Ekspresi Differensial Biogenesis/Faktor Ekspor THOC1 dan ALY mRNP pada Kanker yang Terjadi pada Manusia María S Domínguez-Sánchez1, Carmen Sáez2, Miguel A Japón2, Andrés Aguilera1, Rosa Luna1* Abstrak Latar Belakang: Satu langkah kunci dalam ekspresi gen yaitu biogenesis kompleks ribonukleopartikel mRNA (mRNPs). Pembentukan mRNP memerlukan partisipasi sejumlah faktor seperti kompleks THO. THO berinteraksi secara fisik dan fungsional dengan Sub2/UAPS6 tergantung RNA. ATPase, dan Yra1/REF1/ALY RNA yang mengikat protein menghubungkan transkripsi, ekspor mRNA dan integritas genom. Dengan menghubungkan antara instabilitas genom dan kanker, kami telah melakukan amnalisis komparatif dari pola ekspresi THOC1, sebuah subunit kompleks THO, dan ALY pada sampel tumor. Metode: kadar mRNA diukur dengan real-time PCR kuantitatif dan hibridisasi kumpulan cDNA jaringan tumor; dan kadar protein dan distribusi dengan immunostaining dari kumpulan jaringan yang disesuaikan yang mengandung sampel yang terfiksasi dengan paraffin dari tumor yang berbeda dan jaringan normal yang dipantau dengan analisis statistic.
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Ekspresi Differensial Biogenesis/Faktor Ekspor THOC1 dan ALY
mRNP pada Kanker yang Terjadi pada Manusia
María S Domínguez-Sánchez1, Carmen Sáez2, Miguel A Japón2, Andrés Aguilera1, Rosa
Luna1*
Abstrak
Latar Belakang: Satu langkah kunci dalam ekspresi gen yaitu biogenesis kompleks
ribonukleopartikel mRNA (mRNPs). Pembentukan mRNP memerlukan partisipasi sejumlah
faktor seperti kompleks THO. THO berinteraksi secara fisik dan fungsional dengan Sub2/UAPS6
tergantung RNA. ATPase, dan Yra1/REF1/ALY RNA yang mengikat protein menghubungkan
transkripsi, ekspor mRNA dan integritas genom. Dengan menghubungkan antara instabilitas
genom dan kanker, kami telah melakukan amnalisis komparatif dari pola ekspresi THOC1,
sebuah subunit kompleks THO, dan ALY pada sampel tumor.
Metode: kadar mRNA diukur dengan real-time PCR kuantitatif dan hibridisasi kumpulan cDNA
jaringan tumor; dan kadar protein dan distribusi dengan immunostaining dari kumpulan jaringan
yang disesuaikan yang mengandung sampel yang terfiksasi dengan paraffin dari tumor yang
berbeda dan jaringan normal yang dipantau dengan analisis statistic.
Hasil: kami menunjukkan bahwa ekspresi kedua faktor mRNP, THOC1 dan ALY berubah pada
beberapa jaringan tumor. Kadar protein THOC1 dan mRNA meningkat pada tumor ovarium dan
paru-paru dan menurun pada tumor di testis dan kulit, sedangkan ALY berubah dengan variasi
yang luas pada jaringan tumor. Berbeda halnya dengan THOC1, protein ALY banyak terdeteksi
pada sel proliferative normal, tetapi sedikit pada kanker tahap lanjut.
Kesimpulan: hasil tersebut menunjukkan adanya hubungan antara tumorogenesis dan tingkat
ekspresi THO dan ALY manusia. Penelitian ini memungkinkan untuk mendefinisikan faktor
biogenesis mRNP sebagai faktor putative yang berperan dalam proliferasi sel yang dapat
berkontibusi terhadap perkembangan tumor.
Latar Belakang
Ekspresi gen mencakup berbagai proses dari transkripsi sampai pemrosesan mRNA, ekspor dan
translasi. Selama transkripsi, pre-mRNA awal berhubungan dengan RNA yang berikatan dengan
protein (RNA-binding protein) dan menjalani serial langkah pemrosesan, yang menghasilkan
ekspor kompleks ribonukleoprotein mRNA kompeten ke sitoplasma [1]. Sel eukariotik telah
memiliki mekanisme kontrol kualitas yang mencegah ekspor mRNP suboptimal dan sintesis
protein yang mengalami disfungsi [2]. Ekspresi abnormal dari mRNA-binding proteins
mempengaruhi langkah metabolism mRNA yang berbeda, yang secara signifikan mengubah
ekspresi gen. Relevansi fisiologis kontrol biogenesis mRNP didukung oleh fakta bahwa ekspresi
yang berubah atau disfungsi beberapa RNA binding proteins menyebabkan berbagai penyakit,
seperti kanker, sebagai contoh beberapa faktor 3-end processing dan beberapa protein yang
berperan dalam pernyambungan (splicing) alternative [3,4].
Kompleks THO merupakan kompleks nucleus eukariotik yang berfungsi dalam biogenesis
mRNP [5]. Kompleks ini pertama kali diisolasi pada Saccharomyces cerevisiae sebagai
kompleks empat protein yang terdiri dari sejumlah stoikiometrik Tho2, Hpr1, Mft1, dan Thp2
[6]. THO juga telah dipurifikasi pada Drosophila dan sel manusia dan kompleks mengandung
pasangan subunit Hpr1 dan Tho2 yeast, yang disebut dengan Thoc1 dan Thoc2, begitu juga
dengan komponen tambahan seperti Thoc5-Thoc7 dan hTex1/Thoc3 [7,8]. THO berinteraksi
secara fisik dan fungsi dengan protein dalam ekspor mRNA; Sub2/UAP56 RNA dependen
ATPase, dan Yra1/REF1/ALY RNA-binding protein; yang membentuk kompleks yang lebih
besar yang disebut TREX (kompleks transkripsi-ekspor) [8]. THO yeast, mutan sub2 dan mutan
yra1 yang kurang berkembang menunjukkan fenotip yang sama dari kerusakan transkripsi,
gangguan ekspor mRNA, dan transkripsi terkait hiperrekombinasi yang menunjukkan bahwa
protein ini dapat bertindak dalam jalur biogenesis mRNP yang sama [5,9]. THO dan Sub2 dapat
dianggap faktor yang berhubungan paling dekat, mengingat kapasitas Sub2 berlebih untuk
menekan mutasi THO, dan kesamaan dalam kekuatan fenotip diberikan oleh mutasi hpr1, tho2,
dan sub2 [10,11].
Relevansi THO dalam fisiologi sel telah jelas terlihat dari ragi ke manusia. Mutan null THO ragi
sakit dan tumbuh dengan lambat dan deplesi THO memiliki efek negatif pada laju pertumbuhan
manusia dan sel Drosophila [6,7,12]. Selain itu, THO diperlukan untuk kelangsungan hidup
embrio tikus dan untuk kelangsungan hidup pasca melahirkan, sebagaimana ditentukan oleh
konock out THOC1 [13]. Hubungan THO dengan perkembangan kanker juga telah diteliti. Pada
manusia, Thoc1 diidentifikasi sebagai protein matriks nuklear yang mengikat pRB, protein
supresi tumor retinoblastoma [14]. Tingginya kadar hHPR1 / THOC1 telah diamati pada sel
kanker paru-paru dan payudara dan berkaitan dengan ukuran tumor dan agresivitasnya [12,15].
Namun, tidak ada satupun dari pola ekspresi komponen THO THOC1 dan lainnya dan protein
terkait pada tumor yang berbeda dan mekanisme yang mungkin mendasari proses ini diketahui.
Meskipun demikian, data ekspresi gen yang berasal dari microarray dan analisis lokalisasi
protein sistematis tersedia [16,17], sedikit diketahui tentang ekspresi gen dalam rentang kanker
yang luas dan hubungannya dengan patologi pada pasien. Untuk mendapatkan wawasan lebih
jauh tentang peran faktor biogenesis mRNP pada kanker suatu analisis dilakukan terhadap pola
ekspresi THO dan faktor-faktor fungsional terkait lainnya seperti Aly dan hSpt4 pada berbagai
tumor manusia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi THOC1 dan Aly berubah pada
beberapa jaringan tumor yang menunjukkan adanya hubungan faktor biogenesis mRNP dengan
tumorogenesis. Penelitian pembandingan terhadap pola ekspresi gen ini dengan menggunakan
jaringan tumor mengungkapkan perbedaan antara mereka yang bisa menjadi kompatibel dengan
peran yang berbeda dalam biogenesis mRNP dan relevansi dalam proses biologis lainnya.
Metode
Alat dan Bahan
Probe cDNA diperoleh dari klon cDNA dengan menggunakan PCR yang dibeli konsorsium dari
I.M.A.G.E.. Anti-THOC1 dan anti-Aly monoclonal tikus yang dibeli dari Abcam, dan reagen
sekunder yang dibeli dari Dako untuk analisis imunohistokimia (IHC).
Barisan Sel
Barisan sel kanker payudara (MCF7, SKBr-3 dan T47-D), dan MCF10-A yang dibeli dari
American Type Culture Collection dan disebarkan sesuai dengan kondisi yang
direkomendasikan oleh vendor.
Microarray Jaringan
1 mm inti jaringan diperoleh dari blok paraffin tumor yang direseksi di Rumah Sakit
Universitario Virgen del Rocío, dan kemudian disusun menjadi blok paraffin resipien. Diagnosis
patologis disediakan dalam Lampiran 1. Pengumpulan dan penggunaan bahan dari manusia telah