BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar BelakangEnzim adalah biomolekul berupa protein yang
berfungsi sebagai katalis. Adanya enzim membuat reaksi kimia
terjadi menjadi lebih cepat dari normalya. Enzim dapat meningkatkan
laju terjadinya reaksi dengan cara menurunkan energi aktivasi.
Enzim di dalam tubuh manusia terdapat bermacam-macam yang membantu
kerja sel dan organ di dalam tubuh. Contoh yang mudah adalah enzim
amylase yang terdapat di dalam mulut. Enzim amylase merubah amilum
menjadi glukosa. Nasi yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat
mengandung banyak amilum yang tidak dapat langsung diolah oleh
tubuh. Adanya enzim ini dapat merubah karbohidrat kompleks menjadi
struktrur karbohidrat yang lebih sederhana yaitu glukosa.
Akhir-akhir ini juga banyak sekali penelitian tentang enzim yang
melibatkan beberapa sektor, mulai dari sektor industry, pertanian,
dan lain-lain. Penelitian ini membuat adanya temuan baru tentang
enzim yang dapat diisolasi melalui bakteri karena dengan adanya
enzim reaksi kimia yang kompleks dan rumit dapat diamati. Percobaan
ini akan mempelajari tentang isolasi dan produksi enzim.
1.2 Rumusan MasalahAdapun rumusan masalah dalam percobaan ini
adalah :1. Bagaimana menentukan aktivitas enzim xilanolitik?2.
Berapa berat molekul enzim Endo--1,4-D-Xilanase ?3. Berapa energi
aktivasi enzim kasar (crude) ?4. Berapa energi aktivasi enzim
dengan fraksinasi bertingkat 40-50 ?5. Berapa kadar protein yang
dihasilkan oleh enzim ?
1.3 TujuanAdapun tujuan dalam percobaan ini adalah :1.
Menentukan aktivitas enzim xilanolitik.2. Menentukan berat molekul
relatif enzim Endo--1,4-D-Xilanase.3. Menentukan energi aktivasi
enzim kasar (crude).4. Menentukan energi aktivasi enzim dengan
fraksinasi bertingkat 40-50.5. Menentukan kadar protein yang
dihasilkan oleh enzim
1.4 Manfaat Adapun manfaat yang akan didapatkan dalam percobaan
ini adalah1. Mahasiswa dapat menentukan aktivitas enzim
xilanolitik.2. Mahasiswa dapat menentukan berat molekul relatif
enzim Endo--1,4-D-Xilanase.3. Mahasiswa dapat menentukan energi
aktivasi enzim kasar (crude).4. Mahasiswa dapat menentukan energi
aktivasi dengan fraksinasi bertingkat 40-50.5. Mahasiswa dapat
menentukan kadar protein yang dihasilkan oleh enzim.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Enzim Enzim merupakan unit fungsional dari
metabolisme sel yang bekerja dengan urutan yang teratur. Enzim
mengkatalisis reaksi bertahap yang menguraikan melekul nutrient,
reaksi yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat
makro molekul sel dari perkusor sederhana. Pemakaian enzim memiliki
banyak keunggulan seperti menghemat energi, mengurangi kebutuhan
bahan kimia (Thenawijaya, 1992). Enzim adalah biomolekul berupa
protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat
proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia
organik. Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat
perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk. Jenis produk
yang akan dihasilkan bergantung pada suatu kondisi/zat, yang
disebut promoter. Semua proses biologis sel memerlukan enzim agar
dapat berlangsung dengan cukup cepat dalam suatu arah lintasan
metabolisme yang ditentukan oleh hormon sebagai promoter (Anonim,
2014).Enzim umumnya merupakan protein globular dan ukurannya
berkisar dari hanya 62 asam amino pada monomer 4-oksalokrotonat
tautomerase, sampai dengan lebih dari 2.500 residu pada asam lemak
sintase. Terdapat pula sejumlah kecil katalis RNA, dengan yang
paling umum merupakan ribosom. Jenis enzim ini dirujuk sebagai
RNAenzim ataupun ribozim. Aktivitas enzim ditentukan oleh struktur
tiga dimensinya (struktur kuaterner). Walaupun struktur enzim
menentukan fungsinya, prediksi aktivitas enzim baru yang hanya
dilihat dari strukturnya adalah hal yang sangat sulit (Anonim,
2014).
2.2 Enzim Xilanolitik Xilan adalah komponen utama hemiselulosa
yang memiliki tulang punggung rantai D-xilopiranosa dengan ikatan
glikosidik -1,4. Xilan memiliki residu O-asetil, arabinosil dan
4-O-metil-D-asam glukoronat yang terikat pada tulang punggungnya.
Hidrolisa lengkap xilan menjadi monomernya memerlukan kerja sinergi
beberapa enzim xilanolitik (Subramaniyan dan Prema, 2002).Enzim
xilanolitik merupakan enzim kompleks yang terdiri atas
1,4--endoxilanase, -xilosidase, -L-arabinofuranosidase,
-glukuronidase, asetil xilan esterase dan asam fenolat (asam
ferulat dan asam fumarat) esterase (Collins et al., 2005). Xilanase
mikroba memiliki aplikasi yang luas. Enzim ini dapat digunakan
untuk biobleaching pada industri kertas, penjernihan dan
meningkatkan aroma jus dan anggur, meningkatkan kualitas roti dan
pakan ternak, pengolahan limbah serta pengomposan (Meryandini et
al., 2008).Enzim xilanolitik dihasilkan oleh bakteri xilanolitik.
Bakteri xilanolitik mampu memproduksi enzim endo--1,4-xilanase,
-xilosidase, -L-arabinofuranosidose, -L-glukoronidase dan asetil
xilan esterase. Hidrolisis total xilan membutuhkan beberapa enzim
yang berbeda yaitu : endo-1,4- -xilanase yang menghidrolisis
struktur dasar xilan secara acak menjadi xilooligosakarida; 1,4-
-xilosidase yang memutus xilooligosakarida menjadi xilosa. Gugus
samping yang menyusun xilan akan dibebaskan oleh
-L-arabinofurosidase, -L-glukorosidase, galaktosidase dan asetil
xilan esterase menjadi arabinosa, glukuronat, galaktosa dan asetat
(Subramaniyan dan Prema., 2002).
2.3 Enzim XilanaseXilanase merupakan enzim ekstraseluler yang
mempunyai kemampuan menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi
xilo-oligosakarida dan xilosa. Enzim ini terdiri dari
endo--xilanase (EC 3. 2. 1. 8) dan -xylosidases (EC 3. 2. 1.37).
Xilanase dapat dihasilkan oleh mikroba melalui proses fermentasi.
Enzim xilanase diperlukan oleh beberapa industry antara lain
industri pangan, pakan ternak, pemutih bubur kertas/pulp, dan
biokonversi lignoselulosa untuk bahan bakar (Kimet al. 2000; Rifaat
et al. 2005). Hal yang dilakukan untuk mempercepat proses pada
umumnya industri menggunakan suhu tinggi. Salah satunya pada
industri kertas proses pembuatan bubur kertas dilakukan dengan
pemanasan (Sirait 2003), agar enzim xilanase dapat ditambahkan
tanpa harus dilakukan proses pendinginan maka diperlukan enzim
xilanase termostabil. Hal ini dikarenakan enzim termostabil mampu
mempertahankan aktivitasnya pada suhu tinggi.
Xilanase adalah salah satu enzim yang memiliki prospek yang
besar sebagai enzim penghidrolisis hemiselulosa. Beberapa industri
memerlukan xilanase yang tahan pada suhu tinggi. Proses di industri
memerlukan enzim yang aktif dan stabil pada suhu tinggi, sehingga
memudahkan pencampuran, substrat mudah larut, mempercepat reaksi,
dan mencegah kontaminasi. Salah satunya adalah mencari enzim
termostabil yang dihasilkan oleh mikroorganisme termofilik.
Mikroorganisme tersebut umumnya hidup di sumber air panas. Tujuan
dari eksperimen ini adalah untuk mengisolasi dan menyeleksi bakteri
yang dapat menghasilkan xilanase tinggi, serta menentukan kondisi
produksi enzim. Seleksi dilakukan dengan penapisan semikuantitatif
menggunakan deteksi pada plat agar mengandung substrat xilan dan
penapisan kuantitatif dengan mengukur aktivitas enzim. Kondisi
optimal produksi enzim dipelajari dengan menentukan jenis dan
jumlah substrat, pH serta suhu (Susilowati et al., 2002).Xilanase
dimurnikan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dan penukar
ion. Matrik Sephadex G-100 dikembangkan dalam 10 mM bufer fosfat pH
6,0. Matrik DEAE-Sephadex A50 dikembangkan dengan 10 mM Tris-HCl pH
8,0. Protein yang tidak terikat matrik dibilas dengan bufer yang
sama, sedangkan protein yang terikat matrik dibilas dengan gradien
linier larutan NaCl (0-0,5 M NaCl dalam bufer yang sama) dan 1 M
NaCl. Pembilasan dilakukan dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit
(Meryandini et al., 2008).
BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan3.1.1 Alat Gelas ukur Alat sentrifugasi Tabung
reaksi Beaker gelas Erlenmeyer Pipet volume Ball pipet Kantung
dialisis Lempengan kaca sandwich Penangas air Set alat
elektroforesis Power supply Spektrofotometer
3.1.2 Bahan 1 loop jarum ose bakteri positif xilanolitik MELB
cair Enzim Endo--1,4-D-Xilanase Substrat oat-speltxylan 0,5% Buffer
fosfat-sitrat Reagen DNS (Na-K tartrat, NaOH, DNS, C6H5OH, Na2SO3)
Aquades D-xilosa Ammonium sulfat Buffer Tris-HCl 50 mM Reagen kerja
Bradford (100 mg CBB G250, 100 mL H3PO4 85%, 50 mL C6H5OH 95%,
aquades 1000 mL) Larutan standar BSA Enzim SDS-PAGE SDS 10%
Gliserol -merkaptoetanol BPB 1% Glisin CH3OH CH3COOH
3.2 Alur Percobaan3.2.1 Inokulasi/Produksi Bakteri
XilanolitikBakteri positif xinanolitikHasil
Diinokulasikan 1 loop bakteri ke dalam 5,0 mL medium MELB cair
yang disuplementasi xilan. Dikocok (dishaker) inkubasi selama 12
jam. Diambil sebanyak 1% dari volume medium produksi yang akan
dibuat. Diinokulasikan ke dalam medium MELB yang displementasikan
xilan (medium produksi). Dishaker inkubasi pada suhu 37oC selama 12
jam.
3.2.2 Pemanenan Sel dan Isolasi Ekstrak Kasar Enzim
XilanolitikInokulum hasil inkubasiHasil
Disentrifuse pada kecepatan 1,0x104rpm selama 15 menit.
Ditentukan aktivitas supernatan ekstrak enzim kasar
xilanolitik.
3.2.3 Penentuan Aktivitas Enzim Xilanolitik (Enzim
Endo--1,4-D-Xilanase)Enzim Endo--1,4-D-XilanaseHasil
Diambil 100 l dan ditambahkan pada 100l suspensi substrat
oat-speltxylan 0,5% dalam buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 5,0).
Dibuat kontrol dengan mencampurkan 100 l enzim inactive yang
dipanaskan pada suhu 100oC selama 5 menit, 600 l reagen DNS dan 100
l suspensi substrat oat-speltxylan. Diinkubasi hasil langkah 1
bersama kontrol selama 60 menit pada suhu 40oC. Ditambahkan 600 l
reagen DNS (Na-K tartrat, NaOH, DNS, C6H5OH, Na2SO3). Direinkubasi
bersama dengan kontrol dalam air mendidih selama 15 menit dan
didinginkan secara langsung dalam air es selama 20 menit.
Ditentukan absorbansi warna yang dihasilkan menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. Dibuat standar
dengan menggunakan D-xilosa yang diperlakukan sama dengan sampel
dan kontrol. Diganti D-xilosa dengan aquades sebagai blanko.
3.2.4 Purifikasi Parsial Enzim
Endo--1,4-XilanaseEndo--1,4-XilanaseHasil
Ditambahkan (NH4)2SO4 jenuh 0-100% dengan rentang 10% untuk
proses fraksinasi ammonium sulfat. Dijenuhkan dalam keadaan dingin
sambil diaduk perlahan. Disentrifugasi pada kecepatan 8x103rpm
selama 15 menit dengan suhu 4oC hingga diperoleh supernatan dan
pellet-pellet protein. Diresuspensi ke dalam buffer fosfat-sitrat
50mM (pH 7,5). Ditentukan aktivitas protein seperti prosedur 3.2.3
dan kadar protein. Didialisis supernatan hasil langkah 5 yang
aktivitas spesifiknya tinggi selama 12 jam dalam buffer Tris-HCl
50mM (pH 7,5) menggunakan kantung dialisis pada suhu 4oC. Dilakukan
penggantian buffer pada 2, 4, 6 jam setelah dialisis dimulai.
Ditentukan aktivitas dan kadar protein untuk enzim
Endo--1,4-Xilanase hasil dialisis.
3.2.5 Penentuan Kadar Protein Enzim
Endo--1,4-XilanaseEndo--1,4-XilanaseHasil
Diambil 20 l dan dicampur dengan buffer. Ditambahkan sebanyak
1000 l reagen kerja Bradford (100 mg CBB G250, 100 ml H3PO4 85%, 50
ml C2H5OH 95%, aquades hingga 1000 ml) hingga volumenya 100 l.
Diinkubasi selama 2-5 menit. Ditentukan absorbsivitas dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan standar
larutan BSA. Digunakan aquades sebagai blanko.
3.2.6 Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim Endo--1,4-Xilanase
Endo--1,4-XilanaseHasil
Diestimasi dengan elektroforesis protein SDS-PAGE melalui metode
Bollag. Ditentukan berat molekul relatifnya dengan membandingkan
pita migrasi protein dengan pita migrasi marker. Ditentukan
absorbsivitas dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm
dengan standar larutan BSA.
3.2.7 Tahapan Elektroforesis untuk Penentuan Berat Molekul
Relatif Enzim Endo--1,4-Xilanase3.2.7.1 Preparasi Gel
SDS-PAGESampelHasil
Dilakukan pencucian untuk seluruh perangkat elektroforesis.
Dibersihkan lempengan kaca sandwich untuk pembuatan gel dengan
etanol dan dikeringkan. Dirangkai set alat elektroforesis sesuai
petunjuk. Diisi lempengan kaca pencetak gel dengan aquades di atas
gel. Diinjeksikan formulasi gel ke dalam pencetak gel dan segera
dilakukan pemasangan sisir cetakan dan dilepas apabila gel telah
berpolimerisasi. Dibilas sumur yang terbentuk dengan aquades.
3.2.7.2 Preparasi Sampel SDS-PAGEEnzimHasil
Diambil 40 l yang telah ditambahkan bufer sampel (2 ml SDS 10%,
5 ml gliserol 50%, 0,5 ml -merkaptoetanol, 1 ml BPB 1% dan 0,9 ml
aquades dicampurkan ke dalam 0,6 ml Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8))
sebagai campuran untuk SDS-PAGE. Dipanaskan dalam air mendidih
selama 5 menit untuk mendenaturasi.
3.2.7.3 Running SDS-PAGEProtein
Hasil
Dirangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk. Diisi
kompartemen dengan larutan buffer elektrode (running buffer; 25 mM
Tris, 250 mM glisin dan 0,1% SDS/ stok 5x15,1 g Tris Base, 94 g
glisin, 50 ml 10% SDS ditambahkan aquades hingga volume 100 ml)
hingga memenuhi kompartemen atas dan bawah. Diinjeksikan sampel
protein ke dalam masing-masing sumur yang terbentuk pada gel.
Ditutup kompartemen yang telah dibuat. Dihubungkan elektrode pada
kompartemen atas dan bawah pada power supply dengan voltase 40-100
V dan arus listrik 5,0 A. Dihentikan elektroforesis jika warna biru
tracking dye (BPB) telah mencapai sekitar 0,5 cm dari bagian bawah
gel.
3.2.7.4 Staining dan Destaining SDS-PAGEGel
elektroforesisHasil
Diambil gel dari lempeng kaca pencetak gel dengan hati-hati.
Direndam dalam wadah berisi larutan pewarna (staining solution; 1 g
CBB R250, 450 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingga 100 ml).
Digojok secara perlahan hingga larutan pewarna dapat diikat oleh
protein. Dicuci dengan larutan pelepas warna (destaining solution;
100 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingg 100 ml) jika protein
tidak terikat pada larutan pewarna hingga pita-pita protein tampak
jelas. Dilakukan penggoyangan untuk mempercepat pelepasan larutan
warna.
3.3 Prosedur Kegiatan3.3.1 Inokulasi/Produksi Bakteri
XilanolitikInokulasi 1 loop bakteri ke dalam 5,0 mL medium MELB
cair yang disuplementasi xilan. Kocok (shaker) inkubasi selama 12
jam. Ambil 1% dari volume medium produksi yang akan dibuat.
Inokulasikan ke dalam medium MELB yang disuplementasikan xilan
(medium produksi). Kocok (shaker) lagi inkubasi pada suhu 37oC
selama 12 jam.3.3.2 Pemanenan Sel dan Isolasi Ekstrak Kasar Enzim
XilanolitikSentrifuse inokulum hasil inkubasi pada kecepatan
1,0x104rpm selama 15 menit. Tentukan aktivitas supernatan ekstrak
enzim kasar xilanolitik.3.3.3 Penentuan Aktivitas Enzim Xilanolitik
(Enzim Endo--1,4-D-Xilanase)Ambil 100 l enzim Endo--1,4-D-Xilanase
dan tambahkan pada 100l suspensi substrat oat-speltxylan 0,5% dalam
buffer fosfat-sitrat 50mM (pH 5,0). Buat kontrol dengan
mencampurkan 100 l enzim inactive yang dipanaskan pada suhu 100oC
selama 5 menit, 600 l reagen DNS dan 100 l suspensi substrat
oat-speltxylan. Inkubasi hasil langkah 1 bersama kontrol selama 60
menit pada suhu 40oC. Tambahkan 600 l reagen DNS (Na-K tartrat,
NaOH, DNS, C6H5OH, Na2SO3). Reinkubasi bersama dengan kontrol dalam
air mendidih selama 15 menit dan dinginkan secara langsung dalam
air es selama 20 menit. Tentukan absorbansi warna yang dihasilkan
menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. Buat
standar menggunakan D-xilosa yang diperlakukan sama dengan sampel
dan kontrol. Ganti D-xilosa dengan aquades sebagai blanko.3.3.4
Purifikasi Parsial Enzim Endo--1,4-XilanaseTambahkan (NH4)2SO4
jenuh 0-100% dengan rentang 10% untuk proses fraksinasi ammonium
sulfat dalam enzim Endo--1,4-Xilanase. Jenuhkan dalam keadaan
dingin sambil aduk perlahan. Sentrifugasi pada kecepatan 8x103rpm
selama 15 menit dengan suhu 4oC hingga diperoleh supernatan dan
pellet-pellet protein. Resuspensi ke dalam buffer fosfat-sitrat
50mM (pH 7,5). Tentukan aktivitas protein seperti prosedur 3.2.3
dan kadar protein. Dialisis supernatan hasil langkah 5 yang
aktivitas spesifiknya tinggi selama 12 jam dalam buffer Tris-HCl
50mM (pH 7,5) menggunakan kantung dialisis pada suhu 4oC. Lakukan
penggantian buffer pada 2, 4, 6 jam setelah dialisis dimulai.
Tentukan aktivitas dan kadar protein untuk enzim Endo--1,4-Xilanase
hasil dialisis.3.3.5 Penentuan Kadar Protein Enzim
Endo--1,4-XilanaseAmbil 20 l enzim Endo--1,4-Xilanase dan campur
dengan buffer. Tambahkan sebanyak 1000 l reagen kerja Bradford (100
mg CBB G250, 100 ml H3PO4 85%, 50 ml C2H5OH 95%, aquades hingga
1000 ml) hingga volumenya 100 l. Inkubasi selama 2-5 menit.
Tentukan absorbsivitas dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 595 nm dengan standar larutan BSA. Gunakan aquades
sebagai blanko.3.3.6 Penentuan Berat Molekul Relatif Enzim
Endo--1,4-XilanaseEstimasi berat molekul enzim Endo--1,4-Xilanase
dengan elektroforesis protein SDS-PAGE melalui metode Bollag.
Tentukan berat molekul relatifnya dengan membandingkan pita migrasi
protein dengan pita migrasi marker. Tentukan absorbsivitas dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan standar
larutan BSA.
3.3.7 Tahapan Elektroforesis untuk Penentuan Berat Molekul
Relatif Enzim Endo--1,4-Xilanase3.3.7.1 Preparasi Gel
SDS-PAGELakukan pencucian untuk seluruh perangkat elektroforesis.
Bersihkan lempengan kaca sandwich untuk pembuatan gel dengan etanol
dan keringkan. Rangkai set alat elektroforesis sesuai petunjuk. Isi
lempengan kaca pencetak gel dengan aquades di atas gel. Injeksikan
formulasi gel ke dalam pencetak gel dan segera lakukan pemasangan
sisir cetakan dan lepas apabila gel telah berpolimerisasi. Bilas
sumur yang terbentuk dengan aquades.3.3.7.2 Preparasi Sampel
SDS-PAGEAmbil 40 l enzim yang telah ditambahkan bufer sampel (2 ml
SDS 10%, 5 ml gliserol 50%, 0,5 ml -merkaptoetanol, 1 ml BPB 1% dan
0,9 ml aquades dicampurkan ke dalam 0,6 ml Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8))
sebagai campuran untuk SDS-PAGE. Panaskan dalam air mendidih selama
5 menit untuk mendenaturasi.3.3.7.3 Running SDS-PAGERangkai set
alat elektroforesis sesuai petunjuk. Isi kompartemen dengan larutan
buffer elektrode (running buffer; 25 mM Tris, 250 mM glisin dan
0,1% SDS/ stok 5x15,1 g Tris Base, 94 g glisin, 50 ml 10% SDS
ditambahkan aquades hingga volume 100 ml) hingga memenuhi
kompartemen atas dan bawah. Injeksikan sampel protein ke dalam
masing-masing sumur yang terbentuk pada gel. Tutup kompartemen yang
telah dibuat. Hubungkan elektrode pada kompartemen atas dan bawah
pada power supply dengan voltase 40-100 V dan arus listrik 5,0 A.
Hentikan elektroforesis jika warna biru tracking dye (BPB) telah
mencapai sekitar 0,5 cm dari bagian bawah gel.3.3.7.4 Staining dan
Destaining SDS-PAGEAmbil gel dari lempeng kaca pencetak gel dengan
hati-hati. Rendam dalam wadah berisi larutan pewarna (staining
solution; 1 g CBB R250, 450 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades
hingga 100 ml). Gojok secara perlahan hingga larutan pewarna dapat
diikat oleh protein. Cuci dengan larutan pelepas warna (destaining
solution; 100 ml CH3OH, 100 ml CH3COOH, aquades hingg 100 ml) jika
protein tidak terikat pada larutan pewarna hingga pita-pita protein
tampak jelas. Lakukan penggoyangan untuk mempercepat pelepasan
larutan warna.
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil 4.1.1 Penentuan Energi Aktivasi Enzim
endo--1,4-D-xilanasea. SampelPerlakuanHasil
Sampel 300 L+ xylan 300 L (2 tabung eppendorf) Diinkubasi pada
suhu 40C (30 menit) Ditambah 300 L reagen nelson Dipanaskan pada
suhu 100C (10 menit) Ditambahkan arseno Diukur absorbansi (=540
nm)Pengenceran : 400 L pada 3600 L airSampel : berwarna kuningXylan
: tidak berwarna Berwarna kuningBerwarna biruBerwarna kuning
kehijauan
Berwarna biru kehijauan Absorbansi sampel 1 = 0,150Absorbansi
sampel 2 = 0,253
b. KontrolPerlakuanHasil
Sampel 300 L dimasukkan dalam eppendorf dan dipanaskan Ditambah
xylan 300 L Diinkubasi pada suhu 40C (30 menit) Ditambah 300 L
reagen nelson Dipanaskan pada suhu 100C (10 menit) Ditambahkan
arseno Diukur absorbansi (=540 nm)
Berwarna kuning pucat
Tidak berubah Tidak berubah Berwarna biru Berwarna biru lebih
pudar
Larutan berwarna biru tua Absorbansi kontrol 1 = 0,292Absorbansi
kontrol 2 = 0,394
c. Pembuatan Kurva Standar XilosaPerlakuan Hasil
Larutan xilosa (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5) + reagen nelson
Dipanaskan dalam air 100C selama 10 menit Ditambah arsenomolybdat
Diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UVBerwarna
biru
Berwarna kekuningan
Berwarna biru pekat, meletupA0,02 = 0,136A0,04 = 0,159A0,06 =
0,168A0,08 = 0,267A0,10 = 0,394
4.1.2 Fraksinasi Bertingkat 40-50Absorbansi Uji bradfordKontrol
Uji nelson
Sampel fraksinasi 40%0,3930,1720,173
Sampel fraksinasi 40-50% 0,1430,2110,215
4.2 PembahasanPercobaan pertama yaitu unuk menentukan energi
aktivasi enzim endo--1,4-D-xilanase dengan mengenakan perlakuan
yang berbeda antara sampel dan kontrol. Sampel dan kontrol
diletakkan pada tabung yang berbeda. Tabung pertama berisi sampel
300L berwarna kuning dan ditambahkan xylan 100 L. Tabung berisi
sampel bertujuan untuk mengetahui xilosa enzim, substrat dan
aktifitas enzim xilanase. Tabung yang berisi sampel tersebut
kemudian diinkubasi selama 30 menit dengan suhu sekitar 40C. Proses
inkubasi ini digunakan untuk memberikan waktu kepada enzim untuk
menurunkan energi aktivasi. Setelah 30 menit diinkubasi, larutan
ditambahkan 300 L reagen nelson. Penentuan aktivitas enzim
dilakukan dengan mengukur konsentrasi gula pereduksi yang
dihasilkan dari aktivitas enzim menggunakan metode Nelson ini.
Penambahan arseno kemudian dilakukan, hal ini bertujuan untuk
memberikan warna pada larutan agar dapat teranalisis ketika diukur
menggunkan spektrofotometer UV. Hal tersebut sesuai dengan salah
satu syarat larutan dapat diukur menggunakan spektrofotometer UV
yaitu harus berwarna. Pengukuran absorbansi sampel tersebut
dilakukan pada panjang gelombang 540 nm. Nilai adsorbansi yang
dihasilkan oleh dua sampel adalah sebesar 0,160 dan 0,253.
Perlakuan pada tabung kedua yaitu membuat kontrol yang bertujuan
untuk mengetahui uji xilosa enzim dan xilosa substrat. Hal yang
pertama dilakukan adalah sampel sebanyak 300 L dipanaskan dalam
eppendorf, dihasilkan warna sampel berupa kuning pucat. Tujuan
pemanasan ini adalah untuk menonaktifkan enzim dalam sampel agar
tidak dapat bekerja dengan substratnya. Selanjutnya ditambahan
dengan 300 L substrat xylan, dan dipanaskan pada suhu 40C selama 30
menit. Reagen nelson sebanyak 300 L ditambahkan ke dalam eppendorf
yang berisi sampel dan xylan. Penambahan ini membuat campuran yang
mulanya berwarna kuning pucat menjadi berwarna biru. Campuran
kemudian dipanaskan selama 10 menit dalam air panas dengan suhu
100C dan membuat campuran menjadi biru yang memudar. Campuran
tersebut kemudian ditambahkan reagen arseno sebanyak 300 L dan
campuran berubah menjadi biru tua. Kontrol dibuat sebanyak 2 kali
(dilakukan duplo). Selanjutnya, diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 540 nm. Absorbansi
yang dihasilkan adalah 0,292 dan 0,394. Hasil yang didapat
memberikan perbedaan yang signifikan pada masing-masing tabung
yaitu dengan melihat warna larutan dari tiap tabung. Perbedaan
warna tersebut membuat pengukuran absorbansinyanya berbeda pula.
Pada tabung sampel warna larutannya adalah kuning sedangkan tabung
kontrol larutannya berwarna kuning pucat. Perbedaan warna tersebut
terjadi karena pengaruh dari penambahan enzim xilanase pada saat
telah dan belum dipanaskan sehingga mempengaruhi hasil xilosa yang
didapat pada masing-masing tabung. Penambahan enzim xilanase pada
tabung kontrol kemudian dipanaskan membuat aktivitas enzim xilanase
tidak melakukan reaksi-reaksinya, sedangkan pada tabung sampel
sebelum inkubasi sudah ditambahkan enzim xilanase diawal percobaan
dan tidak dilakukan pemanasan sehingga aktivitas enzim xilanase
sudah terjadi dan telah melakukan reaksi hidrolisis terhadap
substrat (xilan). Pemanasan pada kontrol dan sampel tanpa pemanasan
dengan enzim xilanase di dalamnya sangat mempengaruhi warna sampel
dan membuat xilosa yang dihasilkan juga berbeda yaitu dengan
melihat warnanya yang kemudian dapat diukur dengan
spektrofotometer. Enzim xilanase dapat memproduksi 1 mol xilosa per
1 menit, sehingga tabung sampel xilosa yang didapat lebih banyak
dari pada pada tabung kontrol, hal ini disebabkan pada tabung
sampel tidak dilakukan pemanasan dan membuat enzim yang merupakan
protein tidak mengalami denaturasi dan tetap dapat melakukan
aktifitasnya.Pembuatan larutan sampel dan kontrol tersebut
digunakan untuk menentukan energi aktivasi enzim dengan membuat
kurva standar xilosa. Pembuatan kurva standar xilosa dengan membuat
larutan xilosa pada konsentrasi 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/mL.
Masing-masing konsentrasi dari larutan xilosa kemudian ditambah
reagen nelson, selanjutnya larutan dipanaskan selama 10 menit pada
suhu 100C. Tahapan selanjutnya adalah purifikasi parsial enzim
endo--1,4-xilanase. Proses purifikasi ini melalui beberapa tahapan
yaitu fraksinasi amonium sulfat, dialisis yang selanjutnya diuji
protein menggunakan metode bradford dan penentuan berat molekul
menggunakan elektroforesis SDS-PAGE. Tahapan fraksinasi bertujuan
untuk memekatkan enzim. Proses ini menggunakan ekstrak kasar enzim
endo--1,4-D-xilanase yang ditambahkan amonium sulfat. Penambahan
amonium sulfat ini dapat menarik molekul air yang pada awalnya
mensolvasi pada permukaan protein enzim sehingga residu hidrofob
pada permukaan protein terekspose dan menyebabkan protein
mengendap. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya ikatan hidrogen
antara protein dengan air. Semakin banyak jumlah garam yang
ditambahkan maka ikatan hidrogen antara protein dengan air semakin
kecil. Massa amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam sampel
menggunakan perhitungan pada fraksinasi yang digunakan. Fraksinasi
yang digunakan oleh kelompok 6 adalah fraksinasi bertingkat 40-50.
Amonium sulfat yang ditambahkan merupakan 40% dari total sampel
yakni 10 mL sehingga didapatkan jumlah amonium sulfat sebanyak 4
gram. Amonium sulfat ditambahkan sedikit demi sedikit agar cepat
larut dan mengurangi kesedian air yang berinteraksi dengan protein.
Pengadukan juga dilakukan dengan perlahan untuk menghindari
terbentuknya busa yang menandakan bahwa enzim terdenaturasi.
Perlakuan ini tetap dalam suhu rendah (4C) agar enzim
endo--1,4-xilanase tidak terdenaturasi. Amonium sulfat yang telah
larut kemudian disentrifugasi selama 15 menit. Proses ini tidak
didapatkan pelet pada sampel sehingga dilakukan sentrifugasi
kembali selama 2 kali 15 menit. Larutan yang telah disentrifugasi
selama 45 menit tersebut menghasilkan volume 13 mL supernatan tanpa
terbentuk pelet. Peningkatan volume sebanyak 3 mL dalam tabung
tersebut disebabkan adanya pelarutan amonium sulfat dalam
surfaktan. Supernatan selanjutnya diambil volume sebanyak 10 mL
untuk ditambahkan amonium sulfat sebanyak 50% dari total volume
supernatan yang digunakan untuk dilakukan fraksinasi bertingkat.
Penambahan amonium sulfat ini dilakukan sedikit demi sedikit agar
dapat larut dan mengurangi kesedian air yang berinteraksi dengan
protein. Namun, pelarutan pada fraksinasi ini cukup sulit,
dibutuhkan waktu yang lama agar amonium sulfat dapat larut. Amonium
yang sudah larut kemudian disentrifugasi selama 25 menit.
Supernatan yang sudah difraksinasi secara bertingkat (40-50)
seharusnya dilakukan dialisis. Proses dialisis ini untuk
mengantisipasi adanya aktivitas protease yang mungkin ada. Hal ini
perlu dilakukan karena enzim protease mampu merusak struktur enzim
dan dapat menurunkan energi aktivasinya. Proses ini dilakukan pada
suhu 4C dengan memasukkan pelet yang dihasilkan pada proses
fraksinasi kemudian dimasukkan ke dalam kantung dialisis. Kantung
tersebut selanjutnya dimasukkan dalam larutan yang siap diaduk
menggunakan pengaduk magnetik atau stirer. Namun, proses ini tidak
dilakukan karena kantung dialisis yang tidak ada. Reaksi antara
enzim endo--1,4-xilanase dengan substratnya (xilan) menghasilkan
xilosa dan xilooligosakarida. Kemurnian enzim dapat dilakukan uji
menggunakan bradford dan uji nelson. Uji bradford dilakukan untuk
menguji kadar protein yang dihasilkan (xilosa) dan dilakukan uji
menggunakan reagen nelson simogyi untuk menentukan gula
pereduksinya (xilooligosakarida). Aktivitas enzimnya pada
fraksinasi 40 dan fraksinasi bertingkat 40-50 diuji keesokan
harinya. Pengujian aktivitas enzim ini dilakukan dengan mengukur
absorbansi pada masing-masing fraksinasi dan didapatkan absorbansi
pada fraksinasi 40 adalah 0,173 dan 0,215 pada fraksinasi 50.
Pengukuran aktivitas enzim ini diperlukan kontrol sebagai
pembanding sampel. Kontrol dibuat dengan menambahkan enzim pada
tabung eppendorf yang kemudian dipanaskan pada suhu 100C untuk
menonaktifkan enzim. Enzim yang sudah dipanaskan ini kemudian
ditambahkan xylan sebagai substrat dan kemudian diinkubasi,
selanjutnya sampel ditambah dengan reagen nelson. Penambahan nelson
ini bertujuan untuk pengukuran gula pereduksi yang dihasilkan.
Perlakuan selanjutnya sampel dipanaskan dan ditambah dengan arseno
sebanyak 300L sampel teramati berwarna biru tua. Pengukuran dengan
spektrofotometer dan didapatkan hasil absorbansi sebesar 0,712.
Pengukuran absorbansi juga dilakukan setelah proses fraksinasi
bertingkat 50, perlakuan untuk kontrol pada fraksinasi ini sama
dengan perlakuan kontrol pada fraksinasi bertingkat 40 dan
dihasilkan nilai absorbansi sebesar 0,211. Purifikasi enzim
endo--1,4-xilanase ini diukur energi aktivasinya menggunakan cara
yang sama seperti pada sampel crude. Aktivitas enzim yang
didapatkan pada fraksinasi 40 adalah 2,701.10-5 unit/mL dan 2,91.
10-5 unit/mL pada fraksinasi 50. Uji yang dilakukan pada enzim
adalah uji Bradford. Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur
konsentrasi atau kadar protein total dengan metode kolorimetri
dalam suatu larutan. Prinsip pengukuran kadar protein menggunakan
metode Bradford adalah pengikatan pewarna Commassie Brilliant Blue
G-250 yang terdapat dalam pereaksi Bradford dengan protein yang
mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik
(Tirosin, Triptofan dan Fenilalanin) atau bersifat basa (Arginin,
Histidin, dan Leusin) membentuk komplek berwarna biru yang dapat
diukur absorbansinya dengan spektrofotometri (LambertBeer) pada
panjang gelombang 465-595 nm (cahaya tampak).
Gambar 4.1. Struktur Commassie Brilliant Blue (Anam, 2010).
Langkah pertama yang dilakukan dalam pengujian bradford ini
yaitu sampel diambil sebanyak 7 L kemudian ditambahkan dengan 25 L
larutan buffer. Selanjutnya penambahan reagen bradford dilakukan
sebanyak 1 mL, penambahan ini membuat perubahan warna pada sampel
yang terdapat pada eppendorf, yaitu sampel menjadi berwarna biru
tua. Perubahan warna ini didasarkan pada pergeseran absorbansi
pewarna Commassie Brilliant Blue G-250 yang dalam kondisi asam
bentuk merah pewarna diubah menjadi bentuk yang lebih biru untuk
mengikat protein yang sedang diuji. Kompleks warna biru pada
larutan yang diberi reagen Bradford terjadi sangat cepat terbentuk
dan bersifat stabil. Kestabilan warna biru Commassie Brilliant Blue
G-250 ini karena adanya interaksi antara lapisan hidrofobik dari
protein dengan bentuk anion dari zat warna Coomassie Brilliant Blue
G-250 yang menstabilkan bentuk anion tersebut, sehingga jumlah saat
ini yang kompleks dalam larutan adalah ukuran untuk konsentrasi
protein, dan dapat diperkirakan dengan menggunakan pembacaan
absorbansi.Proses selanjutnya yaitu dilakukannya proses inkubasi
selama 2-5 menit, proses ini merupakan tahap dimana enzim akan
melakukan aktivitasnya, dengan kata lain hal ini merupakan
pemberian waktu unutk enzim dalam melakukan aktivitas. Langkah
berikutnya yaitu pengukuran absorbansi yang dilakukan dengan
menggunakan alat spektrofotometer UV Vis, yaitu alat yang digunakan
untuk analisis kuantitatif farmasi yang memiliki prinsip radiasi
pada rentang panjang gelombang 200-700 nm yang dilewatkan melalui
suatu larutan senyawa. Elektron-elektron pada ikatan di dalam
molekul menjadi tereksitasi sehingga menempati keadaan kuantum yang
lebih tinggi dan dalam proses penyerapan sejumlah energi yang
melewati larutan tersebut. Pengukuran dengan spektrofotometer dapat
dilakukan karena larutan menghasilkan warna berupa biru tua
sehingga dapat dideteksi oleh alat tersebut pada panjang gelombang
595 nm. Hasil absorbansi yang didapatkan pada sampel 1 dan 2 adalah
0,686 dan 0,653. Penentuan kadar protein xilanase dapat dilakukan
dengan menggunakan kurva standar bovine serum albumin (BSA).
Pembuatan bovine serum albumin (BSA) dilakukan dengan membuat
variasi konsentrasi BSA di dalam 50 mM larutan dapar Tris-HCl pH 9.
Setiap variasi konsentrasi standar BSA diambil sebanyak 50 L
kemudian dicampurkan dengan 2,5 mL larutan bradford dalam tabung
reaksi. Larutan yang telah divampur kemudian dihomogenkan dengan
vorteks, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. Kurva
standar BSA adalah grafik hubungan konsentrasi protein standar (BSA
dengan variasi konsentrasi) dengan nilai absorbansi pada panjang
gelombang 595 nm. Persamaan garis dapat diperoleh dari hasil plot
konsentrasi 0,01; 0,015; 0,02; 0,025; 0,03 terhadap nilai
absorbansi dari masing-masing konsentrasi tersebut yaitu 0,345;
0,497; 0,571; 0,620; 0,677 yaitu y 15,74x + 0,2272 dengan nilai
regresi sebesar 0,9387. Penentuan kadar protein dapat diperoleh
dengan memasukkan nilai absorbansi dari sampel kedalam persaman
garis, sehingga menghasilkan konsentrasi sampel 1 dan 2 yang telah
dirata-rata absorbansinya yaitu 0,028 mg/mL. Keuntungan dari metode
ini adalah pereaksi yang digunakan sangat sederhana dan mudah
disiapkan, nilai akurasi dan presisi data yang didapatkan cukup
tinggi serta untuk menjamin keakuratan data sampel yang berada di
luar jangkauan dapat dilakukan uji ulang yang hanya membutuhkan
beberapa menit saja. Hal itu membuat keefektifan kerja sangat cepat
(Septiningrum dan Moeis, 2008).Perlakuan berikutnya yaitu melakukan
uji nelson. Perlakuan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas
enzim yang dapat dilakukan dengan mengukur gula pereduksi dari
sampel. gula pereduksi yang dihasilkan pada reaksi antara enzim
endo--1,4-D-xilanase dengan substrat xilan menghasilkan gula
pereduksi xilooligosakarida. Sampel yang telah difraksinasi
bertingkat 40%-50% diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV dan dihasilkan absorbansi pada fraksinasi 40%
adalah 0,17 sedangkan absorbansi pada fraksinasi bertingkat 50%
adalah 0,215. Hasil tersebut menunjukkan bahwa semakin besar gula
pereduksi yang dihasilkan maka absorbansi yang dihasilkan juga
semakin besar pula dengan kata lain gula pereduksi yang dihasilkan
menggunakan fraksinasi bertingkat 50% lebih banyak dibandingkan
pada fraksinasi 40%.Uji kemurnian selanjutnya adalah penentuan
berat molekul enzim endo--1,4-D-xilanase dengan elektroforesis
protein SDS-PAGE. Uji kemurnian bergantung terhadap aktifitas enzim
xilanase yang optimum. Penentuan berat molekul enzim dilakukan
dengan langkah-langkah berikut yaitu, enzim ditambahkan larutan
buffer sampel sebagai campuran SDS-PAGE, lalu dipanaskan dalam air
mendidih selama 5 menit untuk mendenaturasi enzim. Sampel tersebut
lalu diletakkan pada sumur-sumur pada sisir yang terdapat pada
lapisan gel atas, kemudian dirunning selama 5 jam (kira-kira 0,5 cm
dari gel terbawah).Proses yang dilakukan setelah running adalah
staining dan destaining. Proses staining ini adalah proses
pewarnaan pada protein pada enzim agar garis pada gel yang
dihasilkan pada proses staining dapat teramati. Proses destaining
adalah pencucian warna yang telah dilakukan sehingga akan nampak
bedanya antara garis yang menunjukkan berat molekul enzim dengan
gelnya. Namun, hasil yang diperoleh menunjukkan tidak adanya garis
pada gel-gel dalam sumur tersebut. Hal tersebut diakibatkan karena
proses staining atau pewarnaan yang berlebih sehingga mengakibatkan
pencucian (destaining) tidak dapat dilakukan secara optimal.
BAB 5. PENUTUP
5.1 Kesimpulan Adapun kesimpulan pada percobaan isolasi enzim
adalah 1. Penentuan aktivitas enzim dapat dilakukan menggunakan
crude dengan uji bradford menggunakan sampel dan xilosa terhadap
kontrol. 2. Berat molekul enzim Endo--1,4-D-Xilanase tidak
menunjukkan hasil yang seharusnya. 3. Kemampuan suatu senzim
endo--1,4-D-xilanase menghasilkan 1,12.10-3 unit/mL xilosa pada
suhu 40C dengan suhu 30 menit4. Energi aktivasi enzim pada
fraksinasi 40% adalah 2,701. 10-5 unit/mL dan fraksinasi bertingkat
40-50% adalah 2,91. 10-5 unit/mL.5. Konsentrasi protein yang
dihasilkan pada penentuan kadar protein enzim adalah 0,028
mg/mL.
5.2 SaranSaran yang dapat diberikan pada percobaan ini adalah
praktikan dapat melakukan kegitan praktikum secara lengkap agar
tahu dan paham proses yang seharusnya. Selain itu, pemberian warna
pada proses staining seharusnya diberikan dalam jumlah yang tidak
terlalu banyak.
DAFTAR PUSTAKA
Anam, Khoirul. 2010. Bioteknologi. Bandung : Institut Teknologi
Bandung.Anonim. 2014. Kloning Dan Overekspresi Gen
Beta-Endoxylanase Asal Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap
Tanah Dan Produksi Xilooligosakarida sebagai Produsen Prebiotik.
[Serial Online].http://repository.unej.ac.id/
bitstream/handle/123456789/1042/hbAnak%20Agung%20Istri%20Ratnadewi.
pdf?sequence=1. [diakses 12 November 2014].Collins, Gerday, dan
Feller. Fems Microbiol. Rev. (2005) 29:3-23Kim, J., Kim, S.C &
Nam, S.W. 2000. Constitutive overexpression of the endoxylanase
gene in Bacillus subtilis. J Microbiol Biotechnol 10:
551-553.Meryandini, Widhyastuti, dan Lestari. 2008. Pemurnian Dan
Karakterisasi Xilanase Streptomyces Sp. Skk1-8. Jurnal Natur
Indonesia 14(3), Juni 2012: 199-204. ISSN 1410-9379.Rifaat, H.M.,
Nagieb, Z.A & Ahmed, Y.M. 2005. Production of xylanases by
Streptomyces species and their bleaching effect on rice straw pulp.
App Ecol env Res 4(1): 151-160.Septiningrum, Krisna Dan Moeis,
Maelita. 2008. Isolasi Dan Karakterisasi Xilanase dari Bacillus
Circulans. Bandung : ITB.Sirait, S. 2003. Bleaching Toba Samosir.
Sumatera Utara : PT. Toba Pulp Lestari, Training and Development
Centre.Subramaniyan, dan Prema. 2002. Biotechnol Critical Rev.
22(1):33-46. Susilowati, Raharjo, Kurniawati,Rahim, Sumarlin, dan
Ardiansyah. 2002. Produksi Xilanase Dari Isolat Sumber Air Panas
Sonai, Sulawesi Tenggara Menggunakan Limbah Pertanian. Sulawesi
Tenggara : Universitas Haluoleo.Thenawijaya, Maggy. 1992.
Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta : Erlangga. Tim Penyusun.
2014. Penuntun Praktikum Biokimia. Jember : Universitas Jember.
Lampiran 1. Menghitung Energi Aktivasi a.
CrudeKonsentrasiAbsorbansi
0,020,136
0,040,159
0,060,168
0,080,267
0,10,394
y = 3,12x + 0,037 R2 = 0,849Absorbansi sampel 1 =
0,160Absorbansi sampel 1 = 0,253Absorbansi rata-rata = =
0,2065Absorbansi kontrol = 0,343U/ml = = = 1,12. 10-3 unit/mL
2. Fraksinasi Bertingkat 40-50%a. Fraksinasi 40%Absorbansi
kontrol = 0,172Absorbansi sampel = 0,173
U/ml = = = 2,701. 10-5 unit/mL
b. Fraksinasi bertingkat 50%Absorbansi sampel = 0,215Absorbansi
kontrol = 0,211
U/ml = = = 2,91. 10-5 unit/mL
3. Menghitung Kadar Protein KonsentrasiAbsorbansi
0,010,345
0,0150,497
0,020,571
0,0250,62
0,030,677
Absorbansi sampel 1 = 0,686Absorbansi sampel 2 = 0,653Absorbansi
rata-rata = = 0,670y = 15,74x + 0,2272R = 0,9387Konsentrasi protein
yang didapatkan adalah y = 15,74x + 0,22720,670 = 15,74x +
0,22720,443 = 15,74xx = = 0,028 mg/mL