Egy mucin glikoprotein immunfelismerése

Egy mucin glikoprotein immunfelismerése

Uray KatalinMTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport

2011. december 9.

Mucin glikoproteinek

A mucus (nyálka) alkotórészeiTestcsatornák, mirigyek, belső szervek hámszövetei termelik

Légutak, emésztő- és urogenitális rendszer, nyál

Funkció: Hámfelület védelme a kiszáradástólmikroorganizmusoktólfizikai/kémiai ártalmaktól

Nagy molekulatömeg > 200 kDaA gének és fehérjék ismétlődő szakaszokból állnakMagas Thr és/vagy Ser tartalom

=> O-glikozileződés> 50 %

Mucinok a rosszindulatú megbetegedésekben

Mucintermelő szövetekből kiinduló karcinómák

=> Mucinok rendellenes termelődése

Szövetidegen mucin

Túltermelődés Rendellenes glikoziláció

Tumormarkerek

A mucin szénhidrát-oldalláncainak felépüléseEgészséges Tumoros

esetben

Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262

GalNAc

GlcNAc

Gal

Fuc

Sziálsav

STn

Lex

SLex

Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262

Új fehérje- és szénhidrátepitópok megjelenése

Új fehérje- és szénhidrátspecifikus ellenanyagok termelődése

STn

Lex

SLex

Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262

MUC2 glikoprotein

Gasztrointesztinális szekretált mucinvékony- és vastagbél

Ismétlődő szakasz (~ 100x):1PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQT23

Gum et al 1989 J Biol Chem 264:6480

~ 80% glikoziláció

MAb 996 monoklonális ellenanyagDurrant et al 1994 Eur J Cancer 30A:355

T T

T

T

T

T

T

T

T

P

P

P

G

Q

P

V

T

T

T

T

P

I

I

T

T

P

A MUC2 glikoprotein ismétlődő szakaszánakepitópszerkezete

Uray et al 1999, Arch Biochem Biophys 361, 65

MAb 996 ellenanyag epitópja:

Minimális epitóp: 18PTGTQ22

Optimális epitóp: 16PTPTGTQ22

Uray et al 1998 J Pept Sci 4, 319

Az epitópszerkezet pontosabb megismerése módosított epitóppeptidek segítségével

D-aminosav szubsztitúció

Glikoziláció

Az egyes aminosavak szerepe a kötődésben

PT G

T

Q

N-terminális D-aminosav szubsztitúció hatásaa MAb 996 kötődésre

Uray et al 2000 Arch Biochem Biophys 378, 25

Natív peptid1 D2 D3 D4 D

-20

0

20

40

60

80

100

0,001 0,01 0,1 1 10 100

Peptide concentration (mmol/l)

Inh

ibit

ion

%

PTPTGTQ

pTPTGTQ

ptPTGTQ

ptpTGTQ

ptptGTQ

PTPTGTQpTPTGTQptPTGTQptpTGTQptptGTQ

Peptide concentration (mmol/l)

Inhib

itio

n %

Peptidkoncentráció (mM)

Inhib

íció

s %

D-aminosav szubsztitúció az N- és C-terminális lebegő régióban:3-3 D-amino acids

Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418

Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz

0

25

50

75

100

0 24 48 72 96

Idő (óra)

Pept

id %

0

25

50

75

100

0 60 120 180Idő (óra)

Pept

id %

C-terminális D-aminosavak: Stabilitás lizoszóma kivonatban

N-terminális D-aminosavak:Stabilitás szérumban

0

20

40

60

80

100

0.001 0.01 0.1 1 10

Peptide concentration (mM)

Inhi

bit

ion

%

TPTPTGTQTPTTPTPTGTQtpttptPTGTQTPTtptPTGTQtpt

Time (hour)

Time (min)

Peptidkoncentráció (mM)

Inhib

íció

s %

Idő (óra)

Idő (perc)

0

20

40

60

80

100

0.001 0.01 0.1 1 10

Peptide concentration (mM)

Inhi

bit

ion

%

TPTPTGTQtpttPTPTGTQtpttpTPTGTQtpttptPTGTQtpt

Peptidkoncentráció (mM)

Inhib

íció

s %

D-aminosav szubsztitúció az N-terminális lebegő régióban:1-3 D-aminosav

Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz

0

25

50

75

100

0 24 48 72 96

Idő (óra)

Pept

id %

N-terminális D-amino savak: Stabilitás szérumban

Stabilitás lizoszóma kivonatban

Time (hour)

Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418

Idő (óra)

0

20

40

60

80

100

0.001 0.01 0.1 1 10

Peptide concentration (mM)

Inhi

bit

ion

%

tptPTGTQTPTtptPTGTQTPttptPTGTQTpttptPTGTQtpt

Peptidkoncentráció (mM)

Inhib

íció

s %

0

25

50

75

100

0 60 120 180Idő (óra)

Pept

id %

0

25

50

75

100

0 24 48 72 96Idő (óra)

Pept

id %

D-aminosav szubsztitúció a C-terminális lebegő régióban:1-3 D-amino acids

Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz

Stabilitás lizoszóma kivonatban

Stabilitás szérumban

Time (min)

Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418

Idő (óra)

Idő (perc)

D-aminosavakkal szubsztituált peptidek térszerkezeteNMR spektroszkópia alapján

TPTPTGTQTPTtpTPTGTQtpt

tptPTGTQTpt

Tőke et al 2007 BBRC 358, 739

0

20

40

60

80

100

0.001 0.01 0.1 1 10

Peptide concentration (mM)

Inhi

bit

ion

%

TPTPTGTQTPTTPTPTGTQTPttPTPTGTQTPTtPTPTGTQTPt

Peptidkoncentráció (mM)

Inhib

íció

s %

0

25

50

75

100

0 24 48 72 96Idő (óra)

Pept

id %

0

25

50

75

100

0 60 120 180Idő (óra)

Pept

id %

Stabilitás lizoszóma kivonatbanC- terminális D-aminosavakkal

Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz Részleges stabilitás szérumbanN-terminális D-aminosavakkal

D-aminosav szubsztitúció az N- és C-terminális lebegő régióban:1-1 D-aminosav

Time (min)Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418

Idő (perc)

TPTPTGTQTPT

MAb 996 kötődés

Szérum stabilitás

Lizoszóma stabilitás

tPTPTGTQTPtHatékony ellenanyag kötődés, részleges stabilitás

tpTPTGTQtptHatékony ellenanyag kötődés, proteázokkal szembeni stabilitás

D-aminosav szubsztitúció hatása

A MUC2 epitóp peptid glikozilezése

16PTPTGTQ22

16PT(GalNAcα) PTGTQ22

16PTPT(GalNAcα) GTQ22

16PTPTGT(GalNAcα) Q22

16PT(GalNAcα) PT(GalNAcα) GT(GalNAcα) Q22

Inazu & Mizuno, Noguchi Institute, Japan

Glikoziláció hatása a MAb 996 kötődésre

0

20

40

60

80

100

0.0001 0.001 0.01 0.1 1

Peptide concentration (mmol/L)

Inh

ibit

ion

%

PTPTGTQ

PT(GalNAc)PTGTQ

PTPT(GalNAc)GTQ

PTPTGT(GalNAc)Q

PT(GalNAc)PT(GalNAc)GT(GalNAc)Q

16PTPTGTQ22

16PT(GalNAcα) PTGTQ22

16PTPT(GalNAcα) GTQ22

16PTPTGT(GalNAcα) Q22

16PT(GalNAcα) PT(GalNAcα) GT(GalNAcα) Q22

IC50 (μM)

39256.4

> 1000> 1000

16PTPTGTQ22Peptidkoncentráció (mM)

Inh

ibíc

iós

%

Variábilitás megengedettPro-szubsztitúció gyengíti a kötődést

Savas és nagy térkitöltésű aminosavaknagymértékben gyengítik a kötődést

T19 X G20 X

Az epitóp egyes aminosavjainak szerepe a MAb 996 ellenanyag kötődésben

T

PXGTQ

0 1 2 3

PAGTQ

PCGTQ

PDGTQ

PEGTQ

PFGTQ

PGGTQ

PHGTQ

PIGTQ

PKGTQ

PLGTQ

PMGTQ

PNGTQ

PPGTQ

PQGTQ

PRGTQ

PSGTQ

PTGTQ

PVGTQ

PWGTQ

PYGTQ

OD(405)

P

PTXTQ

0 1 2 3

PTATQ

PTCTQ

PTDTQ

PTETQ

PTFTQ

PTGTQ

PTHTQ

PTITQ

PTKTQ

PTLTQ

PTMTQ

PTNTQ

PTPTQ

PTQTQ

PTRTQ

PTSTQ

PTTTQ

PTVTQ

PTWTQ

PTYTQ

OD(405)

S

P

A

W

I

E

D

Csak a Ser (részben Ala, Gly, Leu)helyettesítheti a natív Thr-t

Hasonló méretű, apoláros aminosavakés Glu helyettesítheti a Gln-t

T21 X Q22 X

Az epitóp egyes aminosavjainak szerepe a MAb 996 ellenanyag kötődésben

PTGTX

0 1 2

PTGTA

PTGTC

PTGTD

PTGTE

PTGTF

PTGTG

PTGTH

PTGTI

PTGTK

PTGTL

PTGTM

PTGTN

PTGTP

PTGTQ

PTGTR

PTGTS

PTGTT

PTGTV

PTGTW

PTGTY

OD(405)

PTGXQ

0 1 2

PTGAQ

PTGCQ

PTGDQ

PTGEQ

PTGFQ

PTGGQ

PTGHQ

PTGIQ

PTGKQ

PTGLQ

PTGMQ

PTGNQ

PTGPQ

PTGQQ

PTGRQ

PTGSQ

PTGTQ

PTGVQ

PTGWQ

PTGYQ

OD(405)

S

A

G

L L

I

E

V

M

Az epitóp magjában a Gly20, Thr21 és Gln22 bármilyen helyettesítése csökkent ellenanyag kötődést okoz

A Thr19 helyettesítése növelheti az ellenanyag felismerést

Thr19 glikozilációja is növelheti az ellenanyag felismerést

18P GT T Q22

LIMVE

SAGL

NMVFKI

SAP

Az epitópszerkezet megismerése módosított epitóppeptidekkel

D-aminosav szubsztitúció:

MAb 996 kötődés +

stabilitás

Glikoziláció: 16PTPTGTQ22

Az egyes aminosavak szerepe a kötődésben

PT G

T

QPeptid – ellenanyag

kölcsönhatás megismerése

Lehetőség aktív specifikus

immunterápiára

Köszönetnyilvánítás

Hollósi MiklósMajer Zsuzsa

Vass Elemér

Mike PriceCRC, University of Nottingham

Tugyi ReginaTőke Orsolya OTKA

ETTEACR

SorosCRC

Medzihradszky-Schweiger Hedvig

Bősze SzilviaKiskó Mária

Schlosser Gitta Mák Marianna

Toshiyuki InazuMamoru Mizuno