ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra
ENGENHARIA GENÉTICABIOLOGIA MOLECULAR
André Fioravante Guerra
CONCEITOS
O QUE É DNA?
O QUE ELE FAZ?
PORQUE ELE É VITAL EM SERES VIVOS?
COMO PROMOVER MODIFICAÇÕES NELE?REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)TÉCNICA DE CLONAGEM (DNA RECOMBINANTE)SELEÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES
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Cada nucleosídeo é ligado a um grupo fosfato formando um nucleotídeo
Cada base nitrogenada é ligada à molécula de açúcar formando um nucleosídeo
EXISTE UM ATOMO CENTRAL DE FOSFORO LIGADO A 4 ATOMOS DE OXYGENIO
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Pirimidinas• Estruturas de anel único contendo 6 átomos C & N
Purinas• Estruturas da cadeias
cíclicas: Anel duplo• 5 e 6 C & N
Bases NitrogenadasQuatro bases de DNA
A= AdeninaT= TiminaG= GuaninaC= Citosina
U = uracil (RNA)
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Açúcar Deoxiribose
DNA RNA
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O QUE ELE FAZ???
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O “dogma central” da biologia molecular
Proposto por Francis Crick em 1958. Em 1970 publicado na revista Nature DNA codifica para produção de RNA RNA codifica para produção de proteina. Proteina não codifica para produção de proteina,
RNA ou DNA. O final nas palavras de Francis Crick
“Once information has passed into protein, it cannot get out again”.
Conceitos Básicos
• GENOMA: todo DNA existente num organismo
• GENE: um segmento de DNA que codifica um produto funcional – proteínas – ou RNAs
COMO?
TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO Dependente de fator protéico
ENVOLVE A PROTEINA rho
LOCALIZAÇÃO DO PROMOTOR
ATG
PROMOTORES DE GENES BACTERIANOS
tRNA• tRNAs tem cerca de 80 bases, • Existem ao menos 31 no
citoplasma, 22 na mitocôndria. • Todos os tRNAs tem um braço
aceptor com uma sequência 3′ CCA, que é covalentemente ligada ao aminoácido. (A)
• Posuem um triplet anticodon que transientemente se liga ao mRNA. (B)
• A estrutura geral é denominada trevo (cloverleaf )
A
B17
AA
braço doanti-codon
tRNAAtivação dos aminoácidos
Amino acil tRNA sintetases: ligação dos aminoácidos à extremidade 3’ do tRNA de acordo com o anti-códon
AAs
Uma única amino acil tRNA sintetase liga umAminoácido a todos os seus tRNAs
Três passos na Tradução: Iniciação
1. A subunidade menor do rRNA se liga ao mRNA via sequência líder próxima ao start codon (AUG).
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Código Genético
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Tradução:
Molécula de mRNA
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
CysMetAla
5’ 3’
AspGlu
Phe His
Direção do avanço do ribossomo
Ribossomo
Proteína
tRNA
aa livre
codon
Gly
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
CysMetAla
5’ 3’
AspGlu
Phe HisGly
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Asp
MetAlaCys
5’ 3’
GluPhe HisGly
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Glu
MetAlaCysAsp
5’ 3’
PheGly
His
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Phe
MetAlaCysAspGlu
5’ 3’
GlyHis
Ile
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Gly
MetAlaCysAspGluPhe
5’ 3’
HisIle
Lys
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
His
MetAlaCysAspGluPheGly
5’ 3’
Ile
Lys
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Ile
MetAlaCysAspGluPheGlyHis
5’ 3’
Lys
G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A
Lys
MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle
5’ 3’
Leu
U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A
Leu
MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle
Lys
5’ 3’
Met
G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G
Met
MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle
LysLeu
5’ 3’
Asn
G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C
Asn
Met AlaCysAspGluPheGlyHisIle
LysLeuMet
5’ 3’
Pro
U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A
Pro
Met Ala CysAspGluPheGlyHisIle
LysLeuMetAsn
5’ 3’
Gln
G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A
Gln
Met Ala Cys AspGluPheGlyHisIle
LysLeuMetAsnPro
5’ 3’
C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A
Met Ala Cys Asp GluPheGlyHisIle
LysLeuMetAsnProGln
5’ 3’STOP
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A A A A
Ala Cys Asp Glu PheMet Gly
HisIle
Lys Leu
Met Asn
Pro Gln
5’ 3’STOP
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu PheMet Gly
HisIle
Lys Leu
Met Asn
ProGln
5’ 3’STOP
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu PheMet Gly
His Ile Gln Lys
Pro LeuAsn Met
5’ 3’
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu PheMet
Gly His
Ile Gln Lys
Pro LeuAsn Met
5’ 3’
A U A A A A U U A A U G A A C AA A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu PheMet
Gly His
Ile Gln Lys
Pro LeuAsn CYS
5’ 3’
Muda aforma e função
VARIAÇÃO GENÉTICA=POLIMORFISMO
A replicação in vivo
• Replicação é semi-conservativa e a polimerização deve ser sempre no sentido 5´→3´
• Mas o DNA é antiparalelo ou seja, uma fita ocorre no sentido 5’ → 3’ e a outra no sentido 3’ → 5’
• Como ocorre então a replicação nos dois sentidos?
Forquilha de replicação do DNA
Proteínas de iniciação identificam a origem da replicação (rica em A-T) participam da ligação da DNA helicase ao DNA
A proteína de iniciação acoplada à DNA helicase abre o DNA na junção “Y”.
As pontes de H se rompem e a molécula se abre como um zíper
As fitas se mantêm separadas durante a replicação graças à ação de umas proteínas as Single-strand binding proteins – SSBP’s
História do PCR
Em 1993, Kary Mullis, um químico ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método em 1985 que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA.
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988): 487-491
PCR
• Qual é o objetivo?Produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima
• Quais os componentes?Mg2+
DNA Polimerase
dNTP
Primers
Termociclador
• Como na técnica de PCR se encontram vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento
Uma reação típica de PCR
Sterile Water 38.0 ul10X PCR Buffer 5.0 ulMgCl2 (50mM) 2.5 uldNTP’s (10mM each) 1.0 ul PrimerFWD (25 pmol/ul) 1.0 ul PrimerREV 1.0 ulDNA Polymerase 0.5 ulDNA Template 1.0 ul
Total Volume 50.0 ul
• Molécula de DNA obtida através da junção de dois ou mais fragmentos de DNA
O que é uma molécula de DNA recombinante?
5’- -3’ 5’- -3’
5’- -3’
• O que é clonagem?• Utilização da reprodução assexuada para obter organismos que
são geneticamente iguais entre si e ao organismo parental
Clonando um gene
Seleção Reprodução assexuadaIsolamento
• O vetor• O DNA inserido não é replicado na célula a menos
que esteja recombinado com DNA cromossômico ou inserido em replicon (elemento genético capaz de replicação autônoma) extracromossômico.
• Replicons são reconhecidos como substratos por enzimas da célula responsáveis pela repli-cação (ou vetores)
• Podem ser usados para carregar DNA recom-binante, permitindo sua replicação• O tipo mais comum de vetor sãoos plasmídeos
Clonando um gene
20min
20min
Após 30 gerações (10h) haverá 1x 109 cels
• Endonucleases altamente específicas, conhecidas como enzimas de restrição, clivam o DNA em sítios precisamente definidos.
• Fragmentos são gerados por cortes nos sítios de restrição no fragmento de DNA e no vetor
• DNA ligases podem unir os fragmentos acima para obter a molécula de DNA recombinante
Clonando um gene
• Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado?
Genes estão presentes em regiões contínuas de DNA cromossômico e não aparecem perfeitamente delimitados por sítios de restrição. Como conseguir o fragmento específico contendo o gene de interesse?
• Há basicamente 3 possibilidades:– DNA sintético– PCR (RT-PCR)– Triagem de Bibliotecas genômicas ou de cDNA
Clonando um gene
• Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado?
Fragmentação mecânicaOu enzimática
Vetores
•Plasmídeos• Sítio de clonagem múltipla (MCS)• Marcadores de seleção• Alfa-Complementação (hospedeiro Lac-)
Tecnologia do DNA recombinante
Gene produtor de toxina