EFEK IMUNOMODULATOR EKSTRAK METANOL DAUN NAMNAM (C. cauliflora L.) DAN PROPOLIS TERHADAP KEMAMPUAN FAGOSITOSIS MAKROFAG PERITONEUM TIKUS SECARA IN VITRO ZAITUN AWALIAH PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2016 M/1437 H
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
EFEK IMUNOMODULATOR EKSTRAK METANOL DAUN NAMNAM
(C. cauliflora L.) DAN PROPOLIS TERHADAP KEMAMPUAN
FAGOSITOSIS MAKROFAG PERITONEUM TIKUS
SECARA IN VITRO
ZAITUN AWALIAH
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2016 M/1437 H
EFEK IMUNOMODULATOR EKSTRAK METANOL DAUN NAMNAM
(C. cauliflora L.) DAN PROPOLIS TERHADAP KEMAMPUAN
FAGOSITOSIS MAKROFAG PERITONEUM TIKUS
SECARA IN VITRO
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Program Studi Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
Oleh:
ZAITUN AWALIAH
1110096000058
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2016 M/1437 H
PERNYATAAN
DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH
HASIL KARYA SAYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN
SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI
ATAU LEMBAGA MANAPUN.
Jakarta, Juli 2016
Zaitun Awaliah
1110096000058
ABSTRAK
ZAITUN AWALIAH. Efek Imunomodulator Ekstrak Metanol Daun Namnam(C. Cauliflora L.) Dan Propolis Terhadap Kemampuan Fagositosis MakrofagPeritoneum Tikus Secara In Vitro.Di bawah bimbingan LA ODE SUMARLIN dan ANNA MUAWANAH
Telah dilakukan penelitian mengenai salah satu bahan alam di Indonesia yaituekstrak metanol daun namnam dan propolis sebagai imunomodulator secara invitro berdasarkan peningkatan nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofagperitoneum tikus. Antigen yang digunakan adalah bakteri Staphylococcusepidermidis. Stimuno digunakan sebagai kontrol positif. Perlakuan konsentrasimasing-masing sampel uji adalah 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm, dan 10000ppm. Hasil analisis statistik (α= 5%) menunjukkan adanya perbedaan yangsignifikan antara nilai aktivitas fagositosis kedua sampel uji dibandingkan dengankontrol negatif (aquades). Sedangkan dalam penetapan nilai kapasitas fagositosisperbedaan yang signifikan dibanding kontrol negatif hanya terjadi pada sampelpropolis konsentrasi 1000 ppm. Sampel ekstrak daun namnam memilikikemampuan imunomodulaor optimal pada konsentrasi 1000 ppm (86% dan 689)dengan peningkatan nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis (30% dan 202).Kemampuan imunomodulaor optimal sampel propolis pada konsentrasi 1000 ppm(93% dan 1621) dengan peningkatan nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis (37%dan 1134). Berdasarkan hasil pengujian masing-masing sampel disimpulkanbahwa ekstrak daun namnam dan propolis memiliki kemampuan sebagaiimunomodulator.
Kata kunci: daun namnam, propolis, imunomodulator, fagositosis
ABSTRACT
ZAITUN AWALIAH. The Immunomodulatory Effect of Namnam LeafMethanol Extract (C.Cauliflora L.) and Propolis Against of Phagocytosis onMacrophage of Rat Peritoneum In Vitro.Under the guidance of LA ODE SUMARLIN dan ANNA MUAWANAH
Immunomodulatory assay of Indonesian product resources were explored isnamnam methanol extract and propolis in vitro based on increased value ofmacrophages phagocytic activity and capacity in rat peritoneum. Staphylococcusepidermidis was used as antigen. The treatment concentrations was used in 1 ppm,10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm, and 10000 ppm. Statistic analytical (α= 5%) showedthere are significant differences between the value phagocytic activity of the testsample as compared to negative controls. Meanwhile in determining valuephagocytic capacity, a difference compares to negative control only was showedon propolis sampel concentration is 1000 ppm. Namnam leaf extract samples haveimmunomodulatory capabilities optimally at a concentration of 1000 ppm (86%and 689) with an increase in value of the activity and phagocytic capacity (30%and 202). Propolis samples immunomodulatory capabilities optimally at aconcentration of 1000 ppm (93% and in 1621) with an increase in value of theactivity and phagocytic capacity (37% and 1134). Based on these results indicatedthat namnam leaf extracts and propolis have the ability as an immunomodulator.
4.1 Ekstraksi Daun Namnam….………………………………………………... 35
4.2 Hasil Uji Fitokimia.………………………………………………................ 36
4.3 Hasil Uji Viabilitas Makrofag………………………………………………. 45
4.4 Hasil Uji Fagositosis………………………………………………………... 47
BAB V SIMPULAN DAN SARAN…………………………………………… 58
5.1 Simpulan……………………………………………………………………. 58
5.2 Saran………………………………………………………………………... 58
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………….. 60
LAMPIRAN…………………………………..……………………………….. 71
xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Daun Namnam dan Buah Namnam ..………………………….. 7
Gambar 2. Struktur Senyawa (a) Flavonoid, (b) Isorhamnetin, (c)Rhamnazin, (d) Flavon, dan (e) Flavonol………………………. 9
Gambar 3. Komponen Utama Ekstrak Etanol Buah Namnam (5-hidroksimetilfurfural)
10
Gambar 4. Struktur Kimia Cafeic Acid Phenethyl Esther (CAPE) ………... 12
Gambar 5. Struktur Kimia adalah baccharis oxide ((3S)-2,3-epoxy-2,3dihydrosqualene) ..………………………….....……………….. 12
Gambar 6. Struktur Kimia Friedelanol…………………………………....... 13
Gambar 7. Staphylococcus epidermidis di Bawah Pengamatan MikroskopPerbesaran 400x..………………………….. ..………………… 15
Gambar 8. Daun Meniran..………………………….. ..………………….... 17
Gambar 9. Produk Komersil Mengandung Ekstrak Meniran..……………... 17
Gambar 10. Mekanisme Fagositosis.…………………………...…………… 22
Gambar 11. Reaksi Uji Alkaloid Pereaksi Dragendorff.….............................. 37
Gambar 12. Reaksi Uji Alkaloid Pereaksi Mayer ……................................... 37
Gambar 13. Reaksi Pengujian Fitokimia Flavonoid……................................ 38
Gambar 14. Reaksi Pengujian Fitokimia Terpenoid.……............................... 39
Gambar 15. Reaksi Pengujian Fitokimia Kuinon…….................................... 40
Gambar 16. Reaksi Pengujian Fitokimia Tanin……………………………... 40
Gambar 17. Reaksi Hidrolisis Saponin dalam Air…………………………... 41
Gambar 18. Uji Viabilitas Makrofag Tikus (Rattus novergicus)……………..... 46
xii
Gambar 19. Makrofag (1) Aktif Sedang Memfagosit Bakteri, (2) TidakAktif Memfagosit, (3) Bakteri yang Sedang Difagosit olehMakrofag……………………………………………………… 47
Gambar 20. Fagositosis Mikroba di Dalam Sel……………………………. 48
Gambar 21. Diagram % Aktivitas Fagositosis Ekstrak Metanol Daun
Namnam dan Propolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol
Tabel 2. Komposisi Kimia Propolis Sebagai Imunomodulator…................. 13
Tabel 3. Hasil Uji Fitokimia Propolis dan Ekstrak Metanol DaunNamnam……….……………..…………………………………… 36
Tabel 4. Hasil Uji Viabilitas Makrofag………….………………………… 46
Tabel 5. Nilai Aktivitas Fagositosis Ekstrak Metanol Daun Namnam (C.Cauliflora L.) dan Propolis dengan Kontrol Negatif dan KontrolPositif……………………………………………………………… 51
Tabel 6. Nilai Kapasitas Fagositosis Ekstrak Metanol Daun Namnam (C.Cauliflora L.) dan Propolis dengan Kontrol Negatif dan KontrolPositif……………………………………………………………… 52
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian………………………………………... 71
Lampiran 2. Bagan Ekstraksi Daun Namnam……………………………. 72
Lampiran 7. Hasil Pengamatan Uji Aktivitas Fagositosis………………… 77
Lampiran 8. Hasil Pengamatan Uji Kapasitas Fagositosis………………... 78
Lampiran 9. Hasil Analisis Data (Uji Statistik) Aktivitas FagositosisEkstrak Daun Namnam dengan Kontrol Negatif dan KontrolPositif …….…………………………………………………. 79
Lampiran 10. Hasil Analisis Data (Uji Statistik) Aktivitas FagositosisPropolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif ……… 82
Lampiran 11. Hasil Analisis Data (Uji Statistik) Kapasitas FagositosisEkstrak Daun Namnam dengan Kontrol Negatif dan KontrolPositif ……………………………………………………….. 85
Lampiran 12. Hasil Analisis Data (Uji Statistik) Kapasitas FagositosisPropolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif ……… 88
Lampiran 13. Bahan Utama Penelitian…………………………...………. 91
Lampiran 14. Proses Dalam Penelitian…………………….....………....... 92
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Di Indonesia penggunaan obat-obatan tradisional sudah dikenal sejak
ratusan tahun yang lalu dan makin populer dengan makin berkembangnya industri
obat tradisional. Meskipun masyarakat sebagai konsumen mengakui adanya
dampak positif dari konsumsi obat-obatan tersebut, namun bukti ilmiah dari
manfaatnya tetap diperlukan dan tidak dapat dilupakan kemungkinan adanya efek
samping dan efek samping penggunaan obat-obatan tersebut (Sjahrurachman et
al., 2004).
Berbagai macam penyakit dapat masuk ke dalam tubuh tergantung pada
sistem kekebalan tubuh. Ketika sistem imun tidak bekerja optimal, tubuh akan
rentan terhadap penyakit. Beberapa hal dapat mempengaruhi daya tahan tubuh,
misalnya saja karena faktor lingkungan, makanan, gaya hidup sehari-hari, stres,
umur dan hormon (Suhirman dan Winarti, 2007).
Adanya senyawa-senyawa kimia yang dapat meningkatkan efektivitas
sistem imun sangat membantu untuk mengatasi penurunan sistem imun. Industri
kesehatan biasanya menggunakan produk alami sebagai alternatif untuk formulasi
terapi medis konvensional (allopathic) dalam rangka pengobatan berbagai
penyakit (Margaretha, 2012). Dengan demikian, upaya telah dilakukan untuk
meningkatkan kekebalan tubuh oleh agen imunomodulator/imunostimulan yang
2
bekerja sebagai adjuvant untuk pengobatan konvensional (Sarisetyaningtyas et al.,
2006).
Bahan-bahan yang dapat memodulasi sistim imun tubuh dikenal sebagai
imunomodulator. Imunomodulator adalah bahan yang dapat mengembalikan dan
memperbaiki sistem imun yang fungsinya terganggu atau untuk menekan yang
fungsinya berlebihan (Baratawidjaja, 2002). Usaha pencarian tanaman yang
berkhasiat sebagai imunomodulator dapat diawali dari penggunaannya secara
empiris. Beberapa pendekatan dilakukan dari berbagai aspek seperti etnobotani,
etnofarmasi, etnofarmakologi dan etnomedis dilanjutkan dengan test secara in
vitro (Suhirman dan Winarti, 2007).
Menurut Parmer et al. (1997) dan Grotewold (2006), golongan senyawa
alkaloid, senyawa fenolat, flavonoid, isoflavonoid, dan triterpen diketahui
bermanfaat sebagai antikanker dan imunomodulator. Penelitian lain telah
dilakukan oleh Kustiawan (2012) mengenai imunomodulator dari ekstrak etanol
daun sirih merah yang mengandung senyawa golongan neolignan dapat
meningkatkan indeks fagositosis makrofag, diketahui sebagai imunostimulan.
Isolasi dilakukan dan didapat dua isolat yaitu 2-allyl-4-(1’-hydroxy-1’-(3”,4”,5”-
trimethoxyphenyl)propoan- 2’-yl)-3,5-dimethoxycyclohexa-3,5-dienone dan isolat
2 yakni 2-allyl-4-(1’-acetyl-1’-(3”,4”,5”-trimethoxyphenyl) propan-2’-yl)-3,5-
dimethoxycyclohexa-3,5-dienone. Selain itu, salah satu bahan obat tradisional
yakni tempuyung mengandung senyawa flavonoid (luteolin-7-O-glikosida,
apigenin-7-O-glikosida dan kaempferol) yang diduga dapat digunakan sebagai
imunomodulator (Nugroho, 2012). Penggunaan suatu imunomodulator dianggap
3
penting terutama jenis imunomodulator yang memberikan efek pada sistem
kekebalan tubuh dan dapat membantu meringankan kelainan klinis yang dapat
ditimbulkan oleh suatu penyakit (Abraham et al., 2008; Cuningham et al., 2014).
Salah satu bahan alam Indonesia yang diduga mempunyai potensi sebagai
imunomodulator adalah tanaman namnam (Cynometra cauliflora L.), merupakan
keluarga fabaceae atau leguminosae, Sebagian besar tanaman golongan tersebut
adalah sumber senyawa flavonoid baik dalam bentuk flavonoid, isoflavonoid,
efektif menghambat peroksidasi asam linoleat dan mencegah pembentukan anion
superoksida misalnya senyawa isorhamnetin dan rhamnazin (Tringali, 2001).
Aziz dan Iqbal (2013) menyebutkan bahwa total fenolik dan flavonoid
tanaman namnam pada bagian daun merupakan bagian yang terbaik sebagai
sumber antioksidan, yaitu kadar total fenolik sebesar 1180,47 – 1831,47 mg
GAE/g dan kadar total flavonoid sebesar 21,96 – 33,63 mg GAE/g. Penelitian lain
juga menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun namnam (Cynometra cauliflora)
memiliki kandungan total fenolik, flavonoid, vitamin C dan β-karoten yang tinggi
(Sumarlin et al, 2015). Sifat antioksidan dan beberapa senyawa yang
dikandungnya inilah yang memungkinkan adanya potensi sebagai
imunomodulator (Kurniasih et al., 2015).
Selain tanaman namnam, salah satu bahan alam lain yang diyakini secara
empiris mempunyai banyak khasiat dan relatif aman adalah propolis. Propolis
adalah bahan alami tidak beracun dikumpulkan oleh lebah dari berbagai sumber
tanaman, telah digunakan sejak dahulu kala diantaranya sebagai obat tradisional,
biokosmetik, dan makanan kesehatan (Bankova, 2000; Palombo, 2011; Parolia et
4
al., 2010). Propolis merupakan antibiotik karena mempunyai kandungan
flavonoid, yaitu bahan aktif yang berfungsi sebagai antiperadangan dan antivirus.
Propolis juga dapat berperan sebagai antitumor, dapat merangsang sistem
kekebalan secara langsung dan melepaskan unsur yang merespon imunitas seluler
melalui mekanisme fagositosis (Wade, 2005).
Secara kimia, propolis mengandung bahan kimia kompleks yang sangat
kaya berbagai imunomodulator yang potensial berupa asam fenolat dan flavonoid
yang memiliki banyak manfaat untuk meningkatkan aktivasi makrofag. Cafeic
Acid Phenethyl Esther (CAPE) yang memiliki aktivitas sebagai imunomodulator
juga terkandung didalamnya (Challem, 2004). Missima et al. (2007) menyebutkan
senyawa dalam tanaman yang dihinggapi lebah juga menentukan senyawa di
dalam propolis. Salah satu yang berhasil diisolasi adalah senyawa baccharis oxide
((3S)-2,3-epoxy-2,3-dihydrosqualene) dan friedelanol yang dapat meningkatkan
produksi H2O2. Berasal dari tanaman Baccharis dracunculifolia DC sebagai
sumber utama propolis asal Brazil. Hasil menunjukkan efek stimulasi pada
makrofag. Namun penyelidikan lebih lanjut diharapkan memberikan kotribusi
pemahaman yang lebih baik mengenai aksi imunomodulator dari senyawa
metabolit sekunder ini.
Dengan demikian, diduga bahwa ekstrak metanol daun namnam dan
propolis berkhasiat sebagai imunomodulator. Hal inilah yang mendasari perlunya
dilakukan penelitian terhadap kemampuan ekstrak metanol daun namnam dan
propolis sebagai imunomodulator yang dilakukan pengujian secara terpisah.
5
Informasi mengenai sifat imunomodulator dalam penelitian ini akan
diukur berdasarkan pengukuran nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag
secara in vitro. Nilai aktivitas fagositosis ditetapkan dengan menghitung makrofag
aktif sedang memfagosit bakteri. Makrofag yang dipakai berasal dari cairan
peritoneum tikus galur Spreague Dawley dengan bakteri Staphylococcus
epidermidis sebagai antigen. Sementara itu, penetapan nilai kapasitas fagositosis
dilakukan dengan menghitung jumlah bakteri yang difagosit oleh makrofag aktif
dalam proses fagositosis tersebut.
1.2 Rumusan Masalah
Apakah ekstrak metanol daun namnam dan propolis memiliki efek
imunomodulator terhadap kemampuan aktivitas dan kapasitas fagositosis
makrofag peritoneum tikus?
1.3 Hipotesis
Ekstrak metanol daun namnam dan propolis memiliki kemampuan sebagai
imunomodulator dilihat dari peningkatan aktivitas dan kapasitas fagositosis sel
makrofag peritoneum tikus.
1.4 Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kemampuan
imunomodulator ekstrak metanol daun namnam dan propolis dengan
meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag peritoneum tikus.
6
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini yaitu memberikan data mengenai hasil identifikasi
kemampuan ekstrak metanol daun namnam dan propolis sebagai imunomodulator
untuk meningkatkan sistem kekebalan tubuh.
7
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tanaman Namnam (C. cauliflora L.)
Cynometra cauliflora dikenal dengan nama lokal yaitu namnam. Berasal
dari bahasa Yunani kynos, kyon yang berarti anjing, dan metra yang berarti rahim.
Mengacu pada bentuk polong-polongan dan namnam termasuk ke dalam keluarga
leguminose (Quattrochi, 2000). Pohon namnam mempunyai tinggi antara 3-10
meter. Batangnya tegak, bulat, berwarna abu-abu kecoklatan, dan berbonggol-
bonggol. Daun namnam majemuk dengan sepasang anak daun berbentuk lonjong
dengan panjang antara 5 sampai 15 cm, berwarna putih atau merah jambu terang
ketika masih muda, dan berubah menjadi hijau tua mengkilat ketika tua. Bunga
namnam majemuk terdiri dari 4-5 tandan yang tumbuh di batang dan cabang,
bunga namnam berukuran kecil berwarna merah muda atau putih dengan mahkota
berbentuk lanset berwarna putih. Buah namnam berbentuk ginjal keriput yang
ujungnya meruncing dan daging buah yang tebal, tumbuh di batang hingga dekat
ke tanah, berwarna coklat atau kekuningan dengan permukaan yang kasar (Heyne,
1987).
Gambar 1. Daun Namnam (Dokumentasi Pribadi)
8
Biasanya tanaman ini tumbuh di dataran rendah tropis yang lembab,
namun juga dapat tumbuh dengan baik di iklim dengan musim kemarau yang
berbeda dan tahan terhadap angin (Rabeta dan Faraniza, 2013). Menurut orang
terdahulu tanaman ini memiliki banyak sifat gizi dan obat dan dianggap sebagai
buah yang kurang dimanfaatkan (Ikram et al., 2009).
Sebagian besar tanaman golongan fabaceae atau leguminosae merupakan
sumber senyawa flavonoid baik dalam bentuk flavonoid, isoflavonoid, maupun
neoflavonoid yang dilaporkan efektif menghambat peroksidasi asam linoleat dan
mencegah pembentukan anion superoksida misalnya senyawa isorhamnetin dan
rhamnazin (Tringali, 2001). Hasil test secara in vitro dari favonoid golongan
flavones dan flavonols telah menunjukkan adanya respon imun (Hollman et al.,
1996). Golongan senyawa polisakarida, terpenoids, alkaloid dan polifenol
mempunyai bioaktifitas sebagai imunostimulant agent (Wagner, 1985).
(1) (2)
(3) (4)
9
(5)
Gambar 2. Struktur senyawa (1) flavonoid, (2) isorhamnetin, (3) rhamnazin, (4)flavon, dan (5) flavonol (Tringali, 2001)
Tanaman famili fabaceae atau leguminosae juga dilaporkan sebagai
penghasil senyawa fenolik yang tersubstitusi gugus hidroksil khususnya golongan
oligostilbenoid (memiliki struktur yang terdiri dari rantai C6-C2-C6). Senyawa
golongan oligostilbenoid tersebut telah dilaporkan mempunyai beberapa keaktifan
biologis yang sangat menarik, seperti antioksidan, anti-HIV, antibakteri,
antifungal, dan antihepatotoksik sitotoksik, inhibitor enzim 5α-reduktase, dan
enzim asetilkolinesterase. (Kristanti et al., 2006).
Komponen bioaktif yang terdapat pada bagian-bagian tanaman namnam
berbeda-beda (Aziz dan Iqbal, 2013). Hal ini dapat dilihat dalam (tabel 1) analisis
kualitatif fitokimia Cynometra cauliflora L.
Tabel 1. Analisis Kualitatif Fitokimia Cynometra cauliflora L. (Aziz dan Iqbal, 2013)Batang Daun tua Kulit Pohon Daun muda
Keterangan: *) Memberikan perbedaan yang bermakna (signifikan) dibandingkan kontrol negatif; KN = Kontrol Negatif;KP = Kontrol Positif; EDN = Ekstrak metanol daun namnam; (-) = tidak terdeteksi
Sementara itu, nilai aktivitas fagositosis sampel propolis juga
menunjukkan hasil berbeda bermakna dengan kontrol negatif, ditunjukkan
berdasarkan hasil analisis statistik uji LSD (Lampiran 10). Hasil menunjukkan
nilai aktivitas fagositosis tertinggi sampel propolis yaitu pada konsentrasi 10000
ppm dengan nilai kenaikan presentase aktivitas fagositosis sebesar 40%.
Meskipun demikian, tetapi terjadi penurunan pada nilai kapasitasnya dibanding
kontrol negatif. Hasil analisis statistik uji LSD menunjukkan dalam pengamatan
nilai kapasitas fagositos hanya sampel propolis perlakuan konsentrasi 1000 ppm
yang berbeda secara signifikan dibanding dengan kontrol negatif (Lampiran 12).
Oleh karena itu, hasil optimal efek imunomodulator sampel propolis ditetapkan
pada konsentrasi 1000 ppm dengan nilai aktivitas sebesar 93% (Tabel 5) dan nilai
kapasitas 1621 (Tabel 6).
52
Tabel 6. Nilai Kapasitas Fagositosis Ekstrak Metanol Daun Namnam (C. Cauliflora L.)dan Propolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif
Konsentrasi(ppm)
Nilai Kapasitas FagositosisKN KP EDN P Kenaikan Nilai
KP = Kontrol Positif; EDN = Ekstrak metanol daun namnam; (-) = tidak terdeteksi
Perbedaan yang signifikan tidak terlihat pada penetapan nilai kapasitas
fagositosis antara seluruh perlakunan konsentrasi sampel uji ekstrak metanol daun
namnam jika dibandingkan dengan kontrol negatif. Hasil juga menunjukkan
semakin tinggi konsentrasi larutan uji ekstrak metanol daun namnam terjadi
penurunan nilai kapasitas fagositosis. Sementara pada sampel uji propolis hanya
perlakuan konsentrasi 1000 ppm yang menunjukkan perbedaan secara signifikan
dengan kontrol negatif. Hal tersebut dapat terjadi disebabkan data tidak
terdistribusi homogen. Sebab lain adalah kendala teknis dalam penghitungan
bakteri secara manual menggunakan mikroskop. Makrofag yang padat terisi
bakteri seringkali dijumpai saat pengamatan sehingga sulit menghitung jumlahnya
secara tepat dalam medan pandang mikroskop (Gambar 19). Kondisi ini dapat
teratasi jika menggunakan alat khusus yang dapat menghitung jumlah bakteri
secara otomatis menggunakan instrumen fluorosence microplate reader (Wagner
dan Jurcic, 1991).
Perbandingan antara sampel ekstrak metanol daun namnam dengan
propolis yaitu nilai presentase aktivitas fagositosis propolis lebih tinggi daripada
sampel ekstrak metanol daun namnam pada setiap konsentrasi. Begitu juga
53
dengan nilai kapasitas fagositosis sampel propolis lebih tinggi dibanding sampel
ekstrak metanol daun namnam. Diagram perbandingan keduanya dapat dilihat
dalam (Gambar 21) (Gambar 22).
Gambar 21. Diagram % Aktivitas Fagositosis Ekstrak metanol daun namnam danPropolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif
Gambar 22. Diagram Nilai Kapasitas Fagositosis Ekstrak metanol daun namnamdan Propolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif
54
Ada beberapa mekanisme yang dimungkinkan menyebabkan terjadinya
peningkatan aktivitas fagositosis. Kemungkinan pertama adalah faktor opsonin.
Pada saat opsonin membungkus partikel asing tersebut akan terjadi pengikatan
dengan permukaan fagosit. Kemungkinan kedua adanya reseptor pola pengenalan
(pattern recognition receptors/PRR) (Handajani, 2013). Kemungkinan yang
ketiga adalah dari kandungan yang terdapat dalam sampel uji ekstrak metanol
daun namnam dan propolis.
Aktivitas dan kapasitas fagositosis pada bahan uji berkaitan dengan
kandungan kimia yang terdapat dalam bahan uji tersebut (Chairul, 2009). Menurut
Inalci et al. (2005), beberapa komponen bioaktif yang berasal dari alam
mempunyai efek pleitropik (mempunyai beragam efek fisiologis) dan kombinasi
berbagai komponen bioaktif pada satu simplisia atau ekstrak akan memberikan
efek sinergis. Salah satu senyawa yang terdapat dalam ekstrak metanol daun
namnam dan propolis ialah flavonoid, senyawa tersebut akan berinteraksi dengan
dengan membran sel yang dapat mencegah masuknya molekul asing dan
melindungi fungsi struktur membran sel (Oteiza et al., 2006).
Flavonoid berpotensi bekerja terhadap limfokin yang dihasilkan oleh sel T
sehingga akan merangsang sel-sel fagosit untuk melakukan respon fagositosis
(Kusmardi et al., 2007). Flavonoid juga dapat berinteraksi dengan semua
membran sel (termasuk sel imun) melalui ikatan hidrogen yang berguna
mengurangi atau menekan masuknya molekul pengganggu dan melindungi stuktur
dan fungsi membran sel (Oteiza et al., 2006). Flavonoid membantu aktivitas dari
reseptor untuk mengikat partikel asing. Terdapat beberapa pengaruh flavonoid
55
(imunomodulator) dalam mempengaruhi reseptor. Pertama, flavonoid dapat
mempengaruhi sel B dengan cara mengaktifkan sel T untuk menginduksi sekresi
antibodi, antibodi yang dikeluarkan dapat membantu Fc receptors dalam reaksi
opsonisasi, yaitu reaksi untuk mempermudah fagositosis karena antigen diselimuti
oleh antibodi, terutama antibodi IgG. Bagian ekor antibodi IgG yang berikatan
dengan antigen mampu mengikat reseptor di permukaan (makrofag) (Bellanti,
1993 dan Sherwood, 2001). Kedua, interaksi senyawa tersebut dengan membran
sel diduga dapat mempertajam reseptor pada Sel Kupffer (makrofag), khususnya
pada scavenger receptors yang berfungsi sebagai mediator fagositosis (Gao et al.,
2008 dan Oteiza et al., 2006).
Penelitian sebelumnya telah banyak dilakukan mengenai mekanisme kerja
propolis sebagai imunomodulator, meskipun hasilnya masih belum jelas (Cuesta
et al., 2005). Salah satu senyawa di dalamnya yaitu CAPE (Cafeic Acid Phenethyl
Esther), beberapa menjelaskan evaluasi secara in vitro efek propolis dalam
mengaktivasi makrofag menunjukkan propolis meningkatkan pembentukan H2O2
di dalam sel ini (Orsi et al., 2000). Ivanovska et al. (1993) meneliti efek kompleks
caffeic acid dan simanat dengan lisin, menunjukkan asam sinamat menghambat
pembentukan H2O2 oleh peritoneum makrofag, ketika caffeic acid diinduksi
dalam produksi itu. Krol et al. (1995) melaporkan bahwa flavon menghambat
secara langsung luminol-chemoluminescence murin makrofag oleh mekanisme
involusi posforilasi protein kinase C. Indikasi lainnya dari aktivasi makrofag
adalah pembentukan nitrat oksida (NO), dari L-arginin oleh sintesis nitrat oksida
(NOS) (Macfarlaane et al., 1999; Novelli, 2005). NO penting dalam mekanisme
56
mikrobisida dari makrofag untuk menghambat sintesis DNA, respirasi
mitokondria dan transport aktif dalam membran fungi dan bakteri (Chan et al.,
1992; Macmicking et al., 1997). Di samping itu, NO juga merupakan
neutransmissor vasodilator penting dan mediator seluler dari perbaikan jaringan
(Chakraborty et al., 2006).
Menurut Sforcin (2007) menerangkan dalam penelitiannya bahwa aksi
propolis sebagai imunomodulator disebabkan dari produk turunan tanaman dan
isolat ekstrak dari sumber tanamannya tidak memiliki efek yang sama dalam
pengujian tersebut. Mungkin ada efek sinergis, hal ini yang menyebabkan setiap
propolis memiliki aktivitas farmakologi yang berbeda.
Menurut Sriningsih dan Wibowo pada penelitiannya tahun 2006, beberapa
penelitian efek imunitas dari ekstrak atau isolat tanaman menunjukkan bahwa efek
yang muncul sangat tergantung dari dosis uji, dimana efek
imunosupresi/sitotoksik akan muncul manakala dilakukan pada dosis besar.
Sementara efek imunostimulan akan terlihat pada dosis rendah (Wagner, 1999).
Imunosupresi merupakan suatu tindakan untuk menekan respons imun, sedangkan
imunostimulan bekerja dengan cara memperbaiki fungsi sistem imun
menggunakan bahan yang merangsang sistem imun (Baratawidjaja, 2006). Hal
serupa diperkuat oleh (Pinca et al., 2013) dalam penelitiannya yaitu sifat
flavonoid sebagai imunomodulator dapat berubah menjadi imunosupresan
terhadap rerata indeks daya fagosit makrofag, ketika diberikan dalam dosis yang
besar dan dalam jangka waktu yang lama.
57
Dari hasil tersebut ekstrak metanol daun namnam dan propolis dapat
meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag, maka keduanya
memiliki kemampuan sebagai imunomodulator. Namun demikian, perlu adanya
penelitian lebih lanjut mengenai efektivitas imunomodulator ekstrak metanol daun
namnam dan propolis. Berhubung efek imunomodulator disebabkan oleh
mekanisme sistem tubuh yang kompleks, maka perlu menggunakan metode uji
yang lebih komprehensif (Sriningsih, 2006).
58
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
1. Ekstrak daun namnam dan propolis memiliki kemampuan
imunomodulator berdasarkan peningkatan aktivitas dan kapasitas
fagositosis makrofag dibandingkan dengan kontrol negatif.
2. Sampel ekstrak daun namnam memiliki kemampuan imunomodulaor
optimal pada konsentrasi 1000 ppm (86% dan 689) dengan peningkatan
nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis (30% dan 202).
3. Sampel propolis kemampuan imunomodulaor optimal pada konsentrasi
1000 ppm (93% dan 1621) dengan peningkatan nilai aktivitas dan
kapasitas fagositosis (37% dan 1134).
4. Nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis kedua sampel ekstrak metanol
daun namnam masih dibawah kontrol pembanding yang merupakan
produk imunomodulator komersil (stimuno) (93% dan 1106), sedangkan
hasil penetapan pada sampel propolis menunjukkan hasil lebih tinggi
daripada produk komersil tersebut.
5.2 Saran
1. Perlu dilakukan uji toksisitas ekstrak daun namnam dan propolis untuk
mengetahui apakah sampel bersifat toksik atau tidak terhadap makrofag.
59
2. Perlu dilakukan serangkaian pengujian secara in vivo lebih lanjut untuk
mengetahui jenis cara kerja imunomodulator ekstrak daun namnam dan
propolis.
60
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A.K. dan Lichtman, A.H. 2005. Cellular and Molecular Immunology Edisi4, 5. Elsevier Saunders. Philadelphia.
Achmad, S.A. 1986. Kimia Organik Bahan Alam. Jakarta (ID): Karnunika.
Adiyati, P.N. 2011. Ragam Jenis Ektoparasit Pada Hewan Coba Tikus Putih(Rattus Norvegicus) Galur Sprague Dawley. Bogor: Fakultas KedokteranHewan Institut Pertanian Bogor.
Aziz, A.F.A. dan Iqbal, M. 2013. Antioxidant Activity and PhytochemicalComposition of Cynometra cauliflora. Journal of Experimental andIntegrative Medicine. 3(4):337-341.
Bankova, V.S., De Castro SL, Marcucci, M.C. 2000. Propolis: recent advances inchemistry and plant origin. Apidologie. 31: 3-15.
Baratawidjaja, K.G. 1988. Imunologi Dasar. Balai Penerbit Fakultas KedokteranUniversitas Indonesia
Baratawidjaja, K.G. 2002. Imunomodulasi. Dalam: Imunologi dasar. Edisi 5.Jakarta: Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
Baratawidjaja, K.G. dan Rengganis, I. 2010. Imunologi Dasar. Jakarta: BalaiPenerbit Fakultas Kedokteran Indonesia.
Barbuto, J.A.M., Hers, E.M., Salmon, S.E. 2003. Imunofarmakologi dalamfarmakologi dasar dan klinik. Katzung BG. 6: 904-6.
Beekeeping dan Crane, E. 1988. Science, Practice and World Resourses.Heinemann London.
Bellanti, J.A..1993. Imunologi III. Diterjemahkan oleh Wahab AS, Soeripto N.Yogyakarta: Gadjah Mada University Press; 1993. hal. 1, 7-8,18.
Challem, J. 2004. Tuberculosis, Medical Journals Document Value of BeePropolis, Honey and Royal Jelly. The Nutrition Reporter 2004. Dalam:Indeks Daya Fagosit Makrofag Peritoneum Setelah Pemberian Propolis PadaMencit (Mus Musculus). Fakultas Kedokteran Universitas Islam SultanAgung (Unissula) Semarang.
61
Chairul. 2009. Phagocytosis Effectivity Test of Phenylbutenoid CompoundsIsolated from Bangle (Zingiber cassumunarRoxb.) Rhizome. Journal ofBiological Diversity. 10 (1): 40-43
Chan, J., Xing, Y., Magliozzo, R.S., Blomm, B.R., 1992. Killing of VirulentMycobacterium Tuberculosis by Reactive Nitrogen Intermediates Producedby Activated Murine Macrophages. The Journal of Experimental Medicine175, 1111–1122.
Chakraborty, P.D., Bhattacharyya, D., Pal, S., Ali, N., 2006. In Vitro Induction ofNitric Oxide by Mouse Peritoneal Macrophages Treated With HumanPlacental Extracts. International Immunopharmacology 6, 100–107.
Cuesta, A., Rodr´ıguez, A., Esteban, M.A., Meseguer, J.. 2005. In Vivo Effects ofPropolis, A Honeybee Product, On Gilthead Seabream Innate ImmuneResponses. Fish & Shelfish Immunology 18, 71–80.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Parameter Standar Umum EkstrakTumbuhan Obat. Jakarta. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat danMakanan; 2000, Hal. 1-11.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2007. Parameter Standar UmumEkstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat danMakanan. Hal 1-17.
Dimov, V., Ivanovska, N., Manolova, N., Bankova, V., Nikolov, N. dan Popov.1991.Immunomodulatory action of propolis: Influence on anti-infectiousprotection and macrophage function. Apidologie, 22:155-162.
Djauzi, S. 2003. Perkembangan obat imunomodulator. Med J Ked. 4(2): 13-5.
Estany, S., Palacio, J.R., Barnadas, R., Sabes, M, Iborra A, Martinez P.Antiioxidant activity of N-acetylcysteine, flavonoids and α-tocopherol onendometrial cells in culture. J Repro Immun. Elsevier. 2007; 1-10.
Febriansyah, A.R. 2009. Uji Efek Imunomodulator Ekstrak Metanol Daun danKulit Batang Rhodamnia cinerea Jack Melalui Pengukuran Aktivitas danKapasitas Fagositosis Sel Makrofag Peritoneum Mencit Yang DiinduksiStaphylococcus epidermidis Secara In Vitro. Skripsi. Program Studi FarmasiFakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Finlay, T. M., Abdulkhalek, S., Gilmour, A., Guzzo, C., Jayanth, P., Amith, S. R.,.Szewczuk, M. R. 2010. Thymoquinone-induced Neu4 sialidase activates
62
NFkappaB in macrophage cells and pro-inflammatory cytokines in vivo.Glycoconj J, 27(6), 583-600. doi: 10.1007/s10719-010-9302-5. DalamAkrom Dan Fatimah. Ekstrak Heksan Biji Jintan Hitam (Nigella Sativa L)Meningkatkan Aktivitas Fagositosis Makrofag Tikus Betina Galur Sd(Sprague Dawley) Yang Diinduksi Dmba (7,12dimetilbenz(Α)Antrasen)Secara In Vitro. Pharmaciana, Vol. 5, No. 1, 2015: 69-76.
Fischer, G., Conceic¸ ˜ao, F.R., Leite, F.P.L., Dummer, L.A., Vargas, G.D.,H¨ubner, S.O., Dellagostin, O.A., Paulino, N., Paulino, A.S., Vidor, T.,2007. Immunomodulation produced by a green propolis extract on humoraland cellular responses of mice immunized with SuHV-1.Vaccine 25, 1250–1256.
Francis, G., Zohar K., Harinder, P.S.M., dan Klaus B. 2002. The biological actionof saponins in animal sistems. British Journal of Nutrition. 88: 587–605.
Fuente, M.D. dan Victor, V.M. 2000. Antioxidants as modulator of immunefunction. In immunology and cell biology; 78: 49-54.
Garcia, C.R.S.. 1999. Calcium Homeostasis and Signaling in the Blood–StageMalaria Parasite. Parasitology Today. 15. 12:488–491.
Ghisalberti, E.L. 1978. Propolis: a review., Bee Wld. 60: 59–84.
Gordaliza, M. 2007. Natural Product As Leads For anticancer Drug, ClinicalTransl. Oncology, Milan: Springer Milan 9 : 767 -776.
Grotewold, E. 2006. The Science of Flavonoids. Springer Science and BusinessMedia Inc. United States of America.
Hady, Abd El FK., dan Hegazi, A.G. 2002. Egyptian Propolis: 2. chemicalcomposition, antiviral and antimicrobial activities of east Nile Deltapropolis. Dokki, Giza, Egypt: Departments of Chemistry of Natural Productsand Parasitology. National Research Center. 57: 386-394.
Handajani, J. 2013. Minyak Atsiri Temu putih (Curcuma zedoaria Rosc.,Zingiberaceae) Meningkatkan Aktivitas Fagositosis Neutrofil Terpapar A.actinomycetemcomitans. The International Symposium on Oral and DentalSciences. Yogyakarta: Fakultas Kedokteran Gigi UGM.
Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern MengekstraksiTumbuhan. Terjemahan Padmawinata. K. Bandung (ID): Penerbit ITB.
63
Haslam, E. 1996. Natural Polyphenols (Vegetable Tannins) as Drugs:Possiblemodes of Action. J. Nat. Prod. 59: 205-215.
Harley, J.P., Prescott, L.M. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, FifthEdition. The Mc Graw Hill Companies. San Francisco 79: 446-447.
Heyne, K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia, jilid 1. Jakarta: Yayasan SaranaWan Jaya.
Hollman, P.C.H., M.G.L. Hertog dan M.B. Katan, 1996. Analysis and HealthEffects of Flavonoids. Food Chemistry. 57 (1) : 43-46.
Inalci, M. et.al. 2005. Use of Cancer Chemopreventive Phytochemicals asAntineoplastic Agents, Lanset Oncol. 6;899 – 904.
Ivanovska, N.D., Dimov, V.B., Pavlova, S., Bankova, V., Popov, S.. 1995a.Immunomodulatory action of propolis. V. Anticomplementary activity of awater-soluble derivative. Journal of Ethnopharmacology 47, 135–143.
Jawetz, E., Melnick, J. L., Adelberg, E. A. 2001. Mikrobiologi Kedokteran EdisiXXII, diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas KedokteranUniversitas Airlangga. Jakarta: Penerbit Salemba Medik. 205-209.
Jensch-Junior, B.E., Pressinotti, L.N., Borges, J.C.S., deSilva, J.R.M.C. 2006.Characterization of macrophage phagocytosis of the tropical fishProchilodus scrofa (Steindachner, 1881). Aquaculture. 251:509–515.
Kamperdick, C., Adam, G., Van, N.H., Sung, T.V. 1997. Chemical Constituentsof Madhuca pasquiery. Zeitschrift für Naturforschung. 52:295-300.
Kardinan, A. dan Kusuma, F.R.. 2004. Meniran Penambah Daya Tahan TubuhAlami, Cetakan ke-1, 5, 10, 11. Agromedia Pustaka. Jakarta.
Krell, R. 1996. Value-added products from beekeeping, FAO Agricultural ServiceBull., No. 124.
Kresno, S.B. 2001. Respons Imun Pada Infeksi. Imunologi: Diagnosis danProsedur Laboratorium Edisi 4. Jakarta: Balai Penerbit Penerbit FakultasKedokteran Universitas Indonesia
64
Krol, W., Czuba, Z.P., Threadgill, M.D., Cunningham, B.D.M., Shani, J..1995.Modulation of Luminol-Dependent Chemiluminescence of MurineMacrophages by Flavone And Its Synthetic Derivatives. Arzneimittel-Forschung/Drug Research. 45, 815–818.
Kusmardi, Kumala, S., Triana, E.E. 2007. Efek Imunomodulator Ekstrak DaunKetepeng Cina (Cassia Alata L.) Terhadap Aktivitas dan KapasitasFagositosis Makrofag. Makara, Kesehatan, Vol. 11, No. 2: 50-53.
Kurniasih, Nunung, Kusmiyati, M., Nurhasanah, Sari, RP, Wafdan, R. 2015.Potensi Daun Sirsak (Annona Muricata Linn), Daun Binahong (AnrederaCordifolia (Ten) Steenis), Dan Daun Benalu Mangga (DendrophthoePentandra) Sebagai Antioksidan Pencegah Kanker. Volume IX No.1.
Kustiawan, P.M., Wahyuono, S., dan Yuswanto, A. 2012. Isolasi dan IdentifikasiSenyawa Imunostimulan Non Spesifik In Vitro dari Daun Sirih Merah (Pipercrocatum Ruiz & Pav.). Thesis. Program Pascasarjana Fakultas FarmasiUGM.
Lenny, S. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktivitas Kandungan Kimia Utama PudingMerah dengan Metode Uji Brine Shrimp. Medan: USU Repository.
Lyu, S.Y. dan Park, W.B. 2005. Production of Cytokine and NO by RAW 264.7Macropaghes and PBMC in vitro incubation with flavonoids. Arch. Pharm.Res. 28: 573-581
Ma’at, S. 2004. Tanaman Obat Untuk Pengobatan Kanker (Bagian 3). JurnalBahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 3, No. 2.
Macfarlane, A.S., Schwacha, M.G., Eisenstein, T.K., 1999. In Vivo Blockage ofNitric Oxide with Aminoguanidine Inhibits Immunosuppression Induced byan Attenuated Strain of Salmonella Typhimurium, Potentiates SalmonellaInfections, and Inhibits Macrophage and Polymorphonuclear LeukocyteInfluxinto The Spleen. Infection and Immunity 67, 891–898.
Macmicking, J., Xie, Q.W., Nathan, C., 1997. Nitric oxide and macrophagefunction. Annual Review of Immunology 15, 323–350.
Margaretha, I. 2012. Kajian Senyawa Bioaktif Propolis Trigona Spp. SebagaiAgen Anti Karies Melalui Pendekatan Analisis Kimia Dipandu DenganBioassay. Disertasi. Universitas Indonesia.
Marliana, S.D., Suryanti, V., Suyono. 2005. Skrining Fitokimia dan AnalisisKromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechiumedule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol. Biofarmasi 3 (1): 26-31.
Marquez N., Sancho R., Macho A..2004. Caffeic Acid Phenethyl Ester Inhibits T-Cell Activation by Targeting Both Nuclear Factor of Activated T-Cells and
Mathilda, W.B. 1987. Immnomodulator. Jurusan Farmasi Institute TeknologiBandung. Majalah Cermin Dunia Kedokteran. Halaman 44-46.
McGahon, A.J., Martin, R.P., Bissonnette, R.P., Mahboubi, A., Shi, Y., Mogil,R.J., Nishioka, W.K., Green, D.R. 1995. The end of the (cell) line: Methodsfor the study of apoptosis in vitro. Dlm. Methods in Cell Biology. NewYork: Academic Press Inc. dalam Omar et al. 2010.. Penyaringan AntikanserEkstrak Etanol daripada Famili Piperaceae Terpilih dan Penentuannyamelalui Pewarnaan Tripan Biru. Sains Malaysiana
Middleton, E.J.R., Kandaswami, Chithan, Theoharides, Theoharis C. 2000. TheEffects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications forInflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacol Rev 52:673–751.Diakses melalui http://www.pharmrev.org pada tanggal 4 Desember 2009.
Missima, F. dan Sforcin, J.M. 2007. Green Brazilian Propolis Action OnMacrophages And Lymphoid Organs of Chronically Stressed Mice. OriginalArticle. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, in press.
Mor, G. dan Abraham ,V.M. 2008. The immunology of pregnancy. In: MooreMR, Lookwood RJ, editors. Creasy and Resnik’s Maternal Fetal Medicine.New York: Elsevier; 6: 88-90.
Moriyasu, J., Arai, S., Motoda, R., Kurimoto, M.. 1994. In Vitro Activation ofMouse Macrophage by Propolis Extract Powder. Biotherapy 8, 364–365.
Nugroho, Y.A. 2012. Efek Pemberian Kombinasi Buah Sirih (Piper betle L.)Fruit, Daun Miyana (Plectranthus scutellarioides (L.) R. BR.) Leaf, Madudan Kuning Telur Terhadap Peningkatan Aktivitas dan Kapasitas FagositosisSel Makrofag. Artikel. 22 (1).
Orsi, R.O., Funari, S.R.C., Soares, A.M.V.C., Calvi, S.A., Oliveira, S.L., Sforcin,J.M., Bankova, V., 2000. Immunomodulatory action of propolis onmacrophage activation. The Journal of Venomous Animals and Toxins 6,205–219.
Oteiza, Patricia, I., Erlejman, Alejandra G., Sandra, Verstraeten, V., Keen. CarlL., Fraga, Csar, G. 2006. Flavonoid-membran interactions: A protective roleof flavonoids at the membran surface?. Clinical & DevelopmentalImmunology, Volume 12, Issue 1 March 2005. Dalam Kusuma, DY. EfekPemberian Filtrat Daun Sambung Nyawa (Gynura Procumbens Lour.Merr.) Terhadap Aktifitas Sel Kupffer Pada Mencit Putih (Mus MusculusLinn.).
66
Palombo E.A . 2011. Traditional Medicinal Plant Extracts and Natural Productswith Activity against Oral Bacteria: Potential Application in the Preventionand Treatment of Oral Diseases. Hindawi Publishing Corporation,Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. Article ID680354, 15 pages.
Park, J.H., Lee, J.K., Kim, H.S., Chung, S.T., Eom, J.H., Kim, K.A., Chung, S.J.,Paik, S.Y., Oh, H.Y., 2004. Immunomodulatory effect of caffeic acidphenethyl ester in BALB/c mice. International Immunopharmacology 4,429–436.
Parmer, V.S., Jain, S.C., Bisht, K.S., Jain, R., Taneja, P., Jha, A., Tyagi, O.D.,Prasad, A.K., Wengel J., Olsen, E.S., Boll, P.M.. 1997. Phytochemistry ofThe Genus Piper, 46: 597-673.
Parolia, A, Thomas M.S, Kundabala, M., Mohan, M. 2010. Propolis and itspotential uses in oral health. Int. J. Med. and Medical Sci; 2(7): 210-215.
Pechorsky, A., Nitzan, Y., Lazarovitch, T. 2009. Identification of pathogenicbacteria in blood cultures: comparison between conventional and PCRmethods. J Microbiol Meth 78:325-330.
Pinca, S., Djati M.S., Rifa’I, M. 2013. Analisis Mobilisasi Sel T CD4+ dan CD8+
pada Timus Ayam Pedaging Pasca Infeksi Salmonella typhimurium danPemberian Simplisia Polyscias obtuse. Jurnal Biotropika Volume 1 No.1,Malang: Universitas Brawijaya.
Quattrochi, U. 2000. CRC World Dictionary of Plant Names: Common Names,Scientific Names, Eponyms, Synonyms, and Entimology. Francis.
Rabeta, M.S. dan Faraniza, N. 2013. Total phenolic content and ferric reducingantioxidant power of the leaves and fruits of Garcinia atrovirdis andCynometra cauliflora. International Food Research Journal 20(4): 1691-1696.
Ranjith, M.S. 2008. Enhanced Phagocytosis and Antibody Production byTinospora cordifolia – A new dimension in Immunomodulation. AfricanJournal of Biotechnology. 7 (2), 081-085
Robinovitch, M. 1995.Proffesional and non-Proffesional Phagocytes anIntroduction. Trends In Cell Biology. Vol: 5, 85-87.
Sadikin, M. 2002. Biokimia Enzim. Jakarta: Widya Medika.
67
Safitri, E. 2000. Studi Tentang Efek Imunostimulan Tilosin Terhadap PeningkatanRespon Kekebalan Nonspesifik. Skripsi. Jakarta: Fakultas FarmasiUniversitas Pancasila.
Sa-Nunes, A., Faccioli, L.H., Sforcin, J.M. 2003. Propolis: lymphocyteproliferation and IFN-_ production. Journal of Ethnopharmacology 87, 93–97
Sarisetyaningtyas, P.V., Hadinegoro, S.R., dan Munasir, Zakiudin. 2006.Randomized controlled trial of Phyllanthus niruri Linn extract. PaediatricaIndonesiana volume 46.
Sears, B. dan Saenz, R. 2011. Intisari Mikrobiologi dan Imunologi. Jakarta: EGC.
Setyowati, W.A.E., Ariani, S.R.D., Ashadi, Mulyani, B., Rahmawati, C.P. 2014.Skrining Fitokimia dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak MetanolKulit Durian (Durio zibethinus Murr.) Varietas Petruk. MakalahPendamping Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia VI 271-280.
Sforcin, J.M. 2007. Propolis and the immune system: a review. Journal ofEthnopharmacology. 113 (1): 1-14.
Sherwood, L. 2001. Fisiologi Manusia Dari Sel Ke Sistem (Human Physiology:From Cells To Systems) Edisi 2. Diterjemahkan oleh Brahm U. Pendit.Jakarta. Penerbit buku kedokteran EGC.
Siadi, K. 2012. Ekstrak Bungkil Buji Jarak Pagar (Jatropha curcas) SebagaiBiopestisida Yang Efektif Dengan Penambahan NaCl. Jurnal MIPA. 35(1).
Silva, C. A. da, Pinheiro, J.W., Fonseca, N.A.N., Cabrera, L., Novo, V.C.C.,Silva, M.A.A. da, Canteri, R.C., Hoshi, E. H., 2002. Sunflower meal as feedto swine during the growing and finishing phase: digestibility, performanceand carcass quality. Rev. Bras. Zootec., 31 (2) Suppl.: 982-990
Sirois, M. 2005. Laboratory Animal Medicine : Principles and Procedures.United States of America: Mosby, Inc. Dalam: Ragam Jenis EktoparasitPada Hewan Coba Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Galur Sprague Dawley.Bogor: Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Sjahrurachman, A., Sukmana, N., Setiati S., Munazir Z., Rubiana, H., Nelwan,Lesmana dan Dianiati. 2004. Pemberian Terapi Imunomodulator Herbal.Jurnal HTA Indonesia
68
Sriningsih dan Wibowo, A.E. 2006. Efek Pemberian Ekstrak Etanol HerbaMeniran (Phyllanthus niruri L.) Terhadap Aktivitas dan KapasitasFagositosis Makrofag Peritoneum Tikus. Artocarpus. Vol.6, No.2: 91-96.
Sriningsih dan Wibowo, A.E. 2009. Efek Imunostimulan Ekstrak Meniran(Phyllanthus niruri L.) Secara In Vivo Pada Tikus. Jurnal Bahan AlamIndonesia. ISSN 1412-2855 Vol.7, No.1: 15-18.
Sudarsono, 1996. Tumbuhan Obat (Hasil Peneltian, Sifat- Sifat dan Penggunaan).Yogyakarta: PPOT UGM.
Suhirman, S., dan Winarti, C. 2007. Prospek dan Fungsi Tanaman Obat SebagaiImunomodulator. Bogor: Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik.
Sukandar, D. dan E. R. Amelia. 2013. Karakterisasi Senyawa Aktif Antioksidandan Antibakteri dalam Ekstrak Etanol Buah Namnam (Cynometra caulifloraL.). Valensi. 3(1): 34-38.
Sumarlin, L., Suprayogi, A., Rahminiwati A., Tjachja A., dan Sukandar D.,Bioactivity of Methanol Extract of Namnam Leaves in Combination withTrigona Honey, J. Teknol. dan Industri Pangan. 26(2): 144-154.
Sunaryo, H., Chairul, Winaningrum. 2007. Uji Efek Imunomodulator EkstrakDaun, Kulit Batang, dan Buah Ki Pahit (Picrasma javanica Blume). Dalam:FAKTA (Jurnal Ilmiah Ilmu-Ilmu Eksakta) Vol.3 (3). Jakarta: FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Prof. Dr. Hamka. Hal121-126.
Svehla, G. 1990. Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semimikro.Edisi kelima. Penerjemah: Setiono, L. dan A.H. Pudjaatmaka. PT KalmanMedia Pusaka, Jakarta.
Talaro, Kathlee P. 2008. Foundation in Microbiology: basic principle. SixthEdition. New York. McGraw-Hill Company
Tatefuji,T., Izumi, N., Ohta,T., Arai, S., Ikeda, M.,Kurimoto, M. 1996. Isolationand identification of compounds from Brazilian propolis which enhancemacrophage spreading and mobility. Biological & Pharmaceutical Bulletin19, 966–970.
Thabrew, M.I., de Silva, K.T., Labadie, R.P., de Bie PULA, van den Berg, P.1991. Immunomodulatory activity of three Sri Lanka medicinal plants usedin hepatic disorder. J Ethnopharmacol. 74(9): 63-6.
Tizard, I. 1988. Pengantar Imunologi Veteriner. Edisi Ke 2. Terjemahan MasdukiPartodirejo. Airlangga University Press, Surabaya.
69
Tringali, C. 2001. Bioactive Compound from Natural Sources. London: Taylorann Francis Inc. 164-165.
Ulya, A.N., 2012, Efek Peningkatan Aktivitas Fagositosis Makrofag FraksiKloroformEkstrak Etanol Kelopak Rosella (Hibiscus ssabdarifa L) secara invitro. Skripsi. Fakultas Farmasi. UAD, Yogyakarta. Dalam Akrom danFatimah. Ekstrak Heksan Biji Jintan Hitam (Nigella Sativa L) MeningkatkanAktivitas Fagositosis Makrofag Tikus Betina Galur Sd (Sprague Dawley)Yang Diinduksi Dmba (7,12dimetilbenz(Α)Antrasen) Secara In Vitro.Pharmaciana, Vol. 5, No. 1: 69-76
Utami, R. 2009. Uji Efek Imunomodulator Kapur Sirih (CaCO3) TerhadapAktivitas Dan Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag Peritoneum MencitSecara in vivo . Skripsi. Program Sarjana Farmasi UIN Syarif HidayatullahJakarta:44.
Wade, C. 2005. Can Bee Propolis Rejuvenate The Immune System?www.thenaturalshopper.com/buybee- supplements/article.htm. Dalam:Pengaruh Pemberian Ekstrak Propolis Terhadap Sistem Kekebalan SelulerPada Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Strain Wistar. Malang: UniversitasBrawijaya.
Wagner, H., 1985. Immunostimulants from medicinal plants. In Advances inChinese medicinal materials research (Eds.) H.M. Chang; H.W. Yeung;W.W. Tso and A. Koo. World Scientific Publ. Co. Singapura : 159-170.
Wagner, H. 1999. Immunomodulatory Agents From Plants: Search for PotentImmunostimulant Agents from Plants and Other Natural Sources. In: Bohlin,L. dan J.G. Bruhn (eds.) Bioassay Methods in Natural Product Research andDrug. Basel: Kluwer Academic Publisher.
Wagner H dan Jurcic K. 1991. Assays for immunomodulation and effects onmediators of inflammation. Dalam: Dey PM, Harbone JB, editor. Methods inplants biochemistry:assays for bioactivity. Volume ke-6. Academic Pr.
Winarno, F.G. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Bogor (ID): M-Brio Press.
You, K.M., Son, K.H., Chang, H.W., Kang, S.S., Kim, H.P., 1998. Vitexicarpin, aflavonoid from the fruits of Vitex rotundifolia, inhibits mouse lymphocyteproliferation and growth of cell lines in vitro. Planta Medica 64, 546–550.
70
Yu, L., Yueh-Hsiung, K., Yun-Lian, L. Wenchang, C. 2009. Antioxidative Effectand Active Component from Leaves of Lotus (Nelumbo nucifera). J. Agric.Food Chem 57 (15): 6623-6629. DOI: 10.1021/jf900950z.
Yulinery T., Nurhidayat, N. 2012. Penggunaan Ekstrak Fermentasi Beras Daribeberapa Jenis Monascus Purpureus Untuk Aktivitas In Vitro FagositosisSel Makrofag dan Polimorfonuklear Peritoneum Mencit SebagaiImmunomodulator. Berita Biologi 11(2). Bidang Mikrobiologi, PusatPenelitian Biologi-LIPI.
Zalikoff, J.T., Enane, A.E., Bowser, D., Squibb, K.S., Frenkel, K. 1991.Development of Fish Peritoneal Macrophages as a Model for HigherVertebrates in Immunotoxicological Studies I. Characterization of TroutMacrophage Morphological, Functional, and Biochemical Properties.Toxycological Science. Oxford Journal.Volume 16, Issue 3. Pp. 576-589.
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
91
Lampiran 13. Bahan Utama Penelitian
a. Ekstrak Metanol DaunNamnam
b. Propolis c. ST®
d. Bakteri Staphylococcusepidermidis
e. Rattusgovernicus
92
Lampiran 14. Proses dalam Penelitian
a. Preparasi sampel ujib. Preparasi suspensi bakteri
c. Persiapan pengambilan cairan peritoneum c. Uji viabilitas
d. Pengamatan aktivitas dan kapasitasfagositosis
PERNYATAAN
DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH
HASIL KARYA SAYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN
SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI
ATAU LEMBAGA MANAPUN.
Jakarta, Juli 2016
Zaitun Awaliah
1110096000058
ABSTRAK
ZAITUN AWALIAH. Efek Imunomodulator Ekstrak Metanol Daun Namnam(C. Cauliflora L.) Dan Propolis Terhadap Kemampuan Fagositosis MakrofagPeritoneum Tikus Secara In Vitro.Di bawah bimbingan LA ODE SUMARLIN dan ANNA MUAWANAH
Telah dilakukan penelitian mengenai salah satu bahan alam di Indonesia yaituekstrak metanol daun namnam dan propolis sebagai imunomodulator secara invitro berdasarkan peningkatan nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofagperitoneum tikus. Antigen yang digunakan adalah bakteri Staphylococcusepidermidis. Stimuno digunakan sebagai kontrol positif. Perlakuan konsentrasimasing-masing sampel uji adalah 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm, dan 10000ppm. Hasil analisis statistik (α= 5%) menunjukkan adanya perbedaan yangsignifikan antara nilai aktivitas fagositosis kedua sampel uji dibandingkan dengankontrol negatif (aquades). Sedangkan dalam penetapan nilai kapasitas fagositosisperbedaan yang signifikan dibanding kontrol negatif hanya terjadi pada sampelpropolis konsentrasi 1000 ppm. Sampel ekstrak daun namnam memilikikemampuan imunomodulaor optimal pada konsentrasi 1000 ppm (86% dan 689)dengan peningkatan nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis (30% dan 202).Kemampuan imunomodulaor optimal sampel propolis pada konsentrasi 1000 ppm(93% dan 1621) dengan peningkatan nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis (37%dan 1134). Berdasarkan hasil pengujian masing-masing sampel disimpulkanbahwa ekstrak daun namnam dan propolis memiliki kemampuan sebagaiimunomodulator.
Kata kunci: daun namnam, propolis, imunomodulator, fagositosis
ABSTRACT
ZAITUN AWALIAH. The Immunomodulatory Effect of Namnam LeafMethanol Extract (C.Cauliflora L.) and Propolis Against of Phagocytosis onMacrophage of Rat Peritoneum In Vitro.Under the guidance of LA ODE SUMARLIN dan ANNA MUAWANAH
Immunomodulatory assay of Indonesian product resources were explored isnamnam methanol extract and propolis in vitro based on increased value ofmacrophages phagocytic activity and capacity in rat peritoneum. Staphylococcusepidermidis was used as antigen. The treatment concentrations was used in 1 ppm,10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm, and 10000 ppm. Statistic analytical (α= 5%) showedthere are significant differences between the value phagocytic activity of the testsample as compared to negative controls. Meanwhile in determining valuephagocytic capacity, a difference compares to negative control only was showedon propolis sampel concentration is 1000 ppm. Namnam leaf extract samples haveimmunomodulatory capabilities optimally at a concentration of 1000 ppm (86%and 689) with an increase in value of the activity and phagocytic capacity (30%and 202). Propolis samples immunomodulatory capabilities optimally at aconcentration of 1000 ppm (93% and in 1621) with an increase in value of theactivity and phagocytic capacity (37% and 1134). Based on these results indicatedthat namnam leaf extracts and propolis have the ability as an immunomodulator.
4.1 Ekstraksi Daun Namnam….………………………………………………... 35
4.2 Hasil Uji Fitokimia.………………………………………………................ 36
4.3 Hasil Uji Viabilitas Makrofag………………………………………………. 45
4.4 Hasil Uji Fagositosis………………………………………………………... 47
BAB V SIMPULAN DAN SARAN…………………………………………… 58
5.1 Simpulan……………………………………………………………………. 58
5.2 Saran………………………………………………………………………... 58
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………….. 60
LAMPIRAN…………………………………..……………………………….. 71
xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Daun Namnam dan Buah Namnam ..………………………….. 7
Gambar 2. Struktur Senyawa (a) Flavonoid, (b) Isorhamnetin, (c)Rhamnazin, (d) Flavon, dan (e) Flavonol………………………. 9
Gambar 3. Komponen Utama Ekstrak Etanol Buah Namnam (5-hidroksimetilfurfural)
10
Gambar 4. Struktur Kimia Cafeic Acid Phenethyl Esther (CAPE) ………... 12
Gambar 5. Struktur Kimia adalah baccharis oxide ((3S)-2,3-epoxy-2,3dihydrosqualene) ..………………………….....……………….. 12
Gambar 6. Struktur Kimia Friedelanol…………………………………....... 13
Gambar 7. Staphylococcus epidermidis di Bawah Pengamatan MikroskopPerbesaran 400x..………………………….. ..………………… 15
Gambar 8. Daun Meniran..………………………….. ..………………….... 17
Gambar 9. Produk Komersil Mengandung Ekstrak Meniran..……………... 17
Gambar 10. Mekanisme Fagositosis.…………………………...…………… 22
Gambar 11. Reaksi Uji Alkaloid Pereaksi Dragendorff.….............................. 37
Gambar 12. Reaksi Uji Alkaloid Pereaksi Mayer ……................................... 37
Gambar 13. Reaksi Pengujian Fitokimia Flavonoid……................................ 38
Gambar 14. Reaksi Pengujian Fitokimia Terpenoid.……............................... 39
Gambar 15. Reaksi Pengujian Fitokimia Kuinon…….................................... 40
Gambar 16. Reaksi Pengujian Fitokimia Tanin……………………………... 40
Gambar 17. Reaksi Hidrolisis Saponin dalam Air…………………………... 41
Gambar 18. Uji Viabilitas Makrofag Tikus (Rattus novergicus)……………..... 46
xii
Gambar 19. Makrofag (1) Aktif Sedang Memfagosit Bakteri, (2) TidakAktif Memfagosit, (3) Bakteri yang Sedang Difagosit olehMakrofag……………………………………………………… 47
Gambar 20. Fagositosis Mikroba di Dalam Sel……………………………. 48
Gambar 21. Diagram % Aktivitas Fagositosis Ekstrak Metanol Daun
Namnam dan Propolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol
Tabel 2. Komposisi Kimia Propolis Sebagai Imunomodulator…................. 13
Tabel 3. Hasil Uji Fitokimia Propolis dan Ekstrak Metanol DaunNamnam……….……………..…………………………………… 36
Tabel 4. Hasil Uji Viabilitas Makrofag………….………………………… 46
Tabel 5. Nilai Aktivitas Fagositosis Ekstrak Metanol Daun Namnam (C.Cauliflora L.) dan Propolis dengan Kontrol Negatif dan KontrolPositif……………………………………………………………… 51
Tabel 6. Nilai Kapasitas Fagositosis Ekstrak Metanol Daun Namnam (C.Cauliflora L.) dan Propolis dengan Kontrol Negatif dan KontrolPositif……………………………………………………………… 52
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian………………………………………... 71
Lampiran 2. Bagan Ekstraksi Daun Namnam……………………………. 72
Lampiran 7. Hasil Pengamatan Uji Aktivitas Fagositosis………………… 77
Lampiran 8. Hasil Pengamatan Uji Kapasitas Fagositosis………………... 78
Lampiran 9. Hasil Analisis Data (Uji Statistik) Aktivitas FagositosisEkstrak Daun Namnam dengan Kontrol Negatif dan KontrolPositif …….…………………………………………………. 79
Lampiran 10. Hasil Analisis Data (Uji Statistik) Aktivitas FagositosisPropolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif ……… 82
Lampiran 11. Hasil Analisis Data (Uji Statistik) Kapasitas FagositosisEkstrak Daun Namnam dengan Kontrol Negatif dan KontrolPositif ……………………………………………………….. 85
Lampiran 12. Hasil Analisis Data (Uji Statistik) Kapasitas FagositosisPropolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif ……… 88
Lampiran 13. Bahan Utama Penelitian…………………………...………. 91
Lampiran 14. Proses Dalam Penelitian…………………….....………....... 92
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Di Indonesia penggunaan obat-obatan tradisional sudah dikenal sejak
ratusan tahun yang lalu dan makin populer dengan makin berkembangnya industri
obat tradisional. Meskipun masyarakat sebagai konsumen mengakui adanya
dampak positif dari konsumsi obat-obatan tersebut, namun bukti ilmiah dari
manfaatnya tetap diperlukan dan tidak dapat dilupakan kemungkinan adanya efek
samping dan efek samping penggunaan obat-obatan tersebut (Sjahrurachman et
al., 2004).
Berbagai macam penyakit dapat masuk ke dalam tubuh tergantung pada
sistem kekebalan tubuh. Ketika sistem imun tidak bekerja optimal, tubuh akan
rentan terhadap penyakit. Beberapa hal dapat mempengaruhi daya tahan tubuh,
misalnya saja karena faktor lingkungan, makanan, gaya hidup sehari-hari, stres,
umur dan hormon (Suhirman dan Winarti, 2007).
Adanya senyawa-senyawa kimia yang dapat meningkatkan efektivitas
sistem imun sangat membantu untuk mengatasi penurunan sistem imun. Industri
kesehatan biasanya menggunakan produk alami sebagai alternatif untuk formulasi
terapi medis konvensional (allopathic) dalam rangka pengobatan berbagai
penyakit (Margaretha, 2012). Dengan demikian, upaya telah dilakukan untuk
meningkatkan kekebalan tubuh oleh agen imunomodulator/imunostimulan yang
2
bekerja sebagai adjuvant untuk pengobatan konvensional (Sarisetyaningtyas et al.,
2006).
Bahan-bahan yang dapat memodulasi sistim imun tubuh dikenal sebagai
imunomodulator. Imunomodulator adalah bahan yang dapat mengembalikan dan
memperbaiki sistem imun yang fungsinya terganggu atau untuk menekan yang
fungsinya berlebihan (Baratawidjaja, 2002). Usaha pencarian tanaman yang
berkhasiat sebagai imunomodulator dapat diawali dari penggunaannya secara
empiris. Beberapa pendekatan dilakukan dari berbagai aspek seperti etnobotani,
etnofarmasi, etnofarmakologi dan etnomedis dilanjutkan dengan test secara in
vitro (Suhirman dan Winarti, 2007).
Menurut Parmer et al. (1997) dan Grotewold (2006), golongan senyawa
alkaloid, senyawa fenolat, flavonoid, isoflavonoid, dan triterpen diketahui
bermanfaat sebagai antikanker dan imunomodulator. Penelitian lain telah
dilakukan oleh Kustiawan (2012) mengenai imunomodulator dari ekstrak etanol
daun sirih merah yang mengandung senyawa golongan neolignan dapat
meningkatkan indeks fagositosis makrofag, diketahui sebagai imunostimulan.
Isolasi dilakukan dan didapat dua isolat yaitu 2-allyl-4-(1’-hydroxy-1’-(3”,4”,5”-
trimethoxyphenyl)propoan- 2’-yl)-3,5-dimethoxycyclohexa-3,5-dienone dan isolat
2 yakni 2-allyl-4-(1’-acetyl-1’-(3”,4”,5”-trimethoxyphenyl) propan-2’-yl)-3,5-
dimethoxycyclohexa-3,5-dienone. Selain itu, salah satu bahan obat tradisional
yakni tempuyung mengandung senyawa flavonoid (luteolin-7-O-glikosida,
apigenin-7-O-glikosida dan kaempferol) yang diduga dapat digunakan sebagai
imunomodulator (Nugroho, 2012). Penggunaan suatu imunomodulator dianggap
3
penting terutama jenis imunomodulator yang memberikan efek pada sistem
kekebalan tubuh dan dapat membantu meringankan kelainan klinis yang dapat
ditimbulkan oleh suatu penyakit (Abraham et al., 2008; Cuningham et al., 2014).
Salah satu bahan alam Indonesia yang diduga mempunyai potensi sebagai
imunomodulator adalah tanaman namnam (Cynometra cauliflora L.), merupakan
keluarga fabaceae atau leguminosae, Sebagian besar tanaman golongan tersebut
adalah sumber senyawa flavonoid baik dalam bentuk flavonoid, isoflavonoid,
efektif menghambat peroksidasi asam linoleat dan mencegah pembentukan anion
superoksida misalnya senyawa isorhamnetin dan rhamnazin (Tringali, 2001).
Aziz dan Iqbal (2013) menyebutkan bahwa total fenolik dan flavonoid
tanaman namnam pada bagian daun merupakan bagian yang terbaik sebagai
sumber antioksidan, yaitu kadar total fenolik sebesar 1180,47 – 1831,47 mg
GAE/g dan kadar total flavonoid sebesar 21,96 – 33,63 mg GAE/g. Penelitian lain
juga menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun namnam (Cynometra cauliflora)
memiliki kandungan total fenolik, flavonoid, vitamin C dan β-karoten yang tinggi
(Sumarlin et al, 2015). Sifat antioksidan dan beberapa senyawa yang
dikandungnya inilah yang memungkinkan adanya potensi sebagai
imunomodulator (Kurniasih et al., 2015).
Selain tanaman namnam, salah satu bahan alam lain yang diyakini secara
empiris mempunyai banyak khasiat dan relatif aman adalah propolis. Propolis
adalah bahan alami tidak beracun dikumpulkan oleh lebah dari berbagai sumber
tanaman, telah digunakan sejak dahulu kala diantaranya sebagai obat tradisional,
biokosmetik, dan makanan kesehatan (Bankova, 2000; Palombo, 2011; Parolia et
4
al., 2010). Propolis merupakan antibiotik karena mempunyai kandungan
flavonoid, yaitu bahan aktif yang berfungsi sebagai antiperadangan dan antivirus.
Propolis juga dapat berperan sebagai antitumor, dapat merangsang sistem
kekebalan secara langsung dan melepaskan unsur yang merespon imunitas seluler
melalui mekanisme fagositosis (Wade, 2005).
Secara kimia, propolis mengandung bahan kimia kompleks yang sangat
kaya berbagai imunomodulator yang potensial berupa asam fenolat dan flavonoid
yang memiliki banyak manfaat untuk meningkatkan aktivasi makrofag. Cafeic
Acid Phenethyl Esther (CAPE) yang memiliki aktivitas sebagai imunomodulator
juga terkandung didalamnya (Challem, 2004). Missima et al. (2007) menyebutkan
senyawa dalam tanaman yang dihinggapi lebah juga menentukan senyawa di
dalam propolis. Salah satu yang berhasil diisolasi adalah senyawa baccharis oxide
((3S)-2,3-epoxy-2,3-dihydrosqualene) dan friedelanol yang dapat meningkatkan
produksi H2O2. Berasal dari tanaman Baccharis dracunculifolia DC sebagai
sumber utama propolis asal Brazil. Hasil menunjukkan efek stimulasi pada
makrofag. Namun penyelidikan lebih lanjut diharapkan memberikan kotribusi
pemahaman yang lebih baik mengenai aksi imunomodulator dari senyawa
metabolit sekunder ini.
Dengan demikian, diduga bahwa ekstrak metanol daun namnam dan
propolis berkhasiat sebagai imunomodulator. Hal inilah yang mendasari perlunya
dilakukan penelitian terhadap kemampuan ekstrak metanol daun namnam dan
propolis sebagai imunomodulator yang dilakukan pengujian secara terpisah.
5
Informasi mengenai sifat imunomodulator dalam penelitian ini akan
diukur berdasarkan pengukuran nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag
secara in vitro. Nilai aktivitas fagositosis ditetapkan dengan menghitung makrofag
aktif sedang memfagosit bakteri. Makrofag yang dipakai berasal dari cairan
peritoneum tikus galur Spreague Dawley dengan bakteri Staphylococcus
epidermidis sebagai antigen. Sementara itu, penetapan nilai kapasitas fagositosis
dilakukan dengan menghitung jumlah bakteri yang difagosit oleh makrofag aktif
dalam proses fagositosis tersebut.
1.2 Rumusan Masalah
Apakah ekstrak metanol daun namnam dan propolis memiliki efek
imunomodulator terhadap kemampuan aktivitas dan kapasitas fagositosis
makrofag peritoneum tikus?
1.3 Hipotesis
Ekstrak metanol daun namnam dan propolis memiliki kemampuan sebagai
imunomodulator dilihat dari peningkatan aktivitas dan kapasitas fagositosis sel
makrofag peritoneum tikus.
1.4 Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kemampuan
imunomodulator ekstrak metanol daun namnam dan propolis dengan
meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag peritoneum tikus.
6
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini yaitu memberikan data mengenai hasil identifikasi
kemampuan ekstrak metanol daun namnam dan propolis sebagai imunomodulator
untuk meningkatkan sistem kekebalan tubuh.
7
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tanaman Namnam (C. cauliflora L.)
Cynometra cauliflora dikenal dengan nama lokal yaitu namnam. Berasal
dari bahasa Yunani kynos, kyon yang berarti anjing, dan metra yang berarti rahim.
Mengacu pada bentuk polong-polongan dan namnam termasuk ke dalam keluarga
leguminose (Quattrochi, 2000). Pohon namnam mempunyai tinggi antara 3-10
meter. Batangnya tegak, bulat, berwarna abu-abu kecoklatan, dan berbonggol-
bonggol. Daun namnam majemuk dengan sepasang anak daun berbentuk lonjong
dengan panjang antara 5 sampai 15 cm, berwarna putih atau merah jambu terang
ketika masih muda, dan berubah menjadi hijau tua mengkilat ketika tua. Bunga
namnam majemuk terdiri dari 4-5 tandan yang tumbuh di batang dan cabang,
bunga namnam berukuran kecil berwarna merah muda atau putih dengan mahkota
berbentuk lanset berwarna putih. Buah namnam berbentuk ginjal keriput yang
ujungnya meruncing dan daging buah yang tebal, tumbuh di batang hingga dekat
ke tanah, berwarna coklat atau kekuningan dengan permukaan yang kasar (Heyne,
1987).
Gambar 1. Daun Namnam (Dokumentasi Pribadi)
8
Biasanya tanaman ini tumbuh di dataran rendah tropis yang lembab,
namun juga dapat tumbuh dengan baik di iklim dengan musim kemarau yang
berbeda dan tahan terhadap angin (Rabeta dan Faraniza, 2013). Menurut orang
terdahulu tanaman ini memiliki banyak sifat gizi dan obat dan dianggap sebagai
buah yang kurang dimanfaatkan (Ikram et al., 2009).
Sebagian besar tanaman golongan fabaceae atau leguminosae merupakan
sumber senyawa flavonoid baik dalam bentuk flavonoid, isoflavonoid, maupun
neoflavonoid yang dilaporkan efektif menghambat peroksidasi asam linoleat dan
mencegah pembentukan anion superoksida misalnya senyawa isorhamnetin dan
rhamnazin (Tringali, 2001). Hasil test secara in vitro dari favonoid golongan
flavones dan flavonols telah menunjukkan adanya respon imun (Hollman et al.,
1996). Golongan senyawa polisakarida, terpenoids, alkaloid dan polifenol
mempunyai bioaktifitas sebagai imunostimulant agent (Wagner, 1985).
(1) (2)
(3) (4)
9
(5)
Gambar 2. Struktur senyawa (1) flavonoid, (2) isorhamnetin, (3) rhamnazin, (4)flavon, dan (5) flavonol (Tringali, 2001)
Tanaman famili fabaceae atau leguminosae juga dilaporkan sebagai
penghasil senyawa fenolik yang tersubstitusi gugus hidroksil khususnya golongan
oligostilbenoid (memiliki struktur yang terdiri dari rantai C6-C2-C6). Senyawa
golongan oligostilbenoid tersebut telah dilaporkan mempunyai beberapa keaktifan
biologis yang sangat menarik, seperti antioksidan, anti-HIV, antibakteri,
antifungal, dan antihepatotoksik sitotoksik, inhibitor enzim 5α-reduktase, dan
enzim asetilkolinesterase. (Kristanti et al., 2006).
Komponen bioaktif yang terdapat pada bagian-bagian tanaman namnam
berbeda-beda (Aziz dan Iqbal, 2013). Hal ini dapat dilihat dalam (tabel 1) analisis
kualitatif fitokimia Cynometra cauliflora L.
Tabel 1. Analisis Kualitatif Fitokimia Cynometra cauliflora L. (Aziz dan Iqbal, 2013)Batang Daun tua Kulit Pohon Daun muda
Keterangan: *) Memberikan perbedaan yang bermakna (signifikan) dibandingkan kontrol negatif; KN = Kontrol Negatif;KP = Kontrol Positif; EDN = Ekstrak metanol daun namnam; (-) = tidak terdeteksi
Sementara itu, nilai aktivitas fagositosis sampel propolis juga
menunjukkan hasil berbeda bermakna dengan kontrol negatif, ditunjukkan
berdasarkan hasil analisis statistik uji LSD (Lampiran 10). Hasil menunjukkan
nilai aktivitas fagositosis tertinggi sampel propolis yaitu pada konsentrasi 10000
ppm dengan nilai kenaikan presentase aktivitas fagositosis sebesar 40%.
Meskipun demikian, tetapi terjadi penurunan pada nilai kapasitasnya dibanding
kontrol negatif. Hasil analisis statistik uji LSD menunjukkan dalam pengamatan
nilai kapasitas fagositos hanya sampel propolis perlakuan konsentrasi 1000 ppm
yang berbeda secara signifikan dibanding dengan kontrol negatif (Lampiran 12).
Oleh karena itu, hasil optimal efek imunomodulator sampel propolis ditetapkan
pada konsentrasi 1000 ppm dengan nilai aktivitas sebesar 93% (Tabel 5) dan nilai
kapasitas 1621 (Tabel 6).
52
Tabel 6. Nilai Kapasitas Fagositosis Ekstrak Metanol Daun Namnam (C. Cauliflora L.)dan Propolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif
Konsentrasi(ppm)
Nilai Kapasitas FagositosisKN KP EDN P Kenaikan Nilai
KP = Kontrol Positif; EDN = Ekstrak metanol daun namnam; (-) = tidak terdeteksi
Perbedaan yang signifikan tidak terlihat pada penetapan nilai kapasitas
fagositosis antara seluruh perlakunan konsentrasi sampel uji ekstrak metanol daun
namnam jika dibandingkan dengan kontrol negatif. Hasil juga menunjukkan
semakin tinggi konsentrasi larutan uji ekstrak metanol daun namnam terjadi
penurunan nilai kapasitas fagositosis. Sementara pada sampel uji propolis hanya
perlakuan konsentrasi 1000 ppm yang menunjukkan perbedaan secara signifikan
dengan kontrol negatif. Hal tersebut dapat terjadi disebabkan data tidak
terdistribusi homogen. Sebab lain adalah kendala teknis dalam penghitungan
bakteri secara manual menggunakan mikroskop. Makrofag yang padat terisi
bakteri seringkali dijumpai saat pengamatan sehingga sulit menghitung jumlahnya
secara tepat dalam medan pandang mikroskop (Gambar 19). Kondisi ini dapat
teratasi jika menggunakan alat khusus yang dapat menghitung jumlah bakteri
secara otomatis menggunakan instrumen fluorosence microplate reader (Wagner
dan Jurcic, 1991).
Perbandingan antara sampel ekstrak metanol daun namnam dengan
propolis yaitu nilai presentase aktivitas fagositosis propolis lebih tinggi daripada
sampel ekstrak metanol daun namnam pada setiap konsentrasi. Begitu juga
53
dengan nilai kapasitas fagositosis sampel propolis lebih tinggi dibanding sampel
ekstrak metanol daun namnam. Diagram perbandingan keduanya dapat dilihat
dalam (Gambar 21) (Gambar 22).
Gambar 21. Diagram % Aktivitas Fagositosis Ekstrak metanol daun namnam danPropolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif
Gambar 22. Diagram Nilai Kapasitas Fagositosis Ekstrak metanol daun namnamdan Propolis dengan Kontrol Negatif dan Kontrol Positif
54
Ada beberapa mekanisme yang dimungkinkan menyebabkan terjadinya
peningkatan aktivitas fagositosis. Kemungkinan pertama adalah faktor opsonin.
Pada saat opsonin membungkus partikel asing tersebut akan terjadi pengikatan
dengan permukaan fagosit. Kemungkinan kedua adanya reseptor pola pengenalan
(pattern recognition receptors/PRR) (Handajani, 2013). Kemungkinan yang
ketiga adalah dari kandungan yang terdapat dalam sampel uji ekstrak metanol
daun namnam dan propolis.
Aktivitas dan kapasitas fagositosis pada bahan uji berkaitan dengan
kandungan kimia yang terdapat dalam bahan uji tersebut (Chairul, 2009). Menurut
Inalci et al. (2005), beberapa komponen bioaktif yang berasal dari alam
mempunyai efek pleitropik (mempunyai beragam efek fisiologis) dan kombinasi
berbagai komponen bioaktif pada satu simplisia atau ekstrak akan memberikan
efek sinergis. Salah satu senyawa yang terdapat dalam ekstrak metanol daun
namnam dan propolis ialah flavonoid, senyawa tersebut akan berinteraksi dengan
dengan membran sel yang dapat mencegah masuknya molekul asing dan
melindungi fungsi struktur membran sel (Oteiza et al., 2006).
Flavonoid berpotensi bekerja terhadap limfokin yang dihasilkan oleh sel T
sehingga akan merangsang sel-sel fagosit untuk melakukan respon fagositosis
(Kusmardi et al., 2007). Flavonoid juga dapat berinteraksi dengan semua
membran sel (termasuk sel imun) melalui ikatan hidrogen yang berguna
mengurangi atau menekan masuknya molekul pengganggu dan melindungi stuktur
dan fungsi membran sel (Oteiza et al., 2006). Flavonoid membantu aktivitas dari
reseptor untuk mengikat partikel asing. Terdapat beberapa pengaruh flavonoid
55
(imunomodulator) dalam mempengaruhi reseptor. Pertama, flavonoid dapat
mempengaruhi sel B dengan cara mengaktifkan sel T untuk menginduksi sekresi
antibodi, antibodi yang dikeluarkan dapat membantu Fc receptors dalam reaksi
opsonisasi, yaitu reaksi untuk mempermudah fagositosis karena antigen diselimuti
oleh antibodi, terutama antibodi IgG. Bagian ekor antibodi IgG yang berikatan
dengan antigen mampu mengikat reseptor di permukaan (makrofag) (Bellanti,
1993 dan Sherwood, 2001). Kedua, interaksi senyawa tersebut dengan membran
sel diduga dapat mempertajam reseptor pada Sel Kupffer (makrofag), khususnya
pada scavenger receptors yang berfungsi sebagai mediator fagositosis (Gao et al.,
2008 dan Oteiza et al., 2006).
Penelitian sebelumnya telah banyak dilakukan mengenai mekanisme kerja
propolis sebagai imunomodulator, meskipun hasilnya masih belum jelas (Cuesta
et al., 2005). Salah satu senyawa di dalamnya yaitu CAPE (Cafeic Acid Phenethyl
Esther), beberapa menjelaskan evaluasi secara in vitro efek propolis dalam
mengaktivasi makrofag menunjukkan propolis meningkatkan pembentukan H2O2
di dalam sel ini (Orsi et al., 2000). Ivanovska et al. (1993) meneliti efek kompleks
caffeic acid dan simanat dengan lisin, menunjukkan asam sinamat menghambat
pembentukan H2O2 oleh peritoneum makrofag, ketika caffeic acid diinduksi
dalam produksi itu. Krol et al. (1995) melaporkan bahwa flavon menghambat
secara langsung luminol-chemoluminescence murin makrofag oleh mekanisme
involusi posforilasi protein kinase C. Indikasi lainnya dari aktivasi makrofag
adalah pembentukan nitrat oksida (NO), dari L-arginin oleh sintesis nitrat oksida
(NOS) (Macfarlaane et al., 1999; Novelli, 2005). NO penting dalam mekanisme
56
mikrobisida dari makrofag untuk menghambat sintesis DNA, respirasi
mitokondria dan transport aktif dalam membran fungi dan bakteri (Chan et al.,
1992; Macmicking et al., 1997). Di samping itu, NO juga merupakan
neutransmissor vasodilator penting dan mediator seluler dari perbaikan jaringan
(Chakraborty et al., 2006).
Menurut Sforcin (2007) menerangkan dalam penelitiannya bahwa aksi
propolis sebagai imunomodulator disebabkan dari produk turunan tanaman dan
isolat ekstrak dari sumber tanamannya tidak memiliki efek yang sama dalam
pengujian tersebut. Mungkin ada efek sinergis, hal ini yang menyebabkan setiap
propolis memiliki aktivitas farmakologi yang berbeda.
Menurut Sriningsih dan Wibowo pada penelitiannya tahun 2006, beberapa
penelitian efek imunitas dari ekstrak atau isolat tanaman menunjukkan bahwa efek
yang muncul sangat tergantung dari dosis uji, dimana efek
imunosupresi/sitotoksik akan muncul manakala dilakukan pada dosis besar.
Sementara efek imunostimulan akan terlihat pada dosis rendah (Wagner, 1999).
Imunosupresi merupakan suatu tindakan untuk menekan respons imun, sedangkan
imunostimulan bekerja dengan cara memperbaiki fungsi sistem imun
menggunakan bahan yang merangsang sistem imun (Baratawidjaja, 2006). Hal
serupa diperkuat oleh (Pinca et al., 2013) dalam penelitiannya yaitu sifat
flavonoid sebagai imunomodulator dapat berubah menjadi imunosupresan
terhadap rerata indeks daya fagosit makrofag, ketika diberikan dalam dosis yang
besar dan dalam jangka waktu yang lama.
57
Dari hasil tersebut ekstrak metanol daun namnam dan propolis dapat
meningkatkan aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag, maka keduanya
memiliki kemampuan sebagai imunomodulator. Namun demikian, perlu adanya
penelitian lebih lanjut mengenai efektivitas imunomodulator ekstrak metanol daun
namnam dan propolis. Berhubung efek imunomodulator disebabkan oleh
mekanisme sistem tubuh yang kompleks, maka perlu menggunakan metode uji
yang lebih komprehensif (Sriningsih, 2006).
58
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
1. Ekstrak daun namnam dan propolis memiliki kemampuan
imunomodulator berdasarkan peningkatan aktivitas dan kapasitas
fagositosis makrofag dibandingkan dengan kontrol negatif.
2. Sampel ekstrak daun namnam memiliki kemampuan imunomodulaor
optimal pada konsentrasi 1000 ppm (86% dan 689) dengan peningkatan
nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis (30% dan 202).
3. Sampel propolis kemampuan imunomodulaor optimal pada konsentrasi
1000 ppm (93% dan 1621) dengan peningkatan nilai aktivitas dan
kapasitas fagositosis (37% dan 1134).
4. Nilai aktivitas dan kapasitas fagositosis kedua sampel ekstrak metanol
daun namnam masih dibawah kontrol pembanding yang merupakan
produk imunomodulator komersil (stimuno) (93% dan 1106), sedangkan
hasil penetapan pada sampel propolis menunjukkan hasil lebih tinggi
daripada produk komersil tersebut.
5.2 Saran
1. Perlu dilakukan uji toksisitas ekstrak daun namnam dan propolis untuk
mengetahui apakah sampel bersifat toksik atau tidak terhadap makrofag.
59
2. Perlu dilakukan serangkaian pengujian secara in vivo lebih lanjut untuk
mengetahui jenis cara kerja imunomodulator ekstrak daun namnam dan
propolis.
60
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A.K. dan Lichtman, A.H. 2005. Cellular and Molecular Immunology Edisi4, 5. Elsevier Saunders. Philadelphia.
Achmad, S.A. 1986. Kimia Organik Bahan Alam. Jakarta (ID): Karnunika.
Adiyati, P.N. 2011. Ragam Jenis Ektoparasit Pada Hewan Coba Tikus Putih(Rattus Norvegicus) Galur Sprague Dawley. Bogor: Fakultas KedokteranHewan Institut Pertanian Bogor.
Aziz, A.F.A. dan Iqbal, M. 2013. Antioxidant Activity and PhytochemicalComposition of Cynometra cauliflora. Journal of Experimental andIntegrative Medicine. 3(4):337-341.
Bankova, V.S., De Castro SL, Marcucci, M.C. 2000. Propolis: recent advances inchemistry and plant origin. Apidologie. 31: 3-15.
Baratawidjaja, K.G. 1988. Imunologi Dasar. Balai Penerbit Fakultas KedokteranUniversitas Indonesia
Baratawidjaja, K.G. 2002. Imunomodulasi. Dalam: Imunologi dasar. Edisi 5.Jakarta: Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
Baratawidjaja, K.G. dan Rengganis, I. 2010. Imunologi Dasar. Jakarta: BalaiPenerbit Fakultas Kedokteran Indonesia.
Barbuto, J.A.M., Hers, E.M., Salmon, S.E. 2003. Imunofarmakologi dalamfarmakologi dasar dan klinik. Katzung BG. 6: 904-6.
Beekeeping dan Crane, E. 1988. Science, Practice and World Resourses.Heinemann London.
Bellanti, J.A..1993. Imunologi III. Diterjemahkan oleh Wahab AS, Soeripto N.Yogyakarta: Gadjah Mada University Press; 1993. hal. 1, 7-8,18.
Challem, J. 2004. Tuberculosis, Medical Journals Document Value of BeePropolis, Honey and Royal Jelly. The Nutrition Reporter 2004. Dalam:Indeks Daya Fagosit Makrofag Peritoneum Setelah Pemberian Propolis PadaMencit (Mus Musculus). Fakultas Kedokteran Universitas Islam SultanAgung (Unissula) Semarang.
61
Chairul. 2009. Phagocytosis Effectivity Test of Phenylbutenoid CompoundsIsolated from Bangle (Zingiber cassumunarRoxb.) Rhizome. Journal ofBiological Diversity. 10 (1): 40-43
Chan, J., Xing, Y., Magliozzo, R.S., Blomm, B.R., 1992. Killing of VirulentMycobacterium Tuberculosis by Reactive Nitrogen Intermediates Producedby Activated Murine Macrophages. The Journal of Experimental Medicine175, 1111–1122.
Chakraborty, P.D., Bhattacharyya, D., Pal, S., Ali, N., 2006. In Vitro Induction ofNitric Oxide by Mouse Peritoneal Macrophages Treated With HumanPlacental Extracts. International Immunopharmacology 6, 100–107.
Cuesta, A., Rodr´ıguez, A., Esteban, M.A., Meseguer, J.. 2005. In Vivo Effects ofPropolis, A Honeybee Product, On Gilthead Seabream Innate ImmuneResponses. Fish & Shelfish Immunology 18, 71–80.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Parameter Standar Umum EkstrakTumbuhan Obat. Jakarta. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat danMakanan; 2000, Hal. 1-11.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2007. Parameter Standar UmumEkstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat danMakanan. Hal 1-17.
Dimov, V., Ivanovska, N., Manolova, N., Bankova, V., Nikolov, N. dan Popov.1991.Immunomodulatory action of propolis: Influence on anti-infectiousprotection and macrophage function. Apidologie, 22:155-162.
Djauzi, S. 2003. Perkembangan obat imunomodulator. Med J Ked. 4(2): 13-5.
Estany, S., Palacio, J.R., Barnadas, R., Sabes, M, Iborra A, Martinez P.Antiioxidant activity of N-acetylcysteine, flavonoids and α-tocopherol onendometrial cells in culture. J Repro Immun. Elsevier. 2007; 1-10.
Febriansyah, A.R. 2009. Uji Efek Imunomodulator Ekstrak Metanol Daun danKulit Batang Rhodamnia cinerea Jack Melalui Pengukuran Aktivitas danKapasitas Fagositosis Sel Makrofag Peritoneum Mencit Yang DiinduksiStaphylococcus epidermidis Secara In Vitro. Skripsi. Program Studi FarmasiFakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Finlay, T. M., Abdulkhalek, S., Gilmour, A., Guzzo, C., Jayanth, P., Amith, S. R.,.Szewczuk, M. R. 2010. Thymoquinone-induced Neu4 sialidase activates
62
NFkappaB in macrophage cells and pro-inflammatory cytokines in vivo.Glycoconj J, 27(6), 583-600. doi: 10.1007/s10719-010-9302-5. DalamAkrom Dan Fatimah. Ekstrak Heksan Biji Jintan Hitam (Nigella Sativa L)Meningkatkan Aktivitas Fagositosis Makrofag Tikus Betina Galur Sd(Sprague Dawley) Yang Diinduksi Dmba (7,12dimetilbenz(Α)Antrasen)Secara In Vitro. Pharmaciana, Vol. 5, No. 1, 2015: 69-76.
Fischer, G., Conceic¸ ˜ao, F.R., Leite, F.P.L., Dummer, L.A., Vargas, G.D.,H¨ubner, S.O., Dellagostin, O.A., Paulino, N., Paulino, A.S., Vidor, T.,2007. Immunomodulation produced by a green propolis extract on humoraland cellular responses of mice immunized with SuHV-1.Vaccine 25, 1250–1256.
Francis, G., Zohar K., Harinder, P.S.M., dan Klaus B. 2002. The biological actionof saponins in animal sistems. British Journal of Nutrition. 88: 587–605.
Fuente, M.D. dan Victor, V.M. 2000. Antioxidants as modulator of immunefunction. In immunology and cell biology; 78: 49-54.
Garcia, C.R.S.. 1999. Calcium Homeostasis and Signaling in the Blood–StageMalaria Parasite. Parasitology Today. 15. 12:488–491.
Ghisalberti, E.L. 1978. Propolis: a review., Bee Wld. 60: 59–84.
Gordaliza, M. 2007. Natural Product As Leads For anticancer Drug, ClinicalTransl. Oncology, Milan: Springer Milan 9 : 767 -776.
Grotewold, E. 2006. The Science of Flavonoids. Springer Science and BusinessMedia Inc. United States of America.
Hady, Abd El FK., dan Hegazi, A.G. 2002. Egyptian Propolis: 2. chemicalcomposition, antiviral and antimicrobial activities of east Nile Deltapropolis. Dokki, Giza, Egypt: Departments of Chemistry of Natural Productsand Parasitology. National Research Center. 57: 386-394.
Handajani, J. 2013. Minyak Atsiri Temu putih (Curcuma zedoaria Rosc.,Zingiberaceae) Meningkatkan Aktivitas Fagositosis Neutrofil Terpapar A.actinomycetemcomitans. The International Symposium on Oral and DentalSciences. Yogyakarta: Fakultas Kedokteran Gigi UGM.
Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern MengekstraksiTumbuhan. Terjemahan Padmawinata. K. Bandung (ID): Penerbit ITB.
63
Haslam, E. 1996. Natural Polyphenols (Vegetable Tannins) as Drugs:Possiblemodes of Action. J. Nat. Prod. 59: 205-215.
Harley, J.P., Prescott, L.M. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, FifthEdition. The Mc Graw Hill Companies. San Francisco 79: 446-447.
Heyne, K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia, jilid 1. Jakarta: Yayasan SaranaWan Jaya.
Hollman, P.C.H., M.G.L. Hertog dan M.B. Katan, 1996. Analysis and HealthEffects of Flavonoids. Food Chemistry. 57 (1) : 43-46.
Inalci, M. et.al. 2005. Use of Cancer Chemopreventive Phytochemicals asAntineoplastic Agents, Lanset Oncol. 6;899 – 904.
Ivanovska, N.D., Dimov, V.B., Pavlova, S., Bankova, V., Popov, S.. 1995a.Immunomodulatory action of propolis. V. Anticomplementary activity of awater-soluble derivative. Journal of Ethnopharmacology 47, 135–143.
Jawetz, E., Melnick, J. L., Adelberg, E. A. 2001. Mikrobiologi Kedokteran EdisiXXII, diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas KedokteranUniversitas Airlangga. Jakarta: Penerbit Salemba Medik. 205-209.
Jensch-Junior, B.E., Pressinotti, L.N., Borges, J.C.S., deSilva, J.R.M.C. 2006.Characterization of macrophage phagocytosis of the tropical fishProchilodus scrofa (Steindachner, 1881). Aquaculture. 251:509–515.
Kamperdick, C., Adam, G., Van, N.H., Sung, T.V. 1997. Chemical Constituentsof Madhuca pasquiery. Zeitschrift für Naturforschung. 52:295-300.
Kardinan, A. dan Kusuma, F.R.. 2004. Meniran Penambah Daya Tahan TubuhAlami, Cetakan ke-1, 5, 10, 11. Agromedia Pustaka. Jakarta.
Krell, R. 1996. Value-added products from beekeeping, FAO Agricultural ServiceBull., No. 124.
Kresno, S.B. 2001. Respons Imun Pada Infeksi. Imunologi: Diagnosis danProsedur Laboratorium Edisi 4. Jakarta: Balai Penerbit Penerbit FakultasKedokteran Universitas Indonesia
64
Krol, W., Czuba, Z.P., Threadgill, M.D., Cunningham, B.D.M., Shani, J..1995.Modulation of Luminol-Dependent Chemiluminescence of MurineMacrophages by Flavone And Its Synthetic Derivatives. Arzneimittel-Forschung/Drug Research. 45, 815–818.
Kusmardi, Kumala, S., Triana, E.E. 2007. Efek Imunomodulator Ekstrak DaunKetepeng Cina (Cassia Alata L.) Terhadap Aktivitas dan KapasitasFagositosis Makrofag. Makara, Kesehatan, Vol. 11, No. 2: 50-53.
Kurniasih, Nunung, Kusmiyati, M., Nurhasanah, Sari, RP, Wafdan, R. 2015.Potensi Daun Sirsak (Annona Muricata Linn), Daun Binahong (AnrederaCordifolia (Ten) Steenis), Dan Daun Benalu Mangga (DendrophthoePentandra) Sebagai Antioksidan Pencegah Kanker. Volume IX No.1.
Kustiawan, P.M., Wahyuono, S., dan Yuswanto, A. 2012. Isolasi dan IdentifikasiSenyawa Imunostimulan Non Spesifik In Vitro dari Daun Sirih Merah (Pipercrocatum Ruiz & Pav.). Thesis. Program Pascasarjana Fakultas FarmasiUGM.
Lenny, S. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktivitas Kandungan Kimia Utama PudingMerah dengan Metode Uji Brine Shrimp. Medan: USU Repository.
Lyu, S.Y. dan Park, W.B. 2005. Production of Cytokine and NO by RAW 264.7Macropaghes and PBMC in vitro incubation with flavonoids. Arch. Pharm.Res. 28: 573-581
Ma’at, S. 2004. Tanaman Obat Untuk Pengobatan Kanker (Bagian 3). JurnalBahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 3, No. 2.
Macfarlane, A.S., Schwacha, M.G., Eisenstein, T.K., 1999. In Vivo Blockage ofNitric Oxide with Aminoguanidine Inhibits Immunosuppression Induced byan Attenuated Strain of Salmonella Typhimurium, Potentiates SalmonellaInfections, and Inhibits Macrophage and Polymorphonuclear LeukocyteInfluxinto The Spleen. Infection and Immunity 67, 891–898.
Macmicking, J., Xie, Q.W., Nathan, C., 1997. Nitric oxide and macrophagefunction. Annual Review of Immunology 15, 323–350.
Margaretha, I. 2012. Kajian Senyawa Bioaktif Propolis Trigona Spp. SebagaiAgen Anti Karies Melalui Pendekatan Analisis Kimia Dipandu DenganBioassay. Disertasi. Universitas Indonesia.
Marliana, S.D., Suryanti, V., Suyono. 2005. Skrining Fitokimia dan AnalisisKromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechiumedule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol. Biofarmasi 3 (1): 26-31.
Marquez N., Sancho R., Macho A..2004. Caffeic Acid Phenethyl Ester Inhibits T-Cell Activation by Targeting Both Nuclear Factor of Activated T-Cells and
Mathilda, W.B. 1987. Immnomodulator. Jurusan Farmasi Institute TeknologiBandung. Majalah Cermin Dunia Kedokteran. Halaman 44-46.
McGahon, A.J., Martin, R.P., Bissonnette, R.P., Mahboubi, A., Shi, Y., Mogil,R.J., Nishioka, W.K., Green, D.R. 1995. The end of the (cell) line: Methodsfor the study of apoptosis in vitro. Dlm. Methods in Cell Biology. NewYork: Academic Press Inc. dalam Omar et al. 2010.. Penyaringan AntikanserEkstrak Etanol daripada Famili Piperaceae Terpilih dan Penentuannyamelalui Pewarnaan Tripan Biru. Sains Malaysiana
Middleton, E.J.R., Kandaswami, Chithan, Theoharides, Theoharis C. 2000. TheEffects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications forInflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacol Rev 52:673–751.Diakses melalui http://www.pharmrev.org pada tanggal 4 Desember 2009.
Missima, F. dan Sforcin, J.M. 2007. Green Brazilian Propolis Action OnMacrophages And Lymphoid Organs of Chronically Stressed Mice. OriginalArticle. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, in press.
Mor, G. dan Abraham ,V.M. 2008. The immunology of pregnancy. In: MooreMR, Lookwood RJ, editors. Creasy and Resnik’s Maternal Fetal Medicine.New York: Elsevier; 6: 88-90.
Moriyasu, J., Arai, S., Motoda, R., Kurimoto, M.. 1994. In Vitro Activation ofMouse Macrophage by Propolis Extract Powder. Biotherapy 8, 364–365.
Nugroho, Y.A. 2012. Efek Pemberian Kombinasi Buah Sirih (Piper betle L.)Fruit, Daun Miyana (Plectranthus scutellarioides (L.) R. BR.) Leaf, Madudan Kuning Telur Terhadap Peningkatan Aktivitas dan Kapasitas FagositosisSel Makrofag. Artikel. 22 (1).
Orsi, R.O., Funari, S.R.C., Soares, A.M.V.C., Calvi, S.A., Oliveira, S.L., Sforcin,J.M., Bankova, V., 2000. Immunomodulatory action of propolis onmacrophage activation. The Journal of Venomous Animals and Toxins 6,205–219.
Oteiza, Patricia, I., Erlejman, Alejandra G., Sandra, Verstraeten, V., Keen. CarlL., Fraga, Csar, G. 2006. Flavonoid-membran interactions: A protective roleof flavonoids at the membran surface?. Clinical & DevelopmentalImmunology, Volume 12, Issue 1 March 2005. Dalam Kusuma, DY. EfekPemberian Filtrat Daun Sambung Nyawa (Gynura Procumbens Lour.Merr.) Terhadap Aktifitas Sel Kupffer Pada Mencit Putih (Mus MusculusLinn.).
66
Palombo E.A . 2011. Traditional Medicinal Plant Extracts and Natural Productswith Activity against Oral Bacteria: Potential Application in the Preventionand Treatment of Oral Diseases. Hindawi Publishing Corporation,Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. Article ID680354, 15 pages.
Park, J.H., Lee, J.K., Kim, H.S., Chung, S.T., Eom, J.H., Kim, K.A., Chung, S.J.,Paik, S.Y., Oh, H.Y., 2004. Immunomodulatory effect of caffeic acidphenethyl ester in BALB/c mice. International Immunopharmacology 4,429–436.
Parmer, V.S., Jain, S.C., Bisht, K.S., Jain, R., Taneja, P., Jha, A., Tyagi, O.D.,Prasad, A.K., Wengel J., Olsen, E.S., Boll, P.M.. 1997. Phytochemistry ofThe Genus Piper, 46: 597-673.
Parolia, A, Thomas M.S, Kundabala, M., Mohan, M. 2010. Propolis and itspotential uses in oral health. Int. J. Med. and Medical Sci; 2(7): 210-215.
Pechorsky, A., Nitzan, Y., Lazarovitch, T. 2009. Identification of pathogenicbacteria in blood cultures: comparison between conventional and PCRmethods. J Microbiol Meth 78:325-330.
Pinca, S., Djati M.S., Rifa’I, M. 2013. Analisis Mobilisasi Sel T CD4+ dan CD8+
pada Timus Ayam Pedaging Pasca Infeksi Salmonella typhimurium danPemberian Simplisia Polyscias obtuse. Jurnal Biotropika Volume 1 No.1,Malang: Universitas Brawijaya.
Quattrochi, U. 2000. CRC World Dictionary of Plant Names: Common Names,Scientific Names, Eponyms, Synonyms, and Entimology. Francis.
Rabeta, M.S. dan Faraniza, N. 2013. Total phenolic content and ferric reducingantioxidant power of the leaves and fruits of Garcinia atrovirdis andCynometra cauliflora. International Food Research Journal 20(4): 1691-1696.
Ranjith, M.S. 2008. Enhanced Phagocytosis and Antibody Production byTinospora cordifolia – A new dimension in Immunomodulation. AfricanJournal of Biotechnology. 7 (2), 081-085
Robinovitch, M. 1995.Proffesional and non-Proffesional Phagocytes anIntroduction. Trends In Cell Biology. Vol: 5, 85-87.
Sadikin, M. 2002. Biokimia Enzim. Jakarta: Widya Medika.
67
Safitri, E. 2000. Studi Tentang Efek Imunostimulan Tilosin Terhadap PeningkatanRespon Kekebalan Nonspesifik. Skripsi. Jakarta: Fakultas FarmasiUniversitas Pancasila.
Sa-Nunes, A., Faccioli, L.H., Sforcin, J.M. 2003. Propolis: lymphocyteproliferation and IFN-_ production. Journal of Ethnopharmacology 87, 93–97
Sarisetyaningtyas, P.V., Hadinegoro, S.R., dan Munasir, Zakiudin. 2006.Randomized controlled trial of Phyllanthus niruri Linn extract. PaediatricaIndonesiana volume 46.
Sears, B. dan Saenz, R. 2011. Intisari Mikrobiologi dan Imunologi. Jakarta: EGC.
Setyowati, W.A.E., Ariani, S.R.D., Ashadi, Mulyani, B., Rahmawati, C.P. 2014.Skrining Fitokimia dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak MetanolKulit Durian (Durio zibethinus Murr.) Varietas Petruk. MakalahPendamping Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia VI 271-280.
Sforcin, J.M. 2007. Propolis and the immune system: a review. Journal ofEthnopharmacology. 113 (1): 1-14.
Sherwood, L. 2001. Fisiologi Manusia Dari Sel Ke Sistem (Human Physiology:From Cells To Systems) Edisi 2. Diterjemahkan oleh Brahm U. Pendit.Jakarta. Penerbit buku kedokteran EGC.
Siadi, K. 2012. Ekstrak Bungkil Buji Jarak Pagar (Jatropha curcas) SebagaiBiopestisida Yang Efektif Dengan Penambahan NaCl. Jurnal MIPA. 35(1).
Silva, C. A. da, Pinheiro, J.W., Fonseca, N.A.N., Cabrera, L., Novo, V.C.C.,Silva, M.A.A. da, Canteri, R.C., Hoshi, E. H., 2002. Sunflower meal as feedto swine during the growing and finishing phase: digestibility, performanceand carcass quality. Rev. Bras. Zootec., 31 (2) Suppl.: 982-990
Sirois, M. 2005. Laboratory Animal Medicine : Principles and Procedures.United States of America: Mosby, Inc. Dalam: Ragam Jenis EktoparasitPada Hewan Coba Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Galur Sprague Dawley.Bogor: Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Sjahrurachman, A., Sukmana, N., Setiati S., Munazir Z., Rubiana, H., Nelwan,Lesmana dan Dianiati. 2004. Pemberian Terapi Imunomodulator Herbal.Jurnal HTA Indonesia
68
Sriningsih dan Wibowo, A.E. 2006. Efek Pemberian Ekstrak Etanol HerbaMeniran (Phyllanthus niruri L.) Terhadap Aktivitas dan KapasitasFagositosis Makrofag Peritoneum Tikus. Artocarpus. Vol.6, No.2: 91-96.
Sriningsih dan Wibowo, A.E. 2009. Efek Imunostimulan Ekstrak Meniran(Phyllanthus niruri L.) Secara In Vivo Pada Tikus. Jurnal Bahan AlamIndonesia. ISSN 1412-2855 Vol.7, No.1: 15-18.
Sudarsono, 1996. Tumbuhan Obat (Hasil Peneltian, Sifat- Sifat dan Penggunaan).Yogyakarta: PPOT UGM.
Suhirman, S., dan Winarti, C. 2007. Prospek dan Fungsi Tanaman Obat SebagaiImunomodulator. Bogor: Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik.
Sukandar, D. dan E. R. Amelia. 2013. Karakterisasi Senyawa Aktif Antioksidandan Antibakteri dalam Ekstrak Etanol Buah Namnam (Cynometra caulifloraL.). Valensi. 3(1): 34-38.
Sumarlin, L., Suprayogi, A., Rahminiwati A., Tjachja A., dan Sukandar D.,Bioactivity of Methanol Extract of Namnam Leaves in Combination withTrigona Honey, J. Teknol. dan Industri Pangan. 26(2): 144-154.
Sunaryo, H., Chairul, Winaningrum. 2007. Uji Efek Imunomodulator EkstrakDaun, Kulit Batang, dan Buah Ki Pahit (Picrasma javanica Blume). Dalam:FAKTA (Jurnal Ilmiah Ilmu-Ilmu Eksakta) Vol.3 (3). Jakarta: FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Prof. Dr. Hamka. Hal121-126.
Svehla, G. 1990. Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semimikro.Edisi kelima. Penerjemah: Setiono, L. dan A.H. Pudjaatmaka. PT KalmanMedia Pusaka, Jakarta.
Talaro, Kathlee P. 2008. Foundation in Microbiology: basic principle. SixthEdition. New York. McGraw-Hill Company
Tatefuji,T., Izumi, N., Ohta,T., Arai, S., Ikeda, M.,Kurimoto, M. 1996. Isolationand identification of compounds from Brazilian propolis which enhancemacrophage spreading and mobility. Biological & Pharmaceutical Bulletin19, 966–970.
Thabrew, M.I., de Silva, K.T., Labadie, R.P., de Bie PULA, van den Berg, P.1991. Immunomodulatory activity of three Sri Lanka medicinal plants usedin hepatic disorder. J Ethnopharmacol. 74(9): 63-6.
Tizard, I. 1988. Pengantar Imunologi Veteriner. Edisi Ke 2. Terjemahan MasdukiPartodirejo. Airlangga University Press, Surabaya.
69
Tringali, C. 2001. Bioactive Compound from Natural Sources. London: Taylorann Francis Inc. 164-165.
Ulya, A.N., 2012, Efek Peningkatan Aktivitas Fagositosis Makrofag FraksiKloroformEkstrak Etanol Kelopak Rosella (Hibiscus ssabdarifa L) secara invitro. Skripsi. Fakultas Farmasi. UAD, Yogyakarta. Dalam Akrom danFatimah. Ekstrak Heksan Biji Jintan Hitam (Nigella Sativa L) MeningkatkanAktivitas Fagositosis Makrofag Tikus Betina Galur Sd (Sprague Dawley)Yang Diinduksi Dmba (7,12dimetilbenz(Α)Antrasen) Secara In Vitro.Pharmaciana, Vol. 5, No. 1: 69-76
Utami, R. 2009. Uji Efek Imunomodulator Kapur Sirih (CaCO3) TerhadapAktivitas Dan Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag Peritoneum MencitSecara in vivo . Skripsi. Program Sarjana Farmasi UIN Syarif HidayatullahJakarta:44.
Wade, C. 2005. Can Bee Propolis Rejuvenate The Immune System?www.thenaturalshopper.com/buybee- supplements/article.htm. Dalam:Pengaruh Pemberian Ekstrak Propolis Terhadap Sistem Kekebalan SelulerPada Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Strain Wistar. Malang: UniversitasBrawijaya.
Wagner, H., 1985. Immunostimulants from medicinal plants. In Advances inChinese medicinal materials research (Eds.) H.M. Chang; H.W. Yeung;W.W. Tso and A. Koo. World Scientific Publ. Co. Singapura : 159-170.
Wagner, H. 1999. Immunomodulatory Agents From Plants: Search for PotentImmunostimulant Agents from Plants and Other Natural Sources. In: Bohlin,L. dan J.G. Bruhn (eds.) Bioassay Methods in Natural Product Research andDrug. Basel: Kluwer Academic Publisher.
Wagner H dan Jurcic K. 1991. Assays for immunomodulation and effects onmediators of inflammation. Dalam: Dey PM, Harbone JB, editor. Methods inplants biochemistry:assays for bioactivity. Volume ke-6. Academic Pr.
Winarno, F.G. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Bogor (ID): M-Brio Press.
You, K.M., Son, K.H., Chang, H.W., Kang, S.S., Kim, H.P., 1998. Vitexicarpin, aflavonoid from the fruits of Vitex rotundifolia, inhibits mouse lymphocyteproliferation and growth of cell lines in vitro. Planta Medica 64, 546–550.
70
Yu, L., Yueh-Hsiung, K., Yun-Lian, L. Wenchang, C. 2009. Antioxidative Effectand Active Component from Leaves of Lotus (Nelumbo nucifera). J. Agric.Food Chem 57 (15): 6623-6629. DOI: 10.1021/jf900950z.
Yulinery T., Nurhidayat, N. 2012. Penggunaan Ekstrak Fermentasi Beras Daribeberapa Jenis Monascus Purpureus Untuk Aktivitas In Vitro FagositosisSel Makrofag dan Polimorfonuklear Peritoneum Mencit SebagaiImmunomodulator. Berita Biologi 11(2). Bidang Mikrobiologi, PusatPenelitian Biologi-LIPI.
Zalikoff, J.T., Enane, A.E., Bowser, D., Squibb, K.S., Frenkel, K. 1991.Development of Fish Peritoneal Macrophages as a Model for HigherVertebrates in Immunotoxicological Studies I. Characterization of TroutMacrophage Morphological, Functional, and Biochemical Properties.Toxycological Science. Oxford Journal.Volume 16, Issue 3. Pp. 576-589.