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CINETICA DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA Y EFECTO DE LA
TEMPERATURA EN EL PROCESO DE ELABORACION DE ALCOHOL
Laboratorio de alimentos fermentados
Profesora: Elvia Hernndez Hernndez
Equipo 2Contreras Rizo Gustavo
Duran Espinosa Sandra ErandiLino Len Cipactli
Martnez Cruz Mara Guadalupe Morales Carrillo Violeta
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RESUMEN: En esta prctica evaluamos el efecto de la temperatura
en la fermentacin alcohlica para esto utilizamos como inoculo la
levadura Saccharomyces cerevisiae. Y un medio de cultivo a base de
glucosa con pH 4.5 esto se coloco en un fermentador que se
esterilizo a 121 C durante 15 minutos al igual que los medios y se
les realizo una prueba de esterilidad para evitar cualquier
contaminacin y que esto alterara nuestros resultados dando negativa
esta prueba se procedido a colocar el medio con el inoculo en
condiciones estriles en el fermentador.
Se coloco el fermentador en un un bao mara con una temperatura
de 30 que fue a la que le toco trabajar a nuestro equipo pero a
otros equipos les asignaron otra temperatura que son las dos que
comnmente se ocupan en la produccin de etanol a nivel industrial
para producir bebidas alcohlicas
La fermentacin se llevo a cabo por 72 horas a partir del tiempo
cero se empezaron a tomar muestras cada 24h, a las cuales se les
realizo pruebas con el fin de conocer la concentracin de levaduras,
de etanol y azucares reductores.
INTRODUCCION:La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae)
es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado
industrialmente en la fabricacin de pan, cerveza y vino. El ciclo
de vida de las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra
diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemacin.
En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de
reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en
la clula formndose un asca que contiene cuatro ascosporas
haploides. S. cerevisiae es uno de los modelos ms adecuados para el
estudio de problemas biolgicos. Es un sistema eucariota, con una
complejidad slo ligeramente superior a la de la bacteria pero que
comparte con ella muchas de sus ventajas tcnicas. Adems de su rpido
crecimiento, la dispersin de las clulas y la facilidad con que se
replican cultivos y aslan mutantes, destaca por un sencillo y
verstil sistema de transformacin de ADN. Por otro lado, la ausencia
de patogenicidad permite su manipulacin con las mnimas
precauciones. S. cerevisiae es un sistema gentico que, a diferencia
de la mayora de los otros microorganismos, presenta dos fases
biolgicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite
generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad,
mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de
complementacin. Las utilidades industriales ms importantes de esta
levadura son la produccin de cerveza, pan y vino, gracias a su
capacidad de generar dixido de carbono y etanol durante el proceso
de fermentacin. Bsicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta
levadura se encuentra en un medio muy rico en azcares (como la
D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura
utiliza otras rutas metablicas que le permiten obtener un mayor
rendimiento energtico, y por tanto no realiza la fermentacin. Desde
el punto de vista cientfico, este microorganismo se ha empleado
como modelo simple de la clula eucariota. Esto se debe a una serie
de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de divisin
celular (aproximadamente dos horas). Las fuentes de carbono
utilizadas por las levaduras varan desde los carbohidratos hasta
los aminocidos. Entre los azcares que puede utilizar estn
monosacridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa,
entre
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otros. Tambin son capaces de utilizar disacridos como la maltosa
y la sacarosa y trisacridos como la rafinosa. Uno de los azcares
que no puede metabolizar es la lactosa.
(es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae)
La fermentacin alcohlica (denominada tambin como fermentacin del
etanol o incluso fermentacin etlica) es un proceso biolgico de
fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O2), originado por
la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos
de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo
la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener
como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya frmula
qumica es: CH3-CH2-OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas y
unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su
metabolismo celular energtico anaerbico. El etanol resultante se
emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como
el vino, la cerveza, la sidra, etc.[] Aunque en la actualidad se
empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel
industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible.[][]
La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar
energa anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en
ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y
obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el
alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentacin.[] Una
de las principales caractersticas de estos microorganismos es que
viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime
durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la fermentacin
alcohlica es un proceso anaerbico.
SABOURAUD- AGAR.
Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y conservacin
de hongos patgenos y saprfitos. Tambin es til para el cultivo de
levaduras.
Fundamento:Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y
desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones
cutneas (piel, pelo, etc.). En el medio de cultivo, la pluripeptona
y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de
microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de
cloranfenicol y el pH cido, favorecen el crecimiento de hongos por
sobre el de bacterias.Adems, al medio de cultivo, pueden agregarse
otros agentes selectivos de crecimiento.
DETERMINACION POR GRADO ALCOHOLICO
El dicromato de potasio oxida al etanol a cido actico, este
procedimiento es de gran utilidad. El producto de la oxidacin del
etanol con dicromato de potasio, en presencia de cido sulfrico, es
el acido actico:
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2Cr2O7 + 3C2H5OH + 16H 4Cr + 3 CH3COOH + 11 H2O
Para oxidar completamente el etanol a cido actico se requiere
una adecuada concentracin de iones hidrgeno. Si sta no es
suficiente, el alcohol se oxida a acetaldehdo o una mezcla de
acetaldehdo y cido actico. El dicromato en exceso se determina
reduciendo con una disolucin valorada de sulfato ferroso
amoniacal:
Cr2O7 + 6 Fe + 14 H 2CR + 6 Fe + 7 H2O
El punto final de la valoracin no es muy definido visualmente
por lo que se utiliza la 1,10ofenantrolina, como indicador
redox.
DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES
Fundamento: El acido 3,5 dinitrosalicilico en presencia de calor
reduce el cido 3-amino-5 nitrosalicilico por los azucares
reductores presentes, desarrollndose un color amarillo caf el cual
es estable hasta por 24 horas. La lectura se realiza a 575 nm. Este
mtodo permite medir las unidades reductoras presentes en los
azucares.(Miller) Los azcares reductores pueden reducir al cido
3,5dinitrosaliclico (DNS) bajo determinadas condiciones. Preparar
el reactivo DNS: 100ml de solucin DNS 2mM en NaOH 0,2N y 250ml de
solucin de tartrato de sodio y potasio 4hidrato 2,12M. Mezclar
ambas soluciones y se llevar a 500ml.Si la muestra contiene
protenas stas pueden producir falsos negativos, para evitarlos
desproteinizar 5ml de leche aadiendo 1 ml de cido actico 1N;
centrifugar a 4.000 x g durante 10 minutos. Si en la muestra es
posible la presencia de di, tri o polisacridos con ms de un
componente reductor, neutralizar con NaOH 1N para evitar una
posterior hidrlisis cida (se sobre estimara la cantidad del
sacrido).Aadir 4,475ml de agua destilada y 25ml de muestra 500l de
reactivo DNS. Mantener la mezcla en bao de agua hirviendo durante 5
minutos y medir a continuacin absorbancia a 540nm, interpolando el
valor obtenido con los valores calculados para soluciones de
sacrido de concentracin conocida.
AZUL DE METILENO AL 0.5 % (Conteo diferencial de levaduras).
Las coloraciones de acuerdo a la complejidad se subdividen en 2
tipos que son la TINCIN SIMPLE y la TINCIN DIFERENCIAL.
TINCION SIMPLE se emplea un solo colorante, que puede ser azul
de metileno, cristal violeta o carbol fucsina. Y en ella la clula
se tie uniformemente (aunque en algunos casos puede distinguirse
grnulos en el interior de la clula teidos con mayor intensidad, lo
que indica la presencia de entidades qumicas activas).Con este tipo
de tincin se crea un contraste con el medio donde se est haciendo
el frotis o tincin y se puede observar la morfologa y la disposicin
bacteriana. La importancia est en que es muy fcil de aplicar.
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Un ejemplo de uso de tincin simple es cuando se utiliza azul de
metileno de esta forma se pueden ver levaduras y diferenciar las
vivas de las muertas. Las levaduras muertas se tien en su interior
y se ven del mismo color del tinte que se aplico, debido a los
enlaces que forma el azul de metileno (base) con las cargas que
estn dentro de la clula como protenas. Las levaduras vivas no se
tien por dentro debido a los enlaces que forma el colorante con la
membrana celular y de esta manera no entra el colorante al interior
de la clula.
OBJETIVOS:
Analizar el efecto de la temperatura en la fermentacin de un
mosto con Saccharomyces Serevisiae
Estudiar los factores que intervienen en una fermentacin
alcohlica Observar cmo influye el O2 en la produccin de Biomasa
RESULTADOS:Cuadro 1. Condiciones de cultivo
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Tiempo horas
Contenido alcohlico (mL de sulfato ferroso
Alcuota grado alcohlico
Azucares reductores (absorbancia)
Diluciones
Levaduras viables (#)
Levaduras no viables(#)
Levaduras totales (#)
Dilucin
O 59.2 5 mL 0.244 (2/100)(2/12)
3.48x1010
4.8x109 3.96x1010
(1/5)(1/2)
24 18.2 3 mL 0.1955 (2/100)(2/10)
9x1010 5x109 9.5x1010
(1/10)(1/2)
48 8 3 mL 0.1805 (2/100)(2/6)
1.5x1011
1.5x1010
1.5x1011
(1/15)(1/2)
72 0 3 mL 0.075 1/100 1.6x1011
1.74x1011
1.74x1011
(1/20)(1/2)
Ecuacin de la recta: Y=6.583x10-4X-0.0494r2=0.99
Despejando la ecuacin de la recta para calcular las
concentraciones de azcares en el mosto de acuerdo a la
absorbancia.
X=Y+0.04946.583x10-4Para obtener los valores de Azucares
reductores (% p/v), sustituimos los valores de Y en la ecuacin
anterior, el resultado se multiplica por el factor de dilucin, se
pasa a gramos y se obtiene el promedio.
X=0.244+0.04946.583x10-4=445.69g/mL(300)1000000=0.13370x100=13.37%
X=0.1955+0.04946.583x10-4=372.01
g/mL(250)1000000=0.93002x100=9.30%
X=0.1805+0.04946.583x10-4=349.23
g/mL(150)1000000=0.52384x100=5.23%
Concentracin de Glucosa (g/mL)
Absorbancia 540 nm
0 0300 0.091600 0.334900 0.541200 0.763
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X=0.075+0.04946.583x10-4=188.97g/mL(100)1000000=0.01889x100=1.88%
Para obtener el Contenido alcohlico (% v/v) utilizamos la
siguiente formula
Contenido alcohlico=(25-(2518.2mL57.93mL=5.71%
Contenido alcohlico=(25-(258.2mL57.93mL=7.15%
Contenido alcohlico=(25-(250mL57.93mL=8.33%
GRFICAS:
Grafica 1. Por cultivo a 30C
Grafica 1a. Por cultivo 24C
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DISCUSIN:
De acuerdo al cuadro 1 observamos que hubo crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae debido a que la cuenta de levadura tiende
a aumentar conforme pasa el tiempo, de tal forma que las 24 horas
de incubacin ya se encuentra en la fase exponencial y para las 72
horas empieza la fase estacionaria, esto se debe a que la
temperatura ptima es de 30C para el crecimiento de sta
levadura.
Si observamos la figura 1 se aprecia en la curva de crecimiento
un aumento de la concentracin de biomasa, tambin encontramos la
fase exponencial que es de gran importancia, debido a que en esta
se forma etanol que es un metabolito primario; la curva de
contenido de azcares decrece debido a que la levadura la utiliza
para la produccin de etanol, por tal motivo el contenido de etanol
va en aumento.
En la figura 2 tenemos el crecimiento microbiano a dos
temperaturas de acuerdo a la bibliografa la temperatura ptima de
crecimiento para Saccharomyces cerevisiae es de 30C por sta razon a
la temperatura de 24C el crecimiento es lento y se observa con
mayor amplitud la fase de latencia, mientras que a la temperatura
de 30C su crecimiento es ms rpido y llega antes a la fase
exponencial.
En la figura 4 observamos que la concentracin de azcares
conforme pasa el tiempo disminuye debido a que la poblacin de
levaduras va en aumento y el consumo del sustrato (azcares) es
mayor, principalmente a la temperatura de 30C. Para la temperatura
de 24C hay una disminucin de la concentracin de azcares sin embargo
no se nota tan pronunciada porque esos resultados estn mal
calculados; corrigindolos se obtiene la figura 4a en donde tambin
se aprecia la disminucin de la concentracin de azcares y observamos
que no hay gran diferencia en la produccin de azcares reductores a
diferentes temperaturas.
Grfica 3 tenemos el contenido alcohlico para la temperatura de
30C que va en aumento conforme pasa el tiempo debido a que tenemos
una fase exponencial en el crecimiento y es ah en donde se forman
los metabolitos primarios, en este caso el etanol para la
temperatura de 24C los resultados varan demasiado, obteniendo una
curva que disminuye con respecto al tiempo, esto podra significar
una titulacin inadecuada una mala manipulacin de la muestra, o
simplemente un descuido para hacer los clculos por parte del equipo
3, con quines comparamos resultados.
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CONCLUSIN:
Se analizo que en efecto, la temperatura influye en el
rendimiento y en la velocidad con la que se produce etanol. Se
trabajo con 24C y 30C, la temperatura optima de crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae es de 30C y 40C para su mxima produccin de
etanol.
Se estudio que la produccin de etanol en una fermentacin depende
del inoculo, de la composicin del medio de cultivo, de las
condiciones ambientales, del crecimiento microbiano, etc.
En esta prctica se analiz lo importante que es controlar los
factores como temperatura, pH, agitacin, cantidad de oxigeno,
concentracin de sustrato y la adicin de micronutrientes al medio;
ya que al variar alguno de estos factores el resultado podra no ser
el deseado.
Segn los resultados obtenidos durante la prctica, la fermentacin
alcohlica puede realizarse en las siguientes condiciones:
Temperatura: 30C, pH: 4.5 en ausencia de oxgeno, dado que bajo
estas condiciones se obtuvo un mayor rendimiento, lo cual es
coherente ya que la literatura reporta que una fermentacin
alcohlica debe realizarse a un pH entre 3.5-5.5 y una temperatura
de 30C ya que es la temperatura optima de Saccharomyces
cerevisiae.
Una fermentacin alcohlica debe llevarse a cabo en condiciones
aspticas para evitar el crecimiento de microorganismos indeseables
y que se desarrolle el proceso en excelentes condiciones. Adems de
tener mucho cuidado durante la fermentacin, tambin se debe tener
cuidado al determinar azucares, alcohol, levaduras viables y no
viables ya que estas determinaciones son la prueba de que la
fermentacin se llevo a cabo correctamente.La fermentacin alcohlica
es de suma importancia a nivel industrial tanto en bebidas
alcohlicas como en la produccin de biocombustibles.
REFERENCIAS:
(es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae)http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/sabouraudgluagar.htm
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ANEXOS:
Imgenes (Izq y Der.)
Fermentador al tiempo cero; el
medio de cultivo muestra poca
turbidez y ausencia de
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Imgenes: Fermentador despus de
24h (Der) y 48h (Izq); el medio
de cultivo muestra ms
turbidez y abundancia de
espuma (produccin de CO2) conforme transcurre el
tiempo.
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Observacin al microscopio de la levadura Saccharomyces
cerevisiae.
Determinacin de azcares reductores: Dilucin de acuerdo al cuadro
de la preparacin de las
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Determinacin de azcares reductores: Duplicado de la dilucin de
acuerdo al cuadro de la preparacin de las muestras de
Determinacin del grado alcohlico por oxidacin de dicromato.
Color verde botella, luego aadir la solucin de sulfato ferroso
amoniacal.
Determinacin del grado alcohlico por oxidacin de dicromato. Esta
toma fu hecha con ms exposicin a la luz.