1 Efecto de aldehídos alifáticos productos de lipoperoxidación sobre la estructura química y función de la insulina. Resumen. El “Estrés Oxidativo” (EO) modifica la estructura y función de biomoléculas como la LDL y la Insulina, recientemente se demostró en un modelo in vitro, que la insulina humana recombinante es modificada en su estructura al exponerla a radicales libres hidroxilo, observándose una disminución en la función biológica. Se sabe que otro mecanismo de daño a proteínas por EO es la formación de aductos (interacción de grupos aldehídos con grupos amino) con productos de lipoperoxidación (LPx). Objetivo: fue determinar in vitro, el efecto de los aldehídos alifáticos productos de lipoperoxidación (malondialdehído (MDA)) sobre la insulina humana recombinante y determinar en un modelo animal, el efecto hipoglucemiante del aducto insulina-MDA. Metodología: Para la formación de aductos se diseñó un sistema generador de productos de lipoperoxidación el cual consistió en exponer ácidos grasos insaturados (linolénico y linoléico) a RL (HO • ) para obtener los aldehídos alifáticos (productos de lipoperoxidación) que en presencia de insulina forman aductos. En otro sistema se preparó una solución de 1,1,3,3,- tetrametoxipropano (Malondialdehído bis (dietilacetal)) 10 mM en ácido sulfúrico 1%, y ácido clorhídrico (HCl) 0.2 N en presencia de 20 UI de insulina (1 mg). Los dos sistemas fueron incubados a 40 °C durante 2 horas y al término de la incubación se precipitó con ácido tricloroacético (TCA) al 10 %. La formación de aductos se determinó cuantificando: a) MDA unido a la proteína (insulina) con ácido tiobarbitúrico, y b) los grupos carbonilo con dinitrofenilhidrazina. Para el efecto hipoglucemiante se administró insulina nativa o insulina modificada a ratas vía intraperitoneal y se midieron las concentraciones de glucosa a diferentes tiempos con un glucómetro (Accu-Chek sensor, Roche. Bayer HealthCare). Resultados: La formación de aductos formados entre los productos de LPx y la proteína insulina fue establecida al exponer la insulina con el precursor de MDA y obtener 0.4587 ± 0.1015 nmol de MDA/mg de insulina, la exposición de grupos carbonilos 36.53 ± 7.192 nmoles de osazonas/mg de insulina. Lo que dió como consecuencia una disminución en la actividad biológica de la hormona de aproximadamente el 10%. Conclusión: Existe una formación del aducto insulina-MDA, por lo que el aducto formado entre el grupo amino de la insulina y el producto de lipoperoxidación malondialdehído causa un daño indirecto a la proteína, demostrando que el aducto disminuye la función biológica de la insulina aproximadamente en un 10 %. También se demostró que la formación de aductos entre los productos finales de lipoperoxidación y la insulina humana recombinante, puede ser un factor más, no descrito antes que contribuye a un mal funcionamiento de la proteína y que se encuentra relacionado en enfermedades como la diabetes y síndrome metabólico entre otras.
44
Embed
Efecto de aldehídos alifáticos productos de ... · insulina, la exposición de grupos carbonilos 36.53 ± 7.192 nmoles de osazonas/mg de insulina. Lo que dió como consecuencia
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Efecto de aldehídos alifáticos productos de lipoperoxidación sobre la estructura
química y función de la insulina.
Resumen.
El “Estrés Oxidativo” (EO) modifica la estructura y función de biomoléculas como la LDL y la
Insulina, recientemente se demostró en un modelo in vitro, que la insulina humana
recombinante es modificada en su estructura al exponerla a radicales libres hidroxilo,
observándose una disminución en la función biológica. Se sabe que otro mecanismo de daño a
proteínas por EO es la formación de aductos (interacción de grupos aldehídos con grupos
amino) con productos de lipoperoxidación (LPx). Objetivo: fue determinar in vitro, el efecto de
los aldehídos alifáticos productos de lipoperoxidación (malondialdehído (MDA)) sobre la insulina
humana recombinante y determinar en un modelo animal, el efecto hipoglucemiante del aducto
insulina-MDA. Metodología: Para la formación de aductos se diseñó un sistema generador de
productos de lipoperoxidación el cual consistió en exponer ácidos grasos insaturados (linolénico
y linoléico) a RL (HO•) para obtener los aldehídos alifáticos (productos de lipoperoxidación) que
en presencia de insulina forman aductos. En otro sistema se preparó una solución de 1,1,3,3,-
tetrametoxipropano (Malondialdehído bis (dietilacetal)) 10 mM en ácido sulfúrico 1%, y ácido
clorhídrico (HCl) 0.2 N en presencia de 20 UI de insulina (1 mg). Los dos sistemas fueron
incubados a 40 °C durante 2 horas y al término de la incubación se precipitó con ácido
tricloroacético (TCA) al 10 %. La formación de aductos se determinó cuantificando: a) MDA
unido a la proteína (insulina) con ácido tiobarbitúrico, y b) los grupos carbonilo con
dinitrofenilhidrazina. Para el efecto hipoglucemiante se administró insulina nativa o insulina
modificada a ratas vía intraperitoneal y se midieron las concentraciones de glucosa a diferentes
tiempos con un glucómetro (Accu-Chek sensor, Roche. Bayer HealthCare). Resultados: La
formación de aductos formados entre los productos de LPx y la proteína insulina fue establecida
al exponer la insulina con el precursor de MDA y obtener 0.4587 ± 0.1015 nmol de MDA/mg de
insulina, la exposición de grupos carbonilos 36.53 ± 7.192 nmoles de osazonas/mg de insulina.
Lo que dió como consecuencia una disminución en la actividad biológica de la hormona de
aproximadamente el 10%. Conclusión: Existe una formación del aducto insulina-MDA, por lo
que el aducto formado entre el grupo amino de la insulina y el producto de lipoperoxidación
malondialdehído causa un daño indirecto a la proteína, demostrando que el aducto disminuye la
función biológica de la insulina aproximadamente en un 10 %. También se demostró que la
formación de aductos entre los productos finales de lipoperoxidación y la insulina humana
recombinante, puede ser un factor más, no descrito antes que contribuye a un mal
funcionamiento de la proteína y que se encuentra relacionado en enfermedades como la
diabetes y síndrome metabólico entre otras.
2
1. Introducción
La Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) es uno de los principales problemas de salud en
México. Es la primera causa de muerte en adultos, se debe principalmente a factores
genéticos que predisponen a la persona a padecerla y que se incrementa en presencia
de sobrepeso u obesidad (generalmente con distribución visceral o abdominal de la
grasa corporal), sedentarismo, hipertensión arterial; en el caso de la mujer, ovarios
poliquísticos, edad, entre otros. Existen diferentes tipos de Diabetes; como la Diabetes
Mellitus tipo 1, tipo 2, gestacional, asociada a síndromes genéticos, inducida por
fármacos o agentes químicos, defectos genéticos de la célula beta, enfermedades del
páncreas exocrino, entre otras. En la Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) existe producción
de insulina, pero esta puede presentar disminución en su acción o es secretada en
menor cantidad por parte de las células beta del páncreas; por lo que la glucosa tiene
menos capacidad para ingresar a las células (Barry et al, 2006; Escobar- Jiménez et al, 2000).
La diabetes Mellitus es una enfermedad caracterizada por alteraciones en el
metabolismo de los carbohidratos (hiperglucemia >126 mg/dl) (Tabla 1), lípidos
(aumento de grasas como colesterol y triacilglicéridos) y proteínas, que se acompaña
de complicaciones crónicas microangiopáticas (retinopatía, neuropatía)
macroangiopáticas (aterosclerosis) y neurológicas, causado por la disminución en la
actividad de la insulina, secundaria a la disminución en la acción de la proteína, ya sea
por que se produce poco, nada, esta defectuosa o a la sensibilidad de los tejidos a la
insulina.
Concentración de glucosa
en sangre (ayuno) (mg/dL)
Hipoglucemia ≤ 60-50
Normoglucemia 80 y ≤ 110
Glucemia en ayuno 110 y 125
Hiperglucemia ≥ 126
Intolerancia a la glucosa
Post-prandial ≥ 140 y < 200
Diabetes > 200
Tabla 1. Concentración de glucosa en sangre (NOM-015-SSA21994).
3
1.1. Insulina
Estructura química de la insulina.
La insulina es una hormona proteíca constituida por una cadena α de 21 aminoácidos y una β con
30, también llamadas cadena A y B; estas están unidas por dos enlaces disulfuro intermoleculares
(un enlace entre el aminoácido 7 de cada una de las cadenas y el otro enlace en el aminoácido 20
de la cadena A y con el 19 de la B) y por un enlace disulfuro intramolecular en la cadena α, en los
aminoácidos 6 y 11, tiene una vida media plasmática de 6 minutos aproximadamente y
desaparece de la circulación de 10 a 15 minutos.
Síntesis de la insulina.
La insulina es sintetizada en las células β de los islotes de Langerhans del páncreas,
primero, los ribosomas acoplados al retículo endoplásmico traducen el ARN de la
insulina y forman una sola cadena de aminoácidos (preprohormona) llamada
preproinsulina de 81 aminoácidos con un peso molecular de 11,500 Daltones que es
procesada después de su traducción para dar una molécula biológicamente activa; el
precursor de la insulina es una cadena polipeptídica de aproximadamente 9000
daltones, llamado proinsulina. Después de haber completado la síntesis, la molécula de
proinsulina se pliega espontáneamente dando la configuración propicia para la
formación de puentes disulfuros. La conversión de proinsulina a insulina tiene lugar al
proceso de proteolisis, lo que origina la transformación de una proteína de peso
molecular aproximadamente de 6000 daltones y otra de 3000 (péptido C) (Barry et al, 2006;
Farías, 1999). Esta conversión ocurre en el momento de transporte de la proinsulina que se
sintetiza en los ribosomas del retículo endoplásmico y se transfiere al aparato de Golgi
donde se almacena en gránulos para ser liberada como insulina (Williams, 1984). La
secreción de la insulina es iniciada por numerosos estímulos, entre ellos; el incremento
de la concentración de glucosa, así como de aminoácidos y ácidos grasos en sangre
(Barry et al, 2006).
Importancia de la insulina para el almacenamiento de sustancias energéticas.
En el caso de los carbohidratos, hace que se almacenen en forma de glucógeno
principalmente en el hígado y los músculos. Induce el almacenamiento de lípidos en el
tejido adiposo. El exceso de carbohidratos que no puede almacenarse como glucógeno,
se transforma en lípidos por la estimulación insulínica y se almacena también en el
4
tejido adiposo. En el caso de las proteínas, la insulina ejerce un efecto directo
promoviendo la captación de aminoácidos por las células y su conversión en proteínas
(Guyton y Hall, 2001).
Activación de los receptores de las células efectoras (blanco) por la insulina.
Para iniciar sus efectos sobre las células blanco la insulina debe ligarse a una proteína
receptora de la membrana con un peso molecular aproximado a 300,000 Daltones. El
receptor de insulina consta de cuatro subunidades que se mantienen unidas por
puentes disulfuro, dos subunidades alfa situadas en la parte externa de la membrana y
dos subunidades beta que atraviesan la membrana que sobresalen hacia el interior del
citoplasma celular. Es el receptor activado y no la insulina quien desencadena los
efectos.
La insulina se une a las subunidades alfa de la parte externa del receptor, pero debido a
los enlaces con las subunidades beta que se encuentran en la membrana se inicia la
autofosforilación y por lo tanto se convierte en una enzima activa: proteincinasa local
que produce la fosfori lación de otras enzimas intracelulares.
Los efectos finales de la estimulación insulínica son los siguientes:
1. Segundos después de la unión de la insulina a los receptores de las membranas
aproximadamente el 80% de las células del cuerpo aumenta la permeabilidad a la
glucosa. Esto ocurre en las células musculares, hígado y en los adipocitos, pero no
ocurre en la mayor parte de las neuronas del encéfalo. La glucosa, que entra a la célula,
se fosforila y sirve de sustrato para las vías metabólicas de los carbohidratos. La
aceleración del transporte de glucosa es consecuencia de una translocación de
numerosas vesículas intracelulares a la membrana de la célula; estas vesículas portan
varias moléculas de proteínas transportadoras de glucosa (GLUT 4), que se unen a la
membrana celular y facilitan el paso (captación) de glucosa al interior de la célula.
Cuando no está disponible la insulina, las vesículas se desprenden de la membrana
celular en aproximadamente de 3 a 5 minutos y regresan al interior de las células; este
ciclo se repite cuantas veces sea necesario.
2. La membrana celular se vuelve más permeable para muchos aminoácidos, iones
potasio y fosfato, cuyo transporte al interior de la célula se incrementa.
5
3. En los 10 a 15 minutos siguientes se observan efectos más lentos que cambian la
actividad de muchas enzimas intracelulares. Estos efectos se deben, sobre todo a una
variación en los procesos de fosforilación enzimática.
4. Durante algunas horas e incluso días, tiene lugar efectos aún más tardíos. Estos
obedecen a los cambios en la velocidad de traducción de los ARN mensajeros dentro
de los ribosomas para dar nuevas proteínas, e incluso (los efectos más tardíos) a un
cambio de las velocidades de transcripción del ADN (Guyton y Hall, 2001).
La insulina tiene efectos en diversos tejidos. Sin embargo, el hígado, el músculo y el
tejido adiposo son los blancos más importantes para su acción, en los cuales promueve
la síntesis de carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (Guyton y Hall, 2001), por lo
que el déficit de la insulina provoca; a) una lipólisis de la grasa almacenada, con
liberación de los ácidos grasos libres, b) un aumento en las concentraciones
plasmáticas de colesterol y de fosfolípidos, c) un consumo exagerado de lípidos, lo que
provoca cetosis y acidosis, d) una disminución de las proteínas y un aumento de los
aminoácidos en el plasma, y e) el efecto más conocido que es la hiperglucemia.
1.2. Hiperglucemia
La Diabetes mellitus es una enfermedad caracterizada por la hiperglucemia que se
destaca por la persistencia de una alta concentración de glucosa sanguínea en ayuno
(glucemia >126 mg/dl) como consecuencia de la baja, absoluta o relativa, eficiencia de
la insulina, asociada con la resistencia a la insulina, este estado metabólico también se
encuentra relacionado al incremento en la producción de radicales libres.
La hiperglucemia es la causa clave en el desarrollo de complicaciones vasculares,
retinopatía, neuropatía, daño al riñón y en diabetes.
Múltiples vías bioquímicas y mecanismos de acción son las fuentes productoras de
especies reactivas de oxígeno, en estás vías se incluyen: la autoxidación de la glucosa,
activación de la proteína cinasa C (PCK), formación y glicación de meti lglioxal,
metabolismo de la hexosamina y formación de sorbitol (Robertson P, 2004).
La activación de la proteína cinasa C está asociada con el incremento de factor de
crecimiento transformante β1 (TGF-β1), factor de crecimiento endotelial, endotelina-1 y
a la sobreproducción de superóxido que induce la síntesis de novo de la enzima
NADPH oxidasa, que a su vez contribuye significativamente a la producción de anión
6
superóxido. En la reacción de glicación, la glucosa reacciona no-enzimáticamente con
las proteínas para formar los productos de glicación temprana, también llamados de
Amadori o fructosamina. Metilglioxal, 3-deoxiglucosona y sorbitol, son dicarbonilos
reactivos que forman productos de glicación avanzada por reaccionar con los grupos
aminos de proteínas intra y extracelulares (Sera B et al., 2001).
Las concentraciones altas de glucosa incrementan el gradiente de protones en la
mitocondria como resultado de la sobreproducción de electrones por el ciclo del ácido
tricarboxílico, lo cual incrementa la producción de anión superóxido en la mitocondria
(Robertson P, 2004).
1.3. Radicales Libres (RL)
En los elementos y en las moléculas, los electrones se encuentran pareados y cada uno
muestra una rotación o espín (giro opuesto) sobre la misma capa orbital del átomo. Los
orbitales son las regiones del espacio que rodean a un núcleo atómico, cada orbital
atómico contiene dos electrones como máximo, los cuales tienen tres números
cuánticos iguales (n, l y m) se diferencian en el cuarto número, que es el espín (s) y
corresponde al valor del giro. Tales valores son de +1/2 ó -1/2, y dos electrones en el
mismo orbital deben presentar giros antiparalelos. De acuerdo con el principio de
exclusión de Pauli, no pueden existir dos electrones con los cuatro números cuánticos
iguales en un mismo átomo, ya que estarían en el mismo lugar en el espacio. Un radical
libre (RL) es una especie química que contiene uno o más electrones no pareados, ya
sea por pérdida o ganancia de uno de ellos (Hicks, 2007), condición que los hace muy
reactivos y que presenten una vida media del orden de milisegundos, aunque varía
según el tipo de radical libre (Simic et al, 1988). La característica física del RL se expresa por
un punto a la derecha del compuesto, como superíndice y puede preceder a una carga
(Hicks, 2007).
En el organismo humano y en condiciones fisiológicas la producción de los RL es
permanente y esta asociada con el metabolismo celular del oxígeno y las reacciones de
oxido-reducción. La producción controlada de RL permite la realización de la
fertilización del óvulo por el espermatozoide y la activación de genes; también participan
en los mecanismos de defensa del organismo durante una infección, favoreciendo lisis
7
bacteriana. Sin embargo, un aumento en la concentración de los radicales libres que no
pueda ser controlado por los mecanismos antioxidantes conducirá a efectos adversos.
El aumento de RL puede ser de origen endógeno o exógeno, dentro de los de origen
endógeno la principal fuente productora de radicales libres es la respiración
mitocondrial, consiste en una serie de acarreadores de electrones; la mayoría se
compone de proteínas integrales de membrana, con diferentes grupos prostéticos
capaces de aceptar o donar uno o dos electrones.
Los tipos de acarreadores de electrones son los siguientes: 1) ubiquinona, que puede
aceptar hasta dos electrones para generar la forma reducida (Dihidro ubiquinona UQH2)
y dos tipos diferentes de ferroproteínas (citocromos y ferrosulfoproteínas). Cada
elemento de esta cadena puede aceptar electrones del acarreador precedente y
transferirlos al siguiente en una secuencia. Se han descrito tres modalidades mediante
las cuales las moléculas son capaces de transferir electrones en los sistemas
biológicos:
1. Transferencia directa de electrones como en la reducción de Fe3+ a Fe2+.
2. Transferencia de electrones como átomos de hidrógeno (constituido por un
protón y un electrón).
3. Transferencia desde un donador de electrones a un aceptor en forma de iones
hidruro, que portan dos electrones.
Además de los acarreadores de electrones mencionados antes, existen los complejos
proteínicos de la cadena respiratoria y se dividen en cuatro:
Complejo I. NADH-ubiquinona-reductasa (cataliza la reducción de ubiquinona a
ubiquinol)
Complejo II. Succinato-ubiquinona-reductasa (reducción de ubiquinona a
ubiquinol, a partir de dos electrones)
Complejo III. Ubiquinol-citocromo c reductasa
Complejo IV. Citocromo c oxidasa
8
En el diagrama 1 se ejemplifican las fuentes de los radicales libres:
Diagrama 1. Fuente de radicales libres de origen endógeno y exógeno.
1.4. Formación de Radicales Libres
Los radicales libres se pueden formar por tres mecanismos:
1. Por rompimiento homolítico: se rompe un enlace covalente de una molécula
estable, de modo que cada fragmento retiene un electrón no pareado (de los dos
que formaban el enlace), proceso que requiere un aporte energético.
X:Y X• + Y•
2. En contraste, en la ruptura heterolítica un fragmento retiene ambos electrones.
X:Y X+ + :Y-
3. Por pérdida o ganancia de electrones.
A + e- A•-
La fisión homolítica y la transferencia de electrones se realizan por uno de los
siguientes mecanismos: a) absorción de energía de diferentes tipos, como las
Fuente de RL
Endógena Exógena
-Contaminación: humo de tabaco,
leña, emisiones de automóviles,
humo de fábricas, etc.
-Radiación ionizante, UV, rayos X,
alfa, beta, gama.
-Fármacos
-Respiración mitocondrial
-Daño renal (hemólisis:liberación del
grupo hemo)
-Enfermedades crónico degenerativas:
-Diabetes (hiperglucemia)
-EPOC (inflamación)
-Asma (inflamación)
-Artritis (inflamación/estallido
respiratorio: leucocitos, neutrófilos)
-Infarto del miocardio (isquemia-
reperfusión)
9
radiaciones ionizantes, ultravioleta, visibles y térmicas; b) reacciones redox, como la
transferencia no enzimática de electrones mediadas por metales de transición y c)
reacciones catalizadas por enzimas, por ejemplo la formación de óxido nítrico por la
óxido nítrico sintasa o del anión superóxido por la NADPH oxidasa (Medina-Navarro et al, 2001).
1.5. Especies reactivas de oxígeno (ERO)
El concepto especies reactivas de oxígeno incluye a radicales libres de este elemento y
a ciertos agentes oxidantes fácilmente convertibles en radicales (por ejemplo, HOCl,
HOBr, O3, ONOO-, H2O2). En otras palabras, todos los radicales libres de oxígeno son
ERO, pero no todas las ERO son radicales libres de oxígeno, sin embargo todas se
forman por la reducción incompleta del oxígeno molecular (Hicks, 2007).
Entre las ERO de interés para la medicina y la biología en general, se encuentran:
a) Oxígeno molecular (O2)
La molécula de oxígeno puede originar cierta confusión por que sus electrones están
distribuidos de tal forma que dos de ellos no están pareados. Por esta razón se
considera un birradical; tal característica no le permite reaccionar tan rápido como otros
radicales. Los dos electrones no pareados del oxígeno presentan giro (espín) paralelo,
por lo que las moléculas o átomos con los que reaccione, deben aportar una a uno los
dos electrones faltantes en los orbitales y ser antiparalelos a los no pareados presentes,
por lo que un sólo átomo no puede proporcionar los dos electrones, pues por definición
tienen que ser antiparalelos entre sí (Hicks, 2007).
..
: O =
..
O:
b) Anión superóxido (O2●-)
El O2●- es el producto de la reducción monovalente del oxígeno molecular, es decir
cuando una molécula de oxígeno acepta un electrón, se convierte en un radical con
carga negativa, conocido como anión superóxido.
El oxígeno utilizado por los organismos aeróbicos se reduce hasta agua mediante el
sistema de transporte de electrones; que incluye al de las coenzimas y al de los
10
citocromos de la cadena respiratoria mitocondrial. A este nivel, el O2●- lo produce el
complejo I (NADH:ubiquinona óxido-reductasa), en la interfase entre la ubiquinona y el
complejo III (ubiquinol:citocromo C óxido-reductasa). Esta producción de O2●- se debe a
la formación del intermediario semiubiquinona, que es un radical libre capaz de reducir
de manera monoelectrónica al O2 (Hicks, 2007).
El O2●- se puede producir durante las reacciones de varias moléculas de manera directa
con el oxígeno, por ejemplo la adrenalina, la dopamina, el tetrahidrofolato, los
citocromos, entre otros (Hicks, 2007). También es producido por las células del sistema
inmune durante la descarga respiratoria de los procesos fagocíticos (neutrófilos,
monocitos, macrófagos, eosinóflos) como parte del mecanismo empleado para destruir
organismos extraños, generalmente bacterias, a través de un complejo enzimático
denominado NADPH oxidasa que cataliza la reducción del oxígeno en anión
superóxido. Ésta es esencial para la destrucción del material fagocitado, aunque en
ocasiones una activación excesiva de los fagocitos puede producir daño tisular, como
en la artritis reumatoide y en la colitis inflamatoria (Cohen et al., 1986).
Se ha estimado que en una célula del cuerpo humano se producen 1 x 1010 moléculas
de O2●- por día y en el organismo completo las concentraciones van de 1 nM a 0.1mM
(Ames et al., 1993).
c) Peróxido de Hidrógeno (H2O2)
El Peróxido de Hidrógeno (H2O2) no es un radical libre como tal, pues no posee
electrones no pareados en su última capa u orbital. Es la forma menos reactiva de las
especies reactivas de oxígeno. Su importancia recae en el hecho de que participa en
numerosas reacciones que dan lugar a la generación de radicales libres. Además,
atraviesa con facilidad las membranas biológicas, con lo que puede dar lugar a
reacciones de oxidación en puntos de la célula más alejados de su lugar de producción.
El peróxido de hidrógeno puede ser formado secundariamente por la dismutación
(proceso de óxido-reducción) del O2●- que es catalizada por la enzima superóxido
dismutasa o ser producto de la reducción bivalente del oxígeno: la adición de un
segundo electrón conduce a la formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno, o
11
también puede formarse en medio acuoso, donde el oxígeno se dismuta de manera
espontánea (Bannister y Rotillo, 1987).
Reacción 1.
2 O2●- + 2 H+ H2O2 + O2
La vida media del H2O2 en los seres vivos depende de las enzimas que lo metabolizan,
como son la catalasa (CAT) o la glutatión peroxidasa (GSH-Px).
El H2O2 puede difundir a través de las membranas celulares al espacio extracelular,
donde existen pocos mecanismos de defensa antioxidante, el H2O2 con un fuerte poder
oxidante, en presencia del ión ferroso (Fe2+), se descompone en el ión OH- y en radical
hidroxilo (HO●) capaz de modificar las estructuras orgánicas más estables.
d) Radical hidroxilo (HO●)
El radical hidroxilo (HO●) es la especie más reactiva derivada de oxígeno y se forma a
partir del peróxido de hidrógeno en presencia de metales de transición (por ejemplo:
hierro o cobre) y es la llamada reacción de Fenton, en donde el peróxido de hidrógeno
se reduce formando radical hidroxi lo y anión hidroxi lo, y el metal correspondiente se
oxida por cesión de un electrón a la especie que se reduce (Haber y Weiss, 1932). Este
proceso puede representarse con la siguiente reacción:
Reacción 2.
H2O2 + Fe+2 HO• + HO- + Fe+3
La reactividad de los radicales HO● tiene una vida media de 10-9 segundos y su radio de
acción es de 3 nm (Hicks, 2007) de modo que reacciona muy cerca de su lugar de
formación con la mayoría de las biomoléculas.
El radical hidroxilo puede formarse in vivo a consecuencia de radiación de alta energía
(rayos X, rayos γ) que puede provocar ruptura homolítica del agua corporal (reacción 3).
La luz UV no tiene suficiente energía como para escindir una molécula de agua, pero
puede dividir el peróxido de hidrógeno en 2 moléculas de radical hidroxilo (reacción 4).
Reacción 3) H2O + radiación HO● + H●
12
Reacción 4) H2O2 + luz UV 2 HO●
Aunque la velocidad de esta reacción es demasiado baja para ser de importancia
fisiológica, los metales de transición como el hierro o el cobre pueden actuar como
catalizadores de la misma, acelerando la velocidad de la reacción (Halliw ell y Gutteridge, 1989).
En la fagocitosis, los neutrófilos al estar en contacto con partículas fagocitables, existe
una estímulación y una aceleración en el consumo de oxígeno, que cataliza la
reducción de éste y la generación de peróxido de hidrógeno que participan en la
producción del radical hidroxilo. Otra manera de producir radicales HO● es la interacción
entre el O2●- y el óxido nítrico (NO●), que es una especie reactiva de óxidos de nitrógeno
y por lo cual produce peroxinitrito (ONOO-), que al hidrolizarse se escinde en dos
moléculas: una de radical hidróxilo y una de bióxido de nitrógeno.
Reacción 5.
O2●- + NO● ONOOH + H+ HO● + NO2
●
e) Singulete de oxígeno (1O2*)
El Singulete de oxigeno se forma cuando uno de los dos electrones libres del O2 capta
energía y modifica su giro y se aparea de inmediato con el otro electrón libre, pero en
diferente orbital. Se forma sobre todo, cuando algunos pigmentos biológicos se iluminan
por excitación electrónica en presencia de oxígeno, por ejemplo en clorofila, retinal,
flavinas, porfirinas y quinonas. El singulete tiene una gran capacidad oxidante frente a
muchas moléculas biológicas, sobre todo lípidos de las membranas. Se forma en
cantidades importantes en tejidos y órganos sometidos a radiaciones ionizantes
terapéuticas (Hicks, 2007).
Entre los daños a macromoléculas que puede ejercer el 1O2*, está el daño al ADN,
debido a la oxidación de residuos guanina a 7-hidro-8-oxo desoxiguanosina (8 oxo-Gu).
Este nucleótido induce la mutación de G:C a T:A, provocando así mutaciones que
pueden llevar a la muerte celular (Ríos, 2003).
f) Ozono (O3)
La luz ultravioleta y las descargas eléctricas rompen los dos enlaces covalentes en la
molécula del O2 produciendo oxígeno atómico (O), el cual se combina de inmediato con
13
el O2 para generar el ozono (O3), gas que en la estratósfera evita que la luz ultravioleta
llegue a la superficie terrestre, e impide el daño a los organismos por este tipo de
radiación. Sin embargo, el O3 también se puede generar a nivel de la superficie terrestre
por efecto de la luz sobre el dióxido de nitrógeno (NO2), este se descompone en NO y
O; y este último reacciona con el O2 para formar el O3, que a su vez puede
interaccionar con biomoléculas, como los lípidos y las proteínas, e incluso generar otras
especies reactivas (Hicks, 2007).
g) Radicales alcoxilo (RO●) y peroxilo (ROO●)
Estos radicales pueden generarse por la acción de un radical libre de oxígeno (O2●-,
OH●) sobre las cadenas de los ácidos grasos poliinsaturados. Los radicales peroxi son
conocidos por ser menos reactivos y más selectivos que los radicales OH●. Tienen una
vida media relativamente larga (segundos), e llos son el origen de las reacciones en
cadena ya que constituyen el proceso de la base de la lipoperoxidación (LPx) de las
membranas celulares (Punchard and Kelly, 1996).
h) Óxido nítrico (NO●)
El óxido nítrico pertenece al grupo de especies reactivas de óxidos de nitrógeno es un
gas lipofílico e hidrosoluble, cuya vida media es relativamente larga (3-5 segundos) en
comparación a otras ERO. Su formación tiene lugar por una reacción enzimática, en la
que la enzima óxido nítrico sintasa cataliza la conversión de L-arginina a L-citrulina
dando como producto NO● en numerosos tipos celulares (Moncada et al, 1991; Bush et al, 1992).
Dicha enzima presenta tres isoformas: La neuronal nNOS (tipo I) y la endotelial eNOS
(tipo III) se expresan constitutivamente y su actividad esta regulada por la concentración
intracelular de calcio (Bredt et al., 1991; Lamas et al., 1992). La inducible iNOS (tipo II) la expresan
los macrófagos y otros tipos celulares cuando son estimulados por citocinas,
lipopolisacáridos u otras sustancias inmunológicas, siendo su expresión regulada tanto
a nivel transcripcional como postranscripcional, en lo cual participan factores de
transcripción sensibles al estado redox como el factor nuclear κB (NF- κB) o las proteín-
cinasas activadas por mitogeno (MAPK-cinasas) (Winther et al., 2005).
El óxido nítrico juega un papel fundamental en numerosos procesos fisiológicos, entre
ellos, actúa como regulador del flujo sanguíneo local, inhibidor de la agregación
plaquetaria, se produce por los macrófagos activados contribuyendo a la defensa
14
inmunitaria primaria y también actúa como neurotransmisor, siendo el cerebro el órgano
con mayor actividad óxido nítrico sintasa (Moncada et al., 1986; Czapski y Goldstein, 1995).
Otro efecto del NO• es su capacidad de reacción con el hierro de hemo-proteínas
intracelulares, tales como hemoglobina, mioglobina y proteínas mitocondriales. Puede
reaccionar con ácidos nucleicos dando lugar a mutaciones y roturas del DNA, también
puede producir necrosis, entre otros fenómenos. Sin embargo, cuando las
concentraciones de NO• aumentan, este tiene efectos indirectos, a través de los
metabolitos derivados de él, pudiendo reaccionar con el oxígeno o el radical superóxido,
lo cual ocurre en situaciones de inflamación. Así pues, un exceso de óxido nítrico es
citotóxico. Parte de su citotoxicidad se cree que es debida al O2•-, con el que reacciona
para dar lugar a anión peroxinitrito (ONOO-).
i) Peroxinitrito (ONOO-)
El peroxinitrito no es un radical, pero sí un intermediario oxidante que puede protonarse
y descomponerse con facilidad de modo que es altamente reactivo (Janssen et al., 1993; Lipton et
al., 1993) y es formado de la siguiente forma:
Reacción 6.
O2•- + NO• ONOO-
El peroxinitrito está en equilibrio con su ácido conjugado (ONOOH). En soluciones
neutras es un potente agente oxidante, capaz de oxidar grupos tioles, de nitrar residuos
de tirosina (Goldstein et al., 2000), de nitrar y oxidar guanosina, de degradar carbohidratos, de
iniciar peroxidación lipídica y de fragmentar ADN. Los residuos de tirosina son oxidados
por los radicales derivados del peroxinitrito formando el radical tirosilo, que a su vez
reacciona con el NO• para formar 3-nitrotirosina (Beckman et al., 1994; 1996).
1.6. Estrés Oxidativo (EO)
La formación de Especies Reactivas de Oxígeno es un proceso normal e inevitable, ya
que son producto de reacciones químicas imprescindibles para la vida celular (Slater, 1984).
Estas especies reactivas no causan daño oxidativo en condiciones no fisiopatológicas
debido a que la célula está provista de mecanismos antioxidantes (enzimáticos por
ejemplo: glutatión peroxidasa (GSH-Px), catalasa (CAT), paraoxonasa y no enzimáticos
15
como el: ácido úrico, vitamina C, E, entre otros). Un antioxidante es una sustancia que
incluso en concentraciones muy pequeñas, comparados con las de un sustrato
oxidable, disminuye o evita la oxidación del sustrato sin que el antioxidante quede
inestable y por lo tanto no es reactivo, este puede considerarse un donador de
electrones capaz de evitar una reacción en cadena de oxidoreducción. Cuando los
sistemas productores de ERO sobrepasan la capacidad neutralizante de los sistemas
antioxidantes del organismo, debido a una disminución de la capacidad antioxidante
(enzimática y no enzimática) o a un incremento en la producción de radicales
(patologías diversas, exposición a radiaciones ionizantes, radiación UV, entre otros) se
establece el estado de desequilibrio denominado Estrés Oxidativo (EO), estado
metabólico que se vincula con diversas enfermedades como aterosclerosis, artritis
reumatoide, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, cáncer, entre otras. En
estas condiciones las ERO y las especies reactivas de óxido de nitrógeno (ERON)
pueden reaccionar con diversas biomoléculas, como son los ácidos nucleicos, los
lípidos y las proteínas, alterándolas en su estructura química y función (Hicks, 2007).
1.7. Daño a biomoléculas por Estrés Oxidativo (EO)
1.7.1. Daño a ácidos nucleicos
En las células eucariontes las moléculas con menor frecuencia de alteración inducida
por el EO, son los ácidos nucleicos, debido a su localización celular (núcleo) y a que
están protegidos por las moléculas que los rodean al producir su empaquetamiento
(cromosomas); pero cuando las ERO interactúan con los ácidos nucleicos se producen
hidroxilaciones de las bases nitrogenadas, el entrecruzamiento y la escisión de las
cadenas de DNA, lo que causa daños irreversibles como mutaciones e inhibición de la
síntesis de proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos (Alberts B et al., 1989).
El radical hidroxilo interacciona tanto con las bases púricas y pirimídicas, como con la
desoxirribosa, y es capaz de generar rupturas del DNA y mutaciones. Normalmente, los
productos del daño a DNA son eliminados por enzimas de reparación y excretados por
orina, como base libres o derivados de nucleósidos (glucotimidina y 8-
hidroxidesoxiguanosina).
La desnaturalización del ADN puede tener consecuencias sobre la replicación del
mensaje genético, así como en la síntesis de proteínas. Los productos de
16
lipoperoxidación también forman aductos con el DNA, mostrando acción genotóxica y
mutagénica. El más genotóxico es el 4-hidroxinonenal, mientras que el más
mutagénetico es el malondialdehído (Droge W, 2002).
1.7.2. Daño a carbohidratos
La oxidación de los carbohidratos al reaccionar con el radical hidroxilo propicia la
formación de enedioles, los cuales en presencia de metales de transición generan
especies reactivas, como el anión superóxido, el radical hidroxilo y el peróxido de
hidrógeno (Hicks, 2002). Este proceso se da, por ejemplo, en la Diabetes Mellitus, donde,
por la hiperglucemia sostenida se forman productos de glicación avanzada entre el
grupo aldehído de la glucosa y un amino de la proteína de acuerdo a la reacción de
Maillard (Miyata, 2002).
1.7.3. Daño a lípidos
Los Lípidos representan al grupo más susceptible a reaccionar con los RL debido a la
presencia de dobles enlaces en los ácidos grasos insaturados, evento denominado
lipoperoxidación (LPx). Los radicales libres que pueden iniciar esta reacción son los
radicales hidroxilo (HO●), el peroxilo (ROO●), el alcoxilo (RO•) y el alquílico (R•).
La lipoperoxidación comienza (iniciación) con el ataque de un radical libre a alguno de
los carbonos vecinos a los dobles enlaces de los ácidos grasos no saturados debido a
que la unión carbono-hidrógeno se debilita por la presencia de un doble enlace
carbono-carbono. (Figura 3). El radical (ejemplo HO●) sustrae un átomo de hidrógeno
((H•, protón y electrón) que constituía un enlace covalente (C ••H) en la cadena del ácido
graso) para su transformación en agua (), dejando el carbono con un solo electrón
dando lugar a un radical lípidico ().
Reacción 7.
Lípido-H + HO● Lípido• + H2O
A continuación se presenta un rearreglo interno que resulta en que el carbón vecino
queda con un electrón no pareado (C•) (). El átomo de carbono transformado en un
radical dentro del ácido graso, tiende a estabilizarse mediante un rearreglo molecular
para producir un dieno conjugado (dobles enlaces en arreglo secuencial) (). El radical
17
formado en la cadena del ácido graso, reacciona rápidamente con el O2 para dar origen
a un radical peroxilo (ROO●) ().
Reacción 8.
Lípido• + O2 Lípido_O2•
Radical ROO●
Propagación: Tanto los radicales peroxilo como los alcoxilos estimulan la reacción en
cadena al sustraer átomos de hidrógeno de otros lípidos con una cadena insaturada
intacta, por la adición de un hidrógeno al peroxilo se forma un hidroperóxido ().
Reacción 9.
Lípido_O2•+ Lípido Lípido_O_OH + Lípido•
Hidroperóxido
Los hidroperóxidos lipídicos son moléculas reactivas, que pueden finalmente
(terminación) formar una gran variedad de productos de lipoperoxidación como son:
alcanos, aldehídos como el Malondialdehído (MDA) y este a su vez reaccionar con los
grupos Thiol (SH) o aminos (NH2) de las proteínas. Por otro lado los peroxilo en
presencia de hierro reducido (Fe2+) originan radicales alcoxilo (Lípido_O•) (Negre et al., 2007).
Reacción 10.
Lípido_O_OH + Fe2+ Fe3+ + OH- + Lípido-O•
Radical alcoxilo
También es posible la reacción de los radicales peroxilo con los compuestos de fierro III.
Reacción 11.
Lípido-OO • + Fe3+ Lípido_O2- + Fe2+
El RL iniciador produce sólo efectos locales y limitados, el radical secundario ocasiona
la formación de los RL con efectos amplificados a distancia del sitio donde se formó el
primer RL (Luczaj y Skrzydlewska, 2003).
La oxidación de ácidos grasos poliinsaturados genera α, β- hidroxialquenales
insaturados altamente reactivos tales como 4-Hidroxinonenal (4-HNE) y 4-
Hidroxihexenal (4-HHE). La oxidación de ácidos grasos n-6 (ácido linoléico y ácido
18
araquidónico o sus hidroperóxidos en concentraciones de 1 M a 5 mM (Van Kuijk et al; 1990,
Esterbauer et al, 1991)) conduce a la formación del producto de lipoperoxidación 4-HNE,
mientras la oxidación de ácidos grasos n-3 (ácido docosahexaenoico, ácido
eicosapentaenoico y ácido linolénico (Van Kuijk et al; 1990)) genera 4-HHE. Los indicadores de
daño oxidativo a lípidos más empleados son el malondialdehído y el 4-hidroxinonenal.
1.7.4. Daño a proteínas
La oxidación de proteínas es definida como la modificación covalente de las proteínas
inducida directamente por ERO o indirectamente por reacción con bioproductos del
estrés oxidativo.
Todas las cadenas laterales de los aminoácidos que constituyen a las proteínas son
sensibles al estrés oxidativo. La lisina, prolina y arginina, se oxidan de forma directa por
los radicales libres (HO●) dando lugar a grupos carbonilo.
Otros aminoácidos como histidina, cisteína y metionina, presentan daño oxidativo de
manera indirecta por los productos generados durante la lipoperoxidación
(malondialdehído, 4-hidroxinonenal, entre otros), pero no forman derivados de tipo
carbonilo (Stadtman et al., 1992). El aminoácido fenilalanina puede formar orto-tirosinas, meta-
tirosinas o para-tirosinas (Pennathur et al., 2001) en presencia de los RL (HO●), las tirosinas al
hidroxilarse por los RL dan lugar a 3,4-dihidroxifenilalaninas que en presencia de
metales de transición forman ortoquinonas. Con la unión de dos radicales tirosilo se
producen las ditirosinas.
En consecuencia, la exposición de las proteínas a los radicales libres conduce a
modificaciones de la estructura primaria y secundaria y como consecuencia la terciaria
que, a su vez, puede da lugar a una pérdida de la función. Este daño es irreversible (Dean
et al., 1993). Algunos ejemplos son: en la albúmina sérica bovina se oxidan los residuos del
triptofano y de la cisteina con lo cual pierde su capacidad antioxidante (Silver et al., 1998).
Otro ejemplo es la gonadotropina equina que in vitro, tanto su estructura como su
19
función es alterada, esta alteración se manifiesta como una pérdida en su capacidad
para inducir la ovulación (Ortega-Camarillo et al., 1999).
La LDL también es afectada tanto en su parte proteica como lipídica y en esta condición
(LDL-oxidada) participa en la formación de la placa de ateroma. Recientemente se ha
descrito que la insulina pierde función por la oxidación de fenilalaninas y tirosinas (Olivares
et al., 2005 a, b).
Las proteínas dañadas por las ERO no deben ser consideradas como productos finales,
ya que estas son capaces de dañar otras biomoléculas, como fue demostrado al
exponer el ácido linoleico y un tripéptido (Glu-Ala-Tir) al radical-albúmina-sérica bovina,
dando como resultado la formación de dienos conjugados y ditirosinas respectivamente
(Ostad, 2002).
Las proteínas además de verse afectadas por los radicales libres, también resultan
sensibles al reaccionar con productos de lipoperoxidación tales como el
malondialdehído (MDA), el 4-hidroxinonenal (4-HNE) y la acroleina, entre otros. Estos
productos finales pueden reaccionar con los grupos amino libres y grupos sulfhidrilos de
las proteínas y formar aductos (unión del grupo aldehído de los productos de Lpx y el
grupo amino libre o sulfhidrilo de las proteínas), la cual es otra forma de alterar una
proteína por estrés oxidativo (Moncada, 2003). Por ejemplo, el 4-HNE presenta gran afinidad
por los residuos cisteina, lisina e histidina originando un aducto estable de Michael con
una estructura hemiacetal (Schaur, 2003, Peterson and Doorn, 2004, Esterbauer, 1991, Uchida et al, 2003) y
forma un pirrol, lo cual ha sido determinado en dos tipos de Albúmina Sérica Bovina (α y
.globulinas) (Hidalgo F; et al, 1998) ץ
La concentración fisiológica en el organismo humano del producto 4-HNE es <1 M. Se
ha demostrado que modifica la Apo lipoproteína B de la LDL, al reaccionar con los
residuos de lisina y en menor grado a histidinas y cisteinas (Jürguens et al; 1986).
La formación de aductos inducen disfunciones en las proteínas y alteran la respuesta
celular (Zarcovic, 2003; Peterson and Doorn, 2004). Se ha visto que el 4-HNE puede contribuir a los
mecanismos de obesidad y resistencia a la insulina, modificando proteínas reguladoras
del adipocito (Grimsrud et al, 2007). En la enfermedad de Parkinson el 4-HNE participa en la
disfunción mitocondrial y degeneración de las células dopaminérgicas (Jenner, 2003) y
puede reaccionar con las proteínas neuronales de la sustancia nigra (Yoritaka et al, 1996).
20
La presencia de aductos 4-HNE y MDA en pacientes dializados es considerado como
un factor de riesgo adicional para complicaciones cardiovasculares (Carluccio et al, 2002). Se
ha descrito que estos aductos, son detectados en cartílago sinovial de pacientes
osteoartríticos (Shah et al, 2005), en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, en la
aterosclerosis (kaur et al., 1997), en desórdenes neurodegenerativos (Negre S; et al, 2007), en el
alzheimer (Sayre et al., 1997), en el parkinson(Castellani et al., 1996) , en el cáncer (Halliw ell et al, 2004), en
daño retinal (Romero F; et al, 1998), diabetes (Odani et al, 1996, Portero-Otin et al, 1995) entre otras.
Cuando existe un incremento de los aductos formados con MDA y 4-HNE se presenta
una relación inversa con respecto a las concentraciones de antioxidantes como el
glutatión, la vitamina E y C; es decir se encuentra un imbalance entre las enzimas
antioxidantes y los productos de lipoperoxidación que pueden generar aductos (Loguercio
and Federico, 2003).
En relación con el producto Malondialdehído (MDA) es el mayor compuesto carbonílico
genotóxico, generado por la lipoperoxidación de los ácidos grasos poliinsaturados y es
también un subproducto del metabolismo del ácido araquidónico en la síntesis de
prostaglandinas, del ácido eicosapentaenoico y del ácido docosahexaenoico (Esterbauer et
al, 1991). Se ha mostrado que es cancerígeno en roedores y mutagénico en bacterias y en
células mamarias. El MDA reacciona con el grupo amino de la lisina y produce
dihidropiridinas (Kikugaw a and Ido, 1984), también forma base de Schiff que modifican las
lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Esterbauer et al, 1993).
2. Antecedentes
La Diabetes mellitus es una enfermedad que cursa con el estado metabólico de estrés
oxidativo, condición que puede afectar a las biomoléculas, entre ellas las proteínas. Los
aminoácidos que forman las proteínas pueden ser modificados por el estrés Oxidativo
(EO), ya sea directamente por los radicales libres o indirectamente al reaccionar con
aldehídos alifáticos producidos durante la lipoperoxidación. Como consecuencia de
estas condiciones, las proteínas pueden alterar su función.
Con base en lo anterior, Olivares y colaboradores en el año 2005 propusieron que el EO
presente en los pacientes con Diabetes Mellitus tipo 2 puede oxidar a la hormona
proteica insulina. Mediante un modelo in vitro expusieron insulina humana recombinante
a los radicales libres HO• formados mediante la reacción de Fenton con H2O2 y CuSO4,
resultando en la proteína la hidroxilación de fenilalaninas formando tirosinas y a partir
21
de estas y de las otras cuatro ya existentes en la insulina, se dió lugar a la formación de
catecoles y ortoquinonas, presentándose un incremento en la exposición y formación de
grupos carbonilos libres por la modificación de la estructura primaria y secundaria de la
proteína, con lo que se concluyó que el radical hidroxilo in vitro, es capaz de inducir
modificaciones moleculares en la hormona (Olivares 2005a), condición que llevó a la
pérdida de un 40% de la actividad biológica de la hormona, lo cual fue demostrado en
un sistema de radiorespirometría, utilizando tejido dependiente de insulina y glucosa
marcada con 14C (Olivares 2005b).
3. Planteamiento del trabajo
En este trabajo se plantea la posibilidad de que la insulina no sólo sea modificada en su
función por la interacción directa con los RL, también podría ser modificada mediante la
formación de aductos con los productos de lipoperoxidación como el malondialdehído
(MDA), debido a que algunos de sus aminoácidos (1 lisina y los 2 aminos terminales de
las dos cadenas peptídicas) son susceptibles a ser modificados químicamente por este
producto de lipoperoxidación.
Por lo que nuestra pregunta a responder es:
¿La exposición de la insulina a productos de lipoperoxidación in vitro, conduce a
cambios químicos y funcionales de la hormona?
4. Justificación
En la Diabetes Mellitus coexisten la formación de RL y de productos de
lipoperoxidación, por lo tanto es posible que la insulina no sólo sea modificada por la
interacción con los RL como ya se ha demostrado (Olivares 2005a), también podría ser
modificada al formar aductos con los aldehídos alifáticos producidos por el evento de
lipoperoxidación.
Esto sería una evidencia más de que el estrés oxidativo debe ser controlado en los
pacientes con resistencia a la insulina, Diabetes y síndrome metabólico entre otros, con
la finalidad de que la insulina que están sintetizando funcione eficientemente.
22
5. Hipótesis
La formación de aductos entre la insulina recombinante humana y aldehídos alifáticos
productos de lipoperoxidación, modifica su estructura química y por lo tanto disminuye
su función.
6. Objetivo general
Determinar in vitro, el efecto de los aldehídos alifáticos productos de lipoperoxidación
sobre la insulina humana recombinante.
6.1. Objetivos particulares
-Determinar, in vitro, la formación de aductos entre la hormona insulina y el producto de
lipoperoxidación, malondialdehído.
-Determinar en rata, el efecto hipoglucemiante del aducto insulina-MDA.
7. Material y Métodos
7.1. Reactivos
La insulina (Origen ADN recombinante, (Humulin*R. Lilly)) fue obtenida de los
laboratorios Lilly Lab. México. Carbonato de sodio (Na2CO3), tartrato de sodio, hidróxido
de sodio (NaOH), sulfato de cobre (CuSO4), folín-Ciocalteu, albúmina bovina, 1,1,3,3-
tetrametoxipropano (Malondialdehído bis (dimetilacetal)), ácido sulfúrico (H2SO4), ácido