Entwicklung und Charakterisierung bispezifischer Antikörper-Derivate zur Immuntherapie CD19-positiver Leukämien und Lymphome Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Christian Kellner aus Nürnberg
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Entwicklung und Charakterisierung bispezifischer ... · 2.3.3 Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate 26 2.3.4 Limitierungen rekombinanter bispezifischer Antikörper-Derivate
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Entwicklung und Charakterisierung
bispezifischer Antikörper-Derivate zur Immuntherapie
CD19-positiver Leukämien und Lymphome
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Christian Kellner
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juni 2008
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. G. H. Fey
Zweitberichterstatter: PD Dr. B. Stockmeyer
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis Seite
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
1.1 Abstract 1
1.2 Zusammenfassung 2
2 EINLEITUNG 3
2.1 Lymphome und Leukämien 3
2.1.1 Lymphome und Leukämien der B-Zellreihe 4
2.1.1.1 Hodgkin-Lymphome 5
2.1.1.2 Non-Hodgkin-Lymphome 6
2.1.1.3 Chronische lymphozytische Leukämie der B-Zellreihe (B-CLL) 8
2.1.1.4 Akute lymphoblastische Leukämie der B-Zellreihe (B-ALL) 11
2.4.1 Auswahl der Effektorzellpopulation durch Wahl der Zielstruktur 31
2.4.2 Der Fcγ-Rezeptor III (CD16) auf NK-Zellen und Makrophagen 32
2.5 Zielstrukturen auf Tumorzellen für eine Antikörper-basierte Therapie 33
2.5.1 Allgemeine Anforderungen für Zielantigene auf Tumorzellen 33
2.5.2 Zielstrukturen auf B-lymphoiden Neoplasien 34
2.5.3 CD19 als Zielstruktur zur Immuntherapie B-lymphoider Neoplasien 36
Inhaltsverzeichnis
II
3 PROBLEMSTELLUNG 38
4 ERGEBNISSE 39
4.1 Herstellung und Charakterisierung rekombinanter bispezifischer
Fab-scFv Fusionsproteine gegen CD19 und CD16 39
4.1.1 Konstruktion der Expressionsvektoren für den bstb [Fab19xds19xds16]
und den bsbb [Fab19xds16] 39
4.1.2 Expression und Aufreinigung des bstb [Fab19xds19xds16] und des
bsbb [Fab19xds16] 42
4.1.3 Analyse der Bindungseigenschaften des bstb [Fab19xds19xds16] und
des bsbb [Fab19xds16] 43
4.1.4 Analyse der Bindungsstärken des bstb [Fab19xds19xds16] und des
bsbb [Fab19xds16] 46
4.1.4.1 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD) 46
4.1.4.2 Bestimmung der Retentionszeit auf Antigen-positiven Zellen in vitro 47
4.1.5 Bestimmung der Stabilität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] in humanem Serum in vitro 49
4.1.6 Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den
bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] in vitro 50
4.1.6.1 Analyse der Antigen-spezifischen zellulären-Zytotoxizität des bstb
[Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] 51
4.1.6.2 Vergleichende Analyse des ADCC-Potentials der Antikörper-Derivate
bstb [Fab19xds19xds16], bsbb Fab[19xds16] und bsscFv [19x16] 53
4.1.6.3 Zytotoxische Aktivität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] gegenüber primären Tumorzellen 55
4.2 Herstellung und funktionelle Charakterisierung des bispezifischen
single-chain Fv triple-bodys ds[19x16x19] 57
4.2.1 Herstellung eines Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] 57
4.2.2 Bindungsstudien mit dem trispezifischen sctb [33xds16xds19] zur
Analyse der Funktionalität des single-chain Fv triple-body Formats 58
4.2.3 Eukaryotische Expression und Aufreinigung des sctb ds[19x16x19] 60
4.2.4 Analyse der Bindungseigenschaften des sctb ds[19x1619] 61
4.2.5 Vergleich der Bindungsstärken des sctb ds[19x16x19] und des
bsscFv ds[19x16] 63
Inhaltsverzeichnis
III
4.2.5.1 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD) 63
4.2.5.2 Kompetitive Inhibition des parentalen CD19 Antikörpers 64
4.2.5.3 Bestimmung der Zelloberflächenretention in vitro 66
4.2.6 Bestimmung der Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv
ds[19x16] in humanem Serum in vitro 67
4.2.7 Bestimmung der Plasmaretention des sctb ds[19x16x19] und des
bsscFv ds[19x16] in Mäusen 68
4.2.8 Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den
sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] 70
4.2.8.1 Nachweis der Antigen-spezifischen Induktion der zellulären Zytotoxi-
zität durch den sctb ds[19x16x19] 70
4.2.8.2 Vergleichende Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxi-
zität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] 72
4.2.8.3 Zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16]
gegen primäre Leukämie- und Lymphomzellen 74
5 DISKUSSION 78
6 MATERIAL UND METHODEN 91
6.1 Materialien 91
6.1.1 Chemikalien und Enzyme 91
6.1.2 Allgemeine Puffer und Lösungen 91
6.1.3 Vektoren 91
6.1.4 Oligonukleotide 91
6.1.5 Bakterienstämme 93
6.1.6 Zellkulturmedien 93
6.1.7 Zelllinien 93
6.1.8 Mäuse 94
6.1.9 Antikörper 94
6.2 Methoden 95
6.2.1 Allgemeine Methoden 95
6.2.2 Klonierungen 95
6.2.2.1 Herstellung der Expressionsvektoren für die bispezifischen Fab-scFv
Fusionsproteine 95
Inhaltsverzeichnis
IV
6.2.2.2 Herstellung der Expressionsvektoren für die scFv triple-bodies 97
6.2.3 Expression der rekombinanten Antikörper-Derivate und der GFP- und
RFP- Fusionsproteine in 293T Zellen 98
6.2.4 Aufreinigung monoklonaler Antikörper aus Hybridomen 99
6.2.5 SDS-PAGE und Western-Transfer Experimente 99
6.2.6 Durchflusszytometrische Methoden 99
6.2.6.1 Nachweis der spezifischen und simultanen Bindung 100
6.2.6.2 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD) 100
6.2.6.3 Bestimmung der Serumstabilität in vitro 101
6.2.6.4 Bestimmung der Zelloberflächenretention in vitro 101
6.2.6.5 Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G7 102
6.2.7 Bestimmung der Plasmaretention in Mäusen 102
6.2.8 Isolierung mononukleärer Zellen (MNCs) 102
6.2.9 Zytotoxizitätsexperimente 103
6.2.10 Graphische Auswertung und statistische Analysen 103
7 LITERATUR 105
8 WEITERE INFORMATIONSQUELLEN UND INTERNETSEITEN 121
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 122
10 EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN 124
Inhaltsverzeichnis
V
Verzeichnis der Abbildungen Seite
Abbildung 1: Prozentualer Anteil der häufigsten Krebsformen an allen Krebs- neuerkrankungen in Deutschland 2004 3 Abbildung 2: Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper 16 Abbildung 3: Antikörper als Vehikel 18 Abbildung 4: Struktur eines monoklonalen IgG Antikörpers und klassische For- mate bispezifischer Antikörper 25 Abbildung 5: Formate rekombinanter bispezifischer scFv Antikörper-Derivate 27 Abbildung 6: Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate mit Dimerisie- rungsdomänen 29 Abbildung 7: Stadienspezifische Expression von Differenzierungsantigenen in der B-Zell-Entwicklung 35 Abbildung 8: Konstruktion der bispezifischen Fab-scFv Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16] 40 Abbildung 9: Spezifischer Nachweis der Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16] nach Aufreinigung 43 Abbildung 10: Spezifische Bindung der Fab-scFv Fusionsproteine 44 Abbildung 11: Simultane Antigenbindung der bispezifischen Fab-scFv Fusionen 46 Abbildung 12: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für den bstb [Fab19xds19xds16] und den [bsbb [Fab19xds16] 47 Abbildung 13: Zelloberflächenretention der Fab-scFv Fusionsproteine 48 Abbildung 14: Stabilität der Fab-scFv Fusionsproteine in humanem Serum 50 Abbildung 15: Antigen-spezifische Induktion der Zielzelllyse durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] 52 Abbildung 16: Einfluss des E:T Verhältnisses auf die durch den bstb [Fab19xds19xds16] oder den bsbb [Fab19xds16] vermittelte Lyse 53 Abbildung 17: Dosis-abhängige ADCC durch den bstb [Fab19xds19xds16], den bsbb [Fab19xds16] und den bsscFv ds[19x16] 54
Inhaltsverzeichnis
VI
Abbildung 18: ADCC gegenüber primäre Tumorzellen durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] 56 Abbildung 19: Schema des Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] 58 Abbildung 20: Nachweis der spezifischen Bindung des sctb [33xds16xds19] an Antigen-positive Zellen 59 Abbildung 21: Analyse der simultanen Bindefähigkeit des sctb [33xds16xds19] 60 Abbildung 22: Aufreinigung und Nachweis des sctb ds[19x16x19] 61 Abbildung 23: Spezifische und simultane Bindung des sctb ds[19x16x19] 62 Abbildung 24: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten KD für den sctb ds[19x16x19] und den bsscFvs ds[19x16] 64 Abbildung 25: Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G7
durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] 65 Abbildung 26: Bestimmung der in vitro Zelloberflächenretention des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] 66 Abbildung 27: Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in humanem Serum bei 37°C 69 Abbildung 28: Vergleich der Plasmaverweildauer des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in Mäusen 69 Abbildung 29: Antigen-spezifische Induktion der ADCC durch den sctb ds[19x16x19] 71 Abbildung 30: Zytotoxizität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] in Abhängigkeit des E:T Verhältnisses 72 Abbildung 31: Dosis-abhängige Vermittlung der Lyse humaner Tumorzellli- nien durch den sctb ds[19x16x19] und der bsscFv ds[19x16] 73 Abbildung 32: Vermittlung der ADCC gegen primäre Leukämie- und Lymphom- zellen durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] 75 Abbildung 33: Dosis-abhängige ADCC durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] gegen primäre Tumorzellen 76
Inhaltsverzeichnis
VII
Verzeichnis der Tabellen Seite
Tabelle 1: Einteilung, Ursprung und relative Häufigkeiten B-lymphatischer Neo- plasien 5 Tabelle 2: Stadieneinteilung der B-CLL nach Rai und Binet 9
Tabelle 3: Chromosomale Aberrationen und assoziierte Prognosen bei der B-CLL 10 Tabelle 4: Klassifizierung akuter lymphoblastischer Leukämien der B-Zellreihe 11
Tabelle 5: Zugelassene Antikörper in der Krebstherapie (Stand: 2007) 21 Tabelle 6: Effektorzellen des Immunsystems, trigger-Moleküle und aktivieren-
de Zytokine 32 Tabelle 7: Bindungseigenschaften und Zytotoxizität der bispezifischen Antikörper-Derivate 55
Tabelle 8: EC50-Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit CD19-positiven Zelllinien 74
Tabelle 9: EC50 Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit primären B-CLL Zellen 77 Tabelle 10: Übersicht über verwendete Oligonukleotide 92
Tabelle 11: Übersicht über die verwendeten Zelllinien 93
Tabelle 12: Übersicht über die verwendeten Antikörper 94
Zusammenfassung
1
1 Zusammenfassung
1.1 Abstract
Bispecific antibodies are attractive agents for therapy of cancer and have been gene-
rated against different combinations of tumor antigens and trigger molecules on ef-
fector cells. Redirecting Natural Killer (NK) cells against leukemias and lymphomas is
promising, as demonstrated by a bispecific single-chain fragment variable (bsscFv)
against the tumor antigen CD19 and the trigger molecule CD16 (FcγRIII). However,
monovalent targeting and almost equal equilibrium constants (KD) for binding to
CD19 (KD = 42 nM) and to CD16 (KD = 56 nM) were considered unfavorable for tu-
mor-site specific retention and cytotoxicity.
Therefore, novel bispecific proteins with increased functional affinity for CD19 were
designed. A bispecific bibody was generated by genetically fusing a CD19-directed
fragment antigen binding (Fab) with a single-chain fragment variable (scFv) specific
for CD16. By extension of this molecule with a CD19-directed scFv, a bispecific tribo-
dy was obtained, now being bivalent for CD19 and monovalent for CD16. The tribody
displayed 3-fold greater avidity for CD19 (KD = 8 nM) than the bibody (KD = 23 nM)
and equal affinity for CD16 (KD = 57 nM). Both the tribody and the bibody induced
ADCC against human leukemia-derived cell lines and primary cells from tumor pa-
tients with human mononuclear cells (MNCs) as effectors. The tribody displayed half-
maximum effective concentrations (EC50) of 55 pM, and promoted equal antibody-
dependent cellular cytotoxicity (ADCC) at 6- and 12-fold lower concentrations than
the bibody and the bsscFv, respectively. Based on these findings a novel format was
designed, a scFv triple-body (sctb), consisting of one polypeptide chain with three
scFvs connected in tandem. The two distal scFvs were specific for CD19, and the
central scFv was directed against CD16. The sctb demonstrated 3-fold greater avidity
for CD19 than the bsscFv (KD = 13 nM) and had equal affinity for CD16 (KD = 58 nM).
The sctb induced ADCC against tumor cell lines and primary malignant cells at 10- to
40-fold lower EC50 than the bsscFv and therefore constituted a major improvement.
In summary, converting CD19 and CD16 directed bispecific antibody-derivatives into
bivalent targeting formats resulted in enhanced cytotoxicity. With EC50 in the low pi-
comolar range, both the sctb and the tribody represent attractive candidates for
further evaluation towards clinical studies.
Zusammenfassung
2
1 Zusammenfassung
Bispezifische Antikörper sind attraktive Wirkstoffe für die Krebstherapie und wurden
gegen verschiedene Kombinationen von Tumorantigenen und trigger Molekülen auf
Effektorzellen hergestellt. Die Rekrutierung von Natürlichen Killer (NK) Zellen gegen
Leukämien und Lymphome ist viel versprechend, wie ein bispezifisches single-chain
fragment variable (bsscFv) gegen das Tumorantigen CD19 und das trigger Molekül
CD16 (FcγRIII) zeigte. Jedoch wurden das monovalente Anvisieren der Tumorzellen
und die fast identischen Gleichgewichtskonstanten (KD) für CD19 (KD = 42 nM) und
CD16 (56 nM) als ungünstig für eine Tumor-spezifische Anreicherung und für die Zy-
totoxizität erachtet.
Daher wurden neue bispezifische Proteine mit höherer funktionaler Affinität für CD19
entwickelt. Ein bispezifischer bibody wurde durch Fusion eines fragment antigen bin-
ding (Fab) gegen CD19 mit einem single-chain fragment variable (scFv) gegen CD16
hergestellt. Durch Erweiterung dieses Moleküls um einen CD19-gerichteten scFv
wurde ein bispezifischer tribody erhalten, der nun bivalent für CD19 und monovalent
für CD16 war. Der tribody besaß eine 3-fach höhere Avidität für CD19 (KD = 8 nM)
als der bibody (KD = 23 nM) und eine gleich hohe Affinität für CD16 (KD = 57 nM). So-
wohl der tribody als auch der bibody induzierten Antikörper-vermittelte zelluläre Zyto-
toxizität (ADCC) gegen Leukämie-abgeleitete Zelllinien und primäre Zellen von Tu-
morpatienten mit mononukleären Zellen (MNCs) als Effektoren. Der tribody wies eine
halbmaximale effektive Konzentration(EC50) von 55 pM auf und vermittelte gleich
starke ADCC in 6- bzw. 12-fach niedrigeren Konzentrationen als der bibody und der
bsscFv. Darauf aufbauend wurde mit dem scFv triple-body (sctb) ein neues Format
entwickelt, welches drei scFvs innerhalb einer Polypeptidkette in tandem verknüpfte.
Die distalen scFvs waren spezifisch für CD19, der zentrale für CD16. Gegenüber
dem bsscFv zeigte der sctb eine 3-fach höhere Avidität für CD19 (KD = 13 nM) und
eine vergleichbare Affinität für CD16 (KD = 58 nM). Der sctb vermittelte ADCC gegen
humane Tumorzelllinien und primäre maligne Zellen in 10- bis 40-fach niedrigeren
Konzentrationen als der bsscFv und repräsentiert somit eine wichtige Verbesserung.
Zusammenfassend führte die Konvertierung CD19- und CD16-gerichteter bispezifi-
scher Antikörper-Derivate in bivalent-anvisierende Formate zu einer gesteigerten Zy-
totoxizität. Mit EC50-Werten in niedrig-picomolaren Bereichen stellen der sctb als
auch der tribody attraktive Kandidaten für eine Weiterentwicklung in Richtung klini-
scher Studien dar.
Einleitung
3
2 Einleitung
2.1 Lymphome und Leukämien
Krebs ist mit etwa 200 000 Todesfällen pro Jahr die zweithäufigste Todesursache
nach Herz- und Kreislauferkrankungen in Deutschland. Insgesamt erkranken jährlich
230 500 Männer und 206 000 Frauen an Krebs. Mit einem Anteil von jeweils über
25% stellen der Prostatakrebs bei Männern und der Brustkrebs bei Frauen die häu-
figsten Krebsformen dar (Abbildung 1). Hämatologische Neoplasien, die grob in Leu-
kämien und Lymphome untergliedert werden, liegen bei Männern und Frauen mit je-
weils ca. 5% an fünfter Stelle der Krebsneuerkrankungen. Im Jahr 2004 erkrankten
23 670 Erwachsene erstmals an einem Lymphom oder einer Leukämie.
Abbildung 1: Prozentualer Anteil der häufigsten Krebsformen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland 2004. Leukämien und Lymphome liegen bei Männern und Frauen mit jeweils 5,5% an fünfter Stelle der Häufigkeitsverteilung. Abgewandelt nach: Krebs in Deutschland, Robert Koch Insti-tut, 2008.
Der Anteil an Kindern unter allen Krebserkrankten beträgt weniger als 1%. Mit etwa
1.800 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland tritt Krebs mit einer Inzidenz von 14
pro 100 000 Kinder unter 15 Jahren auf und ist die zweithäufigste Todesursache.
Das Diagnosespektrum bei Kindern unterscheidet sich generell von dem bei Erwach-
senen. So ist die relative Häufigkeit der hämatologischen Neoplasien bei Kindern
deutlich höher, wobei Leukämien mit 34,1% die häufigste und Lymphome mit 11,8%
Einleitung
4
die dritthäufigste Krebserkrankung darstellen (Krebs in Deutschland, Robert Koch
Institut, 2008).
Leukämien und Lymphome entstehen durch eine unkontrollierte Proliferation maligne
entarteter Zellen des blutbildenden Systems. Die Einteilung nach Linienzugehörigkeit
und Differenzierungsstadium der entarteten Zellen folgt der Klassifikation der World
Health Organization (WHO) und bezieht klinische, morphologische und immunophä-
notypische, aber auch molekulargenetische Merkmale der Tumorzellen ein (Harris et
al, 1999; Jaffe et al, 2001). Lymphome entwickeln sich aus maligne entarteten, in der
Regel bereits differenzierten Lymphozyten in den sekundären lymphatischen Orga-
nen wie den Lymphknoten oder der Milz. Lymphome werden nach histologischen
Gesichtspunkten in Hodgkin-Lymphome und Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) unter-
teilt. Die malignen Zellen können sowohl der B-Zell-, oder deutlich seltener, der T-
Zellreihe entstammen. Je nach Verlauf der Erkrankung werden chronische oder
aggressive Formen unterschieden. Im Gegensatz dazu entstehen Leukämien typi-
scherweise im Knochenmark, meist aus nicht, oder nur schwach ausdifferenzierten
Vorläuferzellen der myeloischen oder der lymphatischen Linie. Nach Linienzugehö-
rigkeit und weiterem Verlauf erfolgt eine Einteilung in akute myeloische Leukämie
(ALL), oder chronische lymphozytische Leukämie (CLL). Wie Lymphome können
auch die lymphatischen Leukämien immunophänotypisch der B- oder der T-Zellreihe
zugeordnet werden.
2.1.1 Lymphome und Leukämien der B-Zellreihe
Die Neoplasien der B-Zellreihe leiten sich von B-lymphoiden Zellen unterschiedlicher
Differenzierungsgrade ab, wodurch die hohe Heterogenität unter diesen Erkrankung-
en erklärt wird. Insbesondere die Lymphome können in eine Vielzahl verschiedener
Subtypen eingeteilt werden (Tabelle 1). Die genaue Abgrenzung zwischen Leukä-
mien und Lymphomen verläuft dabei zum Teil fließend. So wird zum Beispiel die CLL
aufgrund ihres Ursprungs als indolentes NHL eingestuft, verläuft aber durch eine
sehr frühzeitige Ausschwemmung der entarteten Zellen ins Blut primär leukämisch.
Eine Unterscheidung aggressiver Non-Hodgkin-Lymphome von akuten lymphoblasti-
schen Leukämien erfolgt nach dem Ausmaß einer Infiltration des Knochenmarks mit
Einleitung
5
malignen Zellen. Überschreiten diese einen Wert von 25%, so handelt es sich um ei-
ne akute lymphoblastische Leukämie.
Tabelle 1: Einteilung, Ursprung und relative Häufigkeit B-lymphatischer Neoplasien
*relative Häufigkeit unter B-Zell Lymphomen bei Erwachsenen in Europa und den USA. GC, Keimzen-trum (germinal center). Abgewandelt nach: Küppers et al., 2005.
2.1.1.1 Hodgkin-Lymphome
Hodgkin-Lymphome stammen in 95% der Fälle von einer entarteten reifen B-Zelle
des Keimzentrums der Lymphknoten ab und sind charakterisiert durch die Bildung
der Hodgkin- oder Reed Sternberg Zellen. Mit einer Inzidenz von 2-3 pro 100 000
Einwohner ist das Hodgkin-Lymphom eine relativ seltene Krankheit bei Erwachsenen
(0,5% aller jährlichen Krebsneuerkrankungen). Bei Kindern beläuft sich die relative
Häufigkeit unter allen Krebsarten auf 4,8% bei einer Inzidenz von 0,7 pro 100 000
(Krebs in Deutschland, Robert Koch Institut, 2008). Hodgkin-Lymphome werden
nach histologischen Merkmalen weiter in das klassische Hodgkin-Lymphom (95% der
Fälle) und das seltenere noduläre Lymphozyten-prädominante Hodgkin-Lymphom
A Hb > 10,0 g/dL, Thrombozytenzahl normal und < 3 vergrößerte Lymph-knotenregionen*
I Lymphozytose und Lymphadenopathie
II Lymphozytose und Hepatomegalie und/oder Splenomegalie
B Hb >10,0 g/dL, Thrombozytenzahl normal und ≥ 3 vergrößerte Lymph-knotenregionen
III Lymphozytose und Anämie (Hb < 11,0 g/dL)
IV Lymphozytose und Thrombozytopenie
< 100 000/mm3 mit oder ohne Anämie,
Lymphadenopathie und Organomega-lie
C Hb > 10,0 g/dL und/oder Thrombo-zytenzahl 100 000 x 109/L unab-hängig von der Zahl vergrößerter Lymphknotenregionen
*Zervikale und axilläre, inguinale Lymphknoten uni- oder bilateral sowie Leber- und Milzvergröße-rungen gelten als je eine Region. Hb, Hämoglobin. Nach: Rai et al, 1975 und Binet et al,1981.
Weitere prognostische Faktoren liefern zytogenetische Analysen (Tabelle 3; Dohner
et al, 2000). Häufigste zytogenetische Anomalie ist die Deletion 13q14, die in ca.
55% der Fälle nachzuweisen ist und mit einer günstigen Prognose assoziiert ist. Das
in diesem Genomabschnitt vermutete tumor suppressor Gen ist bis heute nicht ein-
deutig identifiziert (Kalachikov et al, 1997; Liu et al, 1997). Die Deletion 17p13 führt
zum Verlust des tumor suppressor Gens p53 und ist dagegen mit einer schlechten
Einleitung
10
Prognose assoziiert. Weitere ungünstige prognostische Faktoren sind u.a. eine Ex-
pression von CD38, das Fehlen von Hypermutationen in Genen der variablen
Immunglobulinregionen (IgV) und eine kurze Lymphozytenverdopplungszeit von
unter zwölf Monaten.
Tabelle 3: Chromosomale Aberrationen und assoziierte Prognosen bei der B-CLL*
*Untersuchung beruht auf der Analyse von 343 Patienten. Abgewandelt nach: Dohner et al, 2000.
Patienten im Binet Stadium A sind in der Regel symptomlos und müssen nicht be-
handelt werden (Oduncu et al, 2004). Bei Krankheitsprogression oder einer ent-
sprechenden Prognose werden mit Purinanaloga (Fludarabin) verabreicht. Mit dieser
Behandlung konnten zwar in vielen Fällen Komplettremissionen erzielt werden, ob je-
doch die Überlebensrate erhöht wird ist derzeit noch unklar. In fortgeschrittenen Sta-
dien (Binet B und C) werden standardmäßig die Alkylantien Chlorambucil oder Cyclo-
phosphamid eingesetzt, wobei die Ansprechrate 40–70% beträgt. Komplette Re-
missionen werden allerdings, wie auch mit Polychemotherapie nach verschiedenen
Standardprotokollen, selten erreicht (CLL Trialists´Collaborative Group, 1999). Durch
eine Kombinationsbehandlung mit Fludarabin, Cyclophosphamid und Mitoxantron
konnte eine gute Gesamtansprechrate von 67% bei Patienten im Rezidiv und eine
hohe Quote an kompletten Remissionen (50%) erzielt werden, die auch molekulare
Remissionen umfasste (Bosch et al, 2002). Aufgrund des hohen Risikos wird eine
Hochdosis-Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation nur bei Pati-
enten mit hohem Progressionsrisiko, die jünger als 60 Jahre sind und einen guten
Allgemeinzustand haben, durchgeführt (Dreger et al, 2003; Schetelig et al, 2003). In
solchen Fällen konnten verringerte Rückfallquoten erzielt werden. Ob dies zu einer
höheren Überlebensrate beitragen kann wird derzeit untersucht. Als alternativer
Ansatz werden auch therapeutische Antikörper wie der gegen CD52-gerichtete An-
tikörper Alemtuzumab (Campath®) mit in die Therapieprotokolle integriert und in
Kombination mit Chemotherapeutika verabreicht (Alinari et al, 2007).
2.1.1.4 Akute lymphoblastische Leukämie der B-Zellreihe (B-ALL)
Akute lymphatische Leukämien (ALL) treten bei Erwachsenen mit einer Inzidenz von
1 pro 100 000 Einwohner eher selten auf, wobei das mittlere Erkrankungsalter zwi-
schen 30 und 40 Jahren liegt. Im Kindesalter ist die ALL dagegen mit einer jährlichen
Inzidenz von etwa 4 Fällen pro 100 000 ungleich häufiger und stellt mit einem Anteil
von 27% an allen Krebsarten die häufigste Krebsform in dieser Bevölkerungsgruppe
dar. Insbesondere sind Kinder im Alter von unter vier Jahren betroffen, bei denen die
ALL mehr als doppelt so häufig auftritt wie in anderen Altersgruppen. Unter den pä-
diatrischen Leukämien ist die ALL mit einem Anteil von 80% die häufigste Form
(Felix und Lange, 1999).
Die Einteilung der ALL erfolgt durch Immunphänotypisierung nach den Richtlinien der
European Group for the Immunological Classification of Leukemia (EGIL; Bene et al,
1995). Bei Erwachsenen sind etwa 75% der diagnostizierten ALL B-lymphatischen
Ursprungs (B-ALL). Im Kindes- und Jugendalter sind ca. 85% der B-Zellreihe zuzu-
ordnen (Lipp et al, 2003). Innerhalb der B-lymphoiden ALL werden weitere Subtypen
je nach Differenzierungsgrad der malignen Zellen unterschieden (Tabelle 4). Der
häufigste Subtyp bei Erwachsenen und Kindern ist mit etwa 60% die common B-ALL,
wohingegen eine reifzellige B-ALL sehr selten ist (6% der B-ALL).
Tabelle 4: Klassifizierung akuter lymphoblastischer Leukämien der B-Zellreihe
Antigen pro-B common B prä-B B
TdT + + + - HLA-DR + + + +
CD10 - + +/- +/- CD19 + + + +
cyCD22 + + + + cyCD79a + + + +
cyµ - - + - IgM - - - +
+ positiv bei > 20% der Blasten; +/- positiv bei 10% der Blasten; - positiv bei < 10% der Blasten; cy, zytoplasmatisch; TdT, terminale Desoxyadenylattransferase; HLA, human leukocyte antigen; CD clus-
ter of differentiation. Abgewandelt nach: Lipp et al, 2003.
Bei etwa 60 bis 80% der Patienten ist die B-ALL mit strukturellen oder numerischen
Chromosomenaberrationen assoziiert, die auch von prognostischer Bedeutung sein
können. So ist die reziproke Translokation t(9,22), die zur Bildung des Philadelphia-
Chromosoms und des Fusionsproteins bcr-abl führt und die bei 10-30% der erwach-
senen B-ALL Patienten gefunden wird, mit einer sehr ungünstigen Prognose
Einleitung
12
assoziiert (Lipp et al, 2003). Auch Translokationen, die das mixed-lineage leukemia
(MLL) Gen (11q23) betreffen, stehen mit einer schlechten Prognose in Zusammen-
hang (Thirman et al, 1993). MLL Translokationen werden in 50-80% der pädiatri-
schen ALL gefunden (Felix und Lange, 1999). Unter diesen ist die Translokation
t(4;11), die zum Fusionsonkogen MLL-AF4 führt, am häufigsten.
Zur Behandlung der ALL erfolgt eine Induktionstherapie mit einer Poly-Chemothera-
pie. Eingesetzt werden u.a. Prednison (oder Dexamethason), Vincristin, Anthrazykli-
ne (Daunorubizin) und L-Asparaginase, die zur Intensivierung mit Cyclophosphamid,
Cytarabin oder Mercaptopurin ergänzt werden können (Hoelzer et al, 2002). Zur Kon-
solidierung wird insbesondere zusätzlich Methotrexat eingesetzt. Bei Patienten, die
nicht auf eine Chemotherapie ansprechen oder die eine sehr schlechte Prognose ha-
ben, besteht die Möglichkeit einer Stammzelltransplantation. Diese bietet für diese
Patientengruppe oft die einzige Option auf eine Heilung. An die Konsolidierungsthe-
rapie setzt eine bis zu zweijährige Erhaltungstherapie an, die die Gefahr eines Rezi-
divs vermindern soll. Üblicherweise werden Methotrexat und Mercaptopurin verab-
reicht. Ein Problem bei der ALL stellt der Befall des zentralen Nervensystems (ZNS)
dar. Deshalb wird zusätzlich eine ZNS-Prophylaxe mit intrathekal applizierten Che-
motherapeutika wie z.B. Methotrexat oder eine Schädelbestrahlung durchgeführt,
wodurch die Rückfallquote deutlich verringert werden konnte. Inzwischen werden bei
Kindern relativ hohe Heilungsraten von 80% erzielt (Schrappe et al, 2000), wohinge-
gen bei Erwachsenen nur etwa 40% der Patienten geheilt werden (Gokbuget und
Hoelzer, 2002). In Hoch-Risiko Gruppen z.B. mit Translokation t(9;22) liegt die 5-Jah-
res-Überlebenswahrscheinlichkeit noch immer bei unter 20% (Lipp et al, 2003).
Trastuzumab oder Cetuximab (Carter, 2001b; Cooley et al, 1999; Crowe et al, 1992;
Hale et al, 1985; Kimura et al, 2007a; Naramura et al, 1993; Reff et al, 1994). Über
den Fc Teil können Antikörper auch phagozytierende Zellen wie Makrophagen rekru-
tieren und auf diese Weise Phagozytose auslösen (Brekke und Sandlie, 2003).
Abbildung 2: Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper. Therapeutische Antikörper können direkt wirken, indem sie eine Interaktion zwischen einem löslichen oder einem zellgebundenen Ligan-den mit dem Rezeptor auf der Tumorzelle blockieren oder nach Bindung auf Zelloberflächenrezepto-ren der Tumorzelle anti-proliferative oder pro-apoptotische Signale auslösen. Indirekte Mechanismen werden über den Fc-Teil des Antikörpers vermittelt. Über diesen können die Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) ausgelöst oder Immuneffektorzellen rekrutiert werden, welche die Tumorzelle über Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) oder Phagozytose beseitigen können. Abgewan-delt nach: Glennie und Johnson, 2000.
Rituximab bietet ein Beispiel für einen Antikörper, der in vitro sowohl direkt durch
Auslösen der Apoptose, als auch indirekt über CDC oder ADCC wirken kann. Die Be-
Einleitung
17
teiligung der einzelnen Mechanismen in vivo ist noch nicht vollständig geklärt, den in-
direkten Mechanismen werden allerdings eine größere Bedeutung zugeschrieben
(Carter, 2006). Die klinische Bedeutung der CDC ist noch umstritten und wird kontro-
vers diskutiert (Manches et al, 2003; Weng und Levy, 2001). Dahingegen stellt die
Rekrutierung von Immunzellen und die Induktion der ADCC unter Beteiligung von Fc-
Rezeptoren einen klinisch relevanten Mechanismus, sowohl in vitro als auch in vivo,
dar (Cartron et al, 2002; Weng und Levy, 2003). Dies wurde inzwischen auch für an-
dere therapeutische Antikörper, wie Cetuximab (Erbitux®) oder Trastuzumab gezeigt
(Carter, 2001b; Musolino et al, 2008; Zhang et al, 2007).
2.2.2 Antikörper als Vehikel
Antikörper können auch als Vehikel eingesetzt werden um toxische Substanzen zu
den Tumorzellen zu transportieren (Abbildung 3). Am weitesten entwickelt sind Ra-
dioimmunkonjugate, die aus an Antikörper-gekoppelte Radionuklide wie 131Iod (I)
oder 90Yttrium (Y) bestehen. Mit Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin®) und Tositumomab
(Bexxar®) sind zwei gegen CD20 gerichtete Radioimmunkonjugate zur Therapie des
NHL von der U.S. Food and drug administration (FDA) zugelassen, die in der Be-
handlung Chemotherapie-refraktärer Patienten hohe Ansprechraten erzielten (Witzig
et al, 1999). Durch chemische Kopplung wurden Antikörper an verschiedene Zytosta-
tika wie Doxorubicin oder Calicheamycin gekoppelt (Allen, 2002). Bislang ist mit
Gemtuzumab Ozogamicin (Mylotarg®) ein Zytostatika-Immunkonjugat zum klini-
schen Einsatz zugelassen. Antikörper können auch chemisch an Liposomen gekop-
pelt werden, die Zytostatika als Fracht tragen (Immunliposomen). Auf diese Weise
können größere Mengen der Wirkstoffe gezielt zum Tumorgewebe transportiert und
systemische Toxizitäten reduziert werden (Allen, 2002).
Die Entwicklung von Immuntoxinen ermöglichte eine genetische Kopplung proteino-
gener Toxine wie Ricin A oder Pseudomonas Exotoxin A (ETA) an Antikörper (Allen,
2002). Diese Moleküle besitzen eine hohe Effizienz, die Tumorzellen zu beseitigen.
Durch die Verwendung von Antikörperfragmenten, die nur aus den variablen Berei-
chen der schweren und der leichten Kette bestehen (fragment variable, Fv), konnte
ein Großteil der immunogenen Epitope beseitigt werden, die hauptsächlich in den
konstanten Regionen eines Antikörpers lokalisiert sind (Thorpe et al, 2003). Dadurch
Einleitung
18
wurde die Immunogenität der Moleküle entscheidend verringert. Zwar sind derartige
Moleküle derzeit noch nicht zugelassen, zeigten aber in präklinischen Studien viel
versprechende Ergebnisse (Bruell et al, 2005; Peipp et al, 2002; Schwemmlein et al,
2007; Tur et al, 2003). In einer Phase I Studie erzielte ein gegen CD22 gerichtetes
Immuntoxin (BL22) bei Chemotherapie-resistenten Haarzellleukämie-Patienten eine
Ansprechrate von 80%. Die Nebenwirkungen wurden als leicht eingestuft und waren
reversibel und nicht Dosis-limitierend (Kreitman et al, 2005; Kreitman et al, 2001).
Abbildung 3: Antikörper als Vehikel. Antikörper können genutzt werden, toxische Substanzen ge-zielt zum Tumorgewebe zu dirigieren. Toxische Substanzen können Zytostatika, die direkt gekoppelt oder in Form von Immunliposomen transportiert werden können, Radionukleide oder proteinogene To-xine aus Pflanzen, Pilzen sowie aus Bakterien sein. Auf indirektem Weg wirken Immunzytokine. Zyto-kine können Immunreaktionen auslösen oder verstärken. Durch die Fusion eines Zytokins an einen Antikörper kann eine lokale Anreicherung des Moleküls im Tumorgewebe erzielt und eine zielgerichte-te Immunreaktion gegen die malignen Zellen ausgelöst werden. Abgewandelt nach: Carter, 2001.
Auch wurden durch die Fusion von Zytokinen an Antikörper Immunzytokine entwi-
ckelt. Zytokine, wie Interleukin-2, oder andere immunmodulatorische Moleküle kön-
nen antitumorale Immunantworten auslösen oder verstärken. In Form von Immunzy-
tokinen, die gegen Zelloberflächenantigene des Tumors gerichtet sind, kann durch
die resultierende Anreicherung des Zytokins am Tumorgewebe dessen therapeuti-
sche Wirksamkeit unter Minimierung der Nebenwirkungen verstärkt werden
(Schrama et al, 2006). Des Weiteren wurden als Todeseffektordomänen Enzyme
(z.B. Rnasen) oder Todesliganden der tumor necrose factor/nerve growth factor
Einleitung
19
(TNF/NGF)-Superfamilie an Antikörper oder Antikörperfragmente gekoppelt (Bremer
et al, 2004; Newton und Ryback, 2001). Diese Fusionsproteine zeigten viel
versprechende Ergebnisse in vorklinischen Untersuchungen.
2.2.3 Antikörper in der Therapie hämatologischer Neoplasien
Die Entwicklung der Hybridom-Technologie ermöglichte es, monoklonale Antikörper
in größeren Mengen herzustellen und klinisch zu erproben (Kohler und Milstein,
1975). Mit Muromonab-CD3 (OKT3), der gegen Transplantatabstoßung eingesetzt
wird, wurde 1987 der erste Antikörper von der FDA zum klinischen Einsatz zugelas-
sen (Kung et al, 1979; Smith, 1996). Die ersten klinischen Versuche mit Antikörpern
wurden Anfang der 80er Jahre bei der Behandlung von Lymphom-Patienten durch-
geführt (Meeker et al, 1985; Miller et al, 1982; Nadler et al, 1980). Diese Antikörper
waren Anti-Idiotyp-Antikörper und spezifisch für den Idiotyp des dem Lymphom zu-
grunde liegenden entarteten Klons, und boten somit ein Höchstmaß an Spezifität für
die Tumorzellen. Mit diesem Ansatz konnten erste Erfolge verzeichnet werden, und
bei einem Patienten wurde eine komplette Remission erzielt (Miller et al, 1982). Aller-
dings sind Anti-Idiotyp-Antikörper für eine generelle Anwendung nicht geeignet, da
sie individuell für jeden Patienten entwickelt werden müssten. Alternative Zielstruktu-
ren für eine Antikörper-basierte Therapie von Leukämien und Lymphomen sind Diffe-
renzierungsantigene (cluster of differentiation, CD). Diese eignen sich gut als Zielan-
tigene, da ihre Expression auf einen oder wenige Zelltypen beschränkt ist. Dadurch
kann eine Zellpopulation im Organismus gezielt attackiert werden, ohne dass andere
Gewebe geschädigt werden. Somit werden CD Antigene zwar nicht ausschließlich
auf den Tumorzellen exprimiert, ermöglichen aber eine Anwendung, die auf
unterschiedliche Patienten übertragbar ist.
Die ersten klinisch getesteten Antikörper bestanden aus murinen Sequenzen. Ob-
wohl diese therapeutische Effekte zeigten, war ihre Wirkung teilweise eingeschränkt.
Hauptprobleme waren zum einen auftretende Immunreaktionen im Patienten gegen
das Therapeutikum, die zur Bildung neutralisierender Antikörper führten (human anti-
mouse antibody, HAMA). Dies limitierte deren Einsatz und Effizienz. Zum anderen in-
teragierten murine Fc Teile nur schwach mit den humanen Fc-Rezeptoren der Effek-
torzellen. Deshalb waren die vermittelten Effektorfunktionen muriner Antiköper oft
Einleitung
20
nicht effizient genug (Carter, 2001b). Durch Chimärisierung und Humanisierung
konnten diese Limitierungen weitgehend überwunden werden: In einem chimären
Antikörper wurden die murinen konstanten Domänen durch die entsprechenden
humanen ersetzt, während in einem humanisierten Antikörper nur noch die comple-
mentarity determining regions (CDR) der variablen Ketten murinen Ursprungs sind.
Schließlich ist inzwischen auch die Herstellung komplett humaner Antikörper
möglich. Die Phage-Display Technik ermöglichte es Antikörperfragmente der gewün-
schten Spezifität aus humanen Antikörperbanken zu isolieren und durch Kombination
mit den Sequenzen humaner konstanter Antikörper-Domänen zu ganzen Antikörpern
zu fusionieren. Auch ist inzwischen die Erzeugung humaner Antikörper durch
Immunisierung transgener Mäusen, die humane Immunglobulin Gene tragen,
möglich (Green, 1999; Lonberg et al, 1994). Chimäre, humanisierte oder humane
Antikörper sind weniger immunogen als murine Antikörper und besitzen verbesserte
Effektorfunktionen (Carter, 2006).
Bislang sind 21 Antikörper oder Antikörper-abgeleitete Derivate von der FDA zum kli-
nischen Einsatz zugelassen (Stand 2007). Diese werden in verschiedenen Anwen-
Die ersten bispezifischen Antikörper entstanden durch eine Fusion zweier Hybridome
mit der Hybrid-Hybridom-Technologie (Quadroma Antikörper), oder wurden durch
eine chemische Kopplung zweier Antikörper bzw. zweier fragment antigen binding
(Fab) Fragmente hergestellt (Abbildung 4; Glennie et al, 1987; Karpovsky et al, 1984;
Milstein und Cuello, 1983; Schrama et al, 2006; Suresh et al, 1986).
Quadroma Antikörper zeigten eine hohe Zytotoxizität in vitro und im Tiermodell
(Brissinck et al, 1991; Renner et al, 1994; Weiner und Hillstrom, 1991). Auch in er-
sten klinischen Studien wurden therapeutische Effekte bei einzelnen Patienten beo-
bachtet (Canevari et al, 1995; Lamers et al, 1997; Segal et al, 1999). Allerdings er-
wiesen sich die murinen Anteile der bispezifischen Antikörper als immunogen. Dies
führte zu Immunreaktionen und der Bildung von HAMA oder human-anti-bispecific
antibodies (HABA), die eine langfristige Behandlung nicht möglich machten
(Hartmann et al, 1997). Ein weiteres Problem stellte der in den Quadroma Antikör-
Einleitung
25
pern enthaltene Fc-Teil dar. Die Kombination einer Fc-Rezeptor-spezifischen Fv Do-
mäne mit einem Fc-Teil in einem bispezifischen Quadroma-Antikörper führte nach In-
teraktion mit verschiedenen Fc-Rezeptoren zu deren Kreuzvernetzung. Dies resul-
tierte in vivo in einer massiven Zytokinfreisetzung und den damit verbundenen Toxizi-
täten (Link et al, 1998; Weiner et al, 1995; Weiner et al, 1993).
Abbildung 4: Struktur eines monoklonalen IgG Antikörpers und klassische Formate bispezifi-scher Antikörper. Durch die Fusion zweier Hybridome werden Quadroma Antikörper hergestellt. Bispezifische (Fab)2 Fragmente können durch chemische Kopplung erzeugt werden. VL/VH, variable Immunglobulin leichte/schwere Kette, CH1-3, konstante Immunglobulin schwere Kette 1-3; CL, konstante Immunglobulin leichte Kette; Fab, fragment antigen binding, Fc, fragment crystallizable. Abgewandelt nach: Muller und Kontermann, 2007.
Durch Einsatz chemisch gekoppelter bispezifischer Fab Fragmente konnten diese
Begleittoxizitäten vermindert werden. Diese Moleküle zeigten viel versprechende Er-
gebnisse in klinischen Studien (Borchmann et al, 2002; Curnow, 1997; James et al,
2001; Posey et al, 1999; Valone et al, 1995). Allerdings war die Herstellung derarti-
ger Moleküle aufwendig und teuer, so dass die limitierte Verfügbarkeit der Therapeu-
tika eine Durchführung ausgeweiteter klinischer Studien verhinderte (Hartmann et al,
1997). Somit konnten die ursprünglich hohen Erwartungen bislang nicht eingehalten
werden und nach wie vor ist noch kein bispezifischer Antikörper zur klinischen An-
wendung zugelassen (Muller und Kontermann, 2007). Um diese Limitierungen der
klassischen Formate zu überwinden wird seit längerem intensiv an der Entwicklung
neuer Formate bispezifischer Antikörper und deren Herstellungsmethoden geforscht,
und bislang wurde eine Vielzahl von verschiedenen Formaten beschrieben.
Im einfachsten Fall bestehen rekombinante bispezifische Antikörper aus den variablen
Domänen (fragment variable, Fv) zweier Antiköper. Sie besitzen nicht den Fc-Anteil gan-
zer Antikörper und haben ein relativ kleines Molekulargewicht von 55-60 kDa. Daher sind
sie weniger immunogen als intakte, monoklonale Antikörper, haben eine verbesserte Ge-
webegängigkeit und zeigen ein erhöhtes Tumorpenetrationspotential. Auch sind sie leich-
ter herzustellen als chemisch gekoppelte bispezifische Antikörper oder Fab-Fragmente
(Peipp und Valerius, 2002). Die gebräuchlichsten Formate sind bispezifische tandem
scFvs (bsscFvs) (Gruber et al, 1994; Hayden et al, 1994; Mack et al, 1995), bispezifische
diabodies (Holliger et al, 1993) und bispezifische single-chain diabodies (Abbildung 5;
Brüsselbach et al., 1999).
Tandem bsscFvs sind einkettige Moleküle, die als Leseköpfe zwei single-chain Fv (scFv)
Komponenten besitzen (Bird et al, 1988; Huston et al, 1988). Diese sind genetisch über
einen kurzen, aus zwischen 15 und 20 Aminosäuren bestehenden, flexiblen Polypeptid-
linker fusioniert (Gruber et al, 1994). Diabodies dagegen sind zweikettige Moleküle. Sie
formieren sich, wenn die Sequenz des linkers, der die variablen Domänen eines scFvs
verbindet, auf eine Länge von 8-10 Aminosäuren reduziert wird (Kortt et al, 1997;
Todorovska et al, 2001). Dies macht eine Paarung zwischen den variablen Domänen in-
nerhalb einer Polypeptidkette unmöglich und führt zur Ausbildung von Homodimeren.
Das Format eines diabodys kann auch zur Herstellung von bispezifischen Antikörper-De-
rivaten genutzt werden, indem die Ketten mit der Zusammenstellung VHA-VLB und VHB-
VLA in einer Zelle ko-exprimiert werden. Dies führt zur Bildung von heterodimeren bispe-
zifischen diabodies (Holliger et al, 1993). Die Expression von zwei Ketten innerhalb einer
Zelle resultiert jedoch auch in einer Bildung nicht funktionaler Homodimere. Eine Möglich-
keit, dieses Problem zu umgehen, bieten single-chain diabodies (Brüsselbach et al,
1999), die eine Zwischenstufe aus bsscFvs und diabodies darstellen. In diesem Format
sind die variablen Domänen in der Anordnung VHA-VLB-VHB-VLA auf einer Polypeptidket-
te kombiniert, die sich zu einem monomeren Molekül einer diabody ähnlichen Struktur
falten. Durch Variationen in der Länge der linker können tetravalente, bispezifische tan-
dem diabodys (tandabs) hergestellt werden, die je zwei Leseköpfe für die beiden Antige-
ne tragen (Kipriyanov et al, 1999).
Die Wirksamkeit dieser kleinen bispezifischen Antikörper-Derivate wurde bislang in Zell-
kultur und in Tiermodellen nachgewiesen (Dreier et al, 2003; Grosse-Hovest et al, 2005;
Einleitung
27
Kipriyanov et al, 2002; Schlereth et al, 2006). Zwei tandem bsscFv für eine Anwendung
zur Therapie des NHL bzw. des malignen Melanoms werden derzeit in klinischen Phase I
und II Studien bewertet, in denen sich erste therapeutische Effekte abzeichnen (Bargou
et al, 2007).
Abbildung 5: Formate rekombinanter bispezifischer scFv Antikörper-Derivate. Tandem bispecific
single-chain fragments variable (bsscFv) bestehen aus zwei scFv Fragmenten die linear in einer Poly-peptidkette fusioniert sind. Bispezifische diabodies (Db) sind Heterodimere aus zwei scFv Fragmenten, die sich überkreuz aneinander lagern, insofern der linker zwischen den variablen Do-mänen eine Länge von 8-10 AS unterschreitet. Single-chain diabodies (scDb) sind einkettige Molekü-le, einer diabody-ähnlichen Struktur. Durch eine Verkürzung des zentralen linkers wird eine in-tramolekulare Paarung unmöglich, und es formieren sich zweikettige, bispezifische, tetravalente tandem diabodies (Tandab). VL/VH, variable Immunglobulin leichte/schwere Kette. Abgewandelt nach: Little et al, 2000; Muller und Kontermann, 2007.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind Formate, die
Dimerisierungsdomänen ausnutzen. Diese gewährleisten eine effiziente Paarung
zweier unterschiedlicher Polypeptidketten, die jeweils eine Bindespezifität tragen.
Diese Formate werden unter dem Begriff mini-antibodies zusammengefasst (Abbil-
dung 6). Genutzt werden kann die Interaktion der konstanten Domänen der Immun-
globuline. Diese Strategien haben sich allerdings aufgrund des symmetrischen Auf-
baus der Produkte nicht für die Herstellung bispezifischer Heterodimere bewährt, ob-
wohl die Dimerisierung bispezifischer single-chain diabodies durch deren Fusion mit
der CH3-Domäne oder dem ganzen Fc-Teil beschrieben ist (Alt et al, 1999).
Eine elegante Lösung bot die Einführung von knob-into-hole Mutationen an der
CH3/CH3 Kontaktfläche, wodurch sich der Anteil funktionaler Heterodimere
gegenüber inaktiver Homodimere bei der Produktion bispezifischer IgG Antikörper
erhöhen ließ (Atwell et al, 1997; Carter, 2001a; Ridgway et al, 1996). Die knob-into-
hole Strategie konnte auch genutzt werden, um eine effiziente Heterodimerisierung
rekombinanter scFv-Fc oder scFv-CH3 Fusionsproteine zu gewährleisten (Shahied et
al, 2004; Xie et al, 2005). Darüber hinaus wurden bispezifische minibodies durch die
Einleitung
28
Fusion eines scFv Fragments mit der konstanten leichten Immunglobulin-Domäne
(CL), und der Fusion eines weiteren scFv Fragments mit der konstanten schweren
Kette 1 (CH1) konstruiert. Die Assoziation der beiden unterschiedlichen konstanten
Domänen führte zur Formation bispezifischer Heterodimere (Muller et al, 1998b). In
einem weiteren Ansatz wurden Fab-scFv Fusionsproteine hergestellt (Lu et al, 2002;
Schoonjans et al, 2000; Schoonjans et al, 2001; Willems et al, 2003). Hier wurden
scFvs an das C-terminale Ende entweder der leichten Kette (L) oder des fragment
difficult (Fd) eines Fab Fragments fusioniert, woraus sogenannte bispezifischer
bibodys resultierten. Es war auch möglich, in einem Molekül beide Ketten mit einem
scFv zu erweitern. Dies führte zu trivalenten oder, bei unterschiedlichen Spezifitäten,
zu trispezifischen Molekülen (tribodys). Nach dieser Methode wurden in
eukaryotischer Expressionssystemen effizient Heterodimere hergestellt, die bis zu
über 90% des aufgereinigten rekombinanten Proteins darstellten (Schoonjans et al,
2001).
Bispezifische tetravalente Antikörper-Formate, mit jeweils zwei Leseköpfen für beide
Antigene, können durch Fusion eines scFv Fragments an einen intakten IgG Antikörper
oder an ein F(ab)2-Fragment dargestellt werden (Coloma und Morrison, 1997). Auch
wurden hochmolekulare IgG-ähnliche Fusionsproteine aus den CH3 oder Fc Domänen
mit tandem bsscFvs, diabodies oder single-chain diabodys hergestellt (Alt et al, 1999;
Connelly et al, 1998; Lu et al, 2003; Schneider et al, 2005; Zuo et al, 2000).
Neben den konstanten IgG Domänen finden noch weitere heterologe Peptide oder Pro-
teine als Oligomerisierungsdomänen Verwendung (Pluckthun und Pack, 1997). So wur-
den die kurzen Leucin-zipper der beiden Transkriptionsfaktoren fos und jun verwendet,
die unter Bildung heterodimerer Doppelwendeln (coiled-coils) dimerisieren. Diese Hetero-
dimerisierungshelix, die weiter über Disulfidbrücken stabilisiert werden kann, wurde für
die Darstellung bivalenter und bispezifischer Antikörper ausgenutzt (de Kruif und
Logtenberg, 1996; Kostelny et al, 1992; Pack und Pluckthun, 1992). Analog funktionieren
kurze Helix-Schleife-Helix -Motive, die sich unter Ausbildung von vier Helix-Bündeln anei-
nander lagern und somit eine Anwendung für die Darstellung bispezifischer Antikörper-
Derivate mit zwei oder vier Antigenbindungsstellen finden (Muller et al, 1998a; Pack und
Pluckthun, 1992).
Einleitung
29
Abbildung 6: Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate mit Dimerisierungsdomänen. (A) Knob-into-hole Strategie (B) Fusion der scFv Fragmente mit konstanten CH1/CL Domänen (C) Fusion der scFv Fragmente an IgG oder Fc-Fragmente (D) Fusion der scFv Fragmente an homo-oder heterodimerisierende Peptide. VL/VH, variable Immunglobulin leichte/schwere Kette; CH1-3, Immunglobulin konstante schwere Kette 1-3; CL, Immunglobulin konstante leichte Kette; dhlx, homodimerisierende Helix-Schleife-Helix. Abgewandelt nach: Müller und Kontermann, 2007.
ren jedoch mit den bereits beschriebenen Format-assoziierten Problemen, wie Immu-
nogenität und Verfügbarkeit des Agens, behaftet, so dass eine intensive klinische Er-
probung nicht durchgeführt wurde (Hartmann et al, 1997; Weiner et al, 1995). Re-
kombinante CD16-gerichtete bispezifische Antikörper-Derivate zeigten bislang in
Tiermodellen ihr zytotoxisches Potential, eine Evaluierung ihres therapeutischen Ef-
fekts in klinischen Phasen steht jedoch noch aus (Muller und Kontermann, 2007).
2.5 Zielstrukturen auf Tumorzellen für eine Antikörper-basierte
Therapie
2.5.1 Allgemeine Anforderungen für Zielantigene auf Tumorzellen
Antikörper-basierte Strategien zur Behandlung maligner Erkrankungen bieten gegen-
über einer herkömmlichen Chemotherapie den Vorteil, dass sie durch eine geeignete
Einleitung
34
Auswahl des Tumorantigens zielgerichtet gegen die malignen Zellen erfolgen kann
(Allen, 2002). Dabei müssen die Eigenschaften des Antigens mit dem Format des
Antikörpers und der verfolgten Strategie abgestimmt werden. So ist z.B. für eine
erfolgversprechende Anwendung von Immuntoxinen eine stark internalisierende Ziel-
struktur notwendig. Diese Eigenschaft ist jedoch von Nachteil, falls über den Antikör-
per Effektorfunktionen vermittelt werden sollen.
Nach Möglichkeit sollte das Zielantigen auf allen malignen Zellen der Tumormasse
vorhanden sein, wobei eine Expression auf mindestens 20-30% als Voraussetzung
für eine erfolgversprechende Therapie gilt (Hoelzer et al, 2002). Von Vorteil ist auch
eine Expression auf den Tumor-Stammzellen oder intermediären Tumorvorläufer-
Zellen, die sich im Expressionsprofil von der Masse der Tumorzellen abheben kann
(Hosen et al, 2007; Taussig et al, 2005). Dagegen sollte das Zielantigen nicht auf an-
deren Geweben präsent sein, da dies zu Nebenwirkungen führen kann. Um eine Re-
konstitution nach der Behandlung zu gewährleisten, sollte das Antigen nicht auf
Stammzellen exprimiert werden. Weiterhin sollte das Antigen nicht als lösliche Form
z.B. durch proteolytische Abspaltung (shedding) ins Blut abgegeben werden, da dies
zu einer Neutralisation der Antikörper führen und die therapeutische Wirkung beein-
flussen könnte.
2.5.2 Zielstrukturen auf B-lymphoiden Neoplasien
Der Einsatz der monoklonalen Antikörper Rituximab und Alemtuzumab in der Thera-
pie des NHL oder der B-CLL zeigt das große Potential Antikörper-basierter Strate-
gien in der Behandlung hämatologischer Neoplasien auf. Dennoch stoßen diese The-
rapeutika in manchen Fällen an ihre Grenzen, und Rezidive bleiben ein großes Pro-
blem. So sprechen nur etwa die Hälfte der Patienten auf eine Therapie mit Rituximab
an, und auch nach einem initialen Ansprechen können erworbene Resistenzmecha-
nismen oder der Verlust der CD20 Expression auf den malignen Zellen eine weitere
erfolgreiche Behandlung mit Rituximab verhindern (Kennedy et al, 2002b). Darüber
hinaus sind pro-B ALL Blasten in der Regel negativ für CD20, folglich kann Rituximab
für diese Patientengruppe nicht angewendet werden (Abbildung 7). Aufgrund einer
weitverbreiteten Expression des Antigens CD52 auf Zellen des hämatopoietischen
Systems (T-Zellen, Monozyten, Makrophagen, Eosinophilen, NK-Zellen und dendriti-
Einleitung
35
schen Zellen) führt eine Behandlung mit Alemtuzumab häufig zu einer Zytopenie und
schädigt das Immunsystem der Patienten mit den damit verbundenen Komplikatio-
nen (Alinari et al, 2007). Nach gegenwärtiger Meinung könnten auch Patienten, die
für eine Behandlung mit CD20 oder CD52 Antikörpern nicht in Frage kommen eben-
falls von Antikörper-basierten Therapeutika profitieren. Daher werden nach wie vor
neuartige therapeutische Konzepte benötigt (Hoelzer et al, 2002; Kennedy et al,
2002b). Deren Entwicklung schließt sowohl die Erprobung neuer Antikörper-Formate,
als auch die Evaluierung anderer Zelloberflächenmoleküle mit ein (Abbildung 7).
Auf malignen B-Zellen weisen mehrere Zelloberflächenantigene gute Vorausset-
zungen für die Antikörper-basierte Therapie auf, wie beispielsweise CD19, CD20,
CD22, CD25, CD37, CD40, CD74, IgM Idiotyp (Id) oder HLA Klasse II (Rothe und
Schmitz, 1996). Unterschiedliche Antikörper-basierte Strategien gegen diese Antige-
ne wurden in präklinischen und klinischen Studien auf Wirksamkeit erprobt. Nicht al-
le Antigene sind jedoch als Zielantigene zur Vermittlung der ADCC geeignet (Tutt et
al, 1998; Wurflein et al, 1998), und im frühen Entwicklungsstadium der pro-B Zelle
und der malignen Blasten einer pro-B ALL sind nur wenige potentielle Zielantigene
exprimiert (Abbildung 7). Von diesen weist CD19 besonders attraktive Eigenschaften
auf.
Abbildung 7: Stadienspezifische Expression von Differenzierungsantigenen in der B-Zell-Ent-wicklung. In Abhängigkeit des Differenzierungsstadiums werden verschiedene Antigene exprimiert, die sich als Zielstrukturen für die Antikörper-basierte Immuntherapie eignen. cIg = zytoplasmatisch ex-primiertes Immunglobulin; sIg = membranständiges Immunglobulin. Abgewandelt nach: Rothe und Schmitz, 1996.
Einleitung
36
2.5.3 CD19 als Zielstruktur zur Immuntherapie B-lymphoider Neoplasien
Das Zelloberflächenantigen CD19 ist aufgrund seines Expressionsprofils und seiner
Eigenschaften eine gute Zielstruktur zur Immuntherapie B-lymphoider Erkrankungen
(Rothe und Schmitz, 1996). CD19 ist ein glykosyliertes Typ I Transmembranprotein
mit einem Molekulargewicht von 95 kDa und gehört zur Immunglobulin-Superfamilie
(Tedder und Isaacs, 1989). CD19 ist ein wichtiges regulatorisches Protein und spielt
eine Rolle bei der Aktivierung, Proliferation und Differenzierung B-lymphoider Zellen.
Das Protein ist gekennzeichnet durch zwei Immunglobulin-ähnliche Domänen im
extrazellulären Teil, sowie durch eine zytoplasmatische Domäne, die neun hoch
konservierte Tyrosinreste enthält. Diese können phosphoryliert werden und sind an
der Signalübertragung beteiligt (Tedder und Isaacs, 1989). Auf reifen B-Zellen bildet
CD19 zusammen mit den membranständigen Proteinen CD21 (CR2), CD81(TAPA-1)
und Leu13 den B-Zell-Corezeptor-Komplex (Bradbury et al, 1992; Carter et al, 2002;
Fearon und Carter, 1995; Matsumoto et al, 1993). Nach Kreuzvernetzung des B-
Zellrezeptors (B cell receptor, BCR) wird CD19 phosphoryliert und überträgt so
Transmembransignale ins Zellinnere.
Im Gegensatz zu HLA II oder auch CD52, wird CD19 vermutlich ausschließlich auf
Zellen der B-Zellreihe exprimiert. Einzige mögliche Ausnahme bilden follikuläre den-
dritische Zellen, allerdings ist die Expression von CD19 auf diesen Zellen noch um-
stritten (Scheuermann und Racila, 1995). Im Verlauf der B-Zell-Entwicklung wird
CD19 auf fast allen Reifungsstadien exprimiert, von den frühen pro-B Vorläuferzellen
bis zu den reifen B-Zellen, wird aber ab dem Stadium der reifen Plasmazelle herun-
terreguliert (Nadler et al, 1983; Stamenkovic und Seed, 1988). Darüber hinaus wird
CD19 nicht auf gesunden hämatopoietischen Stammzellen exprimiert, unterliegt kei-
ner proteolytischen Abspaltung (shedding, (Press et al, 1989) und geht nicht, wie in
manchen Fällen für CD20 beschrieben, im Verlauf einer Antikörpertherapie verloren
(Davis et al, 1999).
CD19 wird auf der Mehrzahl der B-lymphoiden Neoplasien exprimiert, und ist auf
94% aller reifzelligen B-ALL und auf 95% der Vorläufer B-ALL vorhanden (Gokbuget
und Hoelzer, 2002). Mit eingeschlossen sind auch die CD22- oder CD20-negativen
pro-B ALL, die nicht mit Rituximab behandelt werden können. Auch die Mehrzahl der
Subtypen der B-NHL exprimieren, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß CD19.
So ist CD19 in der Regel auf den Tumorzellen der B-CLL, des lymphoplasmozy-
Einleitung
37
tischen Lymphoms, der Prolymphozytenleukämie, der Haarzellleukämie, des folliku-
lären Lymphoms, des Mantelzelllymphoms, des Burkitt-Lymphoms und des diffusen
großzelligen B-Zelllymphoms nachzuweisen (Kimura et al, 2007b; Rothe und
Schmitz, 1996). Nicht exprimiert wird CD19 in der Regel auf den entarteten Zellen
des Plasmozytoms und der Hodgkin-Lymphome (Masir et al, 2006). Ob CD19 auch
auf leukämischen Stammzellen (leukemic stem cells, LSCs) exprimiert wird, wird
derzeit noch kontrovers diskutiert (Castor et al, 2005; Cox et al, 2004; Hotfilder et al,
2005). Für einige Fälle der pre-B ALL mit den Translokationen t(9;22) oder t(12;22)
wurde die Expression von CD19 auf LSCs berichtet (Castor et al, 2005).
Bislang wurden verschiedene CD19-gerichtete Antikörper oder Antikörper-Derivate
entwickelt und ihre Wirksamkeit in der Zellkultur, im Mausmodell oder in klinischen
Studien untersucht. Klinische Studien mit monoklonalen Antikörpern, die sich für das
Zielantigen CD20 und CD20-positive Lymphome bewährt hatten, blieben jedoch bis-
lang erfolglos (Hekman et al, 1991; Vlasveld et al, 1995). Um CD19 dennoch als Ziel-
antigen nutzen zu können wurden unterschiedliche Strategien erprobt. Diese beinhal-
ten chimäre CD19 Antikörper, die nach glycoengineering des Fc-Teils verbesserte
Effektorfunktionen in vitro aufwiesen und im Mausmodell erste vielversprechende Er-
gebnisse zeigten (Barbin et al, 2006; Lang et al, 2004; Stieglmaier, 2007). Darüber
hinaus wurden Immuntoxine und Immunzytokine hergestellt und in Zellkultur und im
Mausmodell erfolgreich erprobt (Herrera et al, 2006; Schwemmlein et al, 2007;
Stieglmaier et al, 2007). Verschiedene bispezifische Antikörper zur Rekrutierung zy-
totoxischer T-Zellen, Monozyten/Makrophagen oder NK-Zellen wurden in klassi-
schen, oder in rekombinanten Formaten eines diabodys, tandem bsscFvs, oder tan-
dem diabodys hergestellt und zeigten in präklinischen, und klinischen Studien viel-
versprechende Erfolge (Bruenke et al, 2005; Dreier et al, 2003; Ely et al, 1996;
Kipriyanov et al, 2002; Kipriyanov et al, 1999; Schlereth et al, 2006). Am weitesten
entwickelt ist ein tandem bsscFv gegen CD19 und CD3 (MT103/MEDI-538), der der-
zeit in einer Phase II klinischen Studie mit B-Zell NHL Patienten getestet wird
(Bargou et al, 2007). Dennoch ist nach wie vor kein CD19-spezifisches Antikörper-
basiertes Therapeutikum von der FDA zugelassen.
Problemstellung
38
3 Problemstellung
Das zentrale Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer rekombinanter bispezifi-
scher Antikörper-Derivate zur Therapie B-lymphoider Neoplasien. Die bispezifischen
Antikörper-Derivate sollten das Tumorantigen CD19 bivalent und das trigger Molekül
CD16 monovalent binden. Arbeitshypothese war, dass im Vergleich zu monovalenter
Bindung das bivalente Anvisieren (bivalent targeting) der Tumorzellen zu einer
den sollte, ob durch das bivalente Anvisieren der Tumorzellen ein Gewinn an Zytoto-
xizität CD19- und CD16-gerichteter bispezifischer Antikörper-Derivate zu erzielen war
(Abbildung 8).
4.1.1 Konstruktion der Expressionsvektoren für den bstb [Fab19xds19xds16]
und den bsbb [Fab19xds16]
Zur Konstruktion lagen zu Beginn der Arbeit die kodierenden Sequenzen des chimä-
ren CD19-spezifischen Antikörpers 4G7chim und der disulfidstabilisierten (ds) Vari-
anten der scFvs gegen CD19 und CD16 vor (Barbin et al, 2006; Bruenke et al, 2005).
Die variablen Immunglobulinketten waren aus den Hybridomen 4G7 (anti-CD19)
bzw. 3G8 (anti-CD16) subkloniert worden. In den Sequenzen dieser ds scFv Frag-
mente waren durch gezielte DNA-Mutagenese in den variablen Regionen einzelne
Codons in Cystein-kodierende Tripletts umgewandelt worden. Diese eingefügten
Cystein-Reste ermöglichen die Ausbildung einer intramolekularen, stabilisierenden
Disulfidbrücke. Die genetische Fusion der copy DNA (cDNA) Sequenzen erfolgte im
bicistronischen Expressionsvektor pBud/CE4.1. Dieser erlaubt die Co-Expression
zweier Polypeptidketten, die jeweils unter Kontrolle eines starken eukaryotischen
Promotors stehen (immediate-early cytomegalovirus (CMV) Promotor bzw. Elonga-
tionsfaktor 1α (EF1α) Promotor, Abbildung 8).
Ergebnisse
40
Abbildung 8: Konstruktion der bispezifischen Fab-scFv Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16]. A: Blockstrukturen des bsbb [Fab19xds16] und des bstb [Fab19xds19xds16]. In beiden Molekülen ist das Fab Fragment spezifisch für CD19. Die scFvs sind an die C-terminalen Enden der humanen konstanten IgG κ leichten oder schweren Kette 1 fusioniert. Durch Wechselwirkung zwischen der L-Kette und dem Fd-Fragment und der Ausbildung einer intermolekularen Disulfidbrücke formieren sich heterodimere bispezifische Antikörper-Derivate. B: Konstruktion der Expressionsvektoren. CD19L, leichte Kette des chimären CD19 Antikörpers 4G7; CD19 Fd, fragment difficult des chimären CD19 Antikörpers 4G7; scFv, single-chain fragment va-
riable; CMV, Cytomegalovirus immediate early Promotor; E1α: Promotor des EF1α Gens; Igκ, Kodier-
sequenz für den Sekretionsleader der humanen Immunglobulin κ leichten Kette; IgH, Kodiersequenz für den Sekretionsleader der humanen Immunglobulin schweren Kette; VL, VH, cDNA Sequenzen für die variablen Regionen der leichten bzw. schweren Kette der Antikörper gegen CD19 (hellgrau) bzw. CD16 (schwarz); CL, konstante humane Immunglobulin κ leichte Kette; CH1, Region 1 der konstanten humanen γ1 schweren Kette; L1, L2, L3, linker; S, H; cDNA Sequenzen für einen Strep- und einen He-xahistidin-tag; S-S, stabilisierende Disulfidbrücke.
Die Herstellung der Expressionsvektoren verlief in sequentiellen Klonierungsschritten
(siehe Material und Methoden). Die kodierenden Sequenzen wurden durch Polyme-
rase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) unter Einführung der Restrik-
Ergebnisse
41
tionsschnittstellen und gegebenenfalls kodierender linker-Sequenzen aus den Vekto-
ren pBud/4G7chim und pSecTag2HygroC-Strep dsCD19 4G7-dsCD16 amplifiziert
(Daten nicht gezeigt). Die cDNA Sequenzen des humanen Ig κ leaders und der
CD19 Fab L- Kette des Antikörpers 4G7chim wurden in die stromabwärts des CMV
Promotors gelegene multiple Klonierstelle (multiple cloning site, MCS) des Vektors
pBud/CE4.1 ligiert. Anschließend wurde die cDNA des ds scFvs 3G8 über eine kurze
linker Sequenz, die für die Aminosäuren (AS) DVPGGS kodierte, fusioniert (Abbil-
dung 8). Der resultierende Expressionsvektor pBud/CD19L-ds16 kodierte für das L-
scFv Fragment des bsbb [Fab19xds16] und des bstb [Fab19xds19xds16].
Die cDNA des Sekretions-leaders der humanen IgG schweren Kette sowie die cDNA
der VH Kette und der humanen IgG1 CH1 Region einschließlich der ersten fünf AS
der oberen Gelenkregion (EPKSC) des Antikörpers 4G7chim wurden in die MCS
stromabwärts des EF1α Promotors des Vektors pBud/CE4.1 ligiert. Hieraus resultier-
te der Expressionsvektors pBud/19Fd-Stop. Dieser kodierte für das Fd Fragment des
bibodys. Anschließend wurde die cDNA des ds scFv CD19 an das C-terminale Ende
des Fd Fragments über Sequenzen der oberen Gelenkregion und eines flexiblen lin-
kers (EPKSCSGPGGGRS(G4S)2) fusioniert. Dabei entstand der Expressionsvektor
pBud/19Fd-ds19, der für das Fd-scFv Fragment des tribodys kodierte. Durch Um-
setzen der kodierenden Sequenzen des L-scFv Fragments in die Vektoren
pBud/19Fd-ds19 und pBud/19Fd-Stop wurden schließlich die bicistronischen Vek-
toren pBud/Fab19-ds19-ds16 und pBud/Fab19-ds16 erhalten, die nun für beide Ket-
tenuntereinheiten der Moleküle kodierten (Abbildung 8).
Die Sekretion des L-scFv Kette erfolgte über den Sekretions-leader der humanen
IgG κ leichten Kette, die der Fragmente Fd und Fd-scFv über den Sekretions-leader
der humanen IgG schweren Kette. Die freien Cysteine in der oberen Gelenkregion
des Fd- bzw. des Fd-scFv Fragments und in der L-scFv Kette sollten die Ausbildung
einer stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen den beiden Ketten des tribodys und
des bibodys ermöglichen. Die verwendeten Restriktionsschnittstellen wurden so aus-
gewählt, dass sie in der Regel nicht in cDNA Sequenzen muriner variabler Ketten
schneiden. Somit können in diesen Vektoren die cDNA Sequenzen der variablen Do-
mänen des Fab Fragments sowie die der scFvs unabhängig voneinander gegen an-
dere Spezifitäten ausgetauscht werden.
Ergebnisse
42
4.1.2 Expression und Aufreinigung des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16]
Um die Herstellung und Aufreinigung zu erleichtern, wurden stabil transfizierte Pro-
duktionslinien für die Expression des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] hergestellt. Hierzu wurden 293T Zellen mit dem jeweiligen, zuvor line-
arisierten Expressionsvektor transfiziert und unter Selektionsdruck vereinzelt. Der
Zellkulturüberstand wurde durchflusszytometrisch auf Bindung an Antigen-positive
Zellen getestet, wodurch stark exprimierende Einzelklone identifiziert wurden (Daten
nicht gezeigt). Zur Produktion wurden diese in einem kleinen Bioreaktor in Hochdich-
tekultur gehalten. Der Zellkulturüberstand wurde geerntet, und die rekombinanten
Proteine über Ni-Chelat Affinitätschromatographie aus 50-70 ml aufgereinigt. Nach
Hochrechnung lagen die Ausbeuten für beide Moleküle routinemäßig bei zwischen 1
bis 3 mg/l Zellkulturüberstand. Im Vergleich betrugen die Ausbeuten nach transienter
Expression etwa 100 bis 400 µg/l (Daten nicht gezeigt).
Die angereicherten Antikörper-Derivate wurden im Coomassie-gefärbten sodium do-
decylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) Gel analysiert (Abbil-
dung 9). Unter reduzierenden Bedingungen wurden die Polypeptidketten L-scFv, Fd
und Fd-scFv im Gel identifiziert, wobei der spezifische Nachweis dieser
Polypeptidketten mit einem anti-Pentahistidin (Nachweis der Fd bzw. Fd-scFv Frag-
mente; Abbildung 9) und einem anti-humane IgG κ Kette Antikörper (Nachweis des
L-scFv Fragments) im Western Transfer-Experiment erfolgte. Die Mobilitäten der
Fragmente Fd-scFv und L-scFv im Gel entsprachen einer Größe von ca. 50 kDa. Das
Fd Fragment zeigte ein Laufverhalten von etwa 25 kDa. Diese Werte stimmten gut
mit den aus den Sequenzen vorhergesagten Werten von 54 kDa für die Fragmente
Fd-scFv und L-scFv bzw. von 23 kDa für das Fd Fragment überein.
Zum Nachweis der stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen der leichten und der
schweren Kettenuntereinheit wurden die angereicherten Proteine auf ein nicht-redu-
zierendes SDS-PAGE Gel auftragen. Im Western-Transfer Experiment wies der
tribody eine Mobilität entsprechend einer molekularen Masse von etwa 100 kDa, der
bibody eine Mobilität von etwa 80 kDa auf. Die ermittelten Größen standen im
Einklang mit den errechneten molekularen Massen von 108 kDa für den bstb
[Fab19xds19xds16] bzw. 77 kDa für den bsbb [Fab19xds16]. Daraus wurde ge-
schlossen, dass sich die Polypeptidketten zu Dimeren assoziierten, die über eine Di-
Ergebnisse
43
sulfidbrücke kovalent verknüpft waren. Weiterhin bestand die Proteinpräparation des
bibodys hauptsächlich aus L-scFv:Fd Heterodimeren. Funktionslose L-scFv:L-scFv
oder Fd:Fd Homodimere, die eine Größe von 108 bzw. 46 kDa aufgewiesen hätten,
wurden nicht beobachtet. Aufgrund der annähernd gleichen Größen der Fragmente
Fd-scFv und L-scFv konnte für die tribody Präparation keine Aussage getroffen wer-
den, ob eine korrekte Paarung zu L-scFv:Fd-scFv Heterodimeren stattgefunden hat-
te.
Abbildung 9. Spezifischer Nachweis der Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16] nach Aufreinigung. Die rekombinanten dimeren Proteine wurden in 293 T Zel-len in Hoch-Dichtekultur exprimiert und aus dem Überstand über Ni-NTA Affinitätschromatographie gereinigt. (A) Nachweis der Polypeptidketten im nicht-reduzierenden SDS PAGE-Gel nach Coomas-sie-Färbung oder im Western-Transfer Experiment mit einem anti-Pentahistidin (anti his) oder einem anti-humane IgG κ leichte Kette Antikörper (anti Igκ). (B) Nachweis der Ausbildung disulfidstabilisierter Dimere im Western-Transfer Experiment nach nicht-reduzierender SDS PAGE. L, leichte Kette des Antikörpers 4G7chim; Fd, fragment difficult des Antikörpers 4G7chim; scFv, single-chain fragment va-
riable.
4.1.3 Analyse der Bindungseigenschaften des bstb [Fab19xds19xds16] und
des bsbb [Fab19xds16]
Im Anschluss an die Aufreinigung der Proteine, wurden die Bindungseigenschaften
des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] in durchflusszytometri-
schen Analysen untersucht (Abbildung 10). Beide Moleküle reagierten sowohl mit
CD19-positiven SEM, als auch mit CD16-transfizierten CHO Zellen (CHO 16-10).
Eine Bindung an CD19- und CD16-negative, T-ALL abgeleitete CEM Zellen und an
untransfizierte CHO Zellen wurde nicht beobachtet. Somit banden die beiden
rekombinanten Fab-scFv Fusionen spezifisch an CD19- und CD16-positive Zellen.
Ergebnisse
44
Abbildung 10: Spezifische Bindung der Fab-scFv Fusionsproteine. Durchflusszytometrische Ana-lysen der Bindung des bstb [Fab19xds19xds16] (A) und des bsbb [Fab19xds16] (B) an CD19-positive SEM (a), CD19- und CD16-negative CEM (b), CD16-transfizierte CHO (c) und untransfizierte CHO Zellen (d). Schwarze Peaks repräsentieren das Signal der bispezifischen Fab-scFv Fusionsproteine, weiße Peaks das Signal eines Kontrollproteins.
Für bispezifische Antikörper-Derivate ist es essentiell, dass sowohl das Tumorzellan-
tigen als auch das Effektorzellantigen simultan binden zu können, um eine effiziente
Rekrutierung der Effektorzellen zu den Tumorzellen zu erzielen. Um die Möglichkeit
formal auszuschließen, dass die Protein Präparation hauptsächlich aus zwei unter-
schiedlichen Subpopulationen des Proteins bestand, die jeweils in der Lage waren,
nur eines der beiden Antigene, nicht aber beide gleichzeitig zu binden, wurde die si-
multane Bindefähigkeit der Fab-scFv Fusionen untersucht. Hierzu wurden CD19-po-
sitive SEM Zellen mit dem bstb [Fab19xds19ds16] oder dem bsbb [Fab19xds16] in-
kubiert und anschließend mit dem Fusionsprotein CD16exGFP gefärbt, das aus der
extrazellulären Domäne von CD16 und dem green fluorescent protein (GFP) bestand
(Abbildung 11, Bruenke et al, 2004). Ein Zell-assoziiertes Fluoreszenzsignal war nur
in dem Fall zu erwarten, falls das untersuchte Protein mit CD19 auf der Zelloberflä-
che und gleichzeitig mit dem löslichen CD16exGFP reagiert hatte.
Die Inkubation der Zellen mit entweder dem bstb [Fab19xds19xds16] oder dem bsbb
[Fab19xds16] resultierte bei anschließender Färbung mit CD16exGFP in einem deut-
lichen Fluoreszenzsignal im Durchflusszytometer. Kein Signal dagegen wurde nach
Inkubation der SEM Zellen mit einem analog konstruierten nicht-relevanten Kontroll-
Ergebnisse
45
protein, oder nach Färbung mit einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domä-
ne von CD64 und GFP (CD64exGFP) erhalten (Daten nicht gezeigt, Bruenke et al,
2005)). Somit enthielten die Proteinpräparationen, zumindest zu einem gewissen An-
teil, Moleküle, die gleichzeitig mit beiden Antigenen reagierten.
Die Spezifität der Bindung wurde in Blockierungsexperimenten sichergestellt. Das
Fluoreszenzsignal wurde durch Vorinkubation mit einem 50-fach molaren Über-
schuss der parentalen Antikörper 4G7 (anti-CD19) oder 3G8 (anti-CD16) auf das
Hintergrundniveau reduziert. Die Zugabe eines nicht relevanten IgG1 Kontrollantikör-
pers (TH69) im gleichen molaren Überschuss hatte dagegen keinen Einfluss. Diese
Daten bestätigten, dass der bstb [Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16]
spezifisch und simultan mit CD19 und CD16 reagierten.
Abbildung 11: Simultane Antigenbindung der bispezifischen Fab-scFv Fusionen. CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem bstb [Fab19xds19xds16] (A) oder dem bsbb [Fab19xds16] (B) inkubiert und mit einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne von CD16 und GFP (CD16ex-GFP) gefärbt (a). Schwarze peaks repräsentieren das Signal, das durch Inkubation der Zellen mit dem Fab-scFv Fusionsprotein erhalten wurde, weiße peaks das Signal eines nicht-relevanten Kontrollproteins. Das CD16ex-GFP Signal wurde durch Zugabe eines 50-fach molaren Überschusses der parentalen Antikörper 4G7 (b) und 3G8 (c) blockiert (dunkelgraue peaks), wohingegen ein nicht-relevanter IgG1Antikörper das Fluoreszenzsignal nicht beeinflusste (hellgraue Peak peaks).
Ergebnisse
46
4.1.4 Analyse der Bindungsstärken des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16]
Die Bindungsstärke ist ein wichtiger Parameter bispezifischer Antikörper, die die Zy-
totoxizität in vitro und eine spezifische Anreicherung der Moleküle am Tumor in vivo
beeinflusst. Unter diesen Gesichtspunkten sollte die Affinität bzw. die Avidität der
Fab-scFv Fusionen für beide Antigene untersucht werden. Insbesondere sollte die
Frage geklärt werden, ob die Kombination zweier CD19 Leseköpfe in der Anordnung
eines tribodys zu einem Aviditätsgewinn führte. Die Bindungsstärken des tribodys
und des bibodys wurden mit zwei unabhängigen Meßmethoden verglichen. Zum ei-
nen wurde die Gleichgewichtskonstante der Bindungsreaktion aus einer Sättigungs-
kurve bestimmt. Zum anderen wurde die Verweildauer der Moleküle auf der Ober-
fläche Antigen-positiver Zellen bei physiologischer Temperatur gemessen.
4.1.4.1 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD)
Die Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD) erfolgte mit einer durchflusszyto-
metrischen Methode (Benedict et al, 1997; Bruenke et al, 2004). CD19-positive SEM
oder CD16-transfizierte CHO Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der
Antikörper-Derivate inkubiert, die anschließend über den Hexahistidin-tag nachge-
wiesen wurden (Abbildung 12).
Aus den Sättigungskurven wurden die KD-Werte (Konzentrationen, bei denen halb-
maximale Sättigung erreicht wurde) berechnet. Der bsbb [Fab19xds16] wies für
CD19 eine KD von 23,2 ± 2,8 nM auf. Im Gegensatz dazu band der bstb
[Fab19xds19xds16] mit einer statistisch signifikant niedrigeren KD von 8,3 ± 0.6 nM
an CD19 (P = 0,006). Der tribody, der mit zwei Valenzen für CD19 ausgestattet war,
besaß somit eine 2,8-fach höhere Avidität für CD19, als der monovalente bibody.
Diese Verbesserung in der Bindung ließ darauf schließen, dass beide im tribody ent-
haltenen CD19 Leseköpfe funktional waren, und zu der Bindung an CD19 auf intak-
ten Zellen beitrugen. Im Gegensatz dazu war die Affinität für CD16 in beiden Molekü-
len ungefähr gleich hoch. Für den bsbb [Fab19xds16] wurde ein KD -Wert von
56,2 ± 6,9 nM, für den bstb [Fab19xds19xds16] ein KD-Wert von 55,6 ± 4,0 nM ermit-
telt (P = 0,74). Die Anwesenheit eines weiteren scFv Fragments im tribody beein-
Ergebnisse
47
trächtigte demzufolge nicht die Affinität des CD16 scFvs auf der anderen Polypeptid-
kette, z.B. über allosterische Effekte. Beide Moleküle wiesen eine höhere Bindungs-
stärke für CD19 auf als das Vergleichsmolekül bsscFv ds[19x16], für das im weiteren
Verlauf der Arbeit KD-Werte von 42,4 ± 5,7 nM für CD19 und 57,6 ± 8,9 nM für CD16
bestimmt wurden (Abbildung 24).
Abbildung 12: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb Fab 19xds16. CD19-positive SEM oder CD16- transfizierte CHO Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen des bstb [Fab19xds19xds16] (A) oder des bsbb [Fab19xds16] (B) inkubiert, die mit einem anti-Pentahistidin Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen wurden. Die höchste mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) einer jeden Meßreihe wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Datenpunkte auf diesen Wert normalisiert. Die Gleichgewichtskonstante (KD) wurde mit dem Langmuir-Scatchard Algorithmus bestimmt (Benedict et al., 1997). Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus 7 unabhängigen Messungen.
4.1.4.2 Bestimmung der Retentionszeit auf Antigen-positiven Zellen in vitro
In einer unabhängigen Methode zur Messung der Bindungsstärke wurde die Verweil-
dauer des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] auf intakten, Anti-
gen-positiven Zellen in vitro analysiert. Dies basierte auf der Annahme, dass bivalen-
te Moleküle gegenüber monovalenten eine verlangsamte Dissoziation von Antigen-
Ergebnisse
48
positiven Zellen zeigen sollten. Hierzu wurden CD19-positive SEM oder CD16-trans-
fizierte CHO Zellen mit dem tribody oder dem bibody dekoriert. Nachdem ungebun-
dene Moleküle aus dem Überstand entfernt worden waren, wurden die Zellen bei
37°C unter nicht-internalisierenden Bedingungen inkubiert. Zu verschiedenen Zeit-
punkten wurden dissoziierte Moleküle aus dem Überstand entfernt, und die verblie-
benen zellgebundenen Moleküle durchflusszytometrisch über den Hexahistidin-tag
nachgewiesen. Das mittlere Fluoreszenzsignal der zum Zeitpunkt t0 entnommenen
Probe wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Werte relativ dazu bestimmt.
Abbildung 13: Zelloberflächenretention der Fab-scFv Fusionsproteine. CD19-positive SEM (A) oder CD16-transfizierte CHO Zellen (B) wurden mit dem bstb [Fab19xds19xds16] (schwarze Vierecke) oder dem bsbb [Fab19xds16] (graue offene Dreiecke) dekoriert und bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden den Ansätzen Zellen entnommen, und diese auf gebundene Antikörperfragmente durchflusszytometrisch analysiert. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Werte auf diesen Punkt normalisiert. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen dem bstb [Fab19xds19xds16] und dem bsbb [Fab19xds16] sind gekennzeichnet (P < 0,05;*). Die Daten repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 3 unabhängigen Experi-menten.
Unter diesen Bedingungen war der bsbb [Fab19xds16] bereits nach 45 min nicht
mehr auf der Zelloberfläche CD19-positiver Zellen nachweisbar. Zellen hingegen, die
mit dem bstb [Fab19xds19xds16] versetzt worden waren, wiesen zu diesem Zeit-
punkt noch über 50% der ursprünglich zum Zeitpunkt t0 gemessenen mittleren Fluo-
reszenzintensität auf (Abbildung 13). Der bsbb [Fab19xds16] dissoziierte von der
Zelloberfläche einem einphasigem Verlauf folgend und wies eine Retentionshalb-
wertszeit von 9,6 ± 0,3 min auf. Im Gegensatz erfolgte die Dissoziation des bstb
[Fab19xds19xds16] zwei-phasig, mit einer kurzen α-Halbwertszeit von
10,8 ± 1,7 min, und einer langen β-Halbwertszeit (nicht bestimmt). Selbst nach
120 min betrug das relative residuelle Fluoreszenzsignal über 50%. Im Gegensatz
Ergebnisse
49
zeigten beide Moleküle vergleichbare Halbwertszeiten in der Retention auf CD16-po-
sitiven Zellen. Die berechneten Halbwertszeiten betrugen 10,3 ± 0,3 min für den bstb
[Fab19xds19xds16] und 10,2 ± 1,1 min für den bsbb [Fab19xds16] (P = 0,94).
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die Einführung eines weiteren
CD19 Lesekopfes zu einer verlangsamten Dissoziation des Moleküls vom Antigen
führte. Diese Methode wurde allerdings als nicht exakt genug eingestuft, um eine
Dissoziationskonstante zu berechnen. Dennoch bestätigten diese Resultate das Er-
gebnis der Affinitätsmessungen, wonach der tribody gegenüber dem bibody eine hö-
here Avidität für CD19, aber eine gleich hohe Affinität für CD16 besaß.
4.1.5 Bestimmung der Stabilität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] in humanem Serum in vitro
Die therapeutische Wirksamkeit Antikörper-abgeleiteter Proteine wird kritisch durch
deren Stabilität in humanem Serum beeinflusst. Um diese zu bestimmen, wurden der
tribody [Fab19xds19xds16] und der bibody [Fab19xds16] über einen Zeitraum von
vier Wochen in humanem Serum bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunk-
ten wurden beide Moleküle auf ihre residuelle Bindung an CD19-positive SEM oder
CD16-transfizierte CHO Zellen durchflusszytometrisch untersucht. Das mittlere Fluo-
reszenzsignal einer frisch angesetzten Probe wurde auf 100% gesetzt, und die resi-
duelle Bindung der einzelnen Proben relativ dazu ermittelt (Abbildung 14).
Aus den Kurven wurden die Halbwertszeiten für eine Bindung an CD19 und CD16
bestimmt. Die Halbwertszeit des CD19 Fab Fragments im bibody betrug
160,3 ± 27,2 h. Im tribody betrug die Halbwertszeit der Bindung an CD19-positive
Zellen 174.6 ± 30,3 h (P = 0,55). Es wurden keine Anstrengungen unternommen, die
Stabilität des ds CD19 scFvs und des CD19 Fab Fragments im tribody getrennt von-
einander zu untersuchen. Für den ds CD16 scFv dagegen wurden statistisch signifi-
kant unterschiedliche Halbwertszeiten von 113,9 ± 8,4 h im tribody und
195,9 ± 29,0 h im bibody gemessen (P = 0,039). Die C-terminale Erweiterung des Fd
Fragments um einen scFv beeinflusste somit die Stabilität des an der L-Kette fu-
sionierten ds CD16 scFvs. Die dieser Beobachtung zugrunde liegenden molekularen
Mechanismen wurden nicht untersucht. Zusammenfassend wurde aus diesen Experi-
menten geschlossen, dass, auch im Vergleich zu anderen rekombinanten Antikörper-
Ergebnisse
50
fragmenten, der bstb [Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] eine hohe Sta-
bilität in humanem Serum bei 37°C aufwiesen.
Abbildung 14: Stabilität der Fab-scFv Fusionsproteine in humanem Serum. Der bstb [Fab19xds19xds16] (schwarze Vierecke) und der bsbb [Fab19xds16] (graue offene Dreiecke) wurden in humanem Serum bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde die residuelle Bindeaktivität an CD19- (A) und CD16-positive Zellen (B) in Immunfluoreszenzanalysen bestimmt. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Datenpunkte auf diesen Wert normiert. Die Daten repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4-6 unabhängigen Experi-menten.
4.1.6 Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den
bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] in vitro
Rekombinante, bispezifische tandem bsscFvs und diabodies mit Spezifitäten für
CD19 und CD16 haben sich als potente ADCC-vermittelnde Moleküle erwiesen. Da-
her sollte analysiert werden, ob mit den hier gewählten Formaten eines tribodys oder
bibodys eine ähnlich starke Wirkung erzielt werden konnte. Insbesondere sollten die
Antigenspezifität sowie die Effektorzellabhängigkeit der Zielzelllyse untersucht wer-
den. In vergleichenden Experimenten sollte weiterhin der Einfluss der Avidität für das
Tumorantigen CD19 auf die Zytotoxizität der Moleküle analysiert und das Konzept
des bivalenten Anvisierens der Tumorzellen bewertet werden.
Ergebnisse
51
4.1.6.1 Analyse der Antigen-spezifischen zellulären-Zytotoxizität des bstb
[Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16]
In 51Chrom-Freisetzungsexperimenten sollte untersucht werden, ob der bstb
[Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] mit humanen MNCs als Effektoren
spezifische Lyse der Tumorzellen induzieren konnten. Als Zielzellen wurde die pro-B
ALL abgeleitete Zelllinie SEM mit der Translokation t(4;11) verwendet. Der bstb
[Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] wurden äquimolar in einer Konzen-
tration von 1 nM eingesetzt. Aus unabhängigen, gesunden Spendern isolierte, unsti-
mulierte mononukleäre Zellen (MNCs), die typischerweise 5-10% NK-Zellen enthal-
ten, dienten als Effektorzellen. Effektor- und Zielzellen wurden in einem konstanten
Effektor-zu-Zielzell (E:T)-Verhältnis von 40:1 eingesetzt. In einem Ansatz ohne An-
tikörper wurden Lysen der SEM Zellen gemessen, die unter 15% lagen. Dies gab die
basale Zytotoxizität der Effektorzellen wieder (Abbildung 15).
Im Vergleich zu dem Ansatz ohne Antikörper induzierten sowohl der
bstb[Fab19xds19xds16] (P = 0,005), als auch der bsbb [Fab19xds16] (P = 0,012)
spezifische Lyse der Zielzellen. Die gemessenen Lysen lagen im Mittel für beide Mo-
leküle bei etwa 50%. Zur Kontrolle wurden der bispezifische tribody bstb
[Fab7x7xds16] und der bispezifischer bibody bsbb [Fab7xds16] mitgeführt. Diese wa-
ren spezifisch für das T-ALL assoziierte Antigen CD7, das in der Regel nicht inner-
halb der B-Zellreihe exprimiert wird. Weder der bstb [Fab7x7xds16] noch der bsbb
[Fab7xds16] induzierten eine statistisch signifikante Lyse der CD7-negativen SEM
Zellen (P > 0,05). Die monovalente Bindung an CD16 führte somit nicht zu einer
Aktivierung und einer Zielzell-Antigen-unabhängigen Lyse durch die Effektoren. Die
Antigen-spezifische Induktion der Lyse wurde in ADCC-Blockierungsexperimenten
weiter bestätigt. Durch Zugabe eines 120-fach molaren Überschusses der murinen
parentalen Antikörper gegen CD19 (4G7; P < 0,01) oder gegen CD16 (3G8;
P < 0,05) wurde die vermittelten Lysen statistisch signifikant blockiert. Eine Zugabe
des nicht-relevanten IgG1 Antikörpers TH69 nahm keinen Einfluss (Abbildung 15).
Aus diesen Resultaten wurde gefolgert, dass der bstb [Fab19xds19xds16] und der
bsbb [Fab19xds16] ADCC gegenüber den CD19-positiven Tumorzellen vermittelten.
Eine unspezifische Aktivierung der Effektorzellen war nicht zu beobachten. Die
Blockierungsstudien zeigten, dass die bispezifischen Proteine eine Interaktion mit
Ergebnisse
52
dem Zielzellantigen und dem Effektorzellantigen benötigten, um eine effiziente
zelluläre Zytotoxizität zu induzieren.
Abbildung 15: Antigen-spezifische Induktion der Zielzelllyse durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds19]. Die CD19-positive Zelllinie SEM wurde mit den Antikörper-Derivaten bstb [Fab19xds19xds16] (A) oder bsbb [Fab19xds16] (B) in einer Konzentration von 1nM und MNCs von gesunden Spendern bei einem E:T Verhältnis von 40:1 inkubiert. Beide Moleküle vermittelten signifikant höhere Lyse gegenüber einem Ansatz mit MNCs in Abwesenheit eines Antikörpers (Ak; P < 0,05;*). Die beiden Kontrollen bstb [Fab7x7xds16] und bsbb [Fab7xds16] induzierten keine ADCC (P > 0,05). Durch Zugabe eines 120-fachen molaren Überschusses der pa-rentalen Antikörper 3G8 (anti-CD16) oder 4G7 (anti-CD19) wurde die Lyse blockiert (P < 0,05;#), nicht aber durch Zugabe eines nichtrelevanten IgG1. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten.
Um nachzuweisen, dass die beobachtete Lyse Effektorzell-vermittelt war, wurde wei-
terhin die zytotoxische Wirkung beider Antikörper-Derivate bei unterschiedlichen E:T-
Verhältnissen getestet. Bei einer konstanten Konzentration von 1 nM waren der bstb
[Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] über einen breiten Bereich an E:T
Verhältnissen wirksam. Ab einem E:T Verhältnis von 5:1 wurde eine statistisch signi-
fikante ADCC gemessen (P < 0,05). In Abwesenheit der Effektorzellen induzierten
beide Moleküle keine Zielzelllyse, die alleinige Bindung an CD19 war nicht zytoto-
xisch. Mit steigenden E:T Verhältnissen stieg auch die Zelllyse saturativ an, wobei
beide Moleküle bei einem Verhältnis von 40:1 einen Sättigungswert erreichten. Die
maximal erzielten Lysen lagen bei ca. 50% für den tribody und bei 40% für den
bibody. In diesem Experiment induzierte der CD19-bivlante tribody bei allen ge-
Ergebnisse
53
testeten E:T Verhältnissen in der Tendenz höhere Lysen als der monovalente bi-
body. Der zur Kontrolle mitgeführte bstb [Fab7x7xds16] löste keine ADCC aus und
blieb auch bei hohen E:T Verhältnissen wirkungslos (P > 0,05). Die auf einer
Basalaktivität der MNCs beruhende Lyse in Abwesenheit eines Antikörpers lag auch
bei hohen E:T Verhältnissen bei unter 10%. Die gefundene Korrelation zwischen
dem E:T Verhältnis und der Zielzelllyse bestätigte, dass die Zytotoxizität dieser
beiden bispezifischen Antikörper-Derivate durch Effektorzellen vermittelt wurde.
Abbildung 16: Einfluss des E:T Verhältnisses auf die durch den bstb [Fab19xds19xds16] oder den bsbb [Fab19xds16] vermittelte Zielzelllyse. Die CD19-positive Zelllinie SEM wurde mit den bispezifischen Antikörper-Derivaten bstb Fab19xds19xds16 (schwarze Balken) oder bsbb [Fab19xds16] (dunkelgraue Balken) in einer Konzentration von 1nM und MNCs von gesunden Spendern bei verschiedenen E:T Verhältnissen inkubiert. Der Nachweis der spezifischen Lyse erfolgte im 51Chrom-Freisetzungsexperiment. Ab einem E:T Verhältnis von 5:1 vermittelten beide Moleküle signifikant höhere Lyse gegenüber einer Kontrolle ohne Antikörper (weiße Balken; P < 0,05;*). Der bstb [Fab7x7xds16] (hellgraue Balken) als Kontrolle löste keine ADCC aus. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten.
4.1.6.2 Vergleichende Analyse des ADCC Potentials der Antikörper-Derivate
bstb [Fab19xds19xds16], bsbb [Fab19xds16] und des bsscFv ds[19x16]
Schließlich sollte das zytotoxische Potential der beiden Fab-scFv Fusionen unterei-
nander, aber auch mit dem bsscFv ds[19x16] verglichen werden. Dieser wurde paral-
lel unter identischen Bedingungen in einer stabil transfizierten 293T Produktionslinie
in einem Mini-Bioreaktor hergestellt und über den Hexahistidin-tag mit Ni-NTA Perlen
aufgereinigt. In ADCC Experimenten wurden die Moleküle in 5-fach seriellen Verdün-
nungen bei einem konstanten E:T Verhältnis von 40:1 eingesetzt und Dosis-Wir-
Ergebnisse
54
kungskurven erstellt. Um mögliche Qualitätsschwankungen der Proteinpräparationen
auszugleichen wurden die Experimente mit aufgereinigten Proteinen aus mindestens
drei unterschiedlichen Produktionsrunden durchgeführt. Als Zielzellen wurden SEM
Zellen verwendet. Alle drei CD19-gerichteten bispezifischen Moleküle induzierten
konzentrationsabhängig spezifische Lyse der Tumorzelllinie und waren bereits in nie-
drigen, subnanomolaren Konzentrationen wirksam. In diesen Versuchen lagen die
maximal erzielten Lysen für alle drei Antikörper-Derivate bei etwa 40% über dem Hin-
tergrund der Basallyse der MNCs. Allerdings unterschieden sich diese deutlich in ih-
rer Effizienz. So löste der bstb [Fab19xds19xds16] bereits in niedrigeren Konzentra-
tionen eine vergleichbar hohe Lyse aus, wie der bsbb [Fab19xds16] oder der bsscFv
ds[19x16]. Der bstb [Fab7x7xds16] als Kontrolle blieb dagegen auch in hohen Kon-
zentrationen wirkungslos.
Abbildung 17: Dosis-abhängige ADCC durch den bstb [Fab19xds19xds16], den bsbb [Fab19xds16] und den bsscFv ds[19x16]. CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem bstb [Fab19xds19xds16] (graue Vierecke), dem bsbb [Fab19xds16] (schwarze offene Dreiecke) oder dem bsscFv ds [19x16] (graue Kreise) in unterschiedlichen Konzentrationen mit MNCs gesunder Spender inkubiert (E:T = 40:1). Der Nachweis der spezifischen Lyse gegenüber der Basallyse der MNCs erfolgte im 51Chrom-Freisetzungsexperiment (P < 0,05;*). Der bstb [Fab7x7xds16] induzierte keine statistisch signifikante Lyse (P > 0,05). Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 7 unabhängigen Experimenten.
Aus den Dosis-Wirkungskurven wurden die Konzentrationen ermittelt, welche einen
halbmaximalen zytotoxischen Effekt bewirkten (EC50-Werte; Tabelle 7). Die EC50-
Werte betrugen 55,4 pM für den bstb [Fab19x19xds16], 348.2 pM für den bsbb
[Fab19xds16] und 678,0 pM für den bsscFv ds[19x16]. Folglich stieg das ADCC Po-
Ergebnisse
55
tential mit steigender Affinität/Avidität der Moleküle für CD19, wobei der tribody die
höchste und der bsscFv die niedrigste Zytotoxizität aufwiesen. Der bstb
[Fab19xds19xds16] erzielte in 12-fach niedrigeren Konzentrationen als der bsscFv
ds[19x16] (P = 0.001), und in 6-fach niedrigeren Konzentrationen als der bsbb
[Fab19xds16] (P = 0.021) eine halbmaximale zytotoxische Wirkung. Auch der bsbb
[Fab19xds16] hatte eine höherer ADCC-Effizienz als der bsscFv ds[19x16]
(P = 0.049). Die charakteristischen Bindungseigenschaften und die E50-Werte der
ADCC sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert,
dass das bivalente Anvisieren der Tumorzellen zu einem höheren ADCC Potential
führte, wodurch die Arbeitshypothese bestätigt war.
Tabelle 7: Bindungseigenschaften und Zytotoxizität der bispezifischen Antikörper-Derivate
Antikörper-Derivat KD
a [nM] CD19 CD16
t½b [min]
CD19 CD16 EC50
c [pM]
bstb [Fab19xds19xds16] 8,3 55,9 > 120 10,3 55,5
bsbb [Fab19xds16] 23,2 56,2 9,3 10,2 348,2
bsscFv ds[19x16] 42,4 57,6 7,7 14,5 678,0
a bestimmt aus Bindungssättigungskurven b bestimmt aus Zelloberflächenretentionsexperimenten c bestimmt aus ADCC Experimenten mit SEM Zellen als Ziel- und humanen MNCs als Effektorzellen
4.1.6.3 Zytotoxische Aktivität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] gegenüber primären Tumorzellen
Der bstb [Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] vermittelten potente zellulä-
re Zytotoxizität gegenüber der Zelllinie SEM. Da primäre Tumorzellen generell
schwerer zu lysieren sind als etablierte Zelllinien, sollte die Induktion spezifischer Ly-
se mit primären Tumorzellen analysiert werden. Hierzu wurden MNCs aus dem peri-
pheren Blut oder aus dem Knochenmark fünf verschiedener B-CLL Patienten und ei-
nes Patienten mit diffus großzelligem B-Zell-Lymphom aufgereinigt. Bei einer Kon-
zentration von 1nM vermittelten der bstb [Fab19xds19xds16] und der bsbb
[Fab19xds16] zelluläre Zytotoxizität gegenüber den CD19-positiven Tumorzellen aller
sechs Patienten mit MNCs gesunder Spender als Effektoren, wobei das Ausmaß der
Lysen zwischen den einzelnen Proben variierte (Abbildung 18). Mit dem bstb
[Fab19xds19xds16] wurden Lysen zwischen 29% und 57% erzielt. Der bstb
Ergebnisse
56
[Fab7xds7ds16] als Kontrolle blieb wirkungslos. Mit diesen Experimenten wurde ge-
zeigt, dass die Fab-scFv Fusionen auch potente Lyse gegenüber primären
Tumorzellen verschiedener B-CLL oder NHL Patienten induzierten.
Abbildung 18. ADCC gegenüber primären Tumorzellen durch den bstb [Fabxds19xds16] und den bsbb [Fab1xds16]. Der bstb [Fab19xds19xds16] (schwarze Balken) und der bsbb [Fab19xds16] (dunkelgraue Balken) induzieren potente ADCC gegen CD19-positive primäre Zellen, die aus dem Knochenmark (KM) oder dem peripheren Blut (PB) fünf verschiedener B-CLL und eines DLBCL Pa-tienten präpariert worden waren. Die bispezifischen Antikörper wurden bei einer Konzentration von 1nM eingesetzt. Effektorzellen waren MNCs gesunder Spendern (E:T = 40:1). Der Nachweis der spezifischen Lyse erfolgte im 51Cr Freisetzungsexperiment. Die Basallysen der MNCs in Ansätzen ohne Antikörper (weiße Balken) lagen stets bei unter 15%. Der Kontroll-bstb Fab7x7xds16 (hellgraue Balken) löste keine Lyse aus. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus Triplikatbestim-mungen. B-CLL, chronische lymphozytische Leukämie der B-Zellreihe; DLBCL, diffuses großzelliges B-Zell Lymphom.
Ergebnisse
57
4.2 Herstellung und funktionelle Charakterisierung des bispezifi-
schen single-chain Fv triple-bodys ds[19x16x19]
Die beiden Fab-scFv Fusionsproteine wiesen gegenüber dem bsscFv ds[19x16] eine
höhere Zytotoxizität auf. Dies war mit einer höheren Affinität bzw. Avidität für das Tu-
morantigen CD19 zu erklären. Zweikettige Moleküle können in manchen Fällen al-
lerdings Nachteile für die Produktion oder die Herstellung mit sich bringen. Daher
wurde im Rahmen dieser Arbeit ein einkettiges Format entworfen, das drei Leseköp-
fe in einer einzigen Polypeptidkette-Kette vereinigt. Hierzu wurde der bispezifische
scFv ds[19x16] um einen zweiten disulfidstabilisierten, CD19-gerichteten scFv erwei-
tert. Dieses Molekül repräsentierte ein neues Format für bispezifische Antikörper-De-
rivate und wurde single-chain Fv triple-body (sctb) benannt. Der sctb ds[19x16x19]
wurde bezüglich seiner Affinität, Stabilität und Zytotoxizität im Vergleich zu dem
bsscFv ds[19x16] charakterisiert.
4.2.1 Herstellung eines Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19]
Die Herstellung eines Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] erfolgte in se-
quentiellen Klonierungsschritten (Material und Methoden). Die cDNA Sequenzen der
disulfidstabilisierten scFvs 4G7 (anti-CD19) und 3G8 (anti-CD16) wurden aus dem
Vektor pSecTag2HygroC-Strep dsCD19 4G7-dsCD16 (Bruenke et al, 2005) aus-
geschnitten, oder gegebenenfalls, unter Einführung entsprechender Restriktions-
schnittstellen durch PCR amplifiziert. Die Fragmente wurden in die MCS stromab-
wärts des CMV Promotors des Vektors pSecTag2HygroC-Strep ligiert. Als Ergebnis
wurde der Vektor pSecTag2HygroC-Strep-ds19-ds16-ds19 erhalten (Abbildung 19).
Die beiden distalen scFvs waren spezifisch für CD19, und der zentrale scFv für
CD16. Das entwickelte Kassettensystem benutzte Restriktionsenzyme, die nur selten
in variablen Domänen muriner Immunglobuline schneiden, wodurch für weitere An-
wendungen ein unkomplizierter Austausch der einzelnen scFv Leseköpfe gegen
scFvs mit anderer Spezifität ermöglicht wurde. Wie der bsscFv ds[19x16] stand auch
der sctb ds[19x16x19] unter Kontrolle des starken CMV immediate early Promotors.
Das resultierende rekombinante Protein war aus identischen Untereinheiten aufge-
Ergebnisse
58
baut wie der bsscFv ds[19x16], wodurch ein direkter Vergleich dieser beiden Forma-
te möglich wurde.
Abbildung 19: Schema des Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19]. Drei scFv Fragmente sind in linarer Anordnung in tandem auf einer Polypeptidkette fusioniert. Die beiden distalen scFvs sind spezifisch für CD19, der zentrale scFv ist spezifisch für CD16. CMV, Cytomegalovirus immediate
early Promotor; Igκ, Kodiersequenz des Sekretionsleaders der murinen Immunglobulin κ leichten Ket-te; VL,VH, cDNA Sequenenzen für die variablen Regionen der Immunglobulin leichten- bzw. schwe-ren-Kette; L, cDNA Sequenz für einen 20 AS flexiblen Linker (G4S)4; S, M, H cDNA Sequenzen für einen Strep-, einen c-myc- und einen Hexahistidin-tag; S-S, stabilisierende Disulfidbrücke.
4.2.2 Bindungsstudien mit einem trispezifischen sctb [33xds16xds19] zur
Analyse der Funktionalität des single-chain Fv triple-body Formats
Zu diesem Zeitpunkt war unklar, ob in der linearen Anordnung eines sctb drei scFv
Leseköpfe ihre spezifische Bindekapazität behielten. Dieser Nachweis konnte
allerdings mit dem sctb ds[19x16x19] nur indirekt über Affinitätsmessungen erbracht
werden, da zwei der drei Leseköpfe gegen das gleiche Antigen gerichtet waren. Um
einen direkten Nachweis zu erbringen, wurde ein trispezifischer sctb hergestellt.
Hierzu wurde die cDNA Sequenz des N-terminalen ds CD19 scFv im Vektor
pSecTag2HygroCStrep-ds19xds16xds19 gegen einen CD33 gerichteten scFv aus-
getauscht (Schwemmlein et al, 2006). Der resultierende Expressionsvektor
pSecTag2HygroCStrep-33-ds16-ds19 wurde transient in 293T Zellen transfiziert, und
das rekombinante Protein anschließend über Ni-Chelat Chromatographie aus dem
Zellkulturüberstand aufgereinigt (Daten nicht gezeigt). Das aufgereinigte Protein
wurde auf Bindung an Antigen-positive Zellen durchflusszytometrisch analysiert (Ab-
bildung 20). Der sctb [33xds16xds19] band spezifisch an CD33-positive HL-60, an
CD19-positive Nalm-6, sowie an CD16-transfizierte CHO Zellen, reagierte jedoch
nicht mit CEM Zellen, die keines dieser drei Antigene exprimierten. Folglich hatten
alle in diesem sctb enthaltenen einzelnen scFv-Leseköpfe ihre Bindefähigkeit bei-
behalten.
Ergebnisse
59
Abbildung 20: Nachweis der spezifischen Bindung des sctb [33xds16xds19] an Antigen-positi-ve Zellen. CD33-positive HL-60 (A), CD19-positive Nalm-6 (B), CD16-transfizierte CHO (C) und Anti-gen-negative CEM Zellen (D) wurden mit dem sctb [33xds16xds19] (dunkelgraue peaks) oder einem Kontroll-sctb (hellgraue peaks) inkubiert und die spezifische Bindung im Durchflusszytometer analy-siert.
Zum Nachweis der simultanen Bindefähigkeit des sctb [33xds16xds19] an verschie-
dene Kombinationen dieser drei Antigene, wurden Färbungen mit CD16exGFP und
einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne von CD33 und dem red fluo-
rescent protein (CD33exRFP) durchgeführt (Abbildung 21). Dazu wurden zunächst
CD33-positive HL-60 Zellen, CD19-positive Nalm-6 und CD16-transfizierte CHO Zel-
len mit dem trispezifischen sctb [33xds16xds19] inkubiert. Die simultane Bindung die-
ses sctb an CD16 und CD33 wurde durch Färbung mit dem Fusionsprotein
CD16exGFP auf den CD33-positiven HL-60 Zellen nachgewiesen. Analog erfolgte
der Nachweis der simultanen Bindung des Moleküls an CD19 und CD16 bzw. an
CD19 und CD33 auf CD19-positiven Nalm-6 Zellen durch Färbung mit CD16exGFP
bzw. CD33exRFP. In allen drei Ansätzen wurde ein deutliches Fluoreszenzsignal im
Durchflusszytometer gemessen. Dies zeigte, dass der sctb [33xds16xds19] simultan
mit CD33 und CD16, simultan mit CD19 und CD16 und auch simultan mit CD19 und
CD33 reagierte. Schließlich wurden in einer Doppelfärbung Nalm-6 Zellen mit dem
sctb [33xds16xds19] inkubiert und anschließend mit beiden Fusionsproteinen gleich-
zeitig gefärbt. Im Durchflusszytometer fluoreszierten einzelne Zellen gleichzeitig rot
und grün, somit vermittelte der über CD19 an die Zelle gebundene sctb
[33xds16xds19] eine gleichzeitige Bindung von CD33exRFP und CD16exGFP an
diese Zelle.
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass der sctb [33xds16xds19] unab-
hängig mit den Antigenen CD19, CD33 und CD16 reagierte, und mindestens zwei
dieser Antigene von einem Molekül des sctb [33xds16xds19] gleichzeitig gebunden
werden konnten. Somit war gezeigt, dass das Format eines scFv triple-bodys geeig-
net ist, drei scFv Leseköpfe linear miteinander in einer einzigen Polypeptidkette zu
kombinieren.
Ergebnisse
60
Abbildung 21: Analyse der simultanen Bindefähigkeit des sctb [33xds16xds19]. (A) CD33-positi-ve HL-60 Zellen, CD19-positive Nalm-6 und CD16-transfizierte CHO Zellen wurden mit dem sctb [33xds16xds19] inkubiert. Der Nachweis der Simultanbindung des sctb [33xds16xds19] an CD16 und an CD33 erfolgte mit CD16exGFP auf HL-60 Zellen (a). Mit Nalm-6 Zellen wurde die Simultanbindung an CD19 und CD16 durch Färbung mit CD16exGFP (b) und die Simultanbindung an CD19 und CD33 durch Färbung mit CD33exRFP nachgewiesen (c); dunkelgrauer Peak: sctb [33xds16xds19]; hell-grauer Peak: Kontroll-protein. (B) In einer Doppelfärbung wurden Nalm-6 Zellen mit einem Kontroll-protein (a), oder dem sctb [33xds16xds19] inkubiert (b-d) und anschließend mit CD16ex-GFP (b) und CD33ex-RFP (c) gefärbt. Bei gleichzeitiger Zugabe der Proteine CD16exGFP und CD33exRFP wer-den beide Proteine durch Wechselwirkung mit dem sctb [33xds16xds19] an einzelne Zellen gebun-den, die rot und grün fluoreszieren (d).
4.2.3 Eukaryotische Expression und Aufreinigung des sctb ds[19x16x19]
Der sctb ds[19x16x19] wurde zunächst nach transienter Transfektion in 293T Zellen
hergestellt, und über Ni-NTA Affinitätschromatoghraphie aus dem Zellkulturüberstand
angereichert (Abbildung 4.15). Die Anreicherung des rekombinanten Proteins wurde
in Coomassie-gefärbten SDS-PAGE Gelen und in Western-Transfer Experimenten
geprüft. Der sctb ds[19x16x19] zeigte unter reduzierenden Bedingungen eine elektro-
phoretische Mobilität entsprechend einer Masse von ungefähr 90 kDa, die mit dem
aus seiner AS Sequenz berechneten Molekulargewicht von 88,6 kDa gut überein-
stimmte. Abbruchprodukte oder höherwertige Aggregate wurden nicht beobachtet.
Die Ausbeuten lagen hier routinemäßig bei 300-400 µg/l. Um die Herstellung zu er-
leichtern, wurde eine stabil transfizierte 293T Produktionszelllinie angelegt. Ein stark
exprimierender Einzelklon wurde in einem kleinen Bioreaktor kultiviert, und der sctb
Ergebnisse
61
ds[19x16x19] aus dem Überstand aufgereinigt. Für verschiedene Aufreinigungen be-
trugen die Ausbeuten nach Hochrechnung zwischen 3 und 10 mg/l. Diese lagen in
der gleichen Größenordnung, wie die, die für den bsscFv ds[19x16] unter identischen
Bedingungen erzielt wurden (Daten nicht gezeigt). Zur Expression dieses Proteins
lag zu Beginn der Arbeit bereits eine stabil transfizierte 293T Produktionszelllinie vor
(Jörg Brünke, unpubliziert). Die Produktion der rekombinanten Proteine im Mini-Bio-
reaktor stellte eine massive Verbesserung im Vergleich zu einer Herstellung nach
transienter Expression dar. So wurden sowohl für den sctb ds[19x16x19] als auch für
den bsscFv ds[19x16] eine höhere Ausbeuten, aber auch eine höhere Reinheit er-
zielt. Durch Anschluss eines zweiten Reinigungsschritts über den N-terminalen
Strep-tag mit Streptactin-Sepharose wurde die Reinheit des Proteins weiter
verbessert (Abbildung 22). Die durch den zweiten Aufreinigungsschritt bedingten
Verluste lagen bei ca. 25%.
Abbildung 22: Aufreinigung und Nachweis des sctb ds[19x16x19]. (A) Analyse des Proteins im
Coomassie gefärbten, reduzierendem SDS-PAGE-Gel. Der sctb ds[19x16x19] wurde in transient (a)
oder in stabil transfizierten 293T Zellen unter Kultivierung in einem kleinen Bioreaktor (b) produziert
und über affinitätschromatographische Aufreinigung mit Ni-NTA Agarose angereichert. Die Reinheit
des sctb ds[19x16x19] wurde durch einen zweiten Reinigungsschritt mit Streptactin-Sepharose weiter
verbessert (c). (B) Nachweis des sctb ds[19x16x19] in Western-Transfer Experimenten mit einem anti-
Pentahistidin (a) oder einem anti-Strep-tag II Antikörper (b) nach reduzierender SDS-PAGE. Im
Western-Transfer Experiment mit einem anti-Pentahistidin Antikörper nach SDS-PAGE unter nicht-re-
duzierenden Bedingungen ergaben sich keine Hinweise auf über Disulfidbrücken verbundene
kovalente Aggregate (c).
4.2.4 Analyse der Bindungseigenschaften des sctb ds[19x1619]
Nach erfolgter Aufreinigung wurde die Fähigkeit des sctb ds[19x16x19] an CD19 und
CD16 zu binden in durchflusszytometrischen Analysen mit Antigen-positiven Zellen
Ergebnisse
62
überprüft. Der sctb band spezifisch an CD19-positive SEM und an CD16-transfizierte
CHO Zellen, reagierte jedoch nicht mit CD19- und CD16-negativen CEM und un-
transfizierten CHO Zellen (Abbildung 23).
Abbildung 23: Spezifische und simultane Bindung des sctb ds[19x16x19]. (A) Durchflusszytome-trische Analysen der Bindung des sctb ds[19x16x19] an CD19-positive SEM Zellen (a), CD19-ne-gative CEM Zellen (b), CD16-transfizierte CHO Zellen (c) und untransfizierte CHO Zellen (d). Schwar-ze Peaks repräsentieren das Signal des sctb ds[19x16x19], weiße Peaks das Signal eines Kontroll-proteins. (B) CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem sctb ds [19x16x19] inkubiert und mit einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne von CD16 und GFP (CD16ex-GFP) gefärbt (a). Schwarze peaks repräsentieren das Signal, das mit dem sctb ds[19x16x19], weiße peaks das Signal, das mit einem Kontroll-Protein erhalten wurde. Das CD16ex-GFP-Signal wurde durch Zugabe eines 100-fach molaren Überschusses der Parentalantikörper anti-CD19 4G7 (b) und anti-CD16 3G8 (c) blo-ckiert (dunkelgraue peaks), wohingegen ein nicht-relevanter IgG1 Antikörper keinen Einfluss auf das Fluoreszenzsignal hatte (hellgraue peaks).
Auch für den sctb ds[19x16x19] wurde, wie für die bispezifischen Fab-scFv Fusionen
beschrieben, die simultane Bindekapazität analysiert (siehe Kapitel 4.1.2). Der sctb
ds[19x16x19] reagierte simultan mit CD19 auf intakten SEM Zellen und dem
löslichen Fusionsprotein CD16exGFP (Abbildung 23). Kein Fluoreszenzsignal wurde
in einem Ansatz mit einem nichtrelevanten Kontroll-sctb, oder bei Zugabe des
Fusionsproteins CD64exGFP beobachtet (Daten nicht gezeigt). Weiterhin wurde in
Blockierungsexperimenten die Spezifität des Moleküls sichergestellt. Bei Zugabe ei-
nes 50-fach molaren Überschusses der parentalen Antikörper 4G7 (anti-CD19) oder
3G8 (anti-CD16) wurde das Fluoreszenzsignal auf das Hintergrundniveau reduziert.
Ein IgG1 Isotyp Antikörper in gleicher Konzentration hingegen zeigte keinen Einfluss
Ergebnisse
63
auf das Fluoreszenzsignal. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass der
sctb ds[19x16x19] sowohl mit dem Tumorzellantigen CD19 als auch mit dem Effek-
torzellantigen CD16 spezifisch und simultan reagierte.
4.2.5 Vergleich der Bindungsstärken des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv
ds[19x16]
Ziel dieser Arbeit war, ein einkettiges bispezifisches Molekül mit bivalenter Bindung
für CD19 herzustellen um ein bivalentes Anvisieren der Tumorzellen zu ermöglichen.
Um zu untersuchen, ob durch die Erweiterung des bsscFv ds[19x16] um einem zwei-
ten, gegen CD19-gerichteten scFv ein Aviditätsgewinn erzielt wurde, wurden drei
unabhängige Experimente durchgeführt. Diese beinhalteten eine Bestimmung der
Gleichgewichtskonstanten aus Sättigungskurven, Studien zur kompetitiven Inhibition
des parentalen CD19 Antikörpers 4G7, sowie eine Bestimmung der Zelloberflächen-
retentionszeit. Um einen guten Vergleich zu gewährleisten, wurden beide Moleküle
parallel unter identischen Bedingungen hergestellt und aufgereinigt.
4.2.5.1 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD)
Zur Bestimmung der Gleichgewichtskonstante wurden sättigende Bindungskurven
mit kalibrierter Durchflusszytometrie aufgenommen und aus diesen die KD-Werte ab-
geleitet (Abbildung 24). Die Messung der Affinität der Bindung an CD19 erfolgte mit
CD19-positiven SEM Zellen, die Affinität des CD16 Lesekopfes wurde mit CD16-
transfizierten CHO Zellen bestimmt.
Der sctb ds[19x16x19] hatte eine KD von 13,0 ± 1,2 nM für CD19, der bsscFv
ds[19x16] eine KD von 42,4 ± 5,7 nM (P = 0,005). Demzufolge wies der sctb mit zwei
CD19 Leseköpfen eine 3,3-fach höhere Avidität für CD19 auf als der monovalente
bsscFv. Im Gegensatz dazu besaßen die beiden Moleküle eine vergleichbare Affini-
tät für CD16. Die KD Werte für CD16 wurden zu 58,6 ± 4,0 nM für den sctb und zu
57,6 ± 8,9 nM für den bsscFv bestimmt (P = 0,772). Die Affinität des ds CD16 scFvs
war unabhängig davon, ob nur sein N-Terminus an einen scFv, oder, wie im sctb,
seine beiden Enden an scFvs fusioniert waren. Mögliche herstellungsbedingte
Ergebnisse
64
Schwankungen in der Qualität der Proteine wurden durch Experimente mit ver-
schiedenen Aufreinigungen ausgeglichen. Die Produktion in Hochdichtekultur im
Bioreaktor hatte gegenüber einer Herstellung nach transienter Expression in
Zellkulturschalen keinen Einfluss auf die Affinität oder Avidität, und damit auf die
Qualität der beiden Moleküle nach der Aufreinigung (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 24: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für den sctb ds[19x16x19] und den bsscFvs ds[19x16]. Steigende Konzentrationen des aufgereinigten sctb ds [19x16x19] (A) oder des bsscFv ds[19x16] (B) wurden mit CD19-positiven SEM Zellen oder CD16-transfizierten CHO Zellen in-kubiert und mit einem anti-Pentahistidin Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die maxi-mal erhaltene mittlere Fluoreszenzintensität (MFl) wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Werte re-lativ zu diesem Wert bestimmt. Die KD-Werte der Bindung an CD19 und CD16 wurden mit Hilfe des Langmuir-Scatchard Algorithmus berechnet (Benedict et al, 1997).
4.2.5.2 Kompetitive Inhibition des parentalen CD19 Antikörpers
Die relative Bindungsstärke eines Antikörperfragments für ein Antigen kann aus sei-
ner konzentrationsabhängigen Fähigkeit, den parentalen Antikörper von diesem Anti-
gen zu verdrängen, bestimmt werden. Daher boten kompetitive Inhibitionsexperimen-
te mit dem monoklonalen Antikörper mAk 4G7 eine unabhängige Methode, die Bin-
dungsstärken des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] zu vergleichen.
Hierzu wurden CD19-positive SEM Zellen mit dem mAk 4G7 in einer subsaturativen
Konzentration von 0,5 µg/ml inkubiert. Die beiden Antikörper-Derivate wurden als
Ergebnisse
65
Inhibitoren eingesetzt und in steigenden Konzentrationen zugegeben. Die residuelle
Bindung des mAk 4G7 an die Zellen wurde anschließend durchflusszytometrisch
bestimmt. Die relative Inhibition wurde berechnet und gegen die eingesetzte
Konzentration des Inhibitors aufgetragen (Abbildung 25).
Abbildung 25: Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G7 durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]. Der CD19-gerichtete Antikörper 4G7 wurde in Ge-genwart steigender Konzentrationen des sctb ds [19x16x19] (schwarze Vierecke) oder des bsscFv ds[19x16] (graue offene Dreiecke) mit CD19-positiven SEM Zellen inkubiert. Der zellgebundene Anti-körper 4G7 wurde mit einem PE-gekoppelten anti-Maus IgG Sekundärantikörper durchflusszyto-metrisch nachgewiesen. Die relative Inhibition wurde mit der Gleichung % Inhibition = [(% MFI ohne Inhibitor - % MFI mit Inhibitor) / (% MFI ohne Inhibitor)] x 100 (MFI, mittlere Fluoreszenz Intensität) er-rechnet. Der sctb ds [19x16x19] blockierte in niedrigeren Konzentrationen als der bsscFv ds[19x16] die Bindung des 4G7 Antikörpers (P < 0,05; *). Die Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 5 unabhängigen Experimenten.
Sowohl der bsscFv ds[19x16] als auch der sctb ds[19x16x19] inhibierten konzentra-
tionsabhängig die Bindung des mAk 4G7 an die Zellen. Die Zugabe eines 450-fach
molaren Überschusses des sctb resultierte in einer > 95%igen Reduzierung des
Fluoreszenzsignals gegenüber einem Ansatz mit dem mAk 4G7 in Abwesenheit
eines Inhibitors. Um beide Moleküle zu vergleichen wurde die Konzentration, die in
einer halb-maximalen Inhibition resultierte (IC50), bestimmt. Der IC50-Wert für den
sctb ds[19x16x19] betrug 81,3 ± 1,2 nM, wohingegen für den bsscFv ds[19x16] ein
statistisch signifikant höherer IC50-Wert von 287,5 ± 1,3 nM bestimmt wurde
(P = 0.013). Daher waren 3,5-fach höhere Konzentrationen des bsscFv als des sctb
nötig um eine halb-maximale Inhibition zu erreichen. Dieses Ergebnis stimmt gut mit
den aus den Affinitätsmessungen erhaltenen Ergebnissen überein, in denen für den
sctb ds[19x16x19] eine 3,3-fach höhere Avidität für CD19 bestimmt wurde.
Ergebnisse
66
4.2.5.3 Bestimmung der Zelloberflächenretention in vitro
In weiteren Experimenten wurde die in vitro Retentionszeit der Moleküle auf der Zell-
oberfläche Antigen-positiver Zellen untersucht, in analoger Weise wie für die Fab-
scFv Fusionen bereits beschrieben wurde (Kapitel 4.1.2). Die Messungen wurden mit
CD19-positiven SEM und CD16-transfizierten CHO Zellen durchgeführt (Abbildung
26).
Abbildung 26: Bestimmung der in vitro Zelloberflächenretention des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16]. CD19-positive SEM (A) oder CD16-transfizierte CHO Zellen (B) wurden mit dem sctb ds[19x16x19] (schwarze Vierecke) oder dem bsscFv ds[19x16] (offene graue Dreiecke) de-koriert und bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Zellproben entnommen, und die auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörper-Fragmente durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 wurde auf 100% gesetzt, und alle weiteren Daten-punkte auf diesen Wert normalisiert. Die Daten repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 3 unabhängigen Experimenten.
Im Vergleich zum sctb ds[19x16x19] zeigte der CD19-monovalente bsscFv ds[19x16]
eine deutlich kürzere Retentionszeit auf der Zelloberfläche CD19-positiver Zellen,
aber eine etwa gleich lange Verweildauer auf CD16-positiven Zellen (Abbildung 26).
Die Dissoziation beider Moleküle folgte einem einphasigen Verlauf. Die Halb-
wertszeiten der Retention betrugen 7,7 ± 0,5 min für den bsscFv ds[19x16] und 51,5
± 2,9 min für den sctb ds[19x16x19] (P = 0.006). Im Gegensatz konnte kein Unter-
schied in der Zelloberflächenretention auf CD16-transfizierten CHO-Zellen beobach-
tet werden. Die Halbwertszeiten wurden zu 15,5 ± 1,2 min für den sctb ds[19x16x19]
und zu 14,5 ± 1,9 min für den bsscFv ds[19x16] bestimmt (P = 0,848).
Ergebnisse
67
Zusammenfassend wurde in drei unabhängigen Methoden gezeigt, dass die Erweite-
rung des bsscFv ds[19x16] um einen zweiten ds CD19 scFv zu einem Aviditätsge-
winn führte. Die Affinität des ds CD16 scFvs hingegen blieb durch die Fusion unbe-
einflusst. Dies erlaubte eine Bewertung des Einflusses der Avidität für CD19 auf das
zytotoxische Potential der bispezifischen Antikörper-Derivate.
4.2.6 Bestimmung der Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv
ds[19x16] in humanem Serum in vitro
Ein kritischer Parameter, der die Wirksamkeit Antikörper-abgeleiteter Proteine beein-
flusst, ist die Stabilität in humanem Serum. Die Einführung stabilisierender intramole-
kularer Disulfidbrücken in konservierte Gerüstregionen des CD16 scFv 3G8 und des
CD19 scFv 4G7 führte zu einem massiven Stabilitätsgewinn. Auch der bsscFv
ds[19x16] aus diesen stabilisierten Leseköpfen zeigte eine deutlich erhöhte Halb-
wertszeit als der bsscFv [19x16] auf, der aus den nicht-stabilisierten scFvs bestand.
Obwohl für die einzelnen scFv Leseköpfe eine gute Serumstabilität belegt worden
war, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, ob sie diese Eigenschaft
auch im Format eines sctb beibehalten würden. Als Vergleichsmolekül wurde der
bsscFv ds[19x16] mitgeführt.
Die gereinigten Proteine wurden über einen Zeitraum von vier Wochen in humanem
Serum bei 37°C in vitro inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde die residuelle
Antigenbindung an CD19-positiven SEM oder CD16-transfizierten CHO Zellen durch-
flusszytometrisch gemessen. Das mittlere Fluoreszenzsignal einer frisch angesetzten
Probe wurde auf 100% gesetzt, und die residuelle Bindung der Moleküle der
einzelnen Proben relativ dazu berechnet (Abbildung 27).
Der sctb ds[19x16x19] zeigte gegenüber dem bsscFv ds[19x16] eine statistisch sig-
nifikant verlängerte residuelle Bindung an CD19. Die Halbwertszeiten betrugen
94,0 ± 3,1 h für den sctb ds[19x16x19] und 70,4 ± 3,1 h für den bsscFv ds[19x16]
(P = 0,002). Im Gegensatz dazu war der ds CD16 scFv im Format des bsscFv sig-
nifikant stabiler als im Format des sctb. Nach 700 h lag die relative residuelle CD16-
Bindekapazität bei über 50%. Die Halbwertszeit im sctb ds[19x16x19] betrug da-
gegen 153,1 ± 4,6 h. Diese war im Vergleich zu anderen Antikörper-Derivaten immer
noch als sehr hoch einzustufen, und gemessen an der Halbwertszeit der CD19 Bin-
Ergebnisse
68
dung dürfte die CD16 Seite nicht limitierend sein. Auch waren sowohl die Halbwerts-
zeiten der Bindung an CD19 und an CD16 deutlich höher als die publizierten Werte
der entsprechenden nicht-stabilisierten scFvs im bsscFv [19x16] (Bruenke et al,
2005). Daraus wurde geschlossen, dass sich im sctb ds[19x16x19] zumindest zu ei-
nem gewissen Anteil die stabilisierenden Disulfidbrücken korrekt ausgebildet hatten.
Abbildung 27: Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bssFv ds[19x16] in humanem Serum bei 37°C. Der sctb ds[19x16x19] (schwarze Vierecke) und der bsscFv ds[19x16] (offene graue Dreiecke) wurden in vitro in humanem Serum bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde die residuelle Bindeaktivität an CD19- (A) und CD16-positive Zellen (B) in Immunfluoreszenzanalysen bestimmt. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 wurde auf 100% gesetzt und alle Datenpunkte auf diesen Wert normiert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM aus 6 unabhängigen Experimenten.
4.2.7 Bestimmung der Plasmaretention des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv
ds[19x16] in Mäusen
Als ein weiterer, wichtiger Parameter gilt die Plasmaverweildauer therapeutischer
Moleküle in vivo. Durch die erzielte Vergrößerung der molekularen Masse des sctb
ds[19x16x19] auf 89 kDa (gegenüber 59 kD des bsscFv ds[19x16]) war erhofft wor-
den, eine Verlängerung der Verweildauer des Moleküls im Blut in vivo zu erzielen.
Um die Plasmaverweildauer zu bestimmen wurden äquimolare Mengen des bsscFv
ds[19x16] und des sctb ds[19x16x19] separat in die Schwanzvene von NOD-SCID
Mäusen injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurden Blutpro-
ben entnommen und Serum präpariert. In durchflusszytometrischen Analysen mit An-
tigen-positiven Zellen wurden die im Serum enthaltenen Antikörper-Derivate über
den Hexahistidin-tag nachgewiesen. Hierbei wurde die residuelle Bindung auf CD19-
Ergebnisse
69
positiven SEM, als auch auf CD16-transfizierten CHO Zellen überprüft. Das mittlere
Fluoreszenzsignal einer Blutprobe, die zum Zeitpunkt t0 = 1 min entnommen worden
war, wurde auf 100% gesetzt (Abbildung 28).
Abbildung 28: Vergleich der Plasmaverweildauer des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in Mäusen. Die beiden Antikörper-Fragmente wurden in äquimolaren Mengen den NOD-SCID Mäusen i.v. injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden den Mäusen Blutproben entnommen und Serum präpariert. Der relative Gehalt an sctb ds[19x16x19] (schwarze Vierecke) und bsscFv ds[19x16] (graue Dreiecke) im Serum wurde auf CD19-positiven SEM (A) und auf CD16-transfizierten CHO-Zellen (B) durchflusszytometrisch ermittelt. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 = 1min wurde auf 100% gesetzt und alle Datenpunkte auf diesen Wert normiert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten. Der sctb ds[19x16x19] war statistisch signifikant länger im Serum nachzuweisen als der bsscFv ds[19x16] (P < 0,05, *).
Aus den Messwerten wurden die Plasma-Halbwertszeiten berechnet. Die Plasma-
Halbwertszeit belief sich für den bsscFv ds[19x16] auf ca. 2 h. Die gemessenen Wer-
te betrugen 1,9 ± 0,2 h aus den Messungen mit SEM bzw. 1,9 ± 0,1 h aus den Mes-
sungen mit CD16-transfizierten CHO Zellen. Im Gegensatz dazu zeigte der sctb
ds[19x16x19] eine statistisch signifikant erhöhte Halbwertszeit von ca. 4 h auf
(3,9 ± 0,6 h und 4,2 ± 0,3 h). Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert, dass die Fu-
sion mit einem weiteren scFv und der damit verbundenen Vergrößerung der ur-
sprünglichen molekularen Masse von 59 kDa auf 89 kDa zu einer Verdopplung der
Plasmahalbwertszeit in vivo führte. Somit besitzt der sctb ds[19x16x19] auch
gewissen pharmakokinetische Vorteile gegenüber dem bsscFv ds[19x16].
Ergebnisse
70
4.2.8 Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den
sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]
Für den bsscFv ds[19x16] war bereits gezeigt worden, dass dieser mit humanen NK-
Zellen Antigen-spezifisch zelluläre Zytotoxizität gegenüber CD19-positiven Leukä-
mie- und Lymphomzellen vermittelte. Im Folgenden sollte das ADCC Potential des
sctb ds[19x16x19] untersucht werden. Insbesondere sollte in vergleichenden Experi-
menten analysiert werden, ob der im sctb ds[19x16x19] erzielte Aviditätsgewinn auch
zu einer erhöhten Zytotoxizität führte, wie dies bereits für die zweikettigen Fab-scFv
Fusionen demonstriert worden war.
4.2.8.1 Nachweis der Antigen-spezifischen Induktion der zellulären-Zytotoxizi-
tät durch den sctb ds[19x16x19]
Zunächst wurden das ADCC-Potential und die Antigen-spezifische Zytotoxizität des
sctb ds[19x16x19] in Blockierungsexperimenten analysiert. Der sctb ds[19x16x19]
wurden in einer Konzentration von 1 nM gegen die CD19-positiven SEM Zellen ein-
gesetzt. MNCs von gesunden Spendern waren die Effektorzellen (Abbildung 29). Zur
Kontrolle wurde der bispezifische sctb ds[7xds16x7] gegen CD7 mitgeführt. Dieses
Protein war analog konstruiert und war unter denselben Bedingungen wie der sctb
ds[19x16x19] exprimiert und aufgereinigt worden (Abbildung 29).
In einer Konzentration von 1 nM vermittelte der sctb ds[19x16x19] starke Lyse der
Tumorzellen, wobei die im Mittel maximal erzielte Lyse ca. 60% betrug. Dagegen
blieben der nicht-relevante bispezifische sctb ds[7xds16x7], wie auch die parentalen,
murinen, monoklonalen Antikörper gegen CD19 (mAk 4G7) und CD16 (mAk 3G8)
wirkungslos. Bei einer Zugabe eines 125-fach molaren Überschusses des mAk 4G7
wurde die Lyse statistisch signifikant blockiert (P = 0,011). Auch der mAk 3G8 inhi-
bierte die ADCC (0,004). Dagegen beeinflusste ein nichtrelevanter IgG1 Antikörper
nicht die durch den sctb ds[19x16x19] vermittelte Zytotoxizität (P = 0,45). Aus diesem
Ergebnis wurde geschlossen, dass die Tumorzelllyse Antigen-spezifisch war. Der
sctb ds[19x16x19] benötigte die Interaktion mit CD19 auf den Tumorzellen und dem
trigger Molekül CD16 auf den Effektorzellen, um ADCC auszulösen
Ergebnisse
71
Abbildung 29: Antigen-spezifische Induktion der ADCC durch den sctb ds[19x16x19]. CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem sctb ds[19x16x19] in einer Konzentration von 1 nM versetzt. Als Effektorzellen wurden MNCs gesunder Spender bei einem E:T Verhältnis von 40:1 eingesetzt, und die spezifische Lyse im 51Chrom-Freisetzungsexperiment analysiert. Der sctb ds[19x16x19] induzierte spezifische ADCC (P < 0,05;*). Der sctb [7xds16x7] und die parentalen monoklonalen Antikörper (mAk) 4G7 (anti-CD19) oder 3G8 (anti-CD16) zur Kontrolle lösten keine ADCC aus (P > 0,05). Durch Zugabe eines 120-fach molaren Überschusses der parentalen Antikörper wurde die sctb-vermittelte Lyse blockiert (P < 0,05;#), nicht aber durch einen nicht-relevanten IgG1 Antikörper. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten.
Nachdem die Antigen-spezifische Wirkung des sctb ds[19x16x19] nachgewiesen
worden war, wurde die Abhängigkeit der Zielzelllyse vom eingesetzten E:T-Verhältnis
analysiert. Zum Vergleich wurde der bsscFv ds[19x16] mitgeführt. Bei einer konstan-
ten Konzentration von 1 nM wurden die zytotoxischen Aktivitäten beider Moleküle ge-
genüber SEM Zellen bei verschiedenen E:T Verhältnissen analysiert. (Abbildung 30).
Zu beobachten war ein starker Zusammenhang zwischen der spezifischen Lyse und
dem eingesetzten E:T Verhältnis. So vermittelten der sctb ds[19x16x19] und der
bsscFv ds[19x16] zelluläre Zytotoxizität über einen weiten Bereich verschiedener E:T
Verhältnisse von 2,5:1 bis 80:1 (P < 0,05). Die Lyse stieg dabei in saturativer Weise
mit wachsenden E:T Verhältnissen an, wobei in Abwesenheit der MNCs keine Lysen
beobachtet wurden. Bemerkenswerter Weise war die Tendenz zu erkennen, dass
der sctb ds[19x16x19] bei allen getesteten E:T Verhältnissen höhere Lysen auslöste,
als der bsscFv ds[19x16]. Die Zelllyse war Antigen-spezifisch, da der nichtrelevante
sctb [7xds16x7] selbst bei hohen E:T Verhältnissen wirkungslos blieb (P > 0,05). Auf-
grund der Basalaktivität der Effektorzellen wurden auch in Abwesenheit eines Anti-
körpers schwache Lysen gemessen, die allerdings selbst bei hohen E:T Verhältnis-
sen bei unter 15% lagen. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die Tu-
Ergebnisse
72
morzelllyse durch zelluläre Zytotoxizität ausgelöst wurde, da ein deutlicher Zusam-
menhang zwischen dem Ausmaß der Lyse und dem E:T Verhältnis bestand.
Abbildung 30: Zytotoxizität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] in Abhäng-igkeit des E:T Verhältnisses. CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem sctb ds[19x16x19] (schwarze Balken) oder dem bsscFv ds[19x16] (dunkelgraue Balken) in einer Konzentration von 1 nM versetzt und mit MNCs gesunder Spender bei unterschiedlichen E:T Verhältnissen inkubiert. In 51Cr-Freisetzungsexperimenten wurde die spezifische Lyse durch die bispezifischen Antikörper-Derivate gegenüber einem Ansatz mit MNCs in Abwesenheit eines Antikörpers ermittelt (weiße Balken; P < 0,05;*). Der Kontroll-sctb [7xds16x7] (hellgraue Balken) löste gegen die CD7-negativen SEM Zellen keine ADCC aus (P > 0,05). Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten.
4.2.8.2 Vergleichende Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxi-
zität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]
Im folgendem sollte untersucht werden, ob die Erweiterung des bsscFv ds[19x16] um
einen zweiten CD19 gerichteten scFv und der damit verbundene Aviditätsgewinn zu
einer Erhöhung der zytotoxischen Eigenschaften führte. Daher wurde das ADCC-Po-
tential beider Moleküle in vergleichenden Zytotoxizitätsexperimenten analysiert. Drei
CD19-positive Tumorzelllinien, die unterschiedliche B-Zell Neoplasien verschiedener
Reifungsstadien verkörperten, wurden als Zielzellen verwendet. SEM Zellen reprä-
sentierten eine Hoch-Risiko proB-ALL mit Translokation t(4;11), BV-173 eine B-Zell
Vorläufer Leukämie mit Translokation t(9;22) vom Mischlinien-Phänotyp (CD19- und
CD33-positiv). Beide Translokationen sind mit einer schlechten Prognose assoziiert.
ARH-77 stellte eine reifzellige, EBV-positive B-lymphoblastoide Zellline dar. Um mög-
liche aufreinigungsbedingte Qualitätsschwankungen der beiden rekombinanten Pro-
Ergebnisse
73
teine auszugleichen wurden die Versuche für jede Zelllinie mit Protein aus min-
destens 3 verschiedenen Produktionen durchgeführt. Sowohl der sctb ds[19x16x19]
als auch der bsscFv ds[19x16] vermittelten konzentrationsabhängig Zytotoxizität
gegenüber allen drei untersuchten Zelllinien (Abbildung 31). In allen drei Fällen war
der sctb ds[19x16x19] effizienter als der bsscFv ds[19x16] und induzierte gleich hohe
Lysen in niedrigeren Konzentrationen. Im Gegensatz dazu blieben die zur Kontrolle
eingesetzten sctb [7xds16x7] und bsscFv [7xds16] auch in hohen Konzentrationen
wirkungslos.
Abbildung 31: Dosis-abhängige Vermittlung der Lyse humaner Tumorzelllinien durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]. Die Zell-vermittelte zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] (schwarzes Quadrate) und des bsscFv ds[19x16] (graue offene Dreiecke) gegenüber den CD19-positiven Zelllinien SEM (A), BV-173 (B) und ARH-77 (C) wurde in 51Cr-Freisetzungs-Experimenten analysiert. MNCs gesunder Spender wurden als Effektoren eingesetzt (E:T = 40:1 ein-gesetzt. Der sctb [7xds16x7] (schwarze Kreise) und der bsscFv [7xds16] (graue offene Kreise) blieben wirkungslos. Statistisch signifikante Lysen (P < 0,05) gegenüber der Basalaktivität der MNCs sind mit einem Stern (*) markiert. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4-6 unabhängigen Ex-perimenten. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den induzierten Lysen durch den ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] sind gekennzeichnet (P < 0,05; #).
Aus den Dosis-Wirkungskurven wurden die EC50-Werte für den sctb ds[19x16x19]
und den bsscFv ds[19x16] berechnet (Tabelle 8). Die EC50-Werte des sctb
Ergebnisse
74
ds[19x16x19] lagen im picomolaren Bereich und waren statistisch signifikant niedri-
ger als die des bsscFv ds[19x16]. Der sctb ds[19x16x19] lysierte die SEM Zellen mit
einem EC50-Wert von 4,1 pM. Der bsscFv ds[19x16] dagegen benötigte eine 27,7-
fach höhere Konzentration, um eine halbmaximale Lyse zu erzielen
(EC50 = 113,6 pM). Gegen die Zelllinien BV-173 und ARH-77 induzierte der sctb
ds[19x16x19] in 26,3 und 44,0-fach niedriger Konzentration als der bsscFv ds[19x16]
eine halbmaximale Lyse. Dies zeigte, dass der Aviditätsgewinn um den Faktor 3 im
sctb ds[19x16x19] gegenüber dem bsscFv ds[19x16] zu einem deutlich gesteigerten
ADCC-Potential führte. Somit war das Konzept des bivalenten Anvisierens der Tu-
morzellen auf die einkettigen bispezifischen Formate übertragbar.
Tabelle 8: EC50-Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit CD19-positiven Zelllinien
4.2.8.3 Zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16]
gegen primäre Leukämie- und Lymphomzellen
Primäre Tumorzellen sind im Allgemeinen schwieriger zu lysieren als etablierte Zellli-
nien. Daher sollte auch die Fähigkeit des rekombinanten sctb ds[19x16x19], ADCC
gegenüber primären humanen Tumorzellen aus Patienten zu vermitteln, untersucht
werden. Hierzu wurden Tumorzellen aus dem peripheren Blut (PB), oder aus dem
Knochenmark (KM) von elf unterschiedlichen Patienten aufgereinigt (Abbildung 32).
Neun dieser Patienten waren mit einer B-CLL, einer mit einem Mantelzell-Lymphom
(MCL) und einer mit einer B-ALL diagnostiziert worden. Die CD19-Expression auf
den malignen Zellen wurde durch Immunfluoreszenz nachgewiesen. Die isolierten
malignen Zellen wurden in Zytotoxizitätstests mit MNCs gesunder Spender als Effek-
toren bei einem E:T Verhältnis von 40:1 als Zielzellen eingesetzt.
Ergebnisse
75
Abbildung 32: Vermittlung der ADCC gegen primäre Leukämie- und Lymphomzellen durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]. Der sctb ds[19x16x19] (schwarze Balken) und der bsscFv ds[19x16] (weiße Balken) induzieren potente ADCC gegenüber primären Zellen, die aus dem peripherem Blut (PB), oder dem Knochenmark (KM) verschiedener Leukämie- oder Lymphompatien-ten isoliert wurden. Die Antikörper-Derivate wurden in einer Konzentration von 1 nM eingesetzt. Ef-fektorzellen waren MNCs gesunder Spender (E:T = 40:1). Die Antikörper-vermittelte Lyse wurde in 51Cr-Freisetzungsexperimenten gemessen. Die Basallyse der MNCs (hellgraue Balken) lag bei unter 10%. Der sctb [7xds16x7] (dunkelgraue Balken) löste keine ADCC aus. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus Triplikatbestimmungen. B-CLL, chronische B-lymphatische Leukämie, B-ALL, akute B-lymphatische Leukämie; MCL, Mantelzelllymphom.
Der sctb ds[19x16x19] und der bsscFv ds[19x16] lysierten bei einer Konzentration
von 1 nM die primären Tumorzellen (Abbildung 4.23). Auch hier war die Tendenz zu
erkennen, dass der sctb ds[19x16x19] in allen elf Fällen höhere Lysen induzierte, als
der bsscFv. Da der sctb [7xds16x7] keine Zelllyse auslöste, war der gemessene Ef-
fekt CD19-spezifisch. Die Basallyse durch die MNCs in einem Ansatz ohne Antikör-
per lag dabei stets bei unter 10%. Mit den isolierten Zellen der B-CLL Patienten 1-4
wurden Dosis-Wirkungskurven erstellt (Abbildung 33). Für die Probe eines jeden Pa-
tienten wurden MNCs von mindestens drei unabhängigen, gesunden Spendern bei
einem konstanten E:T von 40:1 eingesetzt.
Ergebnisse
76
Abbildung 33: Dosis-abhängige ADCC durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] gegen primäre Tumorzellen. Die Zell-vermittelte zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] (schwarze Quadrate) und des bsscFv ds[19x16] (graue offene Dreiecke) gegenüber primären Zellen 4 verschiedener B-CLL Patienten wurde mit MNCs gesunder Spender bei einem E:T Verhältnis von 40:1 analysiert. Der sctb [7xds16x7] (schwarze offene Kreise) blieb wirkungslos. Die Ergebnisse re-präsentieren Mittelwerte ± SEM aus 3-6 unabhängigen Experimenten. *Statistisch signifikante Unter-schiede in der ADCC gegenüber Basallyse der MNCs; #statistisch signifikante Unterschiede in der ADCC durch den sctb ds[19x16x19] gegenüber dem bsscFv ds[19x16].
Der sctb ds[19x16x19] und der bsscFv ds[19x16x19] vermittelten Dosis-abhängige
Lyse der primären Tumorzellen aller vier Patienten. Der sctb [7xds16xds7] als Kon-
trolle blieb dagegen auch bei hohen Konzentrationen wirkungslos (P > 0,05). Wie in
ADCC Experimenten mit Zelllinien vermittelte der sctb ds[19x16x19] auch hier in we-
sentlich geringeren Konzentrationen gleich hohe Lysen als der bsscFv ds[19x16].
Aus den Dosis-Wirkungskurven wurden die EC50-Werte berechnet. Der sctb
ds[19x16x19] vermittelte gegenüber primären malignen Zellen ADCC mit EC50-Wer-
ten in niedrig-picomolaren Konzentrationen und induzierte halbmaximale Lysen in
11- bis 21-fach niedrigeren Konzentrationen als der bsscFv ds[19x16] (Tabelle 9).
Diese Werte lagen in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den Zytotoxi-
zitätsexperimenten mit Tumor-abgeleiteten Zelllinien als Zielzellen.
Ergebnisse
77
Tabelle 9: EC50 Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit primären B-CLL Zellen
cpm)] x 100. Maximale 51Cr Freisetzung wurde durch Zugabe von Perchlorsäure in
einer Endkonzentration von 3% bestimmt. Zur Ermittlung der basalen 51Cr Freiset-
zung wurden in einem Ansatz Zielzellen in Abwesenheit von Antikörpern oder Effek-
torzellen inkubiert. Die EC50-Werte wurden aus sigmoidalen Dosis-Wirkungskurven
berechnet.
6.2.10 Graphische Auswertung und statistische Analyse
Graphische und statistisch Auswertungen wurden mit der Software GraphPad Prism
(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt. Falls nicht anders ver-
merkt wurden Daten als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes (standard error
of the mean, SEM) dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit ei-
Material und Methoden
104
nem ungepaarten, oder wenn angemessen, gepaarten Student’s t-test ermittelt. P-
Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant eingestuft.
Alle in dieser Arbeit durchgeführten Versuche mit Mäusen wurden entsprechend dem
deutschen Tierschutzgesetz und mit Erlaubnis der verantwortlichen Behörden der
Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
Alle Experimente mit Patientenzellen wurden durch das Ethik Komitee der Universität
Erlangen-Nürnberg, in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki, gebilligt.
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Immunother; 31:871–884.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Christian Kellner
Geboren am: 19.07.1976
Geburtsort: Nürnberg
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulischer Werdegang
1982-1986: Volksschule Lauf, Hardtstrasse
1986-1995: Christoph-Jacob-Treu Gymnasium Lauf
Sonstiges
1995-1996: Zivildienst beim Arbeiter-Samariter-Bund, Lauf
Studium
1996-2002: Studium der Biologie an der FAU Erlangen-Nürnberg
2002: Diplomarbeit am Lehrstuhl für Genetik der FAU Erlangen-Nürn-
berg
Thema: „Untersuchungen der intrazellulären CD95 Speicher in B-
lymphoiden leukämischen Zelllinien“
Betreuer: Prof. Dr. G. H. Fey und Dr. S. J. Zunino
Berufliche Erfahrung
10/2002-12/20 03: Biologisch-technischer Assistent am Lehrstuhl für Genetik der
FAU Erlangen-Nürnberg
Promotion
seit 01/2004: Dissertation am Lehrstuhl für Genetik der FAU Erlangen-Nürnberg
Thema: „Entwicklung und Charakterisierung bispezifischer Antikör-
per-Derivate zur Immuntherapie CD19-positiver Leukämien und
Lymphome“
Betreuer: Prof. Dr. G. H. Fey
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. G. H. Fey für die Überlassung dieses
interessanten Themas, für die Betreuung meiner Arbeit, für wissenschaftlichen Rat
und für den Gestaltungsspielraum, der es mir ermöglichte, eigene Ideen in diese
Arbeit einfließen zu lassen. Vor allem danke ich ihm für sein mir entgegengebrachtes
Vertrauen in den Zeiten, die nicht sonderlich von Erfolg gekrönt waren.
Herrn PD Dr. B. Stockmeyer danke ich für seine Bereitschaft, das Zweitgutachten
dieser Arbeit zu übernehmen sowie für seine Unterstützung und die erfolgreiche Zu-
sammenarbeit in den vergangenen Jahren.
Bei Herrn Prof. Dr. H. M. Jäck bedanke ich mich für seine Bereitschaft, mich im
Nebenfach Immunologie zu prüfen.
Herrn Prof. Dr. J. H. Brandstätter danke ich für seine Bereitschaft den Prüfungsvor-
sitz zu übernehmen.
Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. B. Stockmeyer, insbesondere
Heike Horner und Barbara Bock, danke ich für Ihre große Hilfe bei der Durchführung
der Zytotoxizitätstests und für die gute Zusammenarbeit.
Dr. M. Peipp und Dr. J. Brünke danke ganz herzlich für ihre Hilfsbereitschaft und für
die zahlreichen guten Ratschläge, durch die so manches Problem in endlosen Tele-
fonaten gelöst werden konnte.
Unseren Kooperationspartnern Herrn PD Dr. F. Oduncu (Klinikum der Universität
München) und Herrn PD Dr. Peter Lang (Universitätsklinik für Kinder- und Jugend-
medizin, Tübingen) danke ich für die erfolgreiche Zusammenarbeit.
Prof. Dr. E. Kämpgen, Dr. J. Dörrie, Dr. N. Schaft und Kathrin Birkholz danke ich für
die gute Zusammenarbeit im Rahmen des SFB 643 „Strategien der zellulären Im-
munintervention“.
Kristin Mentz und Domenica Saul, die mir im Labor so manche Arbeit abgenommen
haben, danke ich ganz besonders für ihre tatkräftige Unterstützung und ihre motivier-
te Mitarbeit, ohne die die Bearbeitung dieses Themas in dieser Form nicht möglich
gewesen wäre.
Michael Schwemmlein danke ich für die schöne gemeinsame Zeit als Nachbar in
Büro und Labor, noch mehr aber für die Freundschaft, die sich in den langen Jahren
entwickelt hat.
Bei allen anderen Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe, Karin Barbin, Julia Stieglmaier,
Heiko Singer, Christoph Stein, Markus Kügler, Ingo Schubert, Tanja Liebig, Jörg
Schubert, Kathrin Birkholz, Nina Reiff, Sebastian Bolduan, Nicolas Rohner und vor
allem bei meinem neuen Büronachbarn Michael Schwenkert, bedanke ich mich für
ihre Hilfsbereitschaft und für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre.
Herrn Thomas Lange danke ich für seine Hilfe bei der Lösung vieler Probleme außer-
halb des Labors.
Herrn Stricker und seinen Kollegen, die mit großem Einsatz die Stiftung Kaminkehrer
helfen krebskranken Kindern ins Leben gerufen haben, danke ich für die finanzielle
Unterstützung.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei meiner Freundin Julia, die auch in schwieri-
gen Zeiten immer zu mir gehalten hat und die durch ihre liebevolle Art mein Leben
ungemein bereichert. Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern und meinem
Bruder Michael für ihre ausnahmslose Unterstützung in vielen Bereichen meines Le-