EXPERIMENTO 5 ENZIMA CATALAZA ACTIVIDAD ENZIMATICA. FACTORES QUE
LA AFECTAN. DETERMINACION DE LA CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN.
EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.REQUISITOS
Repasar la deduccin de la frmula de Michaelis-Menten, sus premisas
y aplicacin. Balance de ecuaciones y titulacin OBJETIVOS Describir
algunas caractersticas de las enzimas. Determinar la actividad
enzimtica de las catalasas, su Km y el efecto de inhibidores sobre
la actividad enzimtica.
1.
FUNDAMENTOS
Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica.
Esto significa que son protenas cuya funcin es acelerar las
reacciones bioqumicas. Aunque se trata de protenas muchas
requieren, para ser activas, un componente no proteico conocido
como coenzima o grupo prosttico, segn se encuentre dbil o
firmemente asociado a la matriz proteica. La estructura de este
componente no proteico va a variar desde un ion (Ca , Mg , Mn , y
otros) hasta molculas complejas como NAD+, NADP+ y FAD. En estos
casos la actividad enzimtica va a depender de la presencia
simultnea de una porcin proteica (apoenzima) y una porcin no
proteica (coenzima) y el conjunto activo apoenzima mas coenzima, se
conoce como holoenzima. La actividad enzimtica se estudia en el
equilibrio, donde no hay cambio neto en la cantidad de sustrato o
de producto. En los sistemas biolgicos, las enzimas abaten la
energa de activacin y permiten que se produzcan reacciones, que de
otro modo, no ocurriran a velocidades mesurables. Las enzimas no se
consumen en el proceso y las reacciones catalizadas no alteran la
naturaleza de la reaccin, solo disminuyen la energa de activacin.
(Figura 1) 60++ ++ ++
Figura 1
Diagrama de energa para reacciones con G positiva y negativa
comparando una
reaccin catalizada contra una no catalizada.
Una consecuencia del hecho de que las reacciones bioqumicas sean
catalizadas por enzimas es la especificidad de stas hacia el
substrato: una enzima cataliza la transformacin de un solo tipo de
molcula o de unos tipos diferentes de molculas estructuralmente muy
relacionadas, la especificidad representa una ventaja para la
clula. Las enzimas dependiendo de las reacciones que catalizan, se
han clasificado por la comisin internacional de enzimas (E.C) en
cuatro dgitos que anteceden al nombre recomendado para la enzima,
este nombre esta compuesto por uno corto unido al nombre de la
reaccin que cataliza, los dgitos son: el primero se refiere a la
clase y van del 1 al 6, representan la reaccin general catalizada,
el segundo la sub-clase, el tercero la sub-subclase y el cuarto
designa a cada enzima especifica. En la tabla a continuacin se
muestra la clasificacin solamente del primer dgito:
61
Tabla 1. Clasificacin de las enzimas en su primer dgito.
62
Como protenas que son, las enzimas, son molculas de uso delicado
por ser fcilmente desnaturalizables. Debido a esto, deben
manipularse bajo condiciones que no favorezcan la desnaturalizacin
puesto que sta conduce a la inactivacin. Entre las condiciones que
se deben controlar durante la manipulacin de las enzimas, cabe
destacar: 1.1 Condiciones a controlar durante la manipulacin de las
enzimas: La temperatura: La estructura terciaria de una protena es
muy sensible a los cambios de la temperatura ya que, como sabemos,
se mantiene gracias a fuerzas no covalentes altamente sensibles al
calor. Esto hace que la actividad enzimtica muestre una dependencia
de la temperatura como la representamos en la figura. 2. Figura. 2
Influencia del aumento de la temperatura sobre la actividad
enzimticaInfluencia del aumento de la temperatura sobre la
actividad enzimatica8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14 Aumento de la temperatura (grados centgrados) Actividad
Enzimatica U/L
1.1.1. El pH: Debido a que los cambios de pH modifican las
concentraciones de los iones H y OH de la solucin, las
interacciones electrostticas intra e intermoleculares as como las
interacciones entre las molculas de protenas y la solucin de un
valor de pH a otro, modificndose as tambin la estructura
tridimensional y la actividad de la protena. La grfica que se
obtiene cuando se estudia la actividad enzimtica en funcin del pH
se parece a la obtenida en el pargrafo anterior como se puede notar
en la siguiente figura.
+
-
63
Figura. 3.
Influencia del aumento del pH sobre la actividad
enzimticaInfluencia del aumento del pH sobre la actividad
enzimticaActividad Enzimtica U/L 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12 13 Aumento del pH
1.1.2. La fuerza inica: Como la fuerza inica esta relacionada
con la concentracin de los diferentes iones de una solucin y stos
pueden influir sobre la estabilidad y la actividad de una protena
debe mantenerse un control sobre este parmetro. 1.1.3. La agitacin:
Las soluciones de protenas tienen baja tensin superficial, lo cual
determina que cuando estas soluciones se agitan violentamente, se
forma espuma. la formacin de espuma es un factor que favorece la
desnaturalizacin. 1.2. Determinacin de la actividad enzimtica
Cuando en el laboratorio se desea estudiar la actividad de una
enzima particular, se comienza por controlar algunos parmetros que
van a determinar la reproducibilidad de los ensayos. Entre estos
parmetros se pueden destacar: 1.2.1. Mtodos de deteccin: Lo primero
de que se debe disponer es de un mtodo que permita detectar y
cuantificar el producto formado o el substrato remanente despus de
la reaccin. Los mtodos ms usados por su rapidez y sencillez, son
los colorimtricos y espectrotofomtricos; luego se encuentran la
cromatografa en papel, en capa fina o de gases; titulacin,
respirometra, otros. 1.2.2. Tiempo de incubacin: Para determinar
una actividad enzimtica es necesario fijar un intervalo de tiempo
conveniente durante el cual se consuma una cantidad mensurable de
substrato. Debe siempre garantizarse que haya un exceso de
sustrato. Para determinar el tiempo de incubacin, se mezclan los
reactantes en varios recipientes y se detiene la reaccin a
diferentes tiempos. Se consigue que mientras no ha ocurrido la
saturacin de la enzima por el substrato, la actividad es
proporcional al tiempo de incubacin; la saturacin provoca la prdida
de la proporcionalidad; sin 64
embargo, no se debe confundir la situacin en que se alcanza la
saturacin con la situacin en que se ha agotado el substrato; por
esto el substrato debe estar en exceso. La grfica que debe
encontrarse es la que se muestra en la figura 4. Figura 4.
Velocidad de reaccin frente concentracin del sustrato (V vs. [ S
])
a
b
Para estudiar la reaccin, se puede elegir cualquier lapso
comprendido dentro de la barra a y se debe desechar el lapso
representado por b, el tiempo debe ser tal que se pueda hacer una
determinacin confiable de la actividad. 1.2.3. Concentracin de la
enzima: Determinado el tiempo de incubacin y en la seguridad de que
la concentracin de substrato es excesiva se incuban las mezclas de
reaccin durante el tiempo predeterminado pero con cantidades
diferentes de enzimas; si el substrato se encuentra en exceso, se
debe hallar una proporcionalidad directa entre la actividad y la
concentracin de enzima (Figura.5).
65
Figura 5
Actividad enzimtica frente a la concentracin de la enzima
Actividad enzimtica frente a la concentracin de la enzimaActividad
enzimtica U/L 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentracin de
la enzima g
Se debe elegir una cantidad de enzima que permita una
determinacin confiable de la actividad. 1.2.4. Concentracin del
substrato: La determinacin de este parmetro es muy importante por
dos razones principales: a. b. Permite el clculo de las propiedades
cinticas Km y Vmax para ese sustrato. Indica definitivamente qu
concentracin de sustrato se puede considerar saturante.
Por lo general, se considera saturante y se emplea
rutinariamente una concentracin de sustrato [s] = 10 Km. Diga el
estudiante a qu fraccin de Vmax corresponde la actividad enzimtica
cuando [s] = 10 Km. Como ya el estudiante debe imaginarse, esta
determinacin se realiza empleando una cantidad fija de enzima e
incubando durante un mismo lapso de tiempo pero con diferentes
concentraciones de sustrato. Al hacer esto hay que tomar en ciertas
precauciones prcticas: Debe cuidarse con las concentraciones
inferiores que no se agote el sustrato en el lapso de tiempo fijado
con la cantidad de enzima usada. Para evitar esto hay varias
alternativas: aqu las mencionaremos y el estudiante deber averiguar
como se justifican: a. b. c. No hacer ninguna modificacin al tiempo
ni a la cantidad de enzima determinados. Reducir la cantidad de
enzima e incubar durante el tiempo determinado. Reducir el tiempo
de incubacin y mantener fija la cantidad de enzima determinada.
66
d. e.
Reducir el tiempo de incubacin y la cantidad de enzima. No
emplear concentraciones de sustrato demasiado bajas.
1.2.5. Temperatura de incubacin: Sabemos que la velocidad de una
reaccin qumica aumenta al elevarse la temperatura; esto tambin es
cierto para las reacciones enzimticas pero el rango de activacin
por la temperatura es limitado, generalmente 0C y 45C; aunque estas
cifras no son absolutas, por lo general a menos de 0C la actividad
es prcticamente indetectable mientras que a ms de 45C la enzima se
inactiva, por las razones expuestas previamente. La temperatura
ptima de reaccin se determina incubando bajo condiciones constantes
de los parmetros previamente determinados y a temperaturas
diferentes; la grfica es la mostrada en la Figura 2. 1.2.6. pH de
incubacin: Se procede igual que para determinar la temperatura
ptima pero slo se vara el pH de la mezcla de reaccin; la grfica que
se obtiene es la mostrada en la Figura 2. 1.3. La determinacin de
la constante de Michaelis y el efecto de inhibidores sobre la
actividad
enzimtica Partiendo de la hiptesis de la formacin del complejo
enzima sustrato de que la velocidad de descomposicin del sustrato
es proporcional a la concentracin de la concentracin de sustrato.
Esta ecuacin tiene la expresin: V max. [S] v = -----------------Km
+ [S] o Vmax. v = ---------------------Km + 1 -----------[S] - 1)
del complejo intermediario ES, Michaelis y Menten derivaron una
ecuacin que indica como vara la velocidad de reaccin en funcin
Km =
V max. [S] ( --------------------V
La constante de Michaelis es un parmetro de gran importancia y
al mismo tiempo una caracterstica de cada enzima con un valor
constante slo para condiciones definidas del sistema. Si una enzima
acta para varios sustratos tendr un KM para cada sustrato. La
constante de Michaelis puede definirse como la concentracin del
sustrato a la semi velocidad mxima de reaccin; tiene por
consiguiente las dimensiones de una concentracin de sustrato en
mol/L. 67
V. max. Esta definicin proviene de la frmula de Km puesto que
cuando v = ------------2 entonces Km = [S]. 1.3.1 Mtodos para
determinar la constante Michaelis-Menten. 1. Si la velocidad
inicial de la reaccin se grfica como funcin de las concentraciones
del sustrato se puede determinar la velocidad mxima y tambin la
concentracin del sustrato a la semi-velocidad mxima de reaccin (Km
). 2. Un procedimiento o mtodo ms empleado es el de Lineweaver y
Burk el cual consiste en graficar los recprocos de las velocidades
de reaccin contra los recprocos de las concentraciones del sustrato
con lo cual se obtiene una lnea recta. Vmax. [S] Tomando la inversa
de la ecuacin v = -------------------Km + [S] 1 ---- = v Km + [S]
--------------------Vmax. [S] + [S] ------------------V. max. [S] 1
= ---------------V max. + Km ----------------V max. (1)
Se obtiene
1 Km ------- = --------------------v V. max. [S] 1 ------v
[------ ][S]
Esta es la ecuacin de una recta ( y = a + b x ) cuyo coeficiente
angular es Km / Vmax. y el valor de la ordenada en el origen es 1/
Vmax. en el eje 1/v. Cuando 1/v = 0, entonces -1 1 ----- = -----Km
[S]
De este modo es posible obtener grficamente los valores de Vmax.
(en la interseccin de 1/v) y calcular el valor de Km. La siguiente
figura representa 68
1.3.2 Inhibicin de la actividad enzimtica. Algunas sustancias
actan sobre las enzimas o coenzimas que intervienen en una reaccin
enzimtica afectando la Vmax. de reaccin y/o la afinidad de la
enzima por el sustrato. El uso de estas sustancias inhibidoras ha
permitido conocer la naturaleza de grupos funcionales del centro
activo, la especificidad del sustrato, posibles mecanismos de
reaccin enzimticos y la participacin de algunos grupos funcionales
en el mantenimiento de la conformacin de la enzima especfica para
su actividad biolgica. La inhibicin puede ser: reversible o
irreversible. En el primer caso es posible eliminado el inhibidor
por dilisis recuperar la enzima intacta. En el segundo caso el
inhibidor reacciona con la enzima destruyendo uno ms grupos
funcionales de la enzima y no puede eliminarse dicho inhibidor por
dilisis. En exceso de inhibidor su accin aumenta con el tiempo ya
que la formacin del complejo EI es irreversible. Inhibicin
reversible: Especifica. El inhibidor se combina con el centro
activo de la enzima D con grupos funcionales esenciales para la
actividad enzimtica pero que no estn en el centro activo. Este tipo
de inhibicin puede ser: Competitivo o no competitivo. Inhibicin
competitiva: La enzima puede enlazar en su centro activo una
sustancia estructuralmente relacionada a su verdadero sustrato
previnindose de esta manera la unin al sustrato; el S y el I
compiten por alcanzar el centro activo de la enzima; esta inhibicin
se revierte por exceso de sustrato. El valor de la Km cambia pero
no Vmax. alcanzada en la reaccin sin inhibidor. Inhibicin no
competitiva: Ocurre cuando se produce inhibicin especfica y
reversible que depende slo de la concentracin del inhibidor y no se
elimina por aumento de la concentracin del sustrato. Esto indica
que el I se une a E en un punto esencial para la actividad
enzimtica diferente del centro activo. Con el inhibidor no
competitivo la Km permanece invariable pero Vmax. alcanzada es
menor que la que se logra en ausencia de inhibidor. 1.3.3 Mtodos
para determinar el efecto de inhibidores: Las figuras a continuacin
(6, 7 y 8), muestran el efecto de los diferentes tipos de inhibicin
por los mtodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk
69
Figura 6
Inhibidor competitivo (Km alterada y la Vmax. es igual). Por los
mtodos de
Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk
70
Figura 7
Inhibidor no competitivo (Km inalterada y Vmax. menor en
ausencia de inhibidor).
Por los mtodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk
71
Figura 8
Inhibidor irreversible no competitivo (Km y Vmax menor en
ausencia de inhibidor).
Por los mtodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk
72
2.
MATERIALES EQUIPOS Y REACTIVOS: Embudos Cronmetro (aportados por
los alumnos) cido sulfrico 2N Permanganato de potasio 0,1N Papel
milimetrado (aportado por los alumnos) Soluciones tampn a
diferentes pH
Soportes Universales Pinzas Nueces Buretas de 50 ml Pipetas de
125 y 10 ml Fiolas de 125 ml Agua oxigenada (H2O2) 2.1
Procedimiento: 2.2.1. Preparacin de la enzima:
A un litro de agua destilada enfriada en hielo agregue 1 ml de
sangre obtenida por venipuntura y mezcle volteando suavemente el
recipiente dos veces. Esta solucin se mantiene siempre en hielo.
Puede usarse 1 ml de homogeneizado de hgado o rin de res o ratas.
2.2.2. Deteccin de la actividad enzimtica: Se detectar la actividad
enzimtica de la catalasa titulando con permanganato de potasio 0 1N
el agua oxigenada presente en cada fiola, despus de agregrsele cido
sulfrico 2N. La ecuacin en que se basa el mtodo de deteccin es:
MnO4+ H2O2 + H+
O2 + Mn
++
+ H2O
El estudiante debe balancear la ecuacin y analizarla ya que a
partir de ella se realizarn los clculos que se van a necesitar
durante la prctica. Igualmente el alumno deber repasar lo aprendido
en qumica inorgnica sobre titulacin. 2.2.3 Determinacin del volumen
de enzima: a. Numere 10 fiolas y siga el esquema de trabajo
mostrado a continuacin: Fiola N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H2O2 (ml) 1.5
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 H2O (ml) 8.0 8.0 7.5 7.5 6.5
6.5 5.5 5.5 4.5 4.5 H2SO4 (ml) t = min 3 3 3 3 3 73 Enzima (ml) 0.5
0.5 1.0 1.0 2.0 2.0 3.0 3.0 4.0 4.0 H2SO4 2N (ml) t = min. 3 3 3 3
3
b. c d. e. f.
Proceda as: Numere las fiolas, aada H2O2 y H2O. Si se trata de
las fiolas 1, 3, 5, 7, 9, adales el H2SO4 al tiempo cero antes de
aadir la enzima. En el caso de la otras fiolas aada primero la
enzima (no aada el cido) y simultneamente ponga a funcionar el
cronmetro mezclando nuevamente. Espere el tiempo indicado (1 min)
para aadir el cido. Mezcle y titule con la solucin de
permanganato. Se hace una grfica representativa del nmero de
moles de H2O2 descompuestos por minutos en
funcin del volumen de enzima empleado y en base a esa grfica el
grupo escoger el volumen de enzima que emplear en las experiencias
siguientes. 2.2.4. Determinacin del tiempo de reaccin: a. Realice
la siguiente experiencia: Fiola N 1 2 3 4 5 H2O2 (ml) 1.5 1.5 1.5
1.5 1.5 H2O (ml) 8.0 8.5-x 8.5-x 8.5-x 8.5-x enzima (ml) X X X X X
t(min) 1 2 4 6 H2SO4 2N(ml) 3 3 3 3 3
Nota: X es el volumen de enzima escogido en la experiencia
anterior. b. El cido sulfrico se agrega despus de transcurrido el
tiempo prescrito a partir de la adicin de la enzima excepto en
fiola 1. c. Titule el H2O2 remanente en cada fiola y haga una
grfica que represente la cantidad de moles de H2O2 descompuestos en
funcin del tiempo de incubacin y en base a ella elija el tiempo de
incubacin que emplear en las experiencias sucesivas. 3.
AUTO-EVALUACIN 1. 2. 3. 4. 5. 6. Qu papel (es) juega el cido
sulfrico? Qu concluye respecto a los resultados de las fiolas 1, 3,
5, 7 y 9? Por qu puede suceder esto?. La ecuacin siguiente es en la
que se basa el mtodo de deteccin, efecte el balance: + ++ MnO4- +
H2O2 + H O2 + Mn + H2 O Disear un protocolo que le permitan
determinar los siguientes parmetros: a. Temperatura b. pH ptimo, c.
Constante de Michaelis (Km) y velocidad mxima (Vmax), d. Efecto de
la azida de sodio sobre la actividad enzimtica. Calcule cmo se
preparan 250 ml de una solucin de H2SO4 2N a partir de una botella
que tiene las siguientes especificaciones: d =1.84 g/ml y pureza
97%. 74
4.
INFORME 6
(CATALASA) Nombres N del mesn N del estudiante Desarrollo
Informe Definitiva
Apellidos Grupo de prcticas Fecha Calificaciones Entrada 1.
Disee una tabla en esta hoja para presentar sus resultados.
75
2.
Anexe sus grficas realizadas en papel milimetrado, recorte y
pegue en el espacio a
continuacin.
3.
Interprete sus resultados experimentales. Sea breve y
ordenado
Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la prctica, sin
anexar hojas.
76