endotoksin dan pirogen

KELOMPOK 9Nama : Anggita Sarasati

Ina HafityaningsihNurfadilla Putri Dewi IndayaniSiti Fatimah Nur Hikmah Y.Wiewik Ambarwati

Uji Endotoksin dan Pirogen

EKSOTOKSIN• Virulensi mikroorganisme ditentukan oleh

produksi toksin, yaitu substansi racun yang di hasilkan mikroorganisme tertentu.

• Kemampuan mikroorganisme menghasilkan toksin di sebut toksigenisitas.

• Istilah toksemia menunjukkan adanya toksin dalam darah.

• Ada dua tipe toksin yaitu eksotoksin (toksin protein) dan endotoksin (toksin lipopolisakarida).

EKSOTOKSIN • Eksotoksin yaitu protein toksin yang tidak

tahan panas , dan bersifat antigenik yang menginduksi pembentukan antibodi.

• Antibodi yang terbentuk akibat induksi eksotoksin disebut antitoksin.

• Toksin ini bekerja dengan cara menghancurkan bagian tertentu sel inang / menghambat fungsi metabolik tertentu.

• Mayoritas bakteri penghasil eksotoksin adalah bakteri gram positif.

• Gen pengkode pada eksotoksin terdapat pada plasmid bakteri atau fag.

• Eksotoksin larut dalam cairan tubuh, sehingga eksotoksin mudah terdifusi dalam darah dan dengan cepat diedarka ke seluruh tubuh.

Tiga tipe Eksotoksin berdasarkan mekanisme aksinya :

1.Sitotoksin, membunuh sel inang atau mempengaruhi fungsi sel.

2.Neurotoksin, terlibat dalam transmisi normal impuls saraf.

3.Enterotoksin, mempengaruhi sel – sel pada saluran pecernaan.

• Daya racun eksotoksin dpat diinaktivasi dengan pemanasan atau paparan formaldehid, iodin atau bahan kimiawi lain.

• Eksotoksin yang di inaktivasi tidak dapat lagi menyebabkan penyakit, namun tetap dapat menginduki pembentukan antitoksin.

• Eksotoksin yang di inaktivasi disebut toksoid.

ENDOTOKSIN• Endotoksin dihasilkan oleh bakteri gram

negatif patogen ataupun nonpatogen selama masa pertumbuhannya atau pada saat sel lisis.

• Toksin ini merupakan bagian dari membran luar bakteri gram negatif yang tersusun atas lapisan lipopolisakarida (LPS).

• Endotoksin bersifat tahan panas, merupakan antigen lemah, dan tidak dapat di ubah menjadi toksoid.

ENDOTOKSIN• Meskipun seluruh bakteri gram negatif memiliki LPS

pada dinding selnya, LPS tidak bersifat toksik hingga dilepaskan dari membran luar dinding sel.

• Pada sat bakteri gram negatif mati, disintegrasi dinding selnya mengakibatkan pelepasan toksin LPS.

• Pelepasan endotoksin dalam sistem peredaran darah dapat menyebabkan syok akibat penurunan tekanan darah dan kegagalan fungsi banyak organ.

• Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin.

Efek Endotoksin Bagi Tubuh

• demam• aktivasi sistem sitokin• rusaknya sel-sel endotelial• permeabilitas pembuluh darah

berubah sehingga menyebabkan turunnya tekanan darah

Perbedaan endotoksin dan eksotoksin

CIRI KHAS ENDOTOKSIN EKSOTOKSIN

Komposisi kimiawi Bagian lipid (lipid A) pada LPS membran luar

Protein

Sumber Dinding sel bakteri gram negatif, dihasilkan pada saat kematian sel atau otolisis bakteri

Mayoritas pada bakteri gram positif, di produksi selama pertumbuhan sel, pada beberapa kasus di produksi setelah lisis atau kematian sel

Farmakologi (efek pada inang)

Tidak spesifik Pada jaringan tertentu

Ketahanan terhadap panas

Tahan panas (heat – stable), pada suhu 121° C selama 1 jam

Tidak tahan panas (heat – labile), inaktif pada suhu 60 – 80° C, kecuali toksi Staphlococcus

Imunologi Tidak mudah dinetralisasi oleh antitoksin sehingga toksoid yang efektif tidak dapat dibuat sebagai imunisasi terhadap toksin

Dapat di ubah menjadi toksoid sebagai imunitas terhadap toksin, di netralisasi oleh antitoksin

Dosis letal Besar Kecil

Toksisitas Rendah tinggi

Penyebab demam Ya tidak

Contoh penyakit Demam tifoid, ISK, meningitis

Gas gangren, tetanus,botulisme, difteri

Perbedaan endotoksin dan eksotoksin

LAL-(Limulus amebocytelysate)Test

• The Limulus amebocytelysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri.

• Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri).

• Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus).

• 1956: Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan Bang bahwa infeksi bakteri gram negatif pada Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.

• 1964: Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein yang dapat menggumpal dalam amubosit.

• Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan karaterisasi protein yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan reaksi enzimatik.

Limulus polyphemus(horseshoe crab)

Cara Memperoleh Lysate

• Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, lalu darahnya diambil dengan menggunakan jarum suntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untuk memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya.

• Amoebocyte lalu difreeze-dried dan diproses untuk digunakan.

Metode LAL yang direkomendasi oleh FDA –USA

• Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan adanya endotoksin

• Metode kinetik turbidimetri: menggunakan kecepatan pembentukan gel untuk menentukan kandungan endotoksin

• Metode Kromogenik: menggunakan substrat kromogenik sintetik, dengan adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan warna kuning dan secara linier ekuivalen dengan konsentrasi endotoksin yang ada

Prinsip LAL Test• Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari kepiting landam kuda

terhadap invasi bakteri gram negatif.

• Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi.

• EndotoksinGram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatan awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin.

• Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzimkoagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal(koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan koagulin.

• Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel.

Penetapan Batas Endotoksin

• 1983 : FDA menentukan batas endotoksin berdasarkan dosis maksimum sediaan obat untuk manusia atau kelinci

• Dan penyesuaian batas endotoksin untuk semua obat (kecuali intratekal) dari2,5 EU kg-1 sampai 5,0 EU kg-1

• EU = Endotoxin Unit

• Batas deteksi untuk beberapa produk diperoleh dari monografi USP atau EP. Kalau tidak dinyatakan dalam farmakope, batas endotoksin harus dihitung dari dosis maksimum manusia

EL = K/M

• EL = endotoksin limit

• K = konstanta = 5 EU atau IU per kg berat badan

• M = dosis maksimum untuk manusia

per kg per jam.

Batas Endotoksin Dan Volume Per Jam

• Harus diperhatikan bahwa batas endotoksin dinyatakan per jam. Oleh karena itu konsentrasi yang dibolehkan untuk endotoksin per mililiter injeksi beragam tergantung pada volume pemberian dalam satu jam.

• Suatu dosis tunggal injeksi 1 ml secara teoritis mengandung 349 EU per ml dan masih diijinkan pada uji endotoksin bakteri, sedangkan infus dengan volume 1 L harus mengandung kurang dari 0,349 EU per ml.

Contoh Perhitungan

Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis maksimum 2 unit per kg dan sensitivitas lisat 0,125 unit/ml, makaC = 100 unit per mlK = 0,5 EU per kg λ = 0,125 unit per mlM = 2 unit per kg

MVD = 100 x 5 = 1 : 2000 0,125 x 2

• Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC

• MVD = potensi sediaan/MVC

LAL Test Untuk Alat Kesehatan

• Kadar endotoksin pada alat kesehatan diperoleh dengan prosedur ekstraksi, yaitu dengan cara merendam sejumlah alat pada cairan pengekstraksi biasanya pereaksi air LAL. Nilai batas 20 EU per alat dinyatakan dalam addendum USP 1997, jadi batas maksimum konsentrasi endotoksin yang diijinkan dalam cairan hasil ekstraksi (ERL) dihitung dengan rumus:

• ERL = K x N/V

K = 20 EUN = jumlah alatV = total volume larutan ekstraksi

Kelebihan LAL-Test

• Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode alternatif terhadap rabbit pyrogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam produk, untuk menghindari penggunaan hewan dalam percobaan

• Metode lebih akurat

Metode Gel-Clot

• Pada metode ini, hasil akhir dapat dideteksi berupa spot pada slide, atau microplate

• Perlu pembanding, berupa control standard endotoxin (CSE)

• Peralatan gelas yang digunakan harus di“de-pirogenasi”

Prinsip Uji Dan Prosedur

• 100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabung gelas depirogen (positive control)

• LAL reagent water (negative control)

• Sampel jumlah sama

• + 100 ullysate

• Inkubasi 37°C di atas penangas air selama 1 jam

• Tabung lalu dibalik perlahan (180°) untuk melihat solid clot yang terjadi

Hal Yang Harus Diperhatikan Dalam Metode Gel-Clot

• Untuk membuat alat-alat depirogen: pemanasan pada 180°C, selama 4 jam atau 250°C selama 30 menit

• Teknik pengerjaan pada saat membalik tabung kira-kira selama 2 detik

• pH sampel 7,0 –8,0. Jika diperlukan pH diatur menggunakan asam atau basa depirogen

Sensitivitas Lisat Pada Gel-Clot

• Diperlukan untuk menentukan konsentrasi minimum endotoksin yang menyebabkan terjadinya gel

• Satuan dinyatakan dalam EU atau IU

• Dibuat 1 seri pengenceran endotoksin (dalamEU/mL) dan percobaan dilakukan rangkap 4 (quadruplicate)

• Titik akhir pengenceran (end-point dilution) ditentukan pada pengenceran terakhir yang masih memberikan reaksi positif

Metode Kromogenik

• Metode kromogenik merupakan metode LAL test yang paling banyak digunakan saat ini karena lebih mudah dan murah

• Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak banyak dan tidak sering (infrequent)

• Digunakan untuk uji sampel serum pada uji klinis

Prinsip Uji Dan Prosedur

• Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi suatu proenzim

• Enzim yang teraktivasiakan mengkatalisis terpecahnya PNA dari substrat Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-PNA

• PNA yang dilepaskan diukur secara spektrofotometri pada 405 nm

• Nilai absorbans sebanding dengan jumlah endotoksin, dibandingkan terhadap endotoksin standard menggunakan kurva standard

Penemuan Baru• Alternatif terhadap LAL saat ini telah berhasil

diteliti di India dan China, yaitu pereaksi TAL, atau Tachypleus amoebocyte lysate, fungsinya mirip dengan LAL, juga untuk deteksi gram-negative bacteria.

• Ilmuwan di Singapur tengah meneliti cloning gen pendeteksi toxin dalam darah horseshoe crab. Jika gen tersebut dapat dikloning, derivat LAL dapat dibuat tanpa harus menggunakan horseshoe crabs untuk ekstraksi darahnya.

Perhitungan MVD Dan MVC• MVD = Maximum Valid Dilution (pengenceran

maksimum)

• MVC = Minimum Valid Concentration (konsentrasi minimum)

• MVD dan MVC adalah perhitungan yang menunjukkan seberapa banyak pengenceran yang harus dilakukan untuk mengatasi kemungkinan interferensi, sebelum efek pengenceran melampaui kemampuan uji LAL yang digunakan untuk mendeteksi endotoksin dalam sediaan asli

Penggunaan Istilah MVD Dan MVC

• MVD biasanya digunakan untuk sediaan yang berbentuk cairan dimana pemberian dinyatakan dalam per mililiter Contoh: dosis tunggal injeksi 2 ml dan batas endotoksin dinyatakan dalam EU per mililiter

• MVC biasanya digunakan untuk sediaan dengan batas endotoksin dinyatakan dengan EU per mg dan dosis dinyatakan dengan mg/ kg bb

• Penentuan MVD dan MVC tergantung pada sensitivitas lisat yang digunakan (λ)

• Semakin sensitif lisat atau metoda, semakin tinggi MVD

atau semakin rendah MVC

Perhitungan MVD

MVD = C x K

λx M

• C = konsentrasi obat• K = konstanta = 0,5 EU per kg • M = dosis maksimum manusia

PerhitunganMVC

MVC = λM

K

• λ = sensitifitas dari lisat yaitu nilai terkecil dari standar untuk pengujian kuantitatif

• K = konstanta = 0,5 EU per kg

• M = dosis maksimum manusia

• Pyro artinya keadaan atau bentuk yang berhubungan dengan panas / api. Gen artinya membentuk atau menghasilkan, jadi pyrogen artinya sesuatu yang dapat menghasilkan panas / demam.

• Pirogen adalah hasil dari mikroorganisme berupa kompleks lipo polisakarida protein lipid yang mengandung gugusan radikal nitrogen dan fosfor, merupakan endotoksin dari bakter gram negative dan jika di suntikkan ke dalam tubuh manusia dan hewan dalam dosis tertentu akan menyebabkan demam.

Pirogen

• Pirogen berasal dari macam – macam sumber, sehingga susunan kimiawinya berbeda – beda dan menyebabkan aktivitasnya berbeda misal sifat farmakologis, stabilitas dan daya keracunannya.

• Gejala umum yang timbul dengan adanya pirogen adalah demam setelah beberapa saat penyuntikan, reaksi yang jelas akan terlihat setelah 45 menit sampai 8 jam penyuntikan.

Sumber pirogen

• Air air yang sudah di simpan • Peralatan • Solute atau zat terlarut • Proses produksi • Udara kotor

Sifat – sifat pirogen kelarutan : larut dalam air, alkohol, tidak

larut dalam pelarut organik lain ukuran : 1 – 50 mµ stabilitas : dalam keadaan kering dan

terlarut stabiltasnya t, termostabil, dalam larutan sukar dihilangkan dengan pemanasan , dalam keadaan kering pirogen dapat dihilangkan dengan pemanasan tinggi dan waktu lama tinggi

berat molekul : 15.000 – 4.000.000

Cara – cara pembebasan pirogen

A. Penyulingan : - penyulingan biasa - penyulingan khusus

B. Pemanasan : - dalam larutan - dalam keadaan kering

C. Penyerapanpirogen diserapa dengan secara kimia / fisika dengan adsorben

D.Depirogenase E. Radiasi sinar gammaF. Getaran ultrasonik

DAFTAR PUSTAKA

• Anonim,1995.Farmakope Indonesia edisi IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Jakarta

• Anonim,1997.Farmakope Indonesia edisi III. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Jakarta

• T.Pratiwi Sylvia,2008,Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta

• http://download.fa.itb.ac.id/filenya/Handout%20Kukah/mikrobiologi%20Analisis%20%28FK3207%29/Uji%20ENDOTOKSIN.pdf