que brinda una buena oportunidad para aplicar la
quimiometría a estudios de estabilidad de ambos compuestos.12
Durante los años 70 se dio un impulso al estudio y aplicación de métodos
matemáticos y estadísticos, en el tratamiento de resultados obtenidos en química
analítica en particular datos multivariados y diseño de experimentos.13 Así se dio
inicio a la quimiometría, que a partir de los años ochenta se convirtió en una
disciplina organizada, enfocándose a resolver problemas analíticos simples, tales
como la resolución de señales solapadas mediante calibración multivariada y
análisis de factores14. A partir de estos años, la quimiometría trascendió sus
fronteras hacia otras disciplinas, expandiéndose en sus usos, llegando a ser
utilizados en la obtención de los datos químicos e instrumentales hasta incluso la
resolución simultanea de los datos instrumentales14, siendo utilizada en la industria
farmacéutica para resolver bases de datos complejas, a partir de los años 90.14
Quimiometría se define como “la disciplina que usa métodos matemáticos y
estadísticos para la selección óptima del procedimiento analítico y del tratamiento de
los datos obtenidos por química analítica”15. En la figura 1 se ilustra la forma como la
quimiometría se relaciona con otras disciplinas.16
Si observamos la figura 2, a la izquierda se encuentran todas las ciencias
que están basadas en la matemática y no en la experimentación de laboratorio,
siendo la estadística la que cumple el rol más importante en la quimiometría. A la
derecha de la figura, encontramos a las ciencias que utilizan la quimiometría, siendo
probablemente la química analítica el área que más significativamente se beneficia
de ella.16
María José Orellana Bustos
~ 4 ~
Figura 2. Relación entre la quimiometría y otras disciplinas16
La idea central de todas estas metodologías es compensar la carencia de
selectividad total de las señales analizadas, usando algoritmos matemáticos
eficientes para extraer la porción de la señal solapada, la cual puede ser empleada
para predecir la concentración de un componente particular de la muestra.17 Para
lograr este objetivo, la quimiometría dispone de variadas metodologías, entre las
cuales se debe elegir la que más se adecue a los datos que obtenemos
experimentalmente y lo que queremos obtener de ellos. Dentro de estas
metodologías encontramos12:
Metodología bivariada: Consta de dos etapas: calibración y predicción. Es
útil para determinar concentración de analito determinado, usando dos sensores
diferentes o a dos longitudes de onda distintas. El efecto de la colinealidad espectral
disminuye la sensibilidad, la selectividad y la precisión. En presencia de
interferentes no modelados en la calibración, el análisis de muestras incógnitas es
inexacto.12
Metodología multivariada: por medio de esta metodología se analizan
varios analitos mediante múltiples sensores. Para esta metodología se dispone de
variados modelos:
Introducción
~ 5 ~
Modelo de análisis por cuadrados mínimos clásicos (CLS, classical least-
squares): se trata de un modelo matemáticamente sencillo, que puede seguirse
convenientemente con el auxilio del cálculo matricial estándar. Es útil para tipos de
muestras que no presenten interferencias serias de componentes desconocidos, o
no se encuentran colinealidades espectrales significativas entre los analitos;
proveyendo una manera rápida, simple y confiable de estimar las concentraciones
en muestras de multicomponentes en forma simultanea. Desafortunadamente, el
modelo es sensible a la presencia de colinealidad espectral, de manera que analitos
con espectros severamente solapados no pueden estudiarse mediante esta técnica.
Además es necesario conocer los componentes químicos presentes en las mezclas
incógnitas, de lo contrario, la presencia de interferentes no modelados producirá un
serio error en la determinación, siendo informados por esta técnica.12
Modelo de regresión por cuadrados mínimos inversos (ILS, inverse
least-squares): permite estudiar mezclas de componentes en las que uno o más
analitos son de interés, pero de los restantes componentes pueden desconocerse
concentraciones, espectros e identidades químicas. Lamentablemente, es sensible
a colinealidades espectrales y por ende debe usarse un número reducido de
sensores, con la consecuente pérdida de información y de sensibilidad.12
Modelos de regresión por componentes principales (PCR, principal
component regression): al igual que el anterior (ILS), permite estudiar mezclas de
componentes en las que uno o más analitos son de interés, desconociéndose los
demás componentes de la muestra. Posee una calibración directa, que permite
ignorar las concentraciones de compuestos químicos desconocidos durante el
calibrado y el uso de “espectros” abstractos llamados scores, que eliminan los
problemas asociados con la colinealidad espectral. Lamentablemente se mantiene
el problema de las interferencias no modeladas tanto para este modelo, como para
los anteriormente mencionados, produciéndose un análisis no exacto de la muestra,
problema que tiene un estilo en el mundo multivariado.12
María José Orellana Bustos
~ 6 ~
Modelo de regresión por cuadrados mínimos parciales (PLS, partial
least-square): pretende mejorar la técnica antes descrita (PCR) introduciendo los
valores de las concentraciones de calibración en el cálculo de los factores. Existen
dos tipos de modelos PLS: uno denominado PLS-1, que concentra su atención en
un único analito a la vez, y otro llamado PLS-2, que permite calibrar y predecir las
concentraciones de varios analitos simultáneamente. Este último factor, que puede
parecer una ventaja, ya que en PLS-1 debe repetirse para cada analito de interés,
es una gran desventaja, ya que PLS-1 permite optimizar las condiciones de trabajo
para cada analito independientemente. A pesar de todas estas ventajas por sobre
los anteriores modelos, persiste el problema de la medición inexacta, si en la
muestra problema se presenta un interferente que no esté calibrado en el método.12
Los datos de calibración multivariada detallados anteriormente, se basan en
el procesamiento de datos del tipo vectorial (espectros u otro similar, por ejemplo
voltamperogramas) y se consideran calibraciones de primer orden. Los datos que se
calibran según orden superiores (segundo, tercero, etc.), permiten cuantificar
analitos calibrados en presencia de interferencias no modeladas, propiedad que
está ausente en los datos de primer orden. Esta propiedad presenta inmensas
posibilidades en el análisis de mezclas complejas, en particular de origen
biológico.12
En el ámbito de la tecnología farmacéutica, la quimiometría ha encontrado
variadas aplicaciones, encontrándose dentro de estas las de identificación y
cuantificación de los materiales de partida, así como del producto farmacéutico
terminado, siendo extensiva a la cuantificación de este último en diferentes matrices,
tanto in vitro como in vivo.15
Dentro de las técnicas más utilizadas en la aplicación de la quimiometría se
encuentran la espectrofluorometría, espectrofotometría UV y espectrofotometría
infrarrojo, notándose que el uso de polarografía es muy poco común, debido a las
pocas mezclas de sustancias que dan señales solapadas en esta técnica.
Introducción
~ 7 ~
La polarografía es un tipo de voltamperometría, que consiste en la medición de la intensidad de corriente que se desarrolla en una celda electroquímica en condiciones de polarización total de concentración18, siendo el electrodo de
trabajo utilizado, una gota de mercurio. Este electrodo le confiere ciertas ventajas
por sobre los otros tipos de voltamperometría como son18:
• Su inusual elevado sobrepotencial asociado con la reducción de iones
hidrogeno; lo que trae como consecuencia que iones metálicos, tales como el
zinc y el cadmio, se puedan depositar de disoluciones ácidas, a pesar que sus
potenciales termodinámicos sugieran que la deposición de estos metales es
imposible sin formación de hidrógeno.18
• Es renovable, debido a que se forma una nueva superficie metálica en cada
medición, lo que permite que el comportamiento del electrodo sea
independiente de su historia pasada, situación que no sucede con los
electrodos sólidos, que se caracterizan por su comportamiento irregular, debido
a impurezas adsorbidas o depositadas.18
• Las intensidades promedio reproducibles se obtienen inmediatamente a
cualquier potencial dado, independientemente de si el potencial se alcanza
desde posiciones más altas o más bajas.18
Así como el electrodo de gota de mercurio le brinda ventajas, también tiene
desventajas con respecto a los otros electrodos, como son:
• La facilidad con que el mercurio es oxidado, lo cual limita su uso como ánodo.
• La intensidad residual no farádica o de carga, que limita la sensibilidad del
método clásico a concentraciones aproximadamente de 10-5 M, provocando que
a concentraciones menores, la intensidad residual pueda ser mayor que la
intensidad de difusión, lo que impide determinaciones exactas de esta última.18
Esta última desventaja se mejora de manera importante utilizando la
polarografía de pulso diferencial, la cual se basa en hacer dos medidas de
intensidad, una que se efectúa 16.7 ms antes del pulso y otra 16.7 ms después del
María José Orellana Bustos
~ 8 ~
pulso. La diferencia de intensidad por pulso se registra en función del potencial que
aumenta linealmente. De esta manera se obtiene una curva diferencial en forma de
pico, donde la altura es directamente proporcional a la concentración. Esta
diferencia de intensidad permite aumentar significativamente la sensibilidad del
método polarográfico, elevándola al intervalo de 10-7 a 10-8 M.18
En base a los antecedentes anteriormente expuestos, el objetivo general de
esta Memoria es el desarrollo de metodologías quimométricas aplicadas a técnicas
electroquímicas, con vistas a ser utilizadas en el estudio de la estabilidad de N-(p-
clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol y N-(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-
benzimidazol.
Para cumplir adecuadamente con el objetivo planteado, se estiman como
necesarios los siguientes objetivos específicos:
1. Implementar metodologías eletroanalíticas y cromatográficas, a objeto de contar
con herramientas analíticas selectivas para la identificación y cuantificación de
los compuestos en estudio.
2. Aplicar los métodos quimiométricos para sacar partido de los datos obtenidos
mediante la técnica electroanalíca utilizada.
3. Caracterizar la estabilidad de los compuestos en estudio, haciendo uso de las
Computador Pentium II con programa de adquisición y tratamiento de datos
MILLENIUM versión 3.05
c) Equipos de uso general Balanza analítica de precisión, Precisa 40SM-200A (sensibilidad 0.01 mg)
Agitador magnético, Heidolph MR 3002
Medidor de pH, WTW pMX 537
Sistema purificador de agua, Milli-Q Ultra-Pure Water System
Baño de Ultrasonido, Branson 2210
Estufa WTC Bindert
Agitador Heidolph DSG 304
2.1.7 Programas Computacionales Origin® OriginPro versión 8.0724. OriginLab Corporation.
Microsoft® Office Excel 2003. Microsoft Corporation.
MATLAB® R2007a, versión 7.4.0287. The MathWorks, Inc.
2.2 MÉTODOS
2.2.1 Síntesis a) La síntesis del núcleo base 2-(o-nitrofenil)-1H-benzimidazol se realizó por
condensción entre o-nitrobenzaldehído y 1,2-fenilendiamina en etanol en cantidades
equimolares, obteniéndose una nitrobenzimidazolidina la cual es oxidada in situ19,
de acuerdo con el siguiente esquema sintético:
María José Orellana Bustos
~ 12 ~
N
NH
N+O
-
O
+
O
Cl
R
N
N
O
N+O
-
O
R
THF
25 °CN
+ HCL
R = -Cl, -F
b) Por otra parte, las síntesis de N-(p-clorobenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol y N-
(p-flúorbenzoil)-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol, se llevaron a cabo por reacción entre el
2-(o-nitrofenil)-1H-benzimidazol previamente sintetizado y el respectivo cloruro de
benzoilo comercial (cloruro de p-clorobenzoilo y cloruro de p-flúorbezoilo) en
tetrahidrofurano20, en cantidades equimolares, de acuerdo con el siguiente esquema
sintético:
2.2.2 Preparación de disoluciones a) Tampón Britton-Robinson Se disolvieron 6.20 g de H
3BO
3 en 300 mL de agua Milli-Q aproximadamente,
usando ultrasonido, en un matraz aforado de 1000 mL. Se agregó 6.8 mL de ácido
ortofosfórico, 5.8 mL de ácido acético y se completó volumen con agua Milli-Q. Esta
preparación da como resultado una disolución tampón Britton-Robinson 0.1M, que
permite trabajar en un amplio rango de pH (entre 2.0 y 12.0).
O
N+
O-
O+
NH2
NH2
Δ
EtOH
NH
NH
N+O
-
O
O2 N
NH
N+O
-
O
Materiales y Métodos
~ 13 ~
b) Preparación de disolución estándar de los compuestos estudiados Se pesaron exactamente 0.0378 g de PCNB, que fueron disueltos en acetonitrilo y
llevado a ultrasonido para facilitar su disolución. Luego se completó el aforo en un
matraz de 10 mL. De esta manera se obtiene una disolución estándar de 1×10-2 M.
En el caso del PFNB se pesaron 0.03613 g y se procedió de la misma manera,
obteniendo una disolución madre de concentración 1×10-2 M.
2.2.3 Polarografía de pulso diferencial (PPD) Para trabajar en PPD, cada solución de calibración se obtuvo a partir de las
disoluciones estándar preparadas de ambos compuestos. Para PCNB y PFNB, la
disolución estándar se realizó como indica el punto 2.2.2.b, y para NB se pesaron
exactamente 0.0239 g, los cuales fueron disueltos en acetonitrilo y llevados a
ultrasonido para facilitar su disolución. Luego se completó el aforo en un matraz de
10 mL, con lo que se consiguió una disolución estándar de 1×10-2 M.
a) Condiciones de trabajo Cada disolución fue vertida en la celda polarográfica y burbujeada con nitrógeno
cerca de 6 minutos antes de comenzar la medición. La temperatura de trabajo fue la ambiental y el pH de trabajo fue de 6.8 para PCNB
y pH 7.0 para PFNB. La composición de la disolución fue de acetonitrilo: tampón
Britton-Robinson (50:50), para ambos compuestos estudiados.
Los electrodos utilizados fueron los siguientes:
Electrodo de trabajo : goteo de mercurio (EGM), Metrohm.
Electrodo de referencia : electrodo de Calomelano saturado, Metrohm
Electrodo auxiliar : electrodo de platino, Metrohm
María José Orellana Bustos
~ 14 ~
Las condiciones de trabajo fueron las siguientes:
Sensibilidad : 2,5-10 μA
Rango de potencial : 0 a -1800 mV
Tiempo de goteo : 0,60 s
Altura de pulso : 50 mV
Retardo de pulso : 40 ms
Incremento de potencial : 6 mV
2.2.4 Desarrollo de la metodología polarográfica-quimiométrica a) Set de muestras de calibración. Usando las disoluciones preparadas en el punto 2.2.2.b, se preparó un set de
mezclas de PCNB-NB y PFNB-NB. El intervalo de concentración de cada analito
presente en las mezclas fue definida en función de los niveles esperados en las
muestras de interés. Los niveles seleccionados para PFNB y NB son presentados
en la tabla 1. Las concentraciones de cada una de estas mezclas fueron
determinadas de distinta manera para cada compuesto: para PCNB se eligieron
mezclas al azar (tabla 2) y para PFNB se utilizó un diseño composición central (tabla
3). Para ambos casos, los niveles de concentración considerados fueron más de
cuatro, de modo de asegurar una calibración adecuada.
Tabla 1. Concentraciones de analitos PFNB y de su producto de degradación NB, utilizados para hacer las mezclas del modelo quimiométrico.
PFNB (M) NB (M)
-1 5.40×10-5 2.70×10-5
1 2.60×10-4 1.20×10-4
0 1.57×10-4 7.35×10-5
α 3.05×10-4 1.40×10-4
-α 8.68×10-6 6.54×10-6
Materiales y Métodos
~ 15 ~
Tabla 2. Mezclas realizadas para PCNB y NB
PCNB (M) NB (M) PCNB (M) NB (M)
1 1×10-3 1×10-6 8 1×10-6 1×10-3
2 5×10-4 5×10-6 9 2×10-4 8×10-5
3 1×10-4 1×10-5 10 8×10-4 8×10-5
4 5×10-5 5×10-5 11 8×10-5 2×10-4
5 1×10-4 1×10-4 12 8×10-5 8×10-4
6 1×10-5 1×10-4 13 6×10-4 1×10-6
7 5×10-6 5×10-4 14 3×10-4 1×10-6
Tabla 3. Composición de cada mezcla de analitos (PFNB) y su producto de degradación (NB)
Mezcla N° PFNB (M) NB (M) PFNB (M) NB (M)
1 -1 -1 5.40×10-5 2.70×10-5
2 1 -1 2.60×10-4 2.70×10-5
3 -1 1 5.40×10-5 1.20×10-4
4 1 1 2.60×10-4 1.20×10-4
5 0 0 1.57×10-4 7.35×10-5
6 α 0 3.05×10-4 7.35×10-5
7 -α 0 8.68×10-6 7.35×10-5
8 0 α 1.57×10-4 1.40×10-4
9 0 -α 1.57×10-4 6.54×10-6
En base a estas mezclas se procedió a realizar con cada una de ellas,
determinaciones en triplicados.
Con esta información se establecieron sistemas de matrices usados en la
calibración multivariada PLS, de forma tal de relacionar las señales
correspondientes de cada uno de los analitos estudiados (PCNB y PFNB), junto con
su producto de degradación (NB) y determinar la concentración del analito de
interés, sin que la señal de su producto de degradación interfiriera en esto.
María José Orellana Bustos
~ 16 ~
b) Validación de modelo quimiométrico12. Para determinar el número apropiado de factores (A), que explican la varianza del
modelo, se realizó una validación cruzada. La anterior consiste en:
‐ Construir el modelo con todas las muestras de calibración excepto una,
‐ Predecir la concentración de la muestra dejada de lado,
‐ Calcular el error cometido que es la diferencia entre el valor nominal (Cnom) y
el predicho (Cpred).
Este cálculo se realiza utilizando un número creciente de factores, desde uno hasta
un cierto máximo que debe ser menor al numero de mezclas de calibrado. Luego se
repite el procedimiento hasta que todas las muestras hayan sido dejadas de lado
una vez. Para cada número de factores se calcula la suma de los cuadrados de los
errores de predicción, llamada PRESS (por predicted error sum of squares), de
acuerdo a la siguiente expresión:
Luego se procede a estudiar como varía PRESS, obtenido en función del número de
factores, mediante un procedimiento estadístico. Una vez calibrado el modelo, se
estiman las cifras de mérito correspondientes.
La sensibilidad (SEN) fue calculada de acuerdo a la siguiente ecuación:
|| ||
Donde || || representa la norma de un vector y b es el vector de coeficientes de
regresión obtenido por el algoritmo de PLS.
La selectividad (SEL) fue evaluada de acuerdo a:
|| ñ |||| ñ ||
Materiales y Métodos
~ 17 ~
Donde la señal neta del analito, es calculada por la proyección de un espectro de
una muestra problema, ortogonal al espacio descrito por todos los otros
componentes de la matriz, exceptuando al analito de interés.
Los límites de detección y cuantificación se calcularon de acuerdo a:
. 12 ;
Donde s0 es error estándar de concentración para muestras de baja concentración,
y está dado por:
Donde h es la leva de la muestra (un parámetro que ubica la muestra problema en
el espacio de calibración), sc es el error estándar de la concentración de calibración,
sr es el ruido instrumental y SEN la sensibilidad.
c) Comparación estadística del modelo utilizado. Para comparar los métodos, se usaron como referencia las determinaciones
realizadas por HPLC, las que fueron comparadas mediante prueba t para muestras
emparejadas21.
2.2.5 Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) a) Disolución de trabajo Se utilizó la misma disolución preparada en el punto 2.2.2.b.
b) Condiciones de trabajo Las condiciones bajo las cuales se trabajó en el HPLC para los compuestos fueron
las siguientes:
Fase móvil isocrática : acetonitrilo: agua (65:35) para PCNB y acetonitrilo:
agua (60:40) para PFNB
Flujo : 1.0 mL /min
María José Orellana Bustos
~ 18 ~
Volumen de Inyección : 20 µL
Temperatura : 25 ºC para PCNB y 30ºC para PFNB
c) Ensayo de aptitud de sistema (system suitability test)22 Para PFNB se preparó una disolución de 100 µL PFNB 1×10-2 M, 4900 µL
acetonitrilo y se llevó a volumen de 10 mL con agua. Se acidificó la disolución con 3
gotas de HCl y se procedió a calentar la disolución por 50 minutos. Luego de
neutralizada la disolución, se agregaron 40 µL de PFNB disolución madre y 0.0080
g de KNO3, logrando así una disolución que permite observar las señales tanto del
analito como la de sus productos de degradación.
Se inyectaron 20 µL de la disolución variando la composición de la fase móvil
(acetonitrilo: agua), comenzando con la combinación menos polar (80:20) hasta
llegar a la más polar (20:80). Para cada condición cromatográfica se obtuvieron los
valores de resolución (R), capacidad (k’) y selectividad (α), los cuales fueron
analizados para determinar las condiciones experimentales óptimas de trabajo a
30ºC. Las ecuaciones utilizadas se indican a continuación 22.
R = (tr-t0)12(w2-w1)
Ecuación 1 Ecuación 2 Ecuación 3
Donde,
tr= tiempo de retención.
t0 = tiempo muerto.
w = ancho de pico tomado desde la base.
d) Curva de calibración A partir de la disolución madre de PFNB se prepararon un set de 6 disoluciones en
un intervalo de concentración de 5×10-4 M hasta 5×10-6 M, las que fueron llevadas a
10 mL de volumen con acetonitrilo. Todas las mediciones fueron realizadas por
duplicado.
Materiales y Métodos
~ 19 ~
e) Estudio de repetibilidad Se procedió a realizar 7 mediciones de 3 disoluciones de distinta concentración: dos
en los extremos de la curva de calibración (1×10-4 M y 6×10-6 M) y uno en medio
(5×10-5 M). Se tomó como parámetro estadístico el coeficiente de variación a cada
una de las concentraciones antes señaladas.
f) Estudio de reproducibilidad Se repitió el estudio de repetibilidad señalado en el punto 2.2.5.e, variando el día de
realización de las mediciones y el operador.
g) Límite de detección y límite de cuantificación Para la determinación del límite de detección y del límite de cuantificación se
procedió de la siguiente manera:
A partir de la curva de calibración determinada en el punto 2.2.5.d se obtuvo el valor
de la pendiente de la recta (m).
Se midieron 3 disoluciones en el extremo de la curva (4×10-6 M, 5×10-6 M y 6×10-6
M) todas por duplicado, obteniéndose los valores promedio de las áreas bajo la
curva (ABC) y la desviación estándar (σ).
Se representó gráficamente ABC promedio versus concentración y se obtuvo la
ecuación de la recta, para extrapolar el valor a concentración cero, con lo cual se
obtiene el valor de la respuesta del blanco (Ybl).
De la misma forma se graficó σ versus concentración, obteniéndose la ecuación de
la recta respectiva y al extrapolar el valor de concentración cero, se obtuvo el valor
de la desviación estándar del blanco (σbl).
Con los datos obtenidos anteriormente, se calculó el límite de detección (LD) y el
límite de cuantificación (LC), usando las siguientes ecuaciones22:
(Ecuación 4)22 ; (Ecuación 5)22
María José Orellana Bustos
~ 20 ~
Donde: m = pendiente
Ybl = respuesta del blanco
σbl = desviación estándar del blanco.
2.2.6 Estudios de estabilidad a) Estudio de influencia del pH en la cinética de degradación Se estudió la influencia del pH durante la degradación del PCNB y de PFNB a pHs
1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 y 9.0, a una temperatura de 50ºC. Para cada uno
de los pH estudiados, se preparó 25 mL de una disolución madre de PCNB o PFNB
5×10-4 M, con una composición de acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 30:70.
Cada disolución madre fue dividida en 10 viales ámbar de 2 mL y sometida a la
temperatura requerida, tomando un vial a un intervalo de tiempo determinado y
deteniendo la reacción en hielo. Posteriormente, de cada vial seleccionado, se tomó
una alícuota de 50 μL para medir directamente en el cromatógrafo, en tanto que una
alícuota de 1.5 mL fue llevada a un matraz de 5 mL, se agregó 2.05 mL de
acetonitrilo y se completó a volumen con disolución tampón al pH óptimo para ser
medido por PPD (pH 6.8 para PCNB y pH 7.0 para PFNB) a temperatura ambiente.
Cada disolución obtenida de esta forma tuvo una concentración de 1.25×10-4 M, y
una composición de acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 50:50.
b) Estudio de la influencia de la temperatura en la cinética de degradación Se estudió el efecto de la temperatura en la cinética de degradación de PCNB y
PFNB a 3 temperaturas: 30ºC, 40ºC y 50ºC. El pH 2 fue elegido como el adecuado
para realizar estos estudios, debido a su velocidad de degradación. Las disoluciones
estudiadas se realizaron de la misma manera descrita en el punto 2.2.6.a.
c) Estudio de la influencia de la composición de la disolución en la cinética de degradación Se realizaron estudios para PFNB variando la composición de la disolución, a la
misma temperatura y a igual pH. Las composiciones estudiadas fueron 30:70, 40:60
y 50:50 de acetonitrilo: tampón Britton-Robinson a 50ºC a pH 2. Las disoluciones se
Materiales y Métodos
~ 21 ~
prepararon de la misma forma indicada en el punto 2.2.6.a, variando para cada una
la cantidad de acetonitrilo y tampón Britton-Robinson agregada.
d) Estudio de Influencia del pH en la cinética de degradación por HPLC Se procedió de la misma manera que en el punto 2.2.6.a, utilizando las mismas
disoluciones y la alícuota de 20 µL fue tomada antes de proceder con la disolución
efectuada para PPD. Por lo tanto la concentración de la disolución inyectada en el
HPLC fue 5×10-4 M, para cada pH en estudio.
e) Estudio de la influencia de la temperatura en la cinética de degradación por HPLC Se procedió de la misma manera que en punto 2.2.6.a, utilizando las mismas
disoluciones y procediendo de igual forma que en el punto 2.2.6.b.
f) Estudio de la influencia de la composición de la disolución en la cinética de degradación. Se procedió de la misma forma que en punto 2.2.6.a, utilizando las mismas
disoluciones indicadas 2.2.6.c
g) Cálculo de la constante de velocidad de la reacción Se determinó el valor de la constante de velocidad (kobs) para cada valor de pH, para
cada temperatura y para cada composición de la disolución; graficando cada
experiencia como el logaritmo natural de la concentración vs tiempo, en que kobs
corresponde a la pendiente de la regresión lineal para cada gráfico. Las
concentraciones obtenidas están en moles/litro (M) y el tiempo en minutos (min.)
Ecuación 623
Las unidades para kobs obtenidas son minutos-1 (min-1).
María José Orellana Bustos
~ 22 ~
h) Cálculo de la vida media (t1/2) Se calculó la vida media para cada pH de la disolución degradada, utilizando la
siguiente ecuación:
/ Ecuación 723
El uso de esta ecuación es valida, debido a que la degradación de PCNB y PFNB
tiene una cinética de pseudo primer orden23.
i) Cálculo de la vida de estantería (t90) Se calculó la t90 para cada pH de la disolución degradada, utilizando la siguiente
ecuación:
. Ecuación 823
El uso de esta ecuación es valida, debido a que la degradación de PCNB y PFNB
tiene una cinética de pseudo primer orden 23.
j) Determinación del perfil de pH Para la determinación del perfil de pH se utilizaron los valores de kobs obtenidos en
los estudios de la influencia del pH (2.2.6.a y 2.2.6.d). Estos datos fueron graficados
como logaritmos en base 10 de kobs (log kobs) vs pH, donde se determinó la ecuación
de la cinética de degradación de los compuestos estudiados, además de la
especificación de los intervalos de pH donde la degradación se veía influenciada por
catálisis ácida, catálisis básica y catálisis general, obteniéndose las
correspondientes constantes para cada catálisis.
Para determinar la ecuación de la cinética de los compuestos estudiados, se
estableció la ecuación hipotética de cinética, para luego utilizar los datos obtenidos
experimentalmente y corroborar que esta ecuación fuera correcta con los datos
obtenidos 23.
Materiales y Métodos
~ 23 ~
Para determinar el valor de k1, correspondiente al tramo ácido del perfil de
degradación se utilizó la ecuación:
Ecuación 923
Para determinar el valor de k3, correspondiente al tramo básico del perfil de
degradación se utilizo la ecuación 10.
Ecuación 1023
k) Determinación de la energía de activación (Ea) y ecuación de Arrhenius Para la determinación de la Ea, se utilizaron los datos obtenidos en los estudios de
la influencia de la temperatura en la cinética de degradación (2.2.6.b y 2.2.6.e).
Estos datos se graficaron como log k vs 1/T, donde la temperatura se usó en ºK. La
Ea fue obtenida según la ecuación:
.
Ecuación 1123,
Donde la pendiente del gráfico log k vs 1/T será igual a –Ea/ 2.303RT.
l) Determinación del valor de Q10
Para determinar el valor de Q10 se utilizaron los datos obtenidos en el estudio de la
influencia de la temperatura (2.2.6.c y 2.2.6.f.)
Ecuación 1223
Donde: Ea= energía de activación
R= constante de los gases ideales (1.987×10-3 Kcal/ºK mol)
T= temperatura en ºK
k= pendiente de la recta para cinética de orden uno
María José Orellana Bustos
~ 24 ~
2.2.7 Análisis estadístico. Para saber si los datos obtenidos por el uso de PPD con aplicación quimiométrica y
los datos obtenidos por HPLC son comparables, se debe aplicar una prueba de
significación. Esta prueba consiste en determinar si las diferencias entre los
resultados obtenidos por ambos métodos, son significativas o se pueden justificar
sólo por variables aleatorias.21
Para comparar los métodos, se realizará una prueba de t para muestras
emparejadas usando los valores de concentraciones iniciales obtendios para cada
una de las experiencias realizadas
La prueba de t para muestras emparejadas, determina la diferencia que existe entre
pares de datos que serán comparados entre sí. Luego de debe obtener la media y la
desviación estándar de las diferencias. Una vez obtenidos estos valores, se procede
a determinar el valor para t, con la siguiente ecuación:
√ / Ecuación 1321
Donde:
= media
n= numero de muestras
sd= desviación estándar
Donde t tiene (n-1) grados de libertad y su valor crítico se obtiene a través de tablas
estadísticas. Si el valor del t obtenido mediante la ecuación 11 es menor al valor de t
critico, se acepta que los métodos no tienen diferencias significativas entre si.
Para determinar si los métodos utilizados son aplicables de igual forma a los
estudios de estabilidad, se realizará una prueba de regresión de la curva, con el fin
de determinar si existen diferencias significativas en los valores de kobs obtenidos al
realizar dichas experiencias. La prueba de la regresión de la curva consiste en
graficar los valores obtenidos por medios del método de referencia (en nuestro caso
HPLC) con los valores del método nuevo (PPD con aplicación de calibración
multivariada), determinando lo valores del intercepto, pendiente y r2. Para que los
Materiales y Métodos
~ 25 ~
datos no posean diferencias estadísticas significativas, los valores ideales de los
parámetros requeridos son de 0 para el intercepto y de 1 para la pendiente y r2.
Además, se establecen valores de desviación tanto para el intercepto y la pendiente.
Las ecuaciones utilizadas para estas desviaciones son las siguientes:
∑∑ Ecuación 1421
∑ Ecuación 1521
∑ Ecuación 1621
María José Orellana Bustos
~ 26 ~
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 Caracterización electroquímica
Se caracterizaron electroquímicamente, tanto los compuestos estudiados
(PCNB y PFNB) como su producto de degradación (NB), utilizando polarografía de
pulso diferencial (PPD) bajo distintas condiciones de pH, en disolución tampón
Britton-Robinson 0.1 M.
Al observar los polarogramas para los tres compuestos (figura 3), se
aprecian señales bien definidas a los distintos pH estudiados, que se desplazan a
potenciales más negativos, a medida que el pH aumenta. Además se aprecian dos
señales distintas: una señal principal (señal 1) a potenciales bajos, que se debe a la
reducción del grupo nitro que poseen los compuestos y una segunda señal, de
menor intensidad (señal 2), que se debe probablemente a la reducción del enlace
azometino.24
Respecto a la evolución de los potenciales de pico (EP) en función del pH del
medio, se puede apreciar que los tres compuestos exhiben una dependencia lineal
del potencial de pico con el pH del medio, para su señal principal (figura 4). Para
PCNB se observa un quiebre en el potencial de pico de esta señal a pH 8, en tanto
que para PFNB este punto de quiebre se produce a pH 4. Por otra parte, NB
presenta dos quiebres en cada señal, el primero a pH 5 (señales 1 y 2), y el
segundo a pH 9 para la señal 1, y pH 8.5 para la señal 2. Además, puede
observarse en la figura 4, que a pH superiores a los indicados, el potencial de pico
de NB se mantienen prácticamente independiente del pH. En la tabla 4 se presenta
un resumen de las pendientes obtenidas en cada tramo lineal.
Resultados y Discusión
~ 27 ~
0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 -1.2 -1.40.0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
-1.2
-1.4
I / µ
A
E / V
pH 3.0 pH 4.1 pH 6.1 pH 8.1 pH 11.0
CpH
Señal 1
Señal 2
Figura 3. Polarogramas a distintos pH de PCNB (A), PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) y de NB (C) en etanol: tampón Britton-Robinson 0.1 M
(30:70)25-27
0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 -1.20.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
I/µA
E/V
2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
pHASeñal 1
Señal 2
0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 -1.20.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
i / μ
A
E / V
pH3 pH5 pH7 pH9
BpHSeñal 1
Señal 2
María José Orellana Bustos
~ 28 ~
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10200
300
400
500
600
700-E
p / m
v
pH
A
2 4 6 8 10 12
-200
-400
-600
-800
-1000
-1200
-1400
-1600 Señal 1 Señal 2
E P /
mV
pH
C
3 4 5 6 7 8 9
-0.3
-0.4
-0.5
-0.6
-0.7
-0.8
E p /
V
pH
B
Figura 4. Dependencia del potencial de pico (EP) con respecto al pH. PCNB (A), PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) y de NB (C) en etanol: tampón Britton-
Robinson 0.1 M 25-27
Estos puntos de quiebre se deberían a cambios en la protonación-
desprotonación de la especie electroactiva que accede a las superficie del
electrodo, y que se deberían al nitrógeno de carácter débilmente básico presente en
cada molécula (N-1), siendo consecuente la gráfica 4C con la presencia de dos
grupos ionizables en el NB (N-1 y N-3). En efecto, PCBN y PFBN presentan valores
de pKa de 4.69 y 4.86, respectivamente, en tanto que NB exhibe valores de pKa1 =
5.69 (N=C) y pKa2 = 11.38 (N-H)25-27.
Resultados y Discusión
~ 29 ~
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
-1.2
-1.4
Ip/μ
A
pH
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
Ip /
μA
pH
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
I p / μ
A
pH
A
Tabla 4. Valor de las pendientes de los gráficos EP – pH para NB, PCNB y PFNB.
La evolución de las corrientes de pico (IP) respecto del pH para los tres
compuestos estudiados, se puede apreciar en la figura 5. PCNB presenta un
incremento lineal de IP entre pH 2 y 6, disminuyendo en forma lineal entre pH 6 y 8,
volviendo a aumentar de la misma forma entre pH 8 y 11 (figura 5-A). Por otra parte,
PFNB presenta un aumento lineal de IP entre pH 3 y 6.5, seguido de una
estabilización de la corriente para luego decaer (figura 5-B).
En el caso de NB, se aprecia un incremento no lineal de IP hasta pH 5, a
partir del cual se produce un descenso de IP hasta pH 9, para luego volver a
aumentar a partir del pH 10 (figura 5-C). Estas variaciones en los valores de IP con
respecto al pH se podrían explicar por el efecto de la protonación y desprotonación
de los nitrógenos presentes en la molécula, de forma análoga a lo observado con el
comportamiento de los potenciales de pico de cada sustancia. Figura 5. Relación IP vs pH de PCNB (A), PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson
0.1 M (30:70) y NB (C) en etanol: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70)25-27
Valor de pendientes (mV/pH)
Tramo 1 r2 Tramo 2 r2 Tramo 3 r2
PCNBa 59.4 0.9996 30.8 0.9963 - -
PFNBb 77.0 1 53.6 0.9980 - -
NB (1era señal)c 28.3 0.9833 53.4 0.9991 15.4 0.9505
NB (2da señal)d 70.4 0.9839 151.9 0.9923 34.32 0.6329
3.2 Desarrollo del método polarográfico asistido por quimiometría a) Calibración del modelo multivariado. Con el fin de establecer tanto el comportamiento de los compuestos
estudiados frente a su producto de degradación, como la relación entre la
concentración y la intensidad de corriente (IP), se realizaron mezclas de cada uno de
los analitos (PCNB y PFNB) junto con su producto de degradación (NB), como que
se indica en el punto 2.2.4. Las gráficas obtenidas para cada una de las mezclas
consideradas se presentan en la figura 6.
Figura 6. Polarogramas de mezclas para PCNB (A) y PFNB (B) junto con su producto de degradación (NB).
Como se observa en la figura 6, los analitos de interés y su producto de
degradación presentan una solapación parcial en la región de potenciales de -0.5 V,
sin observarse cambios en la morfología de ninguna de las señales obtenidas.
b) Validación del modelo quimiométrico Para determinar el numero de factores (A) se procedió a realizar una
validación cruzada. Para esto se utilizaron las mezclas de compuestos establecidas
en el punto 2.2.4.a y además soluciones de cada analito por separado (PCNB y NB),
cuyas concentraciones se muestran en la tabla 5.
Resultados y Discusión
~ 31 ~
Tabla 5. Concentraciones de PCNB y NB utilizadas en la validación cruzada.
Muestra nº PCNB (M) NB (M)
1 1×10-3 1×10-3
2 7×10-4 7×10-4
3 5×10-4 5×10-4
4 4×10-4 1×10-4
5 3×10-4 7×10-5
6 2×10-4 5×10-5
7 1×10-4 1×10-5
8 5×10-5 -
9 3×10-5 -
Con los datos obtenidos, se determinó el error predictivo de la suma de los
cuadrados (PRESS) de cada número de factores (A) y se procedió a hacer un
estudio estadístico de la variación de PRESS frente al número de factores (figuras 7
y 8).
Para validar el modelo quimiométrico multivariado, se evaluó el error relativo
de predicción (%REP) y la correlación entre los valores de concentraciones
Figura 7. Gráfico del error predictivo de la suma de cuadrados (PRESS) vs. número
de factores (A) para PCNB.
Figura 8. Gráfico de SEC (Standar error of calibration) vs. número de factores (A) para PCNB.
SEC
SEC vs. A
María José Orellana Bustos
~ 32 ~
predichos y reales, obteniendo un %REP = 5.4 %, con un error estándar de
predicción = 6.5×10-6 (r2=0.97038), para una número de componentes (A) de 4.
La correlación entre los valores de concentraciones predichos y los valores
ideales se observa en la figura 9.
Como se observa en la figura 9, las pendientes obtenidas tiene un valor
cercano a 1 (0.933395), lo que indica una buena correlación entre los datos
analizados.
Como última prueba de validación, se realizó la prueba de exactitud de la
elipse, cuyo resultado se muestra en la figura 10. Como se observa en la figura 10,
el modelo de calibración multivariada aplicado, pasa la prueba de exactitud, ya que
el punto ideal determinado para este modelo, se encuentra dentro de la elipse.
Para PFNB, debido a que la extensión de la degradación de éste es similar a
la PCNB, se determinó el grado de solapamiento de las señales en concentraciones
de 5×10-4 M de cada compuesto (PFNB y NB por separado) y luego se realizaron
las mezclas indicadas en la tabla 3 (punto 2.2.4.a) y graficadas en la figura 6-B.
Figura 12. Curva de calibración por HPLC de PFNB, en fase móvil acetonitrilo: agua (60:40)
c) Limites de detección y limites de cuantificación Los límites de detección y de cuantificación fueron determinados usando los
datos experimentales obtenidos, según se indica en el punto 2.2.5. y aplicando las
ecuaciones 4 y 5. Los valores obtenidos para LD y LC fueron 5.51×10-7 y 7.33×10-7
M, respectivamente.
d) Estudio de repetibilidad Se realizó el estudio de repetibilidad con en fin de establecer la confianza de
los datos obtenidos bajo el método analítico de HPLC, encontrándose valores
menores al 3% para las tres concentraciones ensayadas (tabla 8)
Tabla 8. Valores de CV para el estudio de repetibilidad de PFNB en HPLC. Concentración (M) CV (%)
1×10-4 2.80
5×10-5 0.91
6×10-6 1.75
Resultados y Discusión
~ 37 ~
e) Estudio de reproducibilidad Se realizó este estudio, con el fin de establecer el nivel de confianza que
aportan los datos obtenidos por medio del HPLC pare el PFNB. Los valores de CV
obtenidos para cada concentración estudiada se informan en la tabla 9.
Tabla 9. Valores de CV para el estudio de reproducibilidad de PFNB por HPLC
Concentración (M) CV (%)
1×10-4 3.09
5×10-5 0.57
6×10-6 1.85
f) Comparación de los métodos utilizados
Para determinar si los métodos son comparables estadísticamente entre si,
se realizó una prueba t para muestras emparejadas a las determinaciones de
concentraciones iniciales obtenidas por PPD con aplicación de quimiometría y por
HPLC, aplicando la ecuación 13.
Para este efecto, se tomaron todos los valores de concentraciones obtenidos
en las distintas experiencias del estudio de degradación y cinético, de ambos
compuestos.
En el caso de PCNB, se obtuvo un valor para t = 4.05×10-3, que es menor
que el valor critico de t = 2.31 (P=0.05) para un n = 9 concentraciones iniciales.
En el caso de PFNB, el valor de t obtenido fue de 8.00×10-2 que, comparado
con su valor critico t = 2.18 para n = 14 concentraciones iniciales determinadas, es
mucho menor.
Con los datos anteriores, se puede observar que los valores de las
concentraciones iniciales obtenidas por ambos métodos utilizados, (PPD con
aplicación de calibración multivariada y HPLC) son estadísticamente comparables y
no presentan diferencias significativas, siendo posible afirmar que ambos métodos
son estadísticamente similares y comparables entre si.
María José Orellana Bustos
~ 38 ~
0.0 -0.3 -0.6 -0.9 -1.2 -1.50.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
NB
I / µ
A
E / V
PCNBA
0.0 -0.3 -0.6 -0.9 -1.2 -1.50.0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
-1.2
-1.4
-1.6
NB
P F N B
I/uA
E/V
B
3.4 Estudios de estabilidad
En la figura 13 se presentan los polarogramas obtenidos al realizar el
seguimiento de la degradación de PCNB y PFNB.
Figura 13. Degradación de PCNB (A) y PFNB (B) a pH 7 en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) a 50°C.
Como se puede observar, las señales de los compuestos y de su producto
de degradación se solapan parcialmente en una región del potencial de barrido,
haciendo imposible la determinación de la concentración en forma directa, a partir
de los resultados obtenidos mediante polarografía de pulso diferencial. Este
aparente impedimento en el uso de esta técnica electroquímica, abre la posibilidad
de la aplicación de la quimiometría para tratar los datos obtenidos y así determinar
las constantes cinéticas de importancia en tal estudio.
Resultados y Discusión
~ 39 ~
0 200 400 600 800 1000 12000.0
2.0x10-5
4.0x10-5
6.0x10-5
8.0x10-5
1.0x10-4
1.2x10-4
1.4x10-4
1.6x10-4
C/M
t/min
B
0 20 40 60 80 100 120 140 1600.0
1.0x10-4
2.0x10-4
3.0x10-4
4.0x10-4
5.0x10-4
C /
M
t/min
A
a) Estudio de la influencia del pH sobre la cinética de reacción Se determinó el orden de reacción de la degradación de los compuestos
estudiados, resultando ser de pseudo-primer orden para ambos compuestos en todo
el intervalo de pH estudiado, como se aprecia en la figura 14 para el caso de pH 3.
Figura 14. Curva de concentración (M) vs tiempo (minutos) para PCNB (A) y PFNB (B), a pH
3 en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1M (30:70) a 50°C.
0 200 400 600 800 1000 1200-12
-11
-10
-9
-8
ln [C
]
t/min
0 50 100 150 200 250 300 350
-10.2
-10.0
-9.8
-9.6
-9.4
-9.2
-9.0ln
[C]
t/min
María José Orellana Bustos
~ 40 ~
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-12.0
-11.2
-10.4
-9.6
-8.8
-8.0 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 8
ln [C
]
t/min0 50 100 150 200 250
-12.0
-11.2
-10.4
-9.6
-8.8
-8.0 pH 1 pH 2 pH 7
ln [C
]
t/min
0 50 100 150 200 250
-10.0
-9.5
-9.0
-8.5
pH4 pH 7 pH 8
ln [C
]
t/min0 100 200 300 400 500 600 700
-13.0
-12.5
-12.0
-11.5
-11.0
-10.5
-10.0
-9.5
-9.0
-8.5 pH 2 pH 3 pH 5 pH 6
ln [C
]
t/min
Figura 15. Gráficos de logaritmo natural de la concentración (ln [C]) versus tiempo (t/min) de PCNB (A) y PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) a 50°C.
A partir de la pendiente de los gráficos anteriores (figura 15), se obtuvo el
valor de la kobs para cada pH de cada compuesto. Los valores obtenidos se
presentan el las tablas 10 y 11 y se comparan con los valores obtenidos por HPLC,
para las mismas cinéticas de degradación.
B
A
Resultados y Discusión
~ 41 ~
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.070.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
k obs P
PD
kobs HPLC
Tabla 10. Valores obtenidos para la kobs mediante PPD y HPLC para PCNB en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) 50 °C.
Si observamos los datos presentados en la tabla 10, podemos ver que los
valores se encuentran dentro de mismo orden, poseen buenos coeficientes de
regresión, pero difieren en su valor. El valor para el pH 5 no se determinó aplicando
el método de HPLC, debido a problemas con el compuesto de estudio ajeno a la
reacción.
Para establecer la similitud de los valores de kobs obtenidos por ambos
métodos, se utilizará el método de regresión de la recta. Los valores obtenidos se
informan en la figura 16.
Figura 16. Correlación de kobs a distintos pH (50°C) por PPD vs HPLC para PFNB.
Con estos resultados estadísticos, se establece que los valores obtenidos
mediante la aplicación de las ecuaciones teóricas presentan diferencias
significativas, respecto de los valores obtenidos de forma experimental, en el caso
de PCNB. Esto se debería a que los datos experimentales sobre los cuales se
establecieron los parámetros para definir las ecuaciones, no son comparables entre
sí. Como se explicó anteriormente, esto se debería a que el modelo para PCNB se
realizó sin hacer el diseño experimental correspondiente. En el caso de PFNB, los
datos no poseen diferencias estadísticas significativas, con lo que podemos afirmar
que la ecuación teórica, efectivamente describe el comportamiento de las kobs en el
rango de pH establecido.
María José Orellana Bustos
~ 50 ~
0 50 100 150 200 250 300
-12
-11
-10
-9
-8 30 °C 40 °C 50 °C
ln [C
]
t/min
B
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-11.5
-11.0
-10.5
-10.0
-9.5
-9.0
-8.5
-8.0
30 °C 40 °C 50 °C
ln [C
]
t/min
A
b) Estudio de la influencia de la temperatura sobre la cinética de degradación Los datos obtenidos en el estudio de degradación a distintas temperaturas se
muestran en la figura 17.
Figura 21. Influencia de la temperatura en la cinética de reacción para PCNB (A) y PFNB (B) en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) a pH 2.
Como se puede observar en los gráficos de la figura 21, a medida que
aumenta la temperatura, la pendiente se acerca a 1; por lo tanto el valor de la kobs es
mayor, mostrando que a medida que aumenta la temperatura, aumenta la cinética
de la degradación de estos compuestos. Los valores de las kobs obtenidas en este
estudio se informan en la tabla 16.
Tabla 16. Valores obtenidos para las kobs a distintas temperaturas para PCNB y PFNB
en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M (30:70) a pH 2
Como se observa en la tabla 17 los valores obtenidos por ambos métodos
difieren bastante de los valores ideales informados para esta prueba (intercepto =0;
pendiente y r2 = 1). Esto indica, que los valores obtenidos para las kobs, por medio de
ambos métodos analíticos presentan diferencias significativas y por lo tanto no son
equivalentes en esta experiencia.
Si analizamos con detención los datos informados en la tabla 17 y
representados en la figura 22, en el caso de PFNB se observa una mayor influencia
de la temperatura en la kobs (50°C), tal como se informó previamente (figura 21, tabla
16). Esta influencia haría que la reacción de hidrólisis de PFNB a 50°C y pH 2 fuera
más rápida e inestable, incrementando el error en la determinación de los valores de
kobs, debido a la manipulación previa que debe hacerse de la solución para medirla
por PPD.
Este efecto puede apreciarse más claramente al comparar los métodos
tomando sólo los valores de las kobs determinadas a temperaturas menores (30°C y
40°C), en las cuales se observa una buena correlación entre las kobs obtenidas por
PPD y por HPLC, presentando valores para el intercepto y la pendiente cercanos a
cero y a la unidad , respectivamente (intercepto = -6.407×10-5 ± 6.49×10-15;
pendiente = 1.043 ± 3.32×10-7).
En el caso de PCNB, ya se había estimado con anterioridad que los métodos
presentan diferencias significativas entre ellos, debido a que el ajuste del modelo
multivariado no se realizó aplicando en diseño experimental, además que los datos
obtenidos en la regresión de la curva poseen un buen valor de r2.
Para calcular el valor de la energía de activación (Ea) se realizó el graficó log
kobs vs. 1/T, donde la temperatura esta en grados Kelvin (ºK).
Resultados y Discusión
~ 53 ~
0.00310 0.00315 0.00320 0.00325 0.00330 0.00335
-2.6
-2.4
-2.2
-2.0
-1.8
-1.6
-1.4
log
k
1/T (ºK)
B
0.00310 0.00315 0.00320 0.00325 0.00330
-2.2
-2.0
-1.8
-1.6lo
g k
1/T (K)
A
Figura 23. Gráficos de log kobs vs. 1/T (K) para PCNB (A) y PFNB (B).
A partir de los gráficos, podemos obtener a través de los valores de las
pendientes, el valor de Ea para cada uno de los compuestos estudiados, siendo
estos valores de 5.5 y 18.8 Kcal/mol, para PCNB y PFNB, respectivamente. Los
valores obtenidos son concordantes con los valores generales de Energías de
activación para hidrólisis de ésteres, lo cual pone de manifiesto la labilidad de estos
compuestos5, siendo PCNB más inestable con la temperatura que PFNB.
A partir de los valores de Ea, podemos calcular el valor de Q10 para un rango
de temperatura, utilizando la ecuación 12. Los valores para cada Q10 en cada rango
de temperatura se muestran en la tabla 18.
Tabla 18. Valores de Q10 para cada compuesto estudiado.
Rango Temperatura (°C) Q10 PCNB Q10 PFNB
30 - 40 1.95 2.71
40 - 60 1.87 2.55
Como se aprecia en la tabla 18, los valores para Q10 son similares para cada
uno de los rangos de temperatura, concluyendo que cada 10°C, la constante de
velocidad kobs aumenta aproximadamente 2 veces para PCNB y 2.5 veces para
PFNB.
María José Orellana Bustos
~ 54 ~
0 50 100 150 200 250 300-14
-13
-12
-11
-10
-9
-8 30/70 40/60 50/50
ln [C
]
t/min
B
c) Estudios de la influencia de la composición de la disolución en la cinética de degradación
Los resultados obtenidos durante este estudio están representados en la
figura 24. Esta figura muestra que a mayor cantidad de acetonitrilo en la disolución,
y por ende menor composición de tampón, las rectas se alejan del valor 1, siendo
las cinéticas de degradación más lentas.
Figura 24. Influencia de la composición de la disolución en la cinética de degradación de PFNB, en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 2
Tabla 19. Valores obtenidos para la influencia de la composición en la cinética de degradación de PFNB, en acetonitrilo: tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 2.
• PCNB y PFNB exhiben señales polarográficas pH dependientes, que se desplazan a potenciales más catódicos, a medida que el pH se incrementa.
• PCNB y PFNB sufren degradación de pseudo primer orden, pH dependiente e
influenciado tanto por la temperatura como por la composición de la disolución. • Al someter a ambos compuestos a hidrólisis, se genera una nueva señal
polarográfica, debida al producto de degradación 2-(o-nitrofenil)-1H-benzimidazol (NB), la cual se solapa con la señal del compuesto inicial (PCNB o PFNB).
• Las señales solapadas son resueltas utilizando calibración multivariada PLS,
permitiendo determinar las concentraciones de los analitos de interés (PCNB y PFNB), en presencia de su producto de degradación (NB) exitosamente.
• Las metodologías utilizadas (HPLC y PPD con aplicación de calibración
multivariada) fueron comparadas entre sí utilizando la prueba t para muestras pareadas, no observándose diferencias estadísticamente significativas.
• Los perfiles de pH para cada compuesto presentan puntos de inflexión en las
zonas de pH cercanas a sus valores de pKa. • Para PCNB se observan regiones de catálisis ácida general (pH 2-3) y catálisis
básica general (pH 7-8). Para PFNB se observa catálisis ácida específica y catálisis básica específica en los rangos de pH 2-3 y pH 6-8, respectivamente.
• Los valores de kobs para PFNB obtenidos por ambas metodologías exhiben buena
correlación y sin diferencias estadísticamente significativas. Para PCNB, las diferencias observadas entre ambos métodos se deberían a que no se empleó un diseño experimental al establecer el modelo de calibración multivariada aplicado.
• La degradación de ambos compuestos se ve influenciada por la temperatura,
incrementándose la velocidad de la reacción al aumentar el valor de ésta. • Para PFNB, su velocidad de degradación se ve influenciada por la composición
de la solución, aumentando ésta al aumentar la polaridad de la solución.
Referencias
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