Ensamblado de fragmentos de ADN

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Ensamblado de fragmentos de ADN

Grupo 6

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ORGANIZACIÓN

1. Background Biológico

2.Modelos

3.Algoritmos

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BACKGROUND BIOLÓGICO

•¿Qué es una secuencia de ADN ?

Es un método que nos permite descubrir como es la secuencia del ADN.

•¿Qué es la secuenciación ?

Es una disposición u ordenamiento

de las cuatro bases (A, T, C, G), en la

molécula de ADN.

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METODOLOGÍA

Gen no es igual Genoma

Secuenciación a gran escala

Herramientas de la bioinformática

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GENOMA

Dos métodos de secuenciación principales:

WHOLE GENOME SEQUENCING

Por lo general utilizado para genomas poco repetitivos

(virus, bacterias, moscas)

HIERARCHICAL SHOTGUN SEQUENCING

Por lo general para genomas con repeticiones

(eucariontes en general)

Ventajas:

-Detecta secuencias repetidas

-No tiene problemas de regiones poco representadas

1 2

6

Enzima de restricción de alta frecuencia de corte (1 a 2 kb)

Se eligen clones en forma aleatoria

DNA TARGET

Se introducen fragmentos en vectores

Fragmentos desordenados

Introducción de1 vector por cada bacterias (clon)

Secuenciación y Ensamblado

Secuencia de DNA target

1

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YACS

Mapeo Físico

DNA target (muchas copias)

Enzima de restricción de baja frecuencia de corte

fragmentos de 10 a 1000 kb

Elección al azar de algunas colonias

2

8

Elección al azar de algunas colonias

Se replican

Se elige un clon

fragmentos cortos (40 kb)

Enzima de restricción de alta frecuencia de corte

Inclusión de fragmentos en cósmidos

Introducción de fragmentos en bacterias

Secuenciación de fragmentos pequeños

ENSAMBLADO DE SECUENCIAS DE FRAGMENTOS CORTOS

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ENZIMAS DE RESTRICCION

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CASO IDEAL

Supongamos que tenemos las siguientes secuencias:

ACCGT CGTGC TTAC TACCGT

Una posible manera de ensamblarlas :

--ACCGT-- ----CGTGC TTAC----- -TACCGT--

TTACCGTGC

Las secuencias fueron alineadas ignorando los espacios de las extremidades. Se trata de alinear en la misma columna bases que sean iguales.

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COMPLICACIONES

1. Instancias reales del problema muy largas

2. Errores

Inserciones, deleciones , sustituciones

Fragmentos quiméricos

Contaminación

Regiones repetidas

3. Orientación desconocida

4. Regiones repetidas

5. Pérdida de cobertura

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Inserción: inserta una base o varias (fragmento).

Deleción: se pierde una base o varias (fragmento).

Sustitución: cambio de una base por otra.

Contaminación con vector: existencia de vector entre los fragmentos de ADN a secuenciar.

Fragmento quimérico: unión de dos fragmentos de ADN que no son parte contigua en el ADN target.

Orientación desconocida: se desconoce a que hebra pertenece cada fragmento (aunque sabemos que la lectura es de 5’ a 3’. (Problema vs. Beneficio)

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Regiones repetidas: sucesiones de nucleótidos que aparecen más de una vez.

Falta de cubrimiento: quedan gaps, en la secuencia, se define cubrimiento en la posición i del target como el número de fragmentos que cubren esta posición. (concepto imposible de computar, no se conocen las posiciones de los fragmentos en el target. Se saca el cubrimiento medio)

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ERRORES1-5 errores / 100 caracteres

FRAGMENTOS TARGET

ACCGT --ACCGT--

CGTGC ----CGTGC

TTAC TTAC-----

TGCCGT -TGCCGT--

TTACCGTGCError de sustitución en la segunda posición del últimofragmento donde la A fue remplazada por una G

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FRAGMENTO TARGET

ACCGT --ACC-GT--

CAGTGC ----CAGTGC

TTAC TTAC------

TACCGT -TACC–GT--

TTACC–GTGC

Error de inserción en la segunda posición del segundo fragmento

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FRAGMENTO TARGET

ACCGT --ACCGT--

CGTGC ----CGTGC

TTAC TTAC-----

TACGT -TAC-GT--

TTACCGTGC

Deleción en la tercera o cuarta posición del último fragmento

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CACGT CACGT--------

ACGT -ACGT--------

ACTACG --CGTAGT-----

GTACT -----AGTAC---

ACTGA --------ACTGA

CTGA ---------CTGA

ORIENTACION DESCONOCIDA

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ACCGT --ACCGT--

CGTGC ----CGTGC

TTAC TTAC-----

TACCGT -TACCGT--

TTATGC

TTA---TGC 

FRAGMENTOS QUIMERICOS

TTACCGTGC

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REGIONES REPETIDAS

x1 x2

Los bloques marcados con x1 y x2 son aproximadamente la misma secuencia

A X B X C X D

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A X C X B X D

La secuencia ensamblada es ambigua debido a que las repeticiones son de la forma XXX

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Area descubierta

Fragmentos

ADN

FALTA DE CUBRIMIENTO

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1.Shortest Common Superstring (SCS)

2.Reconstruction

3.Multicontig

MODELOS

Todos los modelos asumen que la colección de fragmentos esta libre de contaminación y fragmentos quiméricos.

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Shortest Common Superstring (SCS)

Características

• No contempla errores

• La orientación de cada fragmento debe ser conocida

•No soporta regiones repetidas

• Solamente tiene interes teórico, ya que no se lo usa como solución del problema biológico real.

• Es un problema NP-hard.

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X X

La secuencia tiene dos copias de la misma subsecuencia, además estas copias son largas y contienen muchos fragmentos de los cuales conocemos su correcta orientación y no tienen errores.

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X X’

Sin embargo, al intentar buscar el superstring más corto, encontraremos una “mejor solución” si ensablamos todos los fragmentos de la segunda ocurrencia como subcadenas de la primera.

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ALGORITMO

Entrada: un conjunto de fragmentos F

Salida: S la cadena más corta , donde para todo f que pertenece a F, S es una supercadena de f. (O sea para todo f que pertenece a F, f es una subcadena de S que representará la secuencia de ADN reconstruida)

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Podemos representarlo en un grafo

Overlap multigraph (Multigrafo de solapamiento) OM(F)

b ACCCTACGA

CTAAAG

GACA

1

1

1

12

d

c

a

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Cada eje entre un par de nodos (a, b) tendrá asociado un peso mayor o igual a 0, si el sufijo con t caracteres es prefijo de b.

Los pesos en el grafo están representando solapamientos entre fragmentos, utilizaremos estos para unir los fragmentos y formar la supercadena.

Dado un camino P en OM(F) podemos construir, un alineamiento múltiple con las secuencias que están en P. Luego la secuencia final puede ser derivada de ese alineamiento, produciendo la supercadena de la siguiente manera:

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Cada eje (a, b) en el camino tiene un peso t, entonces para alinear los fragmentos a y b, b comenzará t posiciones antes del final de a.

Ya que el largo de la secuencia generada en el recorrido es igual a la suma de las longitudes de los fragmentos de los nodos menos la suma de los pesos de los ejes usados.

Buscamos, el camino hamiltoniano más pesado (camino que usa todos los nodos sin repetir ninguno). Es problema es el Traveling salesman problem, que es NP-Completo.

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camino abcd, peso = 3

TACGA-----------

----ACCC--------

-------CTAAAG---

------------GACA

TACGACCCTAAAGACA

camino adbc, peso = 4

TACGA----------

---GACA--------

------ACCC-----

---------CTAAAG

TACGACACCCTAAAG

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Si resolvemos este problema por fuerza bruta, es decir probando todos los caminos posibles, continuaremos con un algoritmo exponencial. Por eso, debemos intentar otra alternativa.

Definición:

Algoritmo goloso (greedy): En cada paso intenta maximizar la solución del subproblema analizado. No retrocede una vez tomada cada decisión.

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Contruimos el grafo OG(F) a partir del multigrafo OM(F), dejando entre cada cada par de nodos únicamente el eje más pesado, ya que estamos buscando el camino de peso máximo.

El algoritmo comienza ordenando los ejes según el peso, de mayor a menor. En cada paso agrega el proximo eje más pesado, mientras no forme ciclos, y los nodos en los que es incidente, se hayan usado a los sumo una vez, respetando las orientaciones.

La solución encontrada es a los sumo 2,75 veces peor que la optima, y se conjetura que lo es 2 veces.

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GCC

ATGC TGCATcb

a

Este algoritmo, no siempre encuentra la solución óptima.

2

2

3

0

0

0

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RECONSTRUTION

Características

• Contempla errores

• Contempla la orientación desconocida.

• No soporta regiones repetidas ni falta de cubrimiento

• Es un problema NP-hard.

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RECONSTRUTION - Definiciones

Veamos al ensamblado como un problema de alineamientos múltiples.

Distancia de edición ( d(a,b) ): Función de puntuación de alineamiento entre dos cadenas que otorga un punto por cada inserción, deleción o sustitución.

Distancia de edición de subcadena (ds(a,b) ): Es similar a la distancia de edición, pero no agrega puntos por las deleciones en los extremos del segundo segmento.

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RECONSTRUTION - Definiciones

Formalmente

ds(a,b) = min s en S(b) d(a, s),

donde S(b) es el conjunto de todos las subcadenas de b.

Error de tolerancia( ): Entre 0 y 1.

f es un subcadena aproximada de S con error si

ds(a,b) <= |f |

donde |f | es la longitud de f.

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ALGORITMO

Entrada: Una colección F de fragmentos y un error de tolerancia entre 0 y 1.

Salida: La cadena más corta posible S tal que para cada f en F vale que:

min(ds(f,S), ds(f c,S)) <= |f |

donde f c es el complemento de f.

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MULTICONTIG – Definiciones

t-contig: Es un contig donde el solapamiento mínimo es de t bases. Se tiene en cuenta cada fragmento o su complemento, pero no ambos.

Si es posible construir un t-contig con un colección de fragmentos F diremos que F admite un t-config.

Dado un error de tolerancia diremos que una secuencia S es un consenso- para un contig, si la distancia de edición entre cada fragmento f en el contig y su imagen en S es a lo sumo | f |

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ALGORITMO

Entrada: Una colección F de fragmentos, un entero t >= 0 y un error de tolerancia entre 0 y 1.

Salida: Una partición de F en la mínima cantidad de subcolecciones Ci tal que cada Ci admite un t-contig con un consenso-

Es un problema NP-Hard

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EN LA PRACTICA1. Buscar solapamientos

• Para cada par de fragmentos, calcular el match prefijo-sufijo

• Alineamiento semiglobal sin penalidad para

• Espacios en el final del primer fragmento o el principio del segundo

2. Ordenar de los fragmentos

• Construir el camino con algoritmos greedy o heurísticas

• Cada camino tiene su correspondiente camnino complementario

• No es necesario incluir fragmetnos incluídos en otros

• Los ciclos y la cubrimiento abundante pueden indicar repeticiones.

3. Alineamiento y consenso

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EN LA PRACTICA

TIGR-Assembler

CAP2

GAP

Dhrap (Univ of Washington, Seattle)

En 1994, en el paper A quantitative comparision of DNA sequence assmbly programs, Miller y Powell comparando 11 paquetes distintos encontraron que los resultados fueron muy diferentes.