Dirección: Dirección: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293 Contacto: Contacto: [email protected]Tesis Doctoral Diversidad genética y estructura Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz poblacional en razas nativas de maíz (Zea mays ssp. mays) del Noroeste (Zea mays ssp. mays) del Noroeste Argentino: presente y pasado del Argentino: presente y pasado del germoplasma autóctono germoplasma autóctono Lia, Verónica V. 2004 Tesis presentada para obtener el grado de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas de la Universidad de Buenos Aires Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the Master's and Doctoral Theses Collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Lia, Verónica V.. (2004). Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz (Zea mays ssp. mays) del Noroeste Argentino: presente y pasado del germoplasma autóctono. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3766_Lia Cita tipo Chicago: Lia, Verónica V.. "Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz (Zea mays ssp. mays) del Noroeste Argentino: presente y pasado del germoplasma autóctono". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2004. http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3766_Lia
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Diversidad genética y estructura poblacional en razas ... · Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz (Zea mays ssp. mays) del Noroeste Argentino:
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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Diversidad genética y estructuraDiversidad genética y estructurapoblacional en razas nativas de maízpoblacional en razas nativas de maíz
(Zea mays ssp. mays) del Noroeste(Zea mays ssp. mays) del NoroesteArgentino: presente y pasado delArgentino: presente y pasado del
germoplasma autóctonogermoplasma autóctono
Lia, Verónica V.
2004
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor de laUniversidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas de la
Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the Master's and Doctoral Theses Collection of the Central LibraryDr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied bythe corresponding citation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
Lia, Verónica V.. (2004). Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz(Zea mays ssp. mays) del Noroeste Argentino: presente y pasado del germoplasma autóctono.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3766_LiaCita tipo Chicago:
Lia, Verónica V.. "Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz (Zeamays ssp. mays) del Noroeste Argentino: presente y pasado del germoplasma autóctono". Tesisde Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2004.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3766_Lia
l3.3.1. Cromosomas supemumerarios 13l3.3.2. Heterocromatina 14I3.3.2. Cromosomas supemumerarios, heterocromatina. contenido de ADNy van'ablesambientales 1l4. RAZAS NATIVAs DE MAiz DEL NOROESTE ARGENTINO 17I4.1. GENERALIDADES 17l4.2. DIVERSIDADMORFOLÓGICA 17I4.3. DIVERSIDADGENETICA 18l4_4. VARIABILIDADCROMOSOMICA 19
l4.4.1. Cromosomas supemumerarios 19l4.4.2. Contenido de ADNy heterocromatina 19l4.4.3. Cromosomas supemumerarios, heterocromatina y variables ambientales 20l5. OBJETIVOS 21
MATERIALES Y MÉTODOS
M1. MUESTRAS 23M1.1. EJEMPLARES ACTUALES 23M1.1.1. Razas nativas 23M1.1.2. Líneas 23M12. EJEMPLARESAROUEOLOGICOS 25M2. ANALISIS DE LA VARIABILIDADDE LOCI MICROSATELnES 29M2.1. MÉTODOS EXPERIMENTALES 30
M2.1.1. Ejemplares actuales 30M2.1.1.1. Selección de loci 30M2.1.1.2. Extracción de ADNgenómico total 30M2.1.1.3. Cuantificación de ADN 30M2.1.1.4. Amplificación por PCR 33M2.1.1.5. Visualización de los productos de amplificación 33M2.1.1.5.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida 34M2.1.1.5.2. Tinción con Nitrato de Plata 34M2.1.1.6. Secuenciación de variantes alélicas 34M2.1.2. Ejemplares arqueológicos 35M2.1.2.1. Selección de loci 35M2.1.2.2. Extracción de ADN genómico total 36M2.1.2.3. Amplificación por PCR 37
M2.1.2.4. Visualización de los productos de amplificación 38M2.1.2.5. Purificación, clonado y secuenciación de fragmentos 38M22. ANALISIS DE DATOS DE SECUENCIA 39
M2.2.1. Edición y Alineamiento 39M2.2.2. Búsqueda en bases de datos 39M23. ANALISIS DE LADIVERSIDADY ESTRUCTURA POBLACIONAL 40M2.3.1. Modelos de evolución de Iocimicrosatélites 40M2.3.2. Cálculo de frecuencias alélicas 41M2.3.3. Índices de diversidad genética 41M2.3.4. Equilibriode Hardy-Weinberg 42M2.3.5. Estmctura poblacional 43M2.3.5.1 Prueba de pennutación de tamaños alélicos 44M2.4. ANALISIS DE LAS RELACIONES INTRAE INTERREGIONALES 45
M2.4.1. Análisis de agmpamiento entre poblaciones del NOA 45M2.4.2. Análisis de agrupamiento entre poblaciones del NOAy razas de América 46M2.4.2.1. Método fenético 46M2.4.2.2. Método Bayesiano para la inferencia de estructura poblacional 46M2.5. ANALISIS DE LAASOCIACIÓN ENTRE VARIABLESGENÉTICAS, CITOGENÉTICAS Y ALTITUD48
M2.5.1. Relación entre frecuencias génicas y número de cromosomas B 48M2.5.2. Correlación entre distancias geográficas, altitudinales e índices dediferenciación 48
R.1.1.1. Diversidad y riqueza alélica 50R.1.1.2. Secuencia nucleotidica de los alelos microsatélites 59R1.2. RAZAS NATIVASARQUEOLOGICAS 67R1.2.1. Locus Phi127 72R1.2.2. Locus Phi029 75R1.2.3. Locus Phi059 77R1.2.4. Afinidades entre ejemplares arqueológicos y razas actuales 77R2. ESTRUCTURA POBLACIONAL 78R2.1. EQUILIBRIODE HARDY-WEINBERG 78R2.2. DIFERENCIACIÓNGENETICA 80R3. RELACIONES INTRAE INTER REGIONALES 84R3.1. EL NOROESTE ARGENTINO 84R32. EL NOROESTE ARGENTINO Y SU INSERCIÓN EN EL CONTINENTEAMERICANO 84R3.2.1. Reconstrucción en base a métodos fenéticos 86R3.2.2. Reconstrucción en base al método bayesiano 92R4. ASOCIACIÓN ENTRE VARIABLES GENÉI’ICAS, CITOGENÉTICAS Y ALTITUD 98R4.1. CORRELACIÓN ENTRE FRECUENCIAS ALÉLICAS Y NÚMERO MEDIO DE BS POR INDIVIDUO
R42. DIFERENCIACION GENETICA Y GRADIENTES ALTITUDINALES 98
DISCUSIÓN
D1. DIVERSIDAD GENETICA EN LAs RAZAS DE MAÍZDEL NOA: IMPLICANCIASPARA LACONSERVACION DE GERMOPLASMA 102
D2. MICROSATÉU'I’ES Y ESTUDIOS EVOLUTIVOS 107Da. DISTRIBUCIÓN DE LA VARIABILIDADGENÉTICA 1 1303.1. ESTRUCTURA GENETICA INTRAPOBLACIONAL 1 1303.2. DIFERENCIACIÓNGENETICAENTRE POBLACIONES 115D4. LAS RAZAS DEL NOA Y su RELACIÓNCON LOS COMPLEJOS RACIALES DE AMERICA 1 18DS. ADN ANTIGUO: UNA HERRAMIENTA PARA EL SEGUIMIENTOTEMPORAL DE Los PATRONESDE VARIACIONGENETICA 122D5.1. CRITERIOS DE AUTENTICIDAD 12405.2. CONSERVACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOSEN EJEMPLARES AROUEOLOGICOS DEL NOA 12505.3. INFERENCIASPOBLACIONALES 128DS. CROMOSOMAS SUPERNUMERARIOS Y GRADIENTES ALTITUDINALES 1 30
CONCLUSIONES 1:5
BIBLIOGRAFÍA 137
APÉNDICE
PROTOCOLOS DE EXTRACCIONDE ADN 151
DELLAPORTAY COL. (1983) MODIFICADO 151YANG Y COL. (1998) MODIFICADO 151SOLUCIONES 152ELECTROFORESIS DE GELES DE AGAROSA 152ELECTROFORESIS DE GELES DE POLIACRILAMIDA 152SECUENCIACIÓN 153PROTOCOLO DE PRECIPITACIÓN CON ISOPROPANOL 153FRECUENCIAS ALELICAS 1 55DIVERSIDADGENETICA 171
CONTRASTES DE STUDENT-NEWMAN-KEULS(ZAR 1984) 171ANALISIS DE EJEMPLARES AROUEOLOGICOS 171
INTRODUCCIÓN
Raza Blanco
Introducción
El maiz, Zea mays ssp. mays. es uno de los cultivos más importantes de América y
ha estado vinculado con la actividad humana desde los inicios de la agricultura. Las razas
nativas presentan una gran diversidad morfológica, bioquímica y citogenética,
extendiéndose a lo largo de todo el continente a través de una amplia gama de climas y
ambientes. En Ia República Argentina, la incorporación del cultivo en las sociedades del
pasado se remonta a tiempos muy anteriores a la conquista y sus usos originarios han
quedado plasmados en las costumbres actuales de los habitantes del Noroeste y Noreste
del país. A pesar de su valor histórico. cultural y agronómico, la caracterización genética de
estos recursos es casi inexistente. El presente trabajo propone hacer un relevamiento de
la variabilidadgenética oontenida en ejemplares actuales y arqueológicos de razas nativas
del Noroeste argentino a fin de establecer su relación con los complejos raciales del
continente americano y determinar la influencia de procesos históricos y selectivos en los
patrones de distribución morfológicosy citogenéticos previamente documentados.
I1. EL GÉNERO ZEA (GRAMINEAE)
El género Zea L. comprende un conjunto de gramíneas anuales y perennes
originarias de México y América Central. La clasificación propuesta por lltis & Doebley
(1980), Doebley (1990b) y lltis & Benz (2000), divide al género en las siguientes
secciones, especies, subespecies y razas:
Sección Luxuriantes
Zea diploperennis lltis. Dobley & Guzmán
Zea perennis (Hitchc.) Reeves &Mangelsdorf
Zea quun'ans (Durieu 8.Ascherson) Bird
Zea nícaraguensis lltis& Benz
Sección Zea
Zea mays L.
subsp. mexicana (Schrader) ltlisRaza Chalco
Raza Central Plateau
Raza Nobogame
subsp. parw'glumis lltis 8. Doebley
subsp. huehuetenangensis (lltis&Doebley) Doebley
subsp. mays lltis & Doebley
La característica morfológicaque distingue al maiz, no sólo de sus congéneres, sino
también de todo el resto de las gramineas. es la presencia de una mazorca polistica, con
numerosos granos de gran tamaño incapaces de desarticularse sin la intervención del
hombre, lo cual le impide desarrollarse en estado silvestre. Las restantes especies y
subespecies del género, también conocidas bajo el nombre de teosintes, poseen, en
cambio, una espiga pequeña, dística, y con pocos granos que logran desarticularse
fácilmente (DOEBLEY& ILTIS1980).
La distribución del maiz abarca toda Ia extensión del continente americano, ya sea
a través de sus formas autóctonas o por intermedio de las variedades comerciales,
extendiéndose además al resto del mundo, en donde fue introducidotras el descubrimiento
de Améri a fines del siglo XV.La distribuciónde los teosintes es, por el contrario, mucho
más restringida, limitándose sólo a ciertas zonas de México, Honduras, Guatemala y
Nicaragua (DOEBLEY& ILTIS1980; ILTIS8. DOEBLEY1980; |LTIS& BENZ 2000).
Dentro de la Sección Luxuriantes,dos de sus especies son anuales, Zea quurians y
Zea nicaraguensis, y dos perennes, Zea diploperennis y Zea perennis, en tanto que en la
Sección Zea todas las subespecies y sus razas son anuales (DOEBLEY& ILTIS1980; ILTIS&
BENZ2000).
El número cromosómico de la mayoría de las especies que integran el género Zea
es 2n=20, siendo las únicas excepciones Zea perennis, con 2n=40, y Zea nicaraguensis,
cuyo 2n no ha sido aún determinado. El nivel de plodía de Zea mays ssp. mays ha sido
objeto de discusión desde los primeros estudios cromosómicos realizados en este cultivo.
En la actualidad, las evidencias citogenéticas y moleculares coinciden en sugerir que tanto
el maíz como las restantes especies del género, serían alopoliploides crípticos de origen
antiguo, con un número básico de x=5 (MOLINA& NARANJO1987; NARANJOet al. 1990;
POGGIO et al. 1990; NARANJO et al. 1994; MOORE et al. 1995; GAUT & DOEBLEY 1997;
GONZALEZ2004).
En las plantas, la abundancia y el comportamiento meiótico de los híbridos
interespecificos proveen una medida de las diferencias génicas y estructurales entre los
genomas de las especies involucradas, y, consecuentemente, de las relaciones evolutivas
entre ellas. Dentro de la sección Zea, la hibridación interespecifica es un fenómeno
frecuente entre Zea mays ssp. mays y Zea mays ssp. mexicana, como asi también entre
Zea mays ssp. mays y Zea mays ssp. huehuetenangensis; mientras que, por el contrario,
los híbridos entre Zea mays ssp. mays y Zea mays ssp. parviglumis son prácticamente
inexistentes en la naturaleza (DOEBLEYet al. 1987a). Desde el punto de vista citogenético,
los tres tipos de híbridos muestran meiosis regular y niveles normales de fertilidad del
2
Introducción
polen (DOEBLEY& ILTIS 1980; ILTIS8. DOEBLEY1980). Si bien estos resultados parecen
indicar muy bajos niveles de diferenciación genómica entre las subespecies, estudios
recientes de citogenética molecular han demostrado que el grado de homología entre los
genomas correspondientes a las subespecies de la sección Zea es menor a lo inicialmente
supuesto (GONZALEZ2004). El análisis de las afinidades genómicas mediante hibridación in
situ (GISH - del inglés Genomíc in situ hybn'dízation)mostró que a pesar de que Zea mays
ssp. mays posee mucha mayor homología con Zea mays ssp. mexicana y Zea mays ssp.
parviglumisque con Zea mays ssp. huehuetenangensis, las divergencias genómicas entre
maíz y las dos primeras son de magnitud apreciable (GONZALEZ2004; GONZALEZet al.
2004; POGGIOet al. 2004).
En la sección Luxuriantes, todos los híbridos interespecíficos analizados -Zea
luxun'ans x Zea diploperennis . Zea perennis x Zea diploperennis, Zea luxun'ans x Zea
Los procesos de domesticación pueden producirse a partir de un único evento. o por
el contrario, ser de eventos múltiples, repetidos tanto en el tiempo como en el espacio. En
este sentido, la gran diversidad del maiz a nivel morfológico y molecular ha resultado dificil
de conciliar con la pérdida de variabilidad asociada a los cuellos de botella por los que
3
generalmente atraviesan las plantas domesticadas, llevando al surgimiento de hipótesis
contrapuestas en cuanto al número de eventos de domesticación involucrados en el on'gendel cultivo.
Diversos argumentos han sido presentados en favor de la teoría del evento único
(DOEBLEYet al. 1986b; DOEBLEY1990b; MATSUOKAet al. 2002b). Según Doebley, Goodman
8. Stuber (1986b), los altos niveles de variabilidad observados podrían ser explicados através de un incremento en la tasa de evolución del maíz como consecuencia de la
intervención del hombre y de la selección artificial. Asimismo, la introgresión de variantes
alélicas provenientes de teosintes ha sido otra de las justificaciones esgrimidas para dar
cuenta del patrón antes mencionado (DOEBLEY1990b).
Por su parte, Randolph (1959), Mangelsdorf (1974), Kato (1984) y, más
recientemente. Goloubinoff, Paabo & Wilson (1993) han propuesto que el maiz se habría
originado en forma recurrente a partir de distintas poblaciones de teosinte, conservando así
gran parte de Ia diversidad presente en sus progenitores.
Según evidencias citogenéticas, bioquímicas y moleculares. el maíz habría surgido
en América Central hace aproximadamente 7.500 —10.000 años, extendiéndose luego
hacia Norte y Sudamérica (lLTIs1983; MATSUOKAet al. 2002b). La ubicación geográfica del
sitio de origen coincidiría, al menos en parte, con las localidades actualmente habitadas por
su supuesto progenitor Zea mays ssp. parviglumis, los valles de los ríos Balsas y Lerma
en el Sudoeste mexicano (DOEBLEY1990a). La llegada del maiz a América del Norte habría
tenido lugar a través de la región sur del Suroeste de los Estados Unidos entre los años
750 y 500 a.C., esparciéndose luego hacia el centro y Este del país hasta llegar a Canadá
(DOEBLEYet al. 1983b).
Los primeros estudios acerca del patrón de dispersión hacia América del Sur fueron
realizados sobre la base del análisis citogenético de razas nativas (MCCLINTOCKet al.
1981). Según los mismos, el maiz habría sido originalmente introducido en los Andes
Centrales sin sufrir nuevas contribuciones genéticas sino hasta tiempos más recientes,
probablemente provenientes del Este de Brasil. Nuevas evidencias obtenidas a partir del
análisis de Ioci microsatélites (MATSUOKAet al. 2002b) sugieren que el ingreso del maiz en
América del Sur se habría producido inicialmente a través de las tierras bajas, llegando
hasta los Andes en una etapa posterior.
I2.2. El registro arqueológico
Gran parte de las inferencias en relación con el origen y dispersión del maíz se han
basado en las características morfológicas, citogenéticas y bioquímicas de sus
representantes actuales. Como se verá a continuación, el registro arqueológico brinda la
oportunidad de contrastar estas inferencias con una fuente de información independiente.
ya sea a través de las aproximaciones clásicas, o de las más recientes metodologíasmoleculares.
l2.2.1. Macro y microfósiles
Las evidencias macrobotánicas más antiguas en relación con las fases iniciales de
la domesticación del maíz provienen de los valles de Tehuacán y Oaxaca en México (LONG
et al. 1989; BENZ2001).
Los restos arqueológicos encontrados en las cuevas de Coxcatlán y San Marcos, en
el valle de Tehuacán, fueron considerados durante mucho tiempo representantes de los
“maíces silvestres” propuestos por la teoría tripartita (BENZ1999). Inicialmente datados
como correspondientes a los 6.000-4.500 a.C., estudios posteriores demostraron que la
antigüedad de dichos vestigios no superaba los 5.500 años (BENZ& ILTIS1990). Más aún. a
pesar de que muchas de sus características concordaban con rasgos considerados
primitivos, un nuevo análisis morfológico de los mismos ejemplares reveló un gran parecido
con las razas actuales y una tendencia al incremento en el diámetro del raquis y tamaño
del grano a lo largo de la sucesión temporal (BENZ& ILTIS1990).
Uno de los resultados más sorprendentes de estas investigaciones surge de la
comparación estadistica de la morfología de los malces primitivos de la cueva de San
Marcos con un conjunto de razas mexicanas y un maíz reventador o popcom de Argentina
(Argentine Pop) a través del método de componentes principales (PCA). Los restos
arqueológicos resultaron significativamente distintos a las razas de México, aunque
indistinguibles del Argentine Pop. Estas observaciones fueron interpretadas como
consecuencia de la conservación de formas primitivas en las zonas periféricas de la
distribución, tras haber sido sustituidas por formas especializadas en el área de origen
(BENZ & ILTIS1990).
La reciente datación de ejemplares provenientes de Guilá Naquitz, Oaxaca, ubica a
estos últimos como los más antiguos descriptos hasta el momento con una antigüedad de
ca. 6.200 años (BENZ2001). A pesar de un desfasaje de aproximadamente 700 años con
respecto a los restos más antiguos de Tehuacán, la diferenciación morfológica entre los
individuos de ambos sitios es prácticamente nula (BENZ2001).
Algunos sitios más tardíos de México,el sudoeste de los Estados Unidos, como asi
también de Centroamérica, fueron descriptos por Mangelsdorf en una serie de trabajos (ver
revisión BENZ1994). Sin embargo. sus conclusiones han sido cuestionadas debido a Ia
falta de registro de las mediciones y datos originales y al sesgo que parece haber
introducido en ellas la “teoría tripartita" (BENZ1994).
De Io anteriormente expuesto se desprende que los registros más antiguos hallados
hasta la fecha provienen de los valles de las tierras altas de Mexico, y no de las zonas
próximas al río Balsas, como cabría esperar si fuera esta la localización geográfica del
centro de origen. Una posible explicación para este hecho viene dada por las
desfavorables condiciones de preservación que caracterizan a los ambientes cálidos y
húmedos, a Io cual debe sumarse la poca atención que ha recibido el área en las
investigaciones arqueológicas.
Algunas de las herramientas comúnmente utilizadas para la detección e
identificación de restos vegetales en sitios arqueológicos de áreas tropicales son los
granos de polen, los granos de almidón y los fitolitos. Los fitolitos son estmcturas silíceas
presentes en los tejidos vegetales que resultan en muchos casos específicas de ciertos
grupos de plantas. y cuya conservación es frecuente en las distintas capas estratigráficas.
como así también en los elementos cerámicos.
Con el fin de determinar la utilidad de su aplicación en el estudio del origen del maíz,
Pipemo & Pearsall (1993) examinaron la estructura de los fitolitos en teosintes, Tn'psacum
y en 11 razas de maíz, entre las que se encontraba el maíz reventador Argentine Pop
estudiado por Benz & Iltis (1990). Los fitolitos de dichos ejemplares demostraron tener
ciertas peculiaridades que los diferenciaban tanto de los de otras razas como los de los
teosintes, lo cual, en vistas de la similitud hallada por Benz e Iltis (1990) con los ejemplares
de la cueva de San Marcos, llevó a proponer su utilización como marcadores de maiz
primitivoen las secuencias arqueológicas.
Si bien el origen mesoamericano del maiz es prácticamente indiscutido, el debate
parece haberse desplazado hacia un nuevo terreno: la antigüedad de la introducción del
cultivo en América del Sur. Según Pipemo & Pearsall (1998), diversos estudios
provenientes de fitolitos, granos de polen y granos de almidón apoyan la hipótesis de una
dispersión temprana hacia las regiones del Sur de Centroamerica y Norte de América del
Sur (7.000-5.000 AP). Asimismo, los granos de polen hallados por Pope y col. (2001) en
capas de ca. 7.000 años de antigüedad en las inmediaciones de Tabasco sobre el golfo de
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México. contribuyen a dar sustento a dicha hipótesis. Por su parte, tanto Smith (1998)
como Staller & Thompson (2002) sostienen que la aparición del maiz en Sudamérica
habría sido mucho más tardía (1200-2000 a.C.). Sin embargo, todos los argumentos
expuestos por dichos autores fueron convincentemente refutados por Pearsall (2002;
2004) sobre la base de nuevas evidencias surgidas del análisis de fitolitos y gránulos de
almidón provenientes de restos arqueológicos de Ecuador.
De aceptar el escenario de introducción temprana, la presencia en Sudamérica de
fitolitos de malz desde hace ya 7.000 años implica que el proceso de domesticación se
habría iniciado en etapas bastante anteriores a lo evidenciado por el registro
macrobotánioo. De hecho, los ejemplares más antiguos descriptos hasta la fecha ya
presentan gran parte de los atributos morfológicos que caracterizan a la inflorescencia del
maiz actual, lo cual constituye una importante diferenciación con respecto a su supuesto
progenitor, el teosinte Zea mays ssp. parviglumis.
I2.2.2. Estudios moleculares
La posibilidad de extraer ácidos nucleicos a partir de restos fósiles, arqueológicos,
ejemplares de museo y residuos forenses ha permitido incorporar una nueva dimensión al
estudio del pasado y de la evolución molecular.
El término ADN Antiguo (ADNa) o “Ancient DNA"comprende todo resto de material
genético proveniente de organismos muertos o de deshechos extracorpóreos de
organismos vivos. Debido al estado de deterioro del ADN, los procedimientos utilizados
para su purificación deben ser ajustados para satisfacer estrictos criterios de autenticidad
incorporando precauciones especiales destinadas a evitar la contaminación y la formación
de artefactos de amplificación durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(PAABO 1989b; HERRMANN & HUMMEL 1994; COOPER & WAYNE 1998; COOPER & POINAR
2000; MAROTA8. ROLLO2002).
En el maiz, las investigaciones realizadas hasta el momento han verificado la
presencia de ADN en buen estado de conservación en manos y can'ópsides
arqueológicas. pudiendo obtenerse fragmentos de secuencias correspondientes a genes
nucleares y mitocondriales. Los estudios pioneros en la materia fueron realizados por
Rollo y col. (1988; 1991). quienes caracterizaron y amplificaron los ácidos nucleicos
extraídos a partir de can'ópsides de 1000 años de antigüedad, provenientes de un
enterratorio de la región costera del Perú (sitio Huari). Mediante ensayos de sensibilidad a
RNAsa, determinación de la composición de bases por HPLC (del inglés High Performance
Liquid Chromatography) y evaluación de las propiedades antigénicas. pudo establecerse
que la mayor parte del extracto correspondía a ácido ribonucleico (ARN). La presencia de
de ácidos nucleicos de origen endógeno pudo ser confirmada a través de Ia amplificación
de 130 pares de bases (pb) del gen mitooondn'al Cox I (citocromo oxidasa c -—subunidad I),
100 pb del ADN altamente repetitivo HZa y 90 pb del elemento transponible Mu (ROLLOet
al. 1994). Estos primeros estudios, si bien tuvieron fundamental importancia abriendo el
camino para investigaciones posteriores. no continuaron su desarrollo. Fueron Goloubinoff
y col. (1993). en cambio, quienes aplicaron por primera vez las técnicas de ADN antiguo
para el abordaje de problemas evolutivos en maiz. A partir de datos de secuencia de 315
pb del gen Adh2, Alcohol Deshídrogenasa 2, se demostró que Ia divergencia nucleotidica
entre los alelos provenientes de los especímenes arqueológicos era similara la observada
entre alelos de las muestras contemporáneas, y que, en algunos casos. los alelos
“antiguos” eran más parecidos a los actuales, de maíz o teosinte, que entre si. Dos
conclusiones derivaron de estas observaciones: 1) la variabilidaddocumentada en maiz no
responde a una aceleración de la tasa de sustitución como lo habían propuesto otros
autores (ver sección I2.1.); y 2) la divergencia de las variantes alélicas presentes en el
maiz es anterior al evento de domesticación. Esto último llevó a proponer que la
conformación del pool génioo del maíz sería consecuencia de eventos múltiples de
domesticación, o bien, de procesos de introgresión temprana con las especies de teosintes
(GOLOUBlNOFFet al. 1993).
Más recientemente. Jaenicke y col. (2003) incorporaron también ejemplares
arqueológicos en sus investigacionesacerca de los caracteres seleccionados en las etapas
iniciales de la domesticación. A pesar de que las evidencias macrobotánicas han permitido
establecer cuáles habrian sido las caracteristicas morfológicas de la mazorca sujetas a
selección por parte de los cultivadores aborígenes, otros aspectos. tales corno la
arquitectura de Ia planta o las estructuras de almacenamiento de almidón, no han podido
ser analizados debido a la naturaleza fragmentan'a de los restos comúnmente hallados en
los sitios arqueológicos (marlos desgranados, mazorcas carbonizadas).
El estudio de la base genética de la diferenciación morfológica entre Zea mays ssp.
mays y los teosintes provee una nueva herramienta para superar este obstáculo. Tres
genes aparentemente involucrados en el proceso de domesticación han sido identificados y
, Batungasta - 400 A.P.*Contexto residencial. Valle Mesotennal
g
"5am
Punta Colorada - 1300 A.P.*Contexto funerario. Valle Mesotermal.
'1
Q v
%‘o%..50 '83,,1 50m
Lorohuasi - 400 A.P.*Contexto funerario. Valle Mesotermal
FIGURA2. Características y sitio de origen de los ejemplares arqueológicos(Pcia. de Catamarca, Argentina).*Antiguedad aproximada.A.P.:años antes del presente
Materiales y Métodos
M2. ANÁLISIS DE LA VARIABlLlDADDE LOCI MICROSATÉLITES
Los loci microsatélites o repeticiones de secuencias simples (SSR- del inglés Simple
Sequence Repeats) están compuestos por repeticiones en tándem de un motivode dos a
seis pares de bases flanqueadas por regiones conservadas no repetitivas, idealmente de
copia única.
Secuencias de estas características se encuentran ampliamente distribuidas en el
genoma de todo tipo de organismos. Desde el punto de vista funcional, los loci SSR suelen
estar ubicados en regiones no codificantes. Pese a ello, la neutralidad de estos marcadores
está, en algunos casos, sujeta a cuestionamientos, ya que se ha demostrado su
participación en regiones regulatorias (KASHI& SOLLER1999).
La tasa de mutación de los microsatélites es del orden de 10'2 —10'5,dependiendo
del Iocus y del organismo, siendo notablemente superior a Ia de las mutaciones puntuales
(10'9 -10"°). Es por ello que estas regiones exhiben un alto grado de polimorlismo
originado, principalmente, por la variación en el número de repeticiones. Diversos
mecanismos han sido propuestos para explicar este particular modo de evolución: el
“slippage” o "deslizamiento" de la enzima polimerasa durante la replicación del ADN,
recombinación desigual y conversión génica (HANCOCK1999).
La presencia de secuencias conservadas no repetitivas en tomo al motivo de
repetición hace posible la amplificación selectiva de los diferentes loci microsatélites a
través de la reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR —Polymerase Chain Reaction). De
este modo, los individuos homocigotas para una variante alélica dada presentarán un único
tipo de producto de amplificación, mientras que en el caso de los heterocigotas se
obtendrán dos fragmentos de tamaños distintos. La determinación del número y tamaño
de los alelos en cada individuo requiere de un sistema capaz de discriminar fragmentos
cuyo largo puede llegar a diferir en tan sólo una base. Esto puede lograrse mediante
electroforesis en gel de poliacn'lamida, utilizando condiciones similares a las
empleadas para geles de secuenciación, o a través de electroforesis capilar y detección
por fluorescencia inducida por láser.
Dado su alto grado de polimorfismo,su naturaleza básicamente neutra y su carácter
codominante, los microsatélites se han convertido en una de las herramientas mas
utilizadas en estudios poblacionales, evolutivos y de mapeo genético.
29
M2.1.Métodos experimentales
M2.1.1. Ejemplares actuales
M2.1.1.1. Selección de loci
La elección de los Ioci SSR se llevó a cabo en base a la información disponible en Ia
base de datos MaizeDB (www.agron.missouri.edu), actualmente MaizeGDB
(http:llwww.maizegdb.org), tomando como referencia los resultados obtenidos por
Senior y col. (1998) en la caracterización de 94 lineas comerciales pertenecientes al banco
de germoplasma de maiz de los Estados Unidos (Colección M.M. Goodman, North
Carolina State University) y lo descripto por Matsuoka y ool. (2002a; 2002b) para 99 Ioci
SSR en razas nativas de maiz y teosintes.
Se estudiaron dos loci independientes por cada par cromosómioo. con excepción
de los pares 8 y 9, en donde sólo pudo analizarse un único locus. Los 18 loci analizados
fueron seleccionados a partir de la evaluación experimental de un total de 39 marcadores,
tomando como criterio su reproducibilidad y facilidad de interpretación (Tabla 4).
M2.1.1.2. Extracción de ADNgenómico total
El ADN genómico total de los individuos pertenecientes a las razas nativas se
extrajo a partir de plántulas de entre 5 y 7 dias de germinación siguiendo el protocolo de
Dellaporta y col. (1983) con ligeras modificaciones (Ver Apéndiae).
La germinación de los granos se llevó a cabo en caja de Petri con algodón
humedecido, bajo condiciones iniciales de oscuridad durante 48 horas a una temperatura
de aproximadamente 28°C, seguido de 1 a 5 días en condiciones de luz continua a la
misma temperatura.
En el caso de las líneas, y debido a que no fue posible obtener ADNamplificable por
PCR mediante el protocolo de Dellaporta y col. (1983), el ADN se extrajo directamente a
partir 200 a 300 mg de can'ópsides pulverizadas en aire líquido, utilizando el protocolo
estándar de CTAB para extracción de ADN vegetal (MILLIGAN1998).
M2.1.1.3. Cuantiflcación de ADN
El ADN genómico se cuantificó mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1% (p/v) y tinción con Bromuro de Etidio (0,5 pg/ml), utilizando como referencia
concentraciones conocidas del fago Lambda digen’docon las enzimas de restricción EcoRl
y Hind III (Promega). Se sembró un volumen de muestra de 12 ul, incluyendo 2 ul de
buffer de siembra. La electroforesis se llevó a cabo en buffer TAE 1X a un voltaje
Tabla5.DiversidadgeneticaenrazasnativasdemaizdelNoroesteArgentino.Rangoalélico:tamañosextremosdelosalelosencontradosenpares debases.A:númerodealelos.Entreparéntesisseindicaelnúmerodealelosexclusivosparacadapoblación.Rs:riquezaalélicapoblacional.HE: heterocigosisesperada. Población
Tabla5.DiversidadgenéticaenrazasnativasdemaízdelNoroesteargentino(cont.).Rangoaiéiico:tamañosextremosdelosaleiosencontradosenparesdebases.A:númerodealeios.Entreparéntesisseindicaelnúmerodealeiosexclusivosparacadapoblación.Re:riquezaaléiicapoblacional.HE:heterocigosisesperada. Población Locus
bnng52). La dinámica mutacional de los nueve loci restantes será discutida en la sección
siguiente.
Como puede apreciarse en la Tabla 5. el rango alélioo de los Ioci SMM resultó
similar en todas las poblaciones, con algunos casos extremos en 6482 (Orgullo
Cuarentón). Lo mismo pudo verificarse para los Ioci no SMM, en donde se observó una
gran homogeneidad en la distribución de los tamaños alélicos entre poblaciones.
58
Resultados
R.1.1.2. Secuencia nucleotldica de los alelos microsatélites
Diversos métodos indirectos pueden ser utilizados para medir el ajuste de un
determinado locus microsatélite al modelo de mutación de a pasos (SMM) sin tener que
recurrir a las pruebas de progenie. Uno de los más comúnmente empleados se basa en el
patrón de distribución de los tamaños alélicos. De acuerdo con las predicciones del
modelo. el surgimiento de nuevas variantes se produce como consecuencia de la ganancia
o pérdida de una unidad de repetición. Asi, las diferencias de longitud entre alelos deberán
consistir en un número de pares de bases que sea múltiplodel motivo en cuestión. Sin
embargo. el mero análisis de los tamaños alélicos y su varianza no permite obtener
información inequívoca acerca de la naturaleza de las diferencias observadas y de los
mecanismos que les dieron origen. La secuenciación de las variantes alélicas, en cambio,
brinda una herramienta mucho más potente para determinar el modo de evolución de un
locus, y es por ello que fue elegida como estrategia para el análisis desarrollado en el
presente estudio.
Se secuenciaron 55 alelos pertenecientes a 9 Ioci con motivos de repetición de dos
(phi037, nc135, bnlg1700, bnlg1165), tres (phi059, phi069. phi121), cuatro (phi127) y seis
(phi029)pares de bases.
Los Ioci phi121, phi069 y phi059 presentaron motivos imperfectos con escasa
variación en el número de repeticiones entre alelos (Figuras 5a. 5d, 5f). Los dos primeros
constituyen casos extremos, en los que resulta dificil identificar la región microsatélite
esperada. En el locus phi059, el motivo es fácilmente distinguible. aunque prácticamente
invariable, con diversas inserciones involucradas en las diferencias de tamaño observadas.
En los Ioci nc135, phi037 y phi127 se obtuvieron patrones mixtos, en donde parte
de la variación se explica por diferencias en el número de repeticiones y otra parte se debe
a cambios en las zonas flanqueantes (Figuras 5b. 5c, 5e). En particular, el Iocus phi037
tiene una distribución bimodal, en la cual los alelos de mayor tamaño exhiben distintas
inserciones cuya longitud varía entre 3 y 27 pb. Los alelos 156 y 160 de este Iocus se
caracterizan. además. por la presencia de un tramo de poli-T de extensión variable en la
región inmediatamente anterior a la zona microsatélite, siendo el número de repeticionesdel motivo inferiora lo encontrado en los alelos más cortos. La variación hallada en el Iocus
phi037 ejemplifica las limitaciones del análisis de tamaños alélicos como único criterio para
la determinación del modelo mutacional. Como puede apreciarse en la Figura 5c, todos los
alelos difieren en un número par de bases; sin embargo, las diferencias no son atribuibles a
la ganancia o pérdida de repeticiones.
59
EI motivo microsatélite descripto en la base de datos MaizeGDB para el Iocus
phi029 posee una composición mixta de seis pares de bases (CCCT-CT).A pesar de ello.
las únicas diferencias encontradas en cuatro de los siete alelos secuenciados —Alelos148,
150, 154 y 156- corresponden al dinucleótido CT (Figura 59). Por su parte, los Alelos 158,
159 y 162 exhibieron un comportamiento heterogéneo, alternando tetranucleótidos CCCT y
dinucléotidos CT en la porción anterior al tracto de repeticiones CT (Figura 59).
Los únicos loci que mostraron un patrón de variación estrictamente compatible con
el modelo SMMfueron bnlg1700 y bnlg1165, ya que todos los cambios que intervienen en
la modificación del largo de sus alelos se encuentran restringidos al número de
repeticiones de la región microsatélite (Figuras 5h, 5i).
En resumen, los resultados aqul presentados indican que la variación hallada para
los loci phi121, phi059, nc135, phi037, phi069, phi127 y phi029, no es susceptible de ser
analizada bajo los supuestos del modelo SMM. Por su parte, las diferencias observadas
entre los alelos correspondientes a los loci bnlg1700 y bnlg1165 coinciden con lo esperado
tanto por el modelo de mutación de a pasos (SMM), como por el modelo de dos fases
(TPM) (DI RIENZOet al. 1994i.
La convergencia de los tamaños alélicos, es decir la existencia de alelos idénticos
en estado pero no idénticos por descendencia, tanto entre poblaciones como dentro de una
misma población, es una de las consecuencias esperadas según el modelo SMM. Sin
embargo, aún sin asumir dicho modelo. mutaciones puntuales en la secuencia
nucleotídica, o bien la combinación de inserciones y deleciones en las regiones
flanqueantes al motivo de repetición, pueden dar lugar a Ia coexistencia de variantes
alélicas distintas dentro de una misma categoria de electromorfos.
Considerando la gran incidencia de inserciones y deleciones en la diversidad alélica
observada, se decidió secuenciar variantes de igual tamaño provenientes de las diferentes
poblaciones analizadas en este estudio. Para ello se eligió el locus phi059, dado que se
contaba, además, oon los datos de secuencia de Ilneas de malz y otras especies del
género Zea (Figura 5f).
El alelo 148 presentó una similitud promedio del 99,7% entre las variantes de maíz
analizadas (excluyendo las bases indetenninadas). La única base variable corresponde a
la posición 132, dividiendo a los electromorfos en dos grupos, uno portador de "G"y otro de
“C”.Los alelos 148 de Zea quun'ans y 147 de la línea W64A resultaron 100% idénticos al
grupo portador de "C”, oon excepción de una deleción en la posición 136 del alineamiento
para el último de los mismos.
60
El alelo 152 representa un claro caso de convergencia en el tamaño alélico. Tanto la
variante de la población 6482 como en la descripta para la líneas Tzi10 exhiben el mismo
número de repeticiones. Sin embargo, esta última se caracteriza por la presencia de una
inserción de 4 pb en las posiciones 30 a 33 del alineamiento, mientras que la primera
posee una inserción de 4 pb en las posiciones 71 a 74.
A pesar de diferiren tan sólo una base con respecto a los alelos 152 y 154 de maíz,
diversos eventos de inserción y deleción distinguen al alelo 153 de Zea diploperennis,
poniendo de manifiesto las dificultades de aplicación de los marcadores microsatélites más
allá del nivel de especie. En forma similar, los alelos 157 de maiz presentan una identidad
promedio del 99,1% por ciento, mientras que su similitud promedio con Ia variante de la
subespecie Zea mays ssp. huehuetenangensis desciende al 95,4 %.
Los dos individuos cuyo genotipo pudo ser determinado para el Iocus phi029
presentaron la variante alélica 154 en homocigosis (Tabla 6). Nuevamente, si bien la
ausencia de heterocigotas puede deberse a limitaciones técnicas, la alta frecuencia del
alelo 154 en las poblaciones y razas previamente estudiadas es compatible con las
observaciones realizadas. Asimismo, la mayor parte de las variantes alélicas actuales de
este locus presentan una longitud inferior a 154 pb. con Io cual el tamaño de los
fragmentos recuperados de las muestras arqueológicas no deberia influiren la detección
de heterocigotas.
La identidad promedio entre los clones fue del 96% para el ejemplar arqueológico 38
(Raza Morocho) y del 99% para el 40 (Raza Chaucha), en tanto que la identidad promedio
con respecto al alelo 154 actual fue del 98% y 97%, respectivamente. Se identificaron 24
sitios variables. 18 de los cuales corresponden a singletons, siendo el 71% de las
sustituciones transiciones de tipo C/G —>TIA (Figura 8).
AI igual que Io observado para el Iocus phi127. el individuo 40 presentó ciertas
características distintivas a nivelde secuencia. Los dos clones recuperados presentan una
"T" en lugar de una “C” en las posiciones 47. 62, 79 y 101 del alineamiento (Figura 8).
estando las tres primeras dentro o inmediatamente contiguas al motivo de repetición. AI
incluiren la comparación la totalidad de las variantes alélicas del locus, como asi también
los alelos 154 correspondientes a Zea mays ssp. mexicana y Zea mays ssp. paNiqumis.esta zona muestra una estructura variable en donde todos los cambios involucran
transiciones de tipo C-T. Sin embargo, es de destacar que en el individuo40 la única base
representada en las posiciones variables, tanto del Iocus phi127 como del Iocus phi029,sea la “T”.
AIestudiar la distribución de frecuencias en las razas actuales es posible distinguir
un grupo compuesto por las poblaciones 6480. 6484, 6476, 6185 y 6167, en donde el alelo
154 es el más frecuente con valores que oscilan entre 0,63 y 0,71, y a las poblaciones
6473, 6482 y 6313, cada una de ellas diferenciada con respecto a las demás. En las dos
últimas, la variante 154 tiene una frecuencia de 0,42 y 0,21 respectivamente, mientras que
ésta asciende a 0,97 para 6473.
Este patrón de variación concuerda con la afinidad entre ejemplares actuales y las
poblaciones 6480, 6484, 6476, 6485, 6167 y 6473, previamente sugen‘da en base a los
'Poblaciones tentativamente asignadas al Complejo Andino.
En concordancia con lo obtenido en el análisis individual de cada Iocus, la
probabilidad de ocurrencia de los genotipos correspondientes a los ejemplares 38, 40 y 54
es mayor para las poblaciones que pertenecerían al Complejo Andino, mientras que resulta
muy baja para 6482 y 6313.
R2. ESTRUCTURA POBLACIONAL
R2.1. Equilibrio de Hardy-Weinberg
De acuerdo con lo esperado para especies de fecundación cruzada, las poblaciones
6473, 6167, 6485, 6484 y 6313 exhibieron un patrón general de ajuste a las proporciones
de Hardy-Weinberg, evidenciado tanto por el análisis de locus individuales como por las
estimas globales de los índices F¡s(Tabla 9).
Por su parte, los valores de F.s positivos y significativos obtenidos para las
poblaciones 6480, 6476 y 6482 indican un exceso de homocigotas con respecto a lo
esperado bajo la hipótesis de unión al azar de gametas. Lo mismo surge del análisis de
Iocus individuales, en donde todas las desviaciones fueron halladas al considerar la
hipótesis alternativa de defecto de heterocigotas (Tabla 9). Por el contrario. al estudiar el
78
Resultados
ajuste tomando como hipótesis alternativa el exceso de heterocigotas, no se observaron
desviaciones significativas en ninguna de las poblaciones ni Iocianalizados.
Tabla 9. Ajuste a las propociones de Hardy-Weinberg. Las casillas sombreadas corresponden alos Ioci en donde se observó ajuste a lo esperado bajo la hipótesis de unión al azar de gametasuna vez realizada la corrección de Bonferroni (Test U; H1=defecto de heterocigotas).
Población Liga-s
n p p p p p b b b b b b b b b b b Fisc h h h h h n n n n n n n n n n n g
:1, ¡b ¡(“J / I I I I / l / I I I Ig 9 9 9 9 05 3 6 2 5 2 1 1 g 1 g 1 g 1 g g g b
6473 m m m m m 0,0956167 0,0806485 m 0,1306480 m 0.189*6484 m 0,1 156476 0,134"6313 0,1006482 0220*
m= locus monomórfico. *p< 0,05. Significación establecida mediante el método de permutaciones.
Los resultados presentados en la Tabla 9 ponen de manifiesto cierta heterogeneidad
en el comportamiento de los Ioci, aún en poblaciones con un patrón general de ajuste a las
proporciones de equilibrio. Esto puede deberse a errores de muestreo, fallas
experimentales, errores de tipificación,o bien, a la existencia de alelos nulos.
De encontrarse en frecuencias apreciables, los alelos nulos pueden ser detectados
a través de la ausencia total de producto de amplificación en los individuos homocigotas.
Sin embargo, este criterio es de dificilaplicación dado que puede confundirse con cualquier
otra falla de índole experimental. Por ello, sólo se consideran homicigotas nulos a los
individuos que presentan ausencia de producto en un único Iocus, siendo su genotipo
fácilmente registrable para el resto de los locí. De acuerdo con dichas pautas, ninguno de
los marcadores empleados en este estudio mostró indiciosde presencia de alelos nulos.
Por otro lado, la heterogeneidad observada también puede explicarse sin tener que
recurrir a distorsiones experimentales. En presencia de bajos niveles de endogamia,
aquellos marcadores con mayor número de alelos resultarán más sensibles a la hora de
detectar las desviaciones con respecto a la panmixia. En este sentido, si bien las
diferencias en el número promedio de alelos por Iocus no fueron estadísticamente
significativas,es interesante destacar que las poblaciones en donde se observó exceso de
79
homocigotas (6476, 6480 y 6482) presentaron los valores más altos para este índice (Tabla
5).
R2.2. Diferenclación genética
El análisis de la estructura poblacional utilizando marcadores microsatélites
presenta dos alternativas: a) estimar los niveles de diferenciación mediante el índice de
fijación FSTde Wright (1965; 1978), asumiendo un modelo de alelos infinitos; y b) estimar
los niveles de diferenciación mediante el indice R51 de Slatkin (SLATKIN1995), asumiendo
un modelo stepwise o de mutación de a pasos. La elección entre uno u otro de ellos
dependerá de las caracteristicas de los loci involucrados y de la contribución relativa de
mutación, migración y den‘vaen el proceso de divergencia.
Los resultados presentados en el análisis de datos de secuencia de los alelos
microsatélites mostraron que los Iocí phi121. phi059. nc135, phi037. phi069, phi127 y
phi029 no exhiben un patrón de variación compatible con el SMM, lo cual invalida la
utilizacióndel estadístico RSTpara este conjunto de marcadores.
En el caso de bnlg1165 y bnlg1700, las evidencias provenientes del análisis de
secuencias concuerdan con lo esperado según el modelo de mutación de a pasos,
mientras que en los loci bnlg1018, bnlg1209, bnlg1287, bnlg1070, bnlg1182, bnlg1866,
bnlg1732, bnlg1360 y bnng52. el ajuste al modelo SMM fue demostrado por Vigouroux y
col. (2002) a través de pruebas de progenie. En esta situación, la aplicación de Pm como
medida de diferenciación es. en teoría. adecuada. Sin embargo, la utilización de este
estadístico sólo se justifica cuando las diferencias en los tamaños alélicos aportan
información acerca del grado de divergencia entre poblaciones. De no cumplirse esto
último, FSTcontinúa siendo el estimador de preferencia por presentar menor varianza
(HARDYet al. 2003).
A fin de seleccionar el estadístico más apropiado, se evaluó la incidencia de los
tamaños alélicos en la diferenciación poblacional (Ho: FST=RST;H1=FsT>Rsr) mediante el
test de perrnutaciones desarrollado por Hardy y col. (2003) (ver Materiales y Métodos,
sección M2.3.5.1.). Dado que el patrón de variación observado para los Ioci bnlg1700 y
bnlg1165. ajusta tanto al modelo SMM como al modelo de dos fases, ó TPM (DIRIENZOet
al. 1994). en una primera etapa sólo se incluyeron en el análisis los Iocíestrictamente SMM
(9 IOCI),incorporando luego los dos potencialmente SMM (11 locr).
En ninguna de las estimas globales consideradas se hallaron diferencias
significativas entre los valores de FSTy RST(Tabla 10), lo cual indica que, en general, los
procesos mutacionales, y por ende. las diferencias en el tamaño de los alelos, no han
80
contribuido a la diferenciación. No obstante, al estudiar separadamente cada Iocus. la
hipótesis nula fue rechazada para tres de los once marcadores (bnlg1866, bnlg1360 y
an9252), evidenciando cierta heterogeneidad en el comportamiento de los Ioci que dan
lugar a las estimas globales (Tabla 10).
Tabla 10. F31vs. R31.Diferencias en el tamaño ale-"co y su contribución a la
diferenciación poblacional. pRST:promedio de los RSTobtenidos a partir del test de
perrnutaciones de tamaños alélicos (HARDYet al. 2003).
Rm PRsr (l-c- 95%) P(H1=Rsr >Fsr)
Global 9 LOCÍ 0,2309 0,1633 (0,0874-0,2455) 0,0529
Global 11 LOCÍ 0,2310 0,1587 (0,08345-0,2490 0,0559
bli/91018 0,3266 0,2323 (0,0350-0,4661) 0,1968
bnlg1209 0,0467 0,1326 (00169-033021) 0.8901
bli/91287 0,0578 0,1097 (0,0156-0,2250) 0,7542
bnlg1070 0,0063 0,1186 (0,0013-0,2935) 0,9670
bli/91182 0,3256 0,2781 (0,0027-0,4790) 0,4326
bnlg1866 0,3198 0,0911 (00.2811) 0,0130.
DFI/91732 0,0050 0,0567 (00.1794) 0,9131
bnlg1360 0,2751 0,1017 (0,0022-0.2379) 0,0080"
bil/9252 0,2454 0.1826 (0,0339-0,3805) 0,2298
bil/91700 0,2937 0,1711 (0,0321-0,3373) 0,0919
bil/91165 0,1861 0,0730 (0,0016-0,1595) 0,0060"
'p<0.05; "p<0,01
En conclusión, el estadístico RST no constituye un estimador adecuado para el
análisis de la diferenciación entre las poblaciones incluidas en el presente estudio. Este
hecho oonvalida el análisis conjunto de los 18 Ioci mediante el estadístico F57,a pesar de
las discrepancias observadas en los patrones mutacionales. Asimismo, dado que las
diferencias en el tamaño de los alelos no resultan informativas, la utilizacióndel estadistico
(óp)2 (GOLDSTEINet al. 1995) como medida de la distancia genética entre poblaciones es,
por consiguiente. inapropiada.
81
Como paso previo al cálculo de los índices F31y con el propósito de determinar su
significación, se utilizó el test exacto de Fisher para analizar la homogeneidad de la
distribuciónde frecuencias génicas entre poblaciones.
Las diferencias entre las frecuencias alélicas resultaron altamente significativas
para todos los pares de poblaciones. No obstante, al efectuar eI análisis discriminando la
contribución de cada Iocus a la diferenciación total, se observó un marcado nivel de
variación entre las diferentes comparaciones de a pares (Tabla 11). Mientras que para el
par de poblaciones 6313-6473 el 94% de los locí variables (16/17) mostraron diferencias
significativas en su composición génica, en el caso de los pares 6167-6485 y 6485-6480
esta cifra se redujo a tan sólo 6% (1/17). Si bien el significado de esta variación no es
evidente, una explicación posible es la existencia de heterogeneidad en el poder
discriminante de los marcadores estudiados. Asi, aquellos con poder más alto serán
capaces de detectar diferenciación,aún cuando esta sea muy baja e imperceptible para losdemás Ioci.
Uno de los factores potencialmente involucrados con la capacidad de discriminación
es el número de alelos. En efecto, el único Iocus en el cual se observó diferenciación
significativa para los pares 6167-6485 y 6485-6480 fue bnlg1360, cuyo número de alelos
es el más alto entre todos los marcadores estudiados.
Dado que las diferencias en las frecuencias alélicas resultaron estadísticamente
significativas para todos los pares de poblaciones comparados, los índices FST
correspondientes fueron considerados significativamente distintos de cero (Tabla 11).
Asimismo, estos resultados fueron confirmados a través de la significación de los indices
mediante permutaciones.
EI análisis de la estructura poblacional reveló que la variación entre poblaciones
constituye el 14.6% de la variación total. Los valores de diferenciación más altos
corresponden a los pares que incluyen a la población 6473 de la raza Altiplano (F51:
0,1686-0,3659), en tanto que los más bajos provienen de las comparaciones entre las
poblaciones 6480, 6485, 6484 y 6167, pertenecientes a las razas Amarillochico, Amarillo
grande, Blanco y Altiplano (FST:0,0263-0,048) (Tabla 11).
La diferenciación promedio entre la raza Pisingallo (6313) y el conjunto de
poblaciones integrantes del Complejo Andino (6476, 6480, 6484, 6167,6473, 6485) fue de
0,230, mientras que Ia diferenciación promedio entre estas últimas y la población
correspondiente a la raza Orgullo Cuarentón (6482) fue de 0,148. Asimismo, la
diferenciación entre las poblaciones de Pisingallo y Orgullo Cuarentón estudiadas resultó
de 0,1675.
82
Resultados
Por último, al analizar la relación entre el grado de diferenciación genética (Fsï) y
distancias geográficas mediante el test de Mantel no se observó asociación alguna entre
ambas variables (ver Tabla 14 para detalle de distancias geográficas entre pares de
poblaciones).
Tabla 11. Diferenciación génica entre poblaciones del NOA. Las casillas sombreadascorresponden a los loci en donde se observaron diferencias significativas en las frecuenciasalélicas de los pares de poblaciones considerados. T.C.S.= total de comparaciones condiferencias significativas tras la corrección de Bonferroni.
Poblaciones FST I Locuscomparadas Numero de Alelos
global
n p p p p p b b b b b b b b b b b T.c h h h h h n n n n n n n n n n n C.
:1), l I I I / l I I l I I S.536252393332‘1’32337 9 7 9 9 7 1 0 2 2 0 1 8 7 3 5
El retículo de NJ resultante del análisis de agrupamíento no permite reconocer un
patrón claro de asociación entre ninguna de las poblaciones analizadas, siendo la
característica más distintiva el alto grado de diferenciación exhibido por las poblaciones
6313 (Pisingallo) y 6473 (Altiplano) (Figura 9).
La partición que presenta mayor apoyo (94,7%) divide al retículo en dos grupos: el
primero conformado por 6313, 6482 y 6476; y el segundo, integrado por 6480, 6485, 6484,
6167 y 6473.
Si bien la ausencia de raíz para el árbol considerado impide la delimitación de
grupos monofiléticos, la disposición en el retículo de las dos poblaciones de Amarillo chico
no es compatible con la monofiliade la raza, cualquiera sea el enraizamiento propuesto. En
el caso de Altiplano, en cambio, las dos poblaciones analizadas podrían llegar a constituir
un grupo monofilético, aunque con un valor de apoyo de ramas inferioral 70%.
R32. El Noroeste argentino y su inserción en el continente americano
Como se mencionó previamente, la incorporación de las razas de maiz del NOA al
marco provisto por las investigaciones de Matsuoka y col. (2002b) (ver introducción,
sección l3.2; Materiales y Métodos, sección M242.) debió ser llevada a cabo a través del
análisis de genotipos multilocus individuales, los cuales fueron definidos en base a los 10
loci SSR comparables entre ambos sets de datos. La metodologia convencional, basada
en el uso de las frecuencias alélicas poblacionales, no pudo ser aplicada debido a las
características del muestreo realizado por dichos autores (1 a 2 individuos por localidad).
6473
6313
Figura 9. Árbol de Neighbor-joining obtenido en base a la distancia genética de Neientrepares de poblaciones. Los números sobre las ramas indican los valores de bootstrapping(1000 pseudoréplicas). 6473, 6167: raza Altiplano;6484, 6476: raza Amarillochico; 6480: raza
R3.2.2. Reconstrucción en base al método bayesiano
La primera etapa del análisis consistió en determinar el patrón de estructuración
considerando únicamente los individuos del NOA y los 18 Ioci microsatélites tipificados en
este estudio. Se analizaron todos los individuos en forma conjunta, sin dar información
acerca de su población de origen, ni del número total de poblaciones involucradas.
El número de unidades panmlcticas o “poblaciones” (K) no pudo ser establecido
en forma inequívoca por observarse en forma concomitante al incremento de K, un
constante incremento en la probabilidad de los datos, expresada como Ln (D/K), aún
cuando se obtenían patrones de estructuración triviales de acuerdo con los lineamientos
para la elección de K establecidos por Pritchard y col. (2000) (Tabla 12) (para detalle de los
lineamientos, ver Materiales y Métodos, sección M2.4.2.2.). En dichas instancias, la
documentación del software STRUCTURE sugiere considerar el valor más pequeño de K
que conserve la mayor estructura posible.
Utilizando este criterio, y mediante el seguimiento de la distribución de los individuos
en los diferentes grupos a lo largo de las sucesivas particiones, el número de poblaciones
obtenido fue K=6 . Para K > 6, diferentes repeticiones de un mismo K mostraron distintos
patrones de asignación de individuos,de modo tal que en cada una de ellas el nuevo grupo
quedaba conformado por un conjunto aleatorio de individuos, sin observarse estructura
real.
Un comportamiento similar fue observado al estudiar separadamente los nueve Ioci
con ajuste al modelo SMM y los nueve Ioci con patrón mutacional diferente del modelo
de a pasos. Cabe destacar que en este último grupo, el valor óptimo de K pudo ser
identificado en base al parámetro Ln (D/K),ya que el mismo alcanza una meseta para K=6,
mostrando tan sólo ligeras fluctuaciones para Ksuperiores (Tabla 12).
En la Figura 12 se muestra la representación gráfica de las particiones obtenidas
para los sucesivos valores de K utilizando los tres sets de datos (Total de loci, Ioci SMM,
Ioci no SMM). En todos los análisis que se presentan a continuación, la pertenencia de los
individuos a una población (K) se determinó fijando un valor arbitrario del 60%. Esto es,
aquellos individuos en cuyo genoma la contribución de cualquiera de las poblaciones
ideales identificadas por el método superara el 60% eran considerados integrantes de lamisma.
Para K=2, la muestra queda dividida en un grupo integrado por 6473 (Altiplano),
6480 (Amarillo Grande), 6484 (Amarillo chico), 6485 (Blanco) y 6167 (Altiplano), y otro
compuesto por 6482 (Orgullo Cuarentón) y 6313 (Pisingallo). La población 6476 (Amarillo
92
chico) muestra una condición mixta con individuos asignados a uno u otro conjunto. Al
pasar a K=3. la población 6313 se diferencia del resto; y lo mismo sucede con 6473
para K=4 y con 6482 para K=5.
Tabla 12. Estimación del número de poblaciones mediante el método Bayesiano para losindividuos del NOA. Ln (D/K)=logaritmo natural de la probabilidad de los datos dado K.
En segundo lugar, tanto el análisis de los loci SMM como el de los Ioci no SMM,
arrojaron resultados semejantes a los obtenidos con el total de locí (Figura 12). No
obstante, probablemente debido a su mayor variabilidad, el patrón de estructuración
observado para los primeros (Ioci SMM) resultó mucho más claro y aproximadamente
idéntico al del conjunto total. Este hecho avala la utilización de un set reducido de Ioci,
integrado por 9 SMM y 1 no SMM, es decir, sólo aquellos compartidos con el trabajo de
Matsuoka y col. (2002b), para el análisis de las poblaciones del NOA en el contexto de las
razas del continente americano.
Por último. el esquema de fragmentación obtenido concuerda con lo observado en
el árbol de NJ construido a partir de las distancias genéticas de Nei (Figura 9), agrupando
por un lado a 6473, 6484, 6167, 6485 y 6480, y por el otro a 6482 y 6313, mientras que
6476 muestra una constitución intermedia (Figura 12). Este hecho pone de manifiesto la
utilidaddel método bayesiano para la inferencia de relaciones, aún cuando sólo se dispone
de los genotipos individuales.
Según los resultados de Matsuoka y col. (2002b), la aplicación del método
bayesiano al análisis de 99 Ioci microsatélites en razas de maíz del continente americano
dio lugar a la discriminación de tres grupos: 1) razas nativas de Estados Unidos; 2) razas
nativas del Complejo Andino; 3) razas nativas de Méxicoy resto de Sudamérica.
Previo a la integración de los datos correspondientes a las poblaciones del NOAy
con el objeto de verificar la consistencia de los ganos definidos frente a la reducción del
número de marcadores. se repitió el análisis de las razas descriptas por los mencionados
autores, considerando únicamente aquellos loci comparables entre ambos conjuntos de
datos (N=10 loco. Al evaluar distintos valores de K, considerando un rango similar al
utilizado para los 99 Ioci (K = 2-5), solamente pudo diferenciarse el grupo correspondiente
a las razas de Estados Unidos (ECEU; SOEU), en tanto que no fue posible identificar a los
individuos pertenecientes al Complejo Andino (CA).
La incorporación al análisis de los individuos del NOA permitió detectar un patrón de
estructuración más definido. Dado que la identificación del valor óptimo de K fue
nuevamente dificultosa siguiendo el criterio probabillstico (Tabla 13), la interpretación de
los resultados se centró principalmente en Ia información obtenida a partir del patrón de
fragmentación generado por los sucesivos incrementos de K(Figura 13).
95
Tabla 13. Estimación del número de poblaciones mediante el método bayesiano para losindividuos del NOA y otras razas de América". Ln (D/K)= logaritmo natural de laprobabilidad de los datos dado K.
Las poblaciones del NOA 6473, 6480, 6484, 6485 y 6167 integran un grupo que
incluye, además, al 80% de los individuos asignados a la categoría Complejo Andino (CA)
por Matuoka y col (2002b). Asimismo, 4 individuos del conjunto Otros Sudamericanos
(OSA) presentan porcentajes de pertenencia a este grupo superiores al 70%, sin hallarse
ninguna caracteristica particular (raza, altitud, localidad de muestreo) a la cual pudiera
atribuirse este hecho.
Para valores de K entre tres y cuatro, Ia población 6313 (Pisingallo) se diferencia
del resto de las poblaciones del NOA, conformando un agrupamiento que también
incorpora a gran parte de los individuos pertenecientes a las razas nativas de los Estados
Unidos, previamente clasificados en los grupos Este y Centro de EEUU (ECEU) y
Sudoeste de EEUU (SOEU). Para K=5, los individuos de Pisingallo se escinden, pasando a
formar parte de un nuevo conjunto cuya representación en el resto de los grupos definidos
a priori.ya sean regiones o poblaciones, es generalmente baja o nula.
A partir de K=3. es posible advertir la diferenciación de 6482 (Orgullo Cuarentón)
con respecto a las restantes razas del NOA. Para K=4 y K=5, aparece un nuevo grupo
constituido principalmente por los individuos de 6482 y un grupo de ejemplares de la zona
del Caribe (Car).
La comparación entre el esquema de relaciones obtenido a partir del método de
distancias y los resultados del análisis bayesiano, parece indicar una mayor sensibilidad
de este último método para Ia identificación de grupos con características genéticas
similares. Esto es, mientras que el único patrón aparente en el árbol de NJ fue la
asociación entre Pisingallo y las razas nativas de Estados Unidos (Figura 11), la afinidad
entre ciertas razas del NOA y los integrantes del Complejo Andino, como asi también, la
afinidad de Orgullo Cuarentón con el germoplasma del Can'be. no pudo ser detectada poresta vía.
96
H 1,2 T43! ¡4 llS 1,5 17
Figura 13.Análisis de la estructura poblacional de las razas del NOAy otras razas de Américamediante el método bayesiano. Cada línea verticalrepresenta a un individuo.Loscolores indicanla
contribución de cada una de las poblaciones identificadas en la constitución de los genomas
individuales. Las líneas negras consignan los límites entre poblaciones. K=número de poblaciones
inferidas en base al método bayesiano. 1: Caribe (Car); 2: Este y Centro de Estados Unidos (ECEU);
3: Guatemala y Sur de México (GuaSM); 4: Tierras altas de México (TAMex);5: Tierras Bajas del Norte
y Oeste de México (TBNOMex);6: Norte de México (NOMex); 7: Sudoeste de los Estados Unidos
R42. Diferenciacióngenética y gradientes altitudinales
Los patrones de variación clinal pueden originarse como consecuencia de procesos
demográficos, o bien, ser producto de fenómenos selectivos. Una forma de discernir entre
ambas posibilidades consiste en estudiar los patrones de estructuración resultantes del
análisis de marcadores neutros. como lo son los Iocimicrosatélites.
Con el objeto de establecer la relación entre la composición genética de las
poblaciones y las diferencias cromosómicas observadas. se utilizó el test de Mantel
(RAYMOND8. ROUSSET1995) a fin de determinar Ia existencia de asociación entre: a)
distancia geográfica y diferencia en el número medio de cromosomas B por individuo; b)
diferenciación genética y diferencia en el número medio de cromosomas B por individuo;
c) diferenciación genética y distancia altitudinal.
98
Para los Iocí microsatélites, el grado de diferenciación genética entre poblaciones
fue estimado a través del índices de fijación F51de Wright (WRIGHT1965; WRIGHT1978).
En la Tabla 14 se presentan los valores de FSTpara cada par de poblaciones. asl como la
distancia geográfica, distancia altitudinal
poblaciones.
y el módulo de la diferencia de E entre
A lo largo de una transecta altitudinal. la distancia geográfica se encuentra siempre
positivamente oorrelacionada con la distancia altitudinal. Sin embargo, las poblaciones aquí
analizadas no se distribuyen estrictamente sobre una transecta, razón por la cual es
necesario evaluar
independientemente de la relación entre distancias geográficas y diferencia de É .
relación entre distancias altitudinales y diferencia de
Tabla 14. Diferenciación genética, distancia geográfica, distancia altitudinaly diferencias en el número promedio de Bs por individuo entre laspoblaciones pertenecientes al gradiente altitudinal descripto por Rosato ycol. ‘19982.
mutacional fue inferido en base al análisis de distribución de tamaños alélicos (phi029,
phi059, phi121, phi127) (MATSUOKAet al. 2002a); Ill) aquellos cuyo modo de evolución no
habia sido determinado con anterioridad al presente estudio (nc135, phi037, phí069,
bnlg1700, bnlg1 165).
107
Discusión
Los alelos correspondientes a los 9 Ioci que integran los grupos ll y lll fueron
secuenciados a fin de establecer su modo de evolución y seleccionar el estadístico más
adecuado para el análisis poblacional. El análisis de los datos de secuencia reveló la
ausencia de ajuste al modelo SMMen 7 de los 9 loci examinados, como asl también una
alta incidencia de inserciones, deleciones y sustituciones en las regiones flanqueantes al
motivo de repetición (Figura 5). Si bien los 7 marcadores en cuestión podrian considerarse
casos excepcionales dentro del universo de los Ioci SSR de maíz, la concomitante falta de
ajuste en 46 de los 48 Ioci estudiados por Matsuoka y col. (2002a) parece indicar que las
desviaciones con respecto al modelo de evolución de a pasos son mucho más abundantes
que lo generalmente supuesto. En favor de esto último, diversos autores han señalado la
ocurrencia de fenómenos semejantes tanto en otros grupos de plantas (SALTONSTALL
2003; ADAMSet al. 2004; HALEet al. 2004) como en animales (ANGERS& BERNATCHEZ1997;
ORTI et al. 1997; COLSON& GOLDSTEIN1999).
Los patrones mutacionales encontrados en el grupo ll mostraron ciertas
discrepancias con respecto a lo inicialmente inferido por Matsuoka y col. (20023). El Iocus
phi121 ilustra el caso más evidente. Mientras que los tamaños alélicos hallados coinciden
con lo esperado para un focus SMM,el motivo microsatélite fue de difícil identificación en la
secuencia nucleotldica, presentando tan sólo dos a cuatro repeticiones contiguas (Figura
5a). Del mismo modo. la distribución de tamaños alélicos del Iocus phi059 es compatible
con un patrón mixto en donde las diferencias residen tanto en la región microsatélite
propiamente dicha, como en las regiones flanqueantes. Sin embargo, la mayoria de las
diferencias entre alelos se ubican en las zonas contiguas al motivo de repetición, según lo
demuestra el análisis de secuencias (Figura 5f). En este último caso, al igual que en los
Ioci phi127 y phi029, las discordancias observadas no influyen sobre la elección de los
estadísticos a emplear en el análisis poblacional, ya que ambos estudios coinciden en un
patrón no-SMM. Por el contrario. ejemplos como el del Ioci phi121 evidencian las
limitaciones del análisis de distribución de tamaños alélicos como herramienta para la
identificación de loci SMM.
La interrupción de un motivo microsatélite a causa de mutaciones puntuales,
inserciones o deleciones, tiene como consecuencia una reducción de los niveles de
polimorfismo debido a una menor probabilidad de “slippage” o "deslizamiento" de la enzima
ADN polimerasa (ESTOUP& CORNUET1999). Un argumento similar permite explicar la
correlación positiva observada entre la longitud de la zona de repetición y la tasa de
mutación (ESTOUP& CORNUET1999), lo cual se traduce en una menor variabilidad de
aquellos Ioci cuyos alelos poseen un bajo número de repeticiones.
108
Discusión
En efecto, la baja variabilidad hallada para el Iocus phi121 coincide con un motivo
de repetición interrumpido por dos mutaciones puntuales que, a su vez, restringen la
extensión de las repeticiones contiguas a un máximo de cuatro unidades (Figura 5a).
El tamaño de la unidad de repetición es también un factor determinante de los
niveles de variación, estando la tasa de mutación inversamente relacionada con el número
de bases que integran el motivo microsatélite (CHAKRABORTYet al. 1997; ESTOUP &
CORNUET1999). En humanos, la tasa de mutación de los loci SSR con unidades de
repetición constituidas por 2 pb es entre 1.5 y 2 veces mayor que la de los motivos de 3 y
4 pb no relacionados con enfermedades (CHAKRABORTYet al. 1997). En líneas generales,
los loci microsatélites aquí estudiados presentan un comportamiento semejante a lo
descripto en humanos, con un número de alelos mucho mayor en los loci dinucleotldicos
(Tabla 4, Tabla 11).
Una de las consecuencias del modelo SMM,o de sus generalizaciones derivadas,
es el surgimiento de variantes idénticas en estado pero no idénticas por descendencia, es
decir, la existencia de convergencia en el tamaño alélico.
A pesar de su evidente falta de ajuste al modelo SMM, los loci phi121, nc135.
phi037, phi069, phi029, phi059 y phi127 no pueden considerarse exentos de los efectos de
la homoplasia, dado que Ia gran abundancia de sustituciones, inserciones y deleciones en
las zonas flanqueantes a Ia región microsatélite también puede producir el surgimiento
independiente de alelos de igual tamaño.
El Iocus phi059 permite examinar en detalle Ia influencia de los fenómenos de
convergencia en los patrones de variación observados, debido a que se dispone de la
secuencia de más de un representante por variante alélica. El único ejemplo claro de
convergencia surge de Ia comparación del alelo 152 proveniente de la raza 6482 con el
correspondiente a la linea Tzi10, en donde ambas variantes alcanzan igual tamaño merced
a dos eventos de inserción independientes (Figura 5f).
En la mayoria de los casos, sin embargo, las diferencias entre las secuencias de los
alelos de igual longitud provenientes de diferentes poblaciones, lineas, subespecies y
especies de Zea, consistieron en un número variable de sustituciones puntuales en las
regiones contiguas al motivo microsatélite (Figura 5f). Estas sustituciones confirman la
coexistencia de diferentes secuencias nucleotidicas dentro de cada una de las categorias
alélicas definidas en base a la longitud de los electromorfos. No obstante, la información
disponible no permite determinar si se trata de un proceso de divergencia a partir de un
antecesor común de igual tamaño o de un caso de convergencia. En la Figura 14 se
esquematizan los dos posibles escenarios para explicar la variación observada. De
109
Discusión
acuerdo con la primera hipótesis, todas las variantes de igual longitud compartirían un
antecesor común, conformando un grupo monofilético.Según la segunda hipótesis, los
AldoL-Pob.A
Figura 14. Hipótesis de relación entre variantes de secuencia de alelos de igual longitud. lui L:longitud en pares de bases; Ü Si : sitio polimórficocorrespondiente a la posición i, O Sj: sitio polimórficocorrespondiente a Iaposiciónj. Loscolores indicanloscambios de estado de carácter.
alelos de igual longitud no necesariamente comparten un antecesor común, es decir, el
surgimiento de variantes de igual tamaño se produjo independientemente al menos dos
veces, como es el caso del alelo 152 del locus phi059.
EI impacto de cada una de las situaciones planteadas sobre las estimas de
diferenciación poblacional es potencialmente distinto. Mientras que en el primer caso el
tamaño alélico conserva parte de la señal fllogenética, en el segundo, esta señal puede
llegar a desaparecer por completo. La discriminación entre ambas hipótesis requiere de la
evaluación de los alelos en un contexto fllogenético. En ausencia de esta información, la
contribución relativa de uno u otro proceso y su efecto sobre el conjunto de Ioci aquí
analizados sólo puede inferirsede manera especulativa en base a las caracteristicas de loslociconsiderados.
Bajo el modelo SMM, la tasa de mutación que da lugar a nuevos alelos es varios
órdenes de magnitud más alta que la de las mutaciones puntuales en la región
flanqueante, por lo tanto, la convergencia en el tamaño alélico es más probable que la
convergencia en el patrón de sustitución nucleotídica (hipótesis 2). Un ejemplo de ello es el
estudio de la variación del locus microsatélite Ots-2 en el salmón Oncorhynchus
tshawytscha (BLANKENSHIPet al. 2002) . En esta especie las secuencias contiguas al motivo
de repetición definen cinco haplotipos, dentro de los cuales se distribuyen la mayoría de lostamaños alélicos encontrados.
110
Discusión
Los Iocino-SMM,en cambio, abarcan un amplio espectro de situaciones, resultando
muy dificil hacer un balance entre la probabilidad de cambio en la longitud del alelo, a
causa de inserciones y deleciones, y la ocurrencia de mutaciones puntuales.
En las poblaciones de maíz estudiadas, los locí que resultaron compatibles con el
modelo SMMde acuerdo con el análisis de secuencia (bn/91700 y bnlg1650) no mostraron
variabilidad alguna en las regiones flanqueantes al motivode repetición, indicando una baja
incidencia de homoplasia, o al menos de homoplasia detectable sensu Estoup y col.
(2002). Por su parte, la heterogeneidad de los patrones de variación observados en los loci
no-SMM y la falta de un contexto fllogenétioo apropiado, no permiten sacar conclusiones
acerca de la incidencia de la homoplasia en cada uno de ellos.
Teniendo en cuenta la información proveniente de las pruebas de progenie, los
datos correspondientes a las secuencias nucleotldicas obtenidas en esta tesis, y los
niveles de variación observados para cada uno de los Ioci, es posible distinguir dos grupos
de marcadores dentro del conjunto de loci analizados. Por un lado, los Iocide la serie bnlg,
compuestos únicamente por motivos de repetición de 2 pb, presentan un alto grado de
polimorfismo y ajustan al modelo SMM. Por el otro, tanto los marcadores de la serie phi
como el de la serie nc, con motivos de repetición de entre 2 y 5 pb, muestran niveles de
variación más bajos y ausencia de ajuste al modelo SMM.
Si bien es cierto que el número de Ioci analizados en esta tesis puede no ser
representativo de cada una de las series, el alto grado de polimorfismode Ia serie bnlg fue
previamente verificado en la evaluación de los 99 Ioci estudiados por Matsuoka y col.
(2002b) y Liuy col. (2003). Asimismo, como se mencionara anteriormente, el análisis de 46
Ioci de la serie phi mostró también que sólo dos eran compatibles con el modelo SMM,
siendo uno de ellos el Iocus phi121 (MATSUOKAet al. 2002a). El patrón de variación
observado por Matsuoka y col. (2002a) llevó a proponer la denominación lRR (lndel Rich
Regions, del inglés regiones ricas en inserciones y deleciones) para este tipo de
marcadores, resaltando asi el origen de las diferencias con respecto a los loci SSR
convencionales. A pesar de ello, gran parte de estos marcadores siguen siendo
ampliamente utilizados en la caracterización de líneas y poblaciones de maíz (VVARBURTON
et al. 2002; REIF et al. 2004; SANTACRUZ-VARELAet al. 2004).
Independientemente de la identidad de las series, es evidente que existe una gran
heterogeneidad entre los IociSSR y que la aplicación de los estadísticos desarrollados bajo
los supuestos del modelo de mutación de a pasos no siempre está justificada.La inclusión simultánea de ambas clases de Ioci microsatélites en estudios
poblacionales, como es el caso del presente trabajo de tesis, plantea la necesidad de
111
considerar ciertos aspectos. Para los Ioci no-SMM, las únicas herramientas de análisis
disponibles son las medidas de diferenciación y distancia que sólo tienen en cuenta Ia
identidad de los alelos (índice de fijación FST,distancia genética de Nei o Ds). Los Ioci
SMM,en cambio. requieren de la elección entre las medidas mencionadas y aquellas que
incorporan, además, la información del tamaño alélico (R51, óuz). Cuando la tasa de
mutación es baja, o bien cuando el tiempo de divergencia entre las entidades consideradas
es corto. ambos tipos de estimas convergen en un mismo valor (HARDYet al. 2003). En
esta situación. tanto los loci no-SMM corno los SMM pueden ser reunidos en un mismo
análisis considerando exclusivamente la identidad de los alelos. De hecho. aún cuando
todos los marcadores evolucionen siguiendo el modelo de mutación de a pasos, las
medidas FSTy Ds resultan más indicadas por presentar menor varianza (BALLOUX8. LUGON
MOULIN2002; HARDYet al. 2003).
Por el contrario. cuando la tasa de mutación es alta, o el tiempo de divergencia es
mayor. FSTy Dstenderán a subestimar las diferencias en los loci SMM, con lo cual no será
posible analizar las dos clases de locidentro del mismo marco teórico.
La prueba propuesta por Hardy y col.(2003) evalúa la contribución de los procesos
mutacionales en la diferenciación poblacional a través de la comparación de los indices RST
y FST.permitiendo establecer así, cuáles son los estadísticos más apropiados para el
análisis de los datos en estudio (para más detalles ver Materiales y Métodos, sección
M2.3.5.1.). El análisis de los Ioci SMM correspondientes a las poblaciones de maíz del
NOA reveló la ausencia de diferencias significativas entre las estimas globales de ambos
parámetros (Tabla 10), indicando que, en general, las diferencias en el tamaño de los
alelos no constituyen una medida del grado de divergencia entre las poblaciones. Estos
resultados avalan el análisis conjunto de los 18 Iocitipificados, a pesar de las discrepancias
detectadas en los patrones mutacionales subyacentes.
Las evidencias presentadas en los párrafos precedentes permiten arribar a tres
conclusiones principales: 1) no todos los Ioci SSR de maiz evolucionan de acuerdo con el
modelo SMM;2) la falta de ajuste al modelo SMM no garantiza la ausencia de fenómenos
de convergencia, y por ende. tampoco asegura la mayor idoneidad de los Ioci no-SMM
para comparaciones interespecíficas; 3) el análisis conjunto de Ioci SMM y no-SMM puede
distorsionar las medidas de diferenciación y distancia genética, a menos que se verifique
una baja incidencia de los procesos mutacionales en la divergencia de las poblacionesconsideradas.
En resumen. los resultados obtenidos dan cuenta del gran número de factores
involucrados en la variación de los marcadores microsatélites y ponen de manifiesto la
112
Discusión
importancia de una exhaustiva evaluación y selección de los mismos como paso previo a
su incorporación en estudios poblacionales.
Ds. DISTRIBUCIÓN DE LA VARIABILIDADGENÉTICA
D3.1.Estructura genética intrapoblaclonal
En las especies vegetales, el sistema de fecundación es uno de los factores de
mayor influencia sobre la estructura genética de las poblaciones. Distintos niveles de
autofecundación pueden dan lugar a patrones endogámicos. alterando las proporciones
genotlpicas esperadas bajo Ia hipótesis de panmixia.
El maiz es una especie diclino-monoica de fecundación cruzada y polinización
anemófila. Las inflorescencias masculinas coronan la planta en el ápice del tallo y
generalmente maduran en forma más temprana que las femeninas, ubicadas en el ápice
de los primordios de las ramas laterales. En concordancia con lo esperado para
organismos de fecundación cruzada, cinco de las ocho poblaciones analizadas mostraron
un patrón general de ajuste a las proporciones de Hardy-Weinberg (Tabla 9). Por el
contran'o, las poblaciones 6476. 6482 y 6480 evidenciaron un exceso de homocigotas (FIS:
0,134-0,220).
Diversos argumentos han sido utilizados para explicar el exceso de homocigotas en
especies fundamentalmente alógamas: errores experimentales, agrupamiento espacial de
individuos, selección y apareamiento preferencial.
Reif y ool. (2004) analizaron la variabilidad microsatélite en 23 poblaciones
artificiales conservadas en el CIMMYT,encontrando en todas ellas una alta proporción de
loci que mostraban un exceso significativode homocigotas (14-40%), aún bajo un diseño
experimental especialmente concebido para asegurar Ia unión al azar de gametas. Estos
desvlos fueron interpretados como consecuencia de errores experimentales relacionados
con la tipificación del los Ioci SSR. Sin embargo, dichos errores dificilmente explican los
resultados similares obtenidos mediante RFLPs (DUBREUIL8. CHARCOSSET1998) y
marcadores isoenzimátioos (KAHLERet al. 1986)
Dubreuil y Charcosset (1998) sugirieron que las diferencias en el tiempo de
maduración de inflorescencias masculinas y femeninas podrian llevar a un apareamiento
preferencial regido por la reproducción entre plantas de igual tiempo de floración. Según
esta hipótesis, sólo aquellos Ioci directamente relacionados con el periodo de floración, o
113
Discusión
muy próximamente ligados a ellos, presentarán desviaciones con respecto a la panmixia,
generando un patrón heterogéneo entre los locianalizados.
Pressoir y Berthaud (2004) estudiaron poblaciones de maíz mantenidas por
cultivadores locales del Valle de Oaxaca, México, utilizando marcadores SSR. La mayor
parte de las poblaciones mostraron un exceso de homocigotas, exhibiendo, además,
diferencias significativas en los índices F.s obtenidos a partir de los diferentes Iocí. En
congruencia con lo esperado según la hipótesis de apareamiento preferencial, las
poblaciones con mayores desvíos presentaron una correlación negativa entre el grado de
parentesco y la divergencia promedio en el tiempo de floración. Del mismo modo, los tres
loci SSR cuyo índice F.s fue significativamente más alto, phi011, phi024 y phi452693,
resultaron estar ubicados en las proximidades de tres genes involucrados en la floración,
con estas diferencias, el reciente relevamiento de los niveles de diferenciación obtenidos
para poblaciones oo-especlficas de especies vegetales utilizando marcadores SSR dio
como resultado un F51promedio de 0,26t0,17 (NYBOM2004).
En el maiz, el único registro documentado de la distribución de la variabilidad de Iocí
microsatélites en poblaciones locales de razas nativas es el ya mencionado estudio de
Pressoir y Berthaud (2004). Las poblaciones analizadas por estos autores pertenecen al
mismo complejo racial, incluyendo diversos maices de grano blanco, y ocupan un área de
aproximadamente 100 Km. Las estimas de FST obtenidas a partir de 11 Ioci SSR
mostraron que la mayor parte de la variabilidad distribuida entre poblaciones derivaba de la
comparación entre parcelas de un mismo poblado (F57:0,011), mientras que tan sólo una
pequeña fracción oonespondía a la diferenciación entre localidades (FST:0,003).
A diferencia de lo hallado en las poblaciones del valle de Oaxaca, el componente de
variación inter-poblacional correspondiente al NOA alcanzó un valor de 14,6%. Factores
económicos y culturales relacionados con la dinámica de intercambio regional podrlan
considerarse suficientes para explicar la mayor diferenciación observada en las
poblaciones del NOA. No obstante, Ia inclusión de poblaciones correspondientes a distintos
complejos raciales podria constituir, asimismo, una fuente adicional de divergencia.
En base a las evidencias citogenéticas, morfológicas e históricas disponibles, las
poblaciones del NOAincluidas en este estudio pueden ser tentativamente asignadas a tres
grupos raciales diferentes (CAMARA HERNANDEZ & MIANTE ALZOGARAY, com. pers.;
MCCLINTOCKet al. 1981; ROSATO1997). Éstos son: a) los maices del Complejo Andino,
definido por McCIintock y col. (1981) de acuerdo con el número y posición de bandas
heterocromáticas o knobs (poblaciones 6473, 6167, 6476, 6484, 6480, 6485); b) los
maices correspondientes a las denominadas razas “incipientes”, surgidos como
consecuencia de Ia incorporación de germoplasma comercial en los materiales autóctonos
(población 6482); c) los maices reventadores o popcoms (población 6313).
En concordancia con las afinidades propuestas, el patrón de estructuración obtenido
permite distinguir, a su vez, tres grupos principales. El primero está compuesto por las
poblaciones 6484, 6480, 6485 y 6167, pertenecientes a las razas Amarillochico, Amarillo
grande, Blanco y Altiplano (FST:0,0263-0,048), incluyendo también a la algo más
116
diferenciada población de Altiplano 6473 (F37: 0,1686-0,2303) (Tabla 11). Si bien los
niveles de diferenciación exhibidos por Ia población 6473 en las comparaciones de a pares
pueden llevar a poner en duda su inclusión dentro de este grupo, el análisis de la
distribución alélica reveló que los variantes halladas en 6473 conforman un subconjunto de
lo encontrado en 6167, 6484, 6476, 6480 y 6485. Por otro lado, los valores de FST
obtenidos son compatibles con lo esperado para poblaciones marginales, fuertemente
influidas por los efectos de la den'va. De este modo, los reducidos niveles de variabilidad y
los relativamente altos niveles de diferenciación encontrados en 6473 concuerdan con la
condición marginal de esta población, previamente sugerida por Rosato y col. (1998) en
base a su localización geográfica.
Por su parte. los dos grupos restantes están integrados por un único representante:
la población 6482 de la raza Orgullo Cuarentón. con niveles de diferenciación intermedios
con respecto al primer grupo; y la población 6313 de la raza Pisingallo, que presenta los
valores de FSTmás altos en todas las comparaciones de a pares (Tabla 11).
Los índices FST pueden ser interpretados como una medida del flujo génico entre
poblaciones que han alcanzado el equilibrio entre migración y deriva bajo un modelo isla
continente, o bien, como una medida del tiempo de divergencia entre poblaciones
totalmente aisladas (NlELSEN& SLATKIN2000). En la práctica, sin embargo, los métodos
convencionales no permiten determinar hasta qué punto las similitudes genéticas
observadas son consecuencia del flujo génico actual, o si por el contrario reflejan una
asociación histórica entre las poblaciones consideradas. La gran coincidencia entre los
niveles de diferenciación obtenidos y el origen racial de las poblaciones estudiadas sugiere
que la asociación histórica entre ellas es un factor determinante de la estructura
poblacional hallada.
117
Discusión
D4. LAS RAZAS DEL NOA Y su RELACIÓNCON LOS COMPLEJOS RACIALES DE
AMÉRICA
Las relaciones evolutivas entre las razas de maiz han sido establecidas
fundamentalmente en base a las características morfológicas y origen geográfico de las
mismas (para una revisión exhaustiva ver GOODMAN& BROWN1988). Desde el punto de
vista genético, uno de los primeros estudios en intentar establecer grupos naturales fue el
análisis de la composición cromosómica de las razas de América desarrollado por
McClintock y col. (1981). Posteriormente, diversos marcadores moleculares han sido
aplicados a la caracterización de las razas con el objetivo principal de cuantificar la
variabilidad genética, abordando sólo tangencialmente los aspectos relacionados con lasafinidades entre ellas.
Uno de los principales problemas para la interpretación de la información existente
es el enfoque regional, y en cierta medida fragmentario, de la mayor parte de los estudios
genéticos. Sumado a ello, las comparaciones entre regiones se ven distorsionadas por la
falta de homogeneidad en la nomenclatura de las razas, como así también en el concepto
de raza utilizado por los especialistas de cada pals (GOODMAN& McK. BIRD1977). Asi,
mientras que la diversidad genética de las razas de México (DOEBLEYet al. 1985b),
Guatemala (BRETTINGet al. 1990), o Sudoeste de los EE.UU. (DOEBLEYet al. 1983b), por
citar algunos ejemplos, ha sido descripta en detalle, la integración de dichos datos no ha
ido más allá de referencias parciales entre los distintos trabajos. Como excepción a esto
último, las contribuciones realizadas por McClintocky col. (1981) y Matsuoka y col. (2002b)
resultan especialmente valiosas, dado que comprenden la totalidad del espectro de loscultivos autóctonos de maíz.
A pesar de las limitaciones mencionadas, algunos complejos raciales emergen
consistentemente a partir de los estudios morfológicos, citogenéticos y moleculares. En
particular, una de las entidades más frecuentemente reconocidas es el denominado
Complejo Andino (MCCLINTOCKet al. 1981) o Complejo Andino Central (GOODMAN& McK.
BIRD1977). Sus integrantes incluyen a la mayor parte de las razas andinas, principalmente
aquellas correspondientes a las regiones de altura que se extienden desde Ecuador hasta
Chile, y se caracterizan por poseer mazorcas más pequeñas y redondeadas, con granos
elipsoidales y coloreados de tipo harinoso (GOODMAN& McK. BIRD 1977). La raza
Pisingallo, o Písinkalla, también se encuentra asociada a regiones andinas de altura. Sin
embargo, su pertenencia al complejo no parece estar avalada por ninguno de los
caracteres utilizados en la delimitación del mismo, siendo habitualmente incluida dentro de
118
los maíces “reventadores” o popcoms del Sur de América (GOODMAN& McK. BIRD1977;
SANTACRUZ-VARELAet al. 2004).
Como ya se mencionara en las secciones precedentes, cuatro de las razas
analizadas en el presente estudio. Altiplano (6473), Amarillo Grande (6484), Amarillo chico
(6476. 6480) y Blanco (6485), pueden ser tentativamente asignadas al Complejo Andino en
base a sus características morfológicas (Cámara Hernández y Miante Alzogaray,
com.pers.) y citogenéticas (ROSATo1997). La población de Pisingallo (6313) puede ser
considerada parte del grupo de los reventadores de América del Sur. mientras que Orgullo
Cuarentón (6482) constituye una de las llamadas razas “incipientes”,surgida a partir de la
incorporación de germoplasma comercial a los materiales autóctonos.
Las relaciones obtenidas a partir del árbol de NJ construido considerando
únicamente las razas del NOA(Figura 9) son consistentes con los grupos propuestos, con
la posible excepción de 6476, que se asocia a 6482 y 6313 en la partición con mayor
soporte. Pese a no contradecir las afinidades sugeridas, los resultados de este análisis
son insuficientes para establecer el vinculo entre cada uno de los grupos y los
correspondientes complejos raciales.
El análisis conjunto de los individuos del NOA con los datos correspondientes a las
razas del continente americano (MATSUOKAet al. 2002b) permitió confirmar Ia pertenencia
de las poblaciones 6476. 6473, 6484. 6480 y 6485 al Complejo Andino (Figura 13). Este
patrón solamente pudo ser detectado a través del metodo bayesiano, y no así mediante
las reconstrucciones generadas en base a los métodos convencionales de distancia y
agrupamiento (Figura 11). Una situación similar se presentó al considerar la raza Orgullo
Cuarentón (6482), cuya afinidad con el germoplasma del Caribe sólo se manifiesta en el
análisis bayesiano (Figura 13). Un resultado particularmente sorprendente es la asociación
de los individuos de la población de la raza Pisingallo del NOA (6313) con el conjunto de
razas nativas originarias de EE.UU. A diferencia de los casos anteriores. esta relación fue
puesta en evidencia tanto por el análisis de distancia (Figura 11) como por el método
bayesiano (Figura 13).
De este modo, mientras que la inclusión de las razas Altiplano, Amarillo grande,
Aman'llo chico y Blanco dentro del Complejo Andino coincide con Io esperado, las
asociaciones observadas para Orgullo Cuarentón y Pisingallo resultan algo más difícilesde
interpretar.
Eventos relativamente recientes vinculados con los procesos de intercambio
agronómico y comercial permiten dar cuenta de Ia relación observada entre Orgullo
Cuarentón y las razas del Caribe. Por un lado, la raza caribeña Cuban Flintes considerada
producto de la introducción en Cuba de germoplasma argentino a principios del siglo XX
119
Discusión
(Hathaway (1957) citado en GOODMAN& BROWN 1988). Considerando Ia naturaleza
incipiente de la raza Orgullo Cuarentón, el patrón de asociación resultante del análisis
bayesiano podría ser fácilmente explicado asumiendo Ia existencia de algún tipo de
relación entre las variedades comerciales involucradas en el origen de dicha raza y las
introducidas en Cuba entre 1910 y 1930. Pese a ser tentadora, esta hipótesis no parece
ser apoyada por los resultados de Bretting, Goodman y Stuber (1987b). Según estos
autores, el análisis de Ia variabilidad enzimática de los materiales del Caribe, reveló un alto
grado de similitud entre todas las razas de la región, incluyendo a Cuban Flint, y la
ausencia de un vínculo evidente con un conjunto de maíces argentinos pertencientes al
grupo de los Catetos.
Por otra parte, Ia intervención en el surgimiento de Orgullo Cuarentón de algunas de
las variedades de maíz dentado antiguamente cultivadas en el cinturón maicero de EE.UU.,
muchas de ellas fuertemente influenciadas por la contribución de germoplasma del Caribe
(GOODMAN8. McK. BIRD 1977; GOODMAN& BROWN 1988), no puede ser descartada,
teniendo en cuenta que el origen de esta raza se remonta aproximadamente a la década
del '60 (CAMARAHERNANDEZ& MlANTEALZOGARAY,com. pers.).
Con respecto a la raza Pisingallo, Santacruz-Varela y col. (2004) describieronrecientemente las relaciones entre los maíces reventadores de América del Norte en base
a caracteres morfológicos, alelos isoenzimáticos y alelos microsatélites. El análisis incluyó,
además, diversas razas reventadoras de América del Sur, entre las que se cuentan las 4
entidades de origen argentino Pisingallo, Perlita, Periita Mediano y el renombrado
Argentine Pop. El árbol de NJ obtenido por dichos autores agrupó a las tres últimas con los
maíces reventadores de las tierras bajas de la región guaranltica (Argentina, Brasil y
Paraguay), conformando un cluster notablemente alejado de la raza Pisingallo, la cual
quedó incluida dentro del grupo de los maíces de ápice aguzado o “puntiagudos” (pointed)
junto con otros maíces latinoamericanos (Palomero Toluqueño, Canguil, Confite
Puntiagudo y Pisinkalla de Bolivia)y dos representantes de América del Norte (White Rice
Pop y Acoma Pueblo).
La morfología de las cariópsides y la distribución de frecuencias alélicas
correspondientes a los Iociphi127, phi121 y phi029 sugieren que la población de Pisingallo
(6313) analizada en el presente estudio también puede ser asignada al grupo de maíces
reventadores de ápice aguzado. Lamentablemente, los análisis de agmpamiento no
permiten confirmar la asignación propuesta debido a la escasa representación de los
maíces reventadores en el conjunto de datos utilizados para Ia comparación de las
poblaciones del NOAcon el resto de las razas del continente americano.
120
Discusión
Otro punto interesante del trabajo de Santacruz-Varela y col. (2004) es la afinidad
genética encontrada entre las razas reventadoras de ápice aguzado de América Latina
(LatinAmerican Pointed Popcom) y aquellas del mismo tipo, pero procedentes de América
del Norte (North American Pointed Rice Popcom), así como la estrecha relación entre
ambas y el conjunto denominado Norteamericano Temprano (North American Eariy), que
comprende a los primeros accessions de maíces reventadores ingresadas en los bancos
de germoplasma de EEUU. Por otro lado, la inclusión de las razas Tama Flint y Fairfax
Brown dentro del mismo cluster que los reventadores tempranos es particularmente
notable, ya que ninguna de ellas es de tipo popcom. Tama Flint representa a los maíces
cómeos y harinosos de Norteamérica (Northern Flints and Flours), mientras que Fairfax
Brown corresponde al complejo racial del Sudoeste de los EEUU (SANTACRUZ-VARELAet al.
2004). En forma análoga, la población 6313. el único maiz reventador incluido en este
trabajo, exhibe una clara asociación con dos grupos de razas nativas originarias de
EE.UU.: a) la categoría ECEU (Este y Centro de EE.UU.), fundamentalmente conformada
por los maíces cómeos y harinosos de Norteamérica; y b) la categoria SOEU (Sudoeste
de EE.UU.), en donde la mayor parte de sus integrantes pertenecen al complejo racial
Sudoeste (Figuras 11 y 13).
Las evidencias morfológicas, genéticas y arqueológicas disponibles (ver referencias
en SANTACRUZ-VARELAet al. 2004) permiten atribuir las similitudes entre los maíces
reventadores de ápice aguzado de todo el continente a la dispersión hacia el Norte y Sur
de América de una variante ancestral común proveniente de México en tiempos muy
anteriores a la conquista. Según McCIintock (1981), el germoplasma de tipo Pisingallo
habría sido introducido en América del Sur posteriormente al establecimiento del Complejo
Andino. pudiendo derivar tanto de las razas presentes en la zona central de México como
de otras con características similares procedentes de Guatemala. Otros autores, sin
embargo. han sugerido que los maíces reventadores de América del Sur habrían surgido
recientemente a partir de germoplasma originario de Paraguay, o bien, que habrian sido
desarrollados a fines de 1920 en las proximidades de la ciudad de Kansas, EE.UU., y
luego introducidos en el sur del continente (GOODMANa. MCK. BIRD1977).
Las marcadas discrepancias entre las cronologías propuestas, probablemente
reflejen la coexistencia de maíces reventadores de diferentes origenes en América del Sur.
Como ejemplo de ello, dos grupos visiblemente distintos pueden ser diferenciados entre los
maíces reventadores de la República Argentina. Un grupo más antiguo, típicamente
andino. relacionado con los maíces de la zona central de Méxicoy representado por la raza
Pisingallo; y otro aparentemente más reciente. asociado a las tierras bajas de la planicie
121
Discusión
mesopotámicO-chaqueña y representado por Argentine pop y las razas Perla y PerlitaMediano.
El patrón de distribución hallado es singulannente concordante con lo propuesto por
Horovitz (1935), quien sugirió que los maíces del Noroeste y de Ia planicie mesopotámico
chaqueña provendrían de dos centros de origen diferentes. coincidentes, a su vez, con la
regiones ando-peruana y austrO-brasileña de agricultura pre-hispánica.
DS. ADN ANTIGUO: UNA HERRAMIENTA PARA EL SEGUIMIENTO TEMPORAL DE
LOS PATRONES DE VARIACIÓN GENETICA
La preservación de ácidos nucleicos en restos fósiles, arqueológicos y ejemplares
de museo provee una herramienta única para la observación directa de la composición
genética de los organismos y poblaciones del pasado. Pese a su gran potencialidad, la
recuperación y amplificaciónde ADNa partir de este tipo de ejemplares presenta enormes
desafíos metodológicos debido a las pequeñas cantidades de ADN conservado en los
mismos, a su naturaleza básicamente fragmentaria y a las altas probabilidades de
contaminación (POINAR2003).
Desde sus comienzos en la década del '80, y tras el entusiasmo inicial ante la
perspectiva de obtener información genética a partir de ejemplares con millones de años
de antigüedad, una serie de estudios de gran repercusión, pero dudosa veracidad. llevaron
a cuestionar los resultados de esta nueva disciplina. Asi, la recuperación de una porción
del gen RbcL a partir un fósil de compresión del género Magnolia de entre 17 y 20 millones
de años de antigüedad, o la amplificación de un fragmento de ADNmitooondrial a partir de
restos de dinosaurio, resultaron ser. finalmente, contaminantes (ver COOPER8. WAYNE
1998; WAYNEet al. 1999). Las evidencias surgidas a partir de estudios empln'cos acerca de
la tasa de degradación de ácidos nucleicos sugieren que la conservación del ADN es
sumamente improbable una vez pasada la barrera de los 100.000 años (LINDAHL1993;
Hoss et al. 1996). Sin embargo, la reciente recuperación de ADN vegetal a partir de
sedimentos congelados de ca. 400.000 años parece indicar que los plazos de
preservación son aún superiores a Io inicialmente supuesto (WILLERSLEVet al. 2003).
La definición de un conjunto de estrictos criterios de autenticidad (COOPER&
POINAR2000; POINAR2003), cuya aplicación se ha convertido en una condición sine qua
non de las investigaciones en ADN antiguo (ADNa). ha contribuido a restablecer la
credibilidad de la disciplina, otorgándole nuevo impulso.
122
Discusión
En las plantas, el número de estudios realizados en el campo del ADNa es
notablemente inferior a lo descripto en animales y humanos. A pesar de la gran
disponibilidad de especimenes fósiles y subfósiles —restos de madera, hojas, espinas y
granos de polen- la recuperación de ácidos nucleioos sólo ha sido posible en una pequeña
fracción de los materiales examinados (PARDUCOI& PETIT2004). Los estudios de mayor
trascendencia han sido llevados a cabo utilizando la secuencia de cloroplasto
correspondiente al gen RbcL y han estado principalmente vinculados con la caracterización
de la flora asociada a restos sedimentan'os de diferente antigüedad (WILLERSLEVet al.
2003), o con la reconstrucción de los hábitos alimenticios de humanos y animales a través
de la identificación de los restos vegetales presentes en coprolitos de distinto origen
(POINARet al. 2001; HOFRElTERet al. 2003).
A pesar de su mayor facilidadde recuperación debido a estar presentes en múltiples
copias, la baja tasa de sustitución que caracteriza a los marcadores plastldicos no permite
estudiar las diferencias temporales ni individuales a nivel poblacional. Frente a esto último,
todos los estudios de ADNa relacionados con plantas domesticadas han debido recurrir a
regiones más variables, demostrando la factibilidadde recuperación de regiones nucleares
tanto en maíz (GOLOUBINOFFet al. 1993; ROLLOet al. 1994; JAENICKE-DESPRÉSet al. 2003;
OLIVEIRAFREITASet al. 2003) como en tn'go, vid y otros cultivos (O'DONOGHUEet al. 1996;
Los marcadores microsatélites empleados en este trabajo presentan un alto grado
de polimorfismo, lo cual permite examinar la diversidad genética en ejemplares
arqueológicos considerando únicamente la longitud de los fragmentos y sin tener que
recurrir al estudio de cambios puntuales en la secuencia nucleotídica. Este hecho Ofrece
una ventaja evidente al considerar las alteraciones químicas sufridas por los ácidos
nucleioos durante el proceso de conservación y que generalmente redundan en cambios
mutacionales difíciles de distinguir de aquellos con significado evolutivo. Estudios
realizados en humanos han sugerido que los Ioci SSR dinucleótidicos pueden presentar
problemas de inconsistencia en la tipificación de ejemplares arqueológicos debido a Ia
generación de moléculas quiméricas surgidas por el aparemiento de fragmentos de ADN
cuya amplificación quedó interrumpida en la región repetitiva (RAMOSet al. 1995; CULJKOVIC
et al. 2003). Sin embargo, ninguno de los Ioci incluidos en el presente estudio mostró
evidencias de este tipo de fenómeno. Por un lado. los marcadores utilizados no son
dinucleotidicos y la porción repetitiva es proporcionalmente pequeña con respecto a la
longitud total del fragmento. Asimismo, la metodologia utilizada por Ramos y col. (1995) no
se ajusta a los procedimientos necesarios para el análisis de ADN antiguo, IO cual
permitiría identificar a las moléculas quiméricas.
123
Discusión
05.1. Criterios de Autentlcldad
Como se mencionó en Ia sección precedente, un aspecto fundamental en cualquier
trabajo de ADNantiguo es la verificaciónde los criterios de autenticidad. Pese a ello, tal
como lo señalaran Parducci y Petit (2004), no siempre es posible satisfacer las exigencias
impuestas por cada una de las diez reglas estipuladas por Cooper y Poinar (COOPER&
POINAR2000; POINAR2003). En el presente estudio, de acuerdo con los tres primeros
criterios, las extracciones de ADNa partir de ejemplares arqueológicos fueron realizadas
en un recinto fisicamente aislado de las actividades de rutina. las amplificaciones
fueron validadas a través de los controles apropiados y la identidad de las secuencias fue
verificada a través del análisis de clones (ver Materiales y Métodos, secciones M2.1.2.2.
—M2.1.2.5.). Del mismo modo, los productos de amplificación obtenidos mostraron un
comportamiento molecular compatiblecon lo esperado para muestras arqueológicas, en
donde la probabilidad de amplificación se encuentra inversamente relacionada con la
longitud de los fragmentos (Tabla 6). El cn'ten'ode reproduclbilldad pudo ser corroborado
a través de rondas independientes de amplificación a partir de un mismo extracto de ADNo
de extractos independientes de un mismo individuo. En cuanto a Ia denominada
coherencia fiiogenétlca (phyiogeneticsense), las secuencias obtenidas mostraron altos
niveles de similitudcon las correspondientes a ejemplares actuales de maiz (Figuras 7 y 8).
Con relación a esto último, cabe destacar que las instalaciones en donde se realizaron
todos los procedimientos de extracción y caracterización de ADNa nunca fueron utilizadas
para el análisis de ejemplares actuales de malz, lo cual permite descartar la contaminacióncon materiales actuales como causa de los altos niveles de similitudobservados. Por otro
lado, la recuperación de secuencias correspondientes a retrotransposones de maíz (Tabla
7) confirma la presencia de ácidos nucleicos endógenos en los ejemplares arqueológicos
estudiados. La supervivencia de ácidos nucleicos en un conjunto de restos
asociados también pudo ser ccnstatada, particularmente, en el caso del locus phi127, en
donde lograron tipificarse entre dos y cinco ejemplares por sitio (Tabla 6).
Las evidencias presentadas claramente avalan la autenticidad de los resultados
obtenidos en el presente estudio, siendo tan sólo tres los criterios incumplidos (replicación
Independiente por otro grupo de investigación, cuantificación a través de PCR en
tiempo real y caracterización bioquímica, determinación de la cantidad, composición y
grado de deterioro de aminoácidos y otros residuos en las muestras arqueológicas).
124
05.2. Conservación de ácidos nucleicos en ejemplares arqueológicos del NOA
Los sitios arqueológicos generalmente albergan restos vegetales intactos o,
parcialmente modificados como consecuencia de la desecación o carbonización. Los
depósitos con mayor potencial para la recuperación de ácidos nucleicos son aquellos de
zonas árticas, cuevas de altura, y otros entornos fríos y áridos con caracteristicas similares
(WAYNEet al. 1999), como es el caso de los sitios del NOA que forman parte de este
trabajo (Tabla 2).
La tasa de éxito en la recuperación y amplificación de ADN que caracteriza a los
estudios de ADNa es muy inferiora lo observado en los ejemplares actuales, a lo cual se
suma el reducido número de muestras con las que habitualmente se cuenta. En especies
cultivadas, el número de ejemplares arqueológicos analizados por los estudios
desarrollados hasta la fecha. raramente excede los 10-15 individuos. llegando a alcanzar
cantidades algo superiores en el análisis de semillas. En la mayoría de los casos, resulta
dificilestablecer Ia tasa de éxito debido a que los resultados negativos son pocas veces
informados y, además, gran parte de los ejemplares son analizados en pool. Uno de los
escasos ejemplos disponibles es el estudio llevado a cabo por Brown y col. (1998) en
semillas de trigo carbonizado provenientes de un sitio griego de 3.000 años de antigüedad.
De las 90 semillas examinadas por estos autores. sólo cinco mostraron los productos de
amplificación esperados, correspondientes a 245 pb. de los genes de gluteninas de alto
peso molecular (HMW-High Molecular Weight glutenins). Un resultado poco sorprendente.
considerando que los fragmentos de ADNrecuperados a partir de los ejemplares de este
sitio tienen en promedio entre 50 y 70 pb (ALLABYet al. 1997).
En el presente trabajo, la presencia de ácidos nucleicos de origen endógeno pudo
ser verificada en 9 de las 57 muestras analizadas (15,8%). una cifra tres veces superior a
lo descripto por Brown y col. (1998). Diversos factores -diferencias en la longitud de los
fragmentos amplificados, diferencias en la antigüedad y ambientes de conservación de las
muestras- pueden explicar la superioridad observada; sin embargo, el estado de
carbonización de los ejemplares griegos, es sin duda. una de las diferencias más
significativas.
O'Donoghue y col. (1996) analizaron la conservación de llpidos y ácidos nucleicos
en un conjunto de semillas momificadas de rábano de 1.450-1.600 años de antigüedad,
recuperadas en el sitio egipcio Qasr Ibrim. La región correspondiente a la unidad de
repetición de un satélite alfoide (149 pb) pudo ser amplificada en 11 ejemplares
arqueológicos. El excelente estado de preservación de los llpidos extraídos de este
material llevó a proponer que el microambiente de las semillas momificadas retrasa la
degradación de las biomóleculas seminales. En este contexto, resulta notable que de los 9
125
Discusión
ejemplares tipificados en este estudio para el locus phi127, 5 corresponden a cariópsides,
al igual que los dos únicos ejemplares que lograron ser tipificados para el locus phi029.
Recientemente, Manen y col. (2003) estudiaron seis colecciones de Vitisvinifera de
distinta antigüedad. logrando recuperar y amplificar ácidos nucleicos a partir de dos
ejemplares conservados en condiciones de anegamiento (ca. 2.500 AP) y de un ejemplar
carbonizado (ca. 1.800 AP). Este trabajo es particularmente interesante ya que ha sido el
primero, y único publicado hasta el momento, en utilizar marcadores SSR en ejemplares
arqueológicos. Las amplificaciones estuvieron dirigidas a cinco regiones microsatélites de
entre 150 y 200 pb. De manera similar a lo observado para las muestras del NOA (Tabla
6), no todos los Ioci pudieron ser amplificados en los diferentes individuos. El ejemplar más
reciente mostró productos de amplificación para los cinco marcadores, mientras que los
dos restantes sólo lo hicieron para dos de ellos.
En lo que respecta a maiz, el primer trabajo en incluir una cantidad significativa de
especimenes arqueológicos fue el llevado a cabo por Oliveira Freitas y col. (2003), quienes
amplificaron un fragmento de 330 pb correspondientes al gen Adh2, a partir de 11
ejemplares procedentes de Brasil. cuya antigüedad comprende un periodo de entre 500 y
1.000 años. Por su parte, Jaenicke-Després y col. (2003) estudiaron 11 ejemplares de
entre 700 y 4.000 años de antigüedad hallados en diversos sitios de Méxicoy del Sudoeste
de EE.UU., pudiendo amplificar en todos ellos tres regiones correspondientes a distintas
porciones de los genes tb1 (107 pb), pbf (72 pb), y su1 (109 pb). El número de ejemplares
examinados en ambos casos, es marcadamente inferior al número total de muestras
examinadas en el presente trabajo (N=57).Sin embargo, la tasa de éxito es aparentemente
mucho mayor. Teniendo en cuenta que los dos estudios mencionados presentan una tasa
de éxito del 100%, un hecho muy poco probable para ejemplares arqueológicos. las
discrepancias observadas posiblemente se deban a la falta de registro de los intentosfallidos.
Los procesos de modificación post-modem constituyen un aspecto clave de los
estudios de ADN antiguo. Por lo tanto, si bien las sustituciones puntuales no son el centro
de interés del presente trabajo. los datos obtenidos a partir del análisis de clones proveen
una fuente adicional de información acerca de los niveles de degradación de los ácidos
nucleicos recuperados.
Dos tipos de alteraciones parecen afectar más frecuentemente el ADN de los
ejemplares arqueológicos: 1) procesos de hidrólisis que resultan en la deaminación de
bases. pérdida de purinas o pirimidinasa través dela ruptura de los enlaces N-glicosldicos;
126
Discusión
2) procesos oxidativos promovidos por la acción directa de agentes ionizantes, como la
radiación y los radicales libres (Hoss et al. 1996).
La deaminación de la citosina es la modificación predominante en los extractos de
ADNobtenidos a partir de ejemplares arqueológicos, dando como resultado la conversión
de citosina a uracilo (HOFREITERet al. 2001). En concordancia con estas observaciones.
11/ 24 sustituciones observadas en los clones correspondientes al Iocus phi127 resultaron
ser transiciones de tipo C/G-T/A, al igual que 19/26 identificadas para el Iocus phi029.
Considerando únicamente sustituciones únicas o singletons, descontando asl aquellas
sustituciones con posible significado evolutivo, 9/21 fueron transiciones de tipo C/G-T/A en
el Iocus phi127, mientras que esta proporción ascendió a 12/18 en el Iocus phi029 (Figuras
7 y 8). Esto sugiere que la mayor parte de las sustituciones observadas serian producto de
las alteraciones del ADN molde como consecuencia de la degradación y no
incorporaciones erróneas de la Taq polimerasa o de la maquinaria de replicación
bacteriana. ya que en este ultimo caso todas las sustituciones deberian encontrarse
igualmente representadas.
En el Iocus phi127, las dos sustituciones potencialmente informativas, las posiciones
88 y 96 del alineamiento, son también transiciones de tipo C/G-T/A(Figura 7), lo cual pone
en duda su interpretación desde el punto de vista evolutivo. Si bien es cierto que en el
individuo51 cinco de los seis clones estudiados presentaron una "T"en lugar de una “C”en
la posición 88. mientras que 4/6 presentaron una "A"en lugar de una "G"en la posición 96,
este patrón también es esperable en aquellos casos en que las moléculas de partida de la
amplificaciónsean muy pocas, oon lo cual las mismas modificaciones se verán trasladadas
a todos los productos (HOFREITERet al. 2001). En este sentido. cabe destacar que el
individuo 51 es el más antiguo de los especimenes estudiados, y probablemente, la
cantidad de ADNrecuperado en este caso haya sido menor. Sin embargo, resulta llamativo
que 4/6 clones presenten simultáneamente "T"y “A”en los dos sitios considerados, y que
lo mismo suceda en los clones lnd.22-c1 e lnd.39-c4. Teniendo en cuenta que la posición
96 es también polimórficaen los alelos actuales, los resultados obtenidos parecen ser más
compatibles oon la existencia de polimorfismos nucleotldicos en los sitios 88 y 96 del alelo
112. Por el contrario. al considerar el sesgo introducido por las modificaciones post-mortem
en la reconstrucción de las secuencias, las sustituciones observadas en el individuo40, en
donde la única base representada en las posiciones variables es la “T’. son consistentes
con una alta incidencia de procesos de deaminación en las citosinas.
El hecho que la mayor parte de las sustituciones observadas en el resto de los
ejemplares analizados sólo estuvieran presentes en un único clon es compatible oon la
existencia de un número considerable de moléculas en el comienzo de la amplificación. De
127
este modo. cada clon representa una molécula inicialdiferente, facilitando la discriminación
entre las sustituciones producto del estado de deten'oro del ADN y aquellas con significadoevolutivo.
Por último, los patrones de sustitución obtenidos son congruentes con lo esperado
para los ácidos nucleicos provenientes de ejemplares arqueológicos, sumando así unanueva evidencia en favor de la autenticidad de las secuencias halladas.
05.3. Inferencias poblacionales
Una de las facetas más interesantes de los estudios de ADNa es el análisis de los
cambios en la estructura genética de las poblaciones a través del tiempo. Una de las
primeras y más importantes contribuciones en este campo ha sido el estudio de los
haplotipos mitocondn‘alesobtenidos a partir de 380 representantes actuales y 96 huesos
subfósiles de la especie de pingüinos Pygoscelis ade/ie (LAMBERTet al. 2002). Este último
trabajo, al igual que otros similares, aunque de menor escala, realizados en osos pardos
(BARNESet al. 2002) y roedores subterráneos (HADLYet al. 2003). pone de manifiesto la
necesidad de contar con un marco de referencia adecuado para la interpretación de los
datos obtenidos a partir de los ejemplares “antiguos”, sean éstos fósiles, subfósiles o
arqueológicos.
En el presente estudio, la tipificación de los Ioci phi127, phi029 y phi059 en 147
individuosactuales pertenecientes a diversas razas nativas de maiz del NOA proporciona
el contexto necesario para la integración de los ejemplares arqueológicos. De acuerdo con
el método de asignación de Paetkau y col. (1995), e independientemente de su sitio de
origen. todos los especimenes arqueológicos tipificados a través de los mencionados
marcadores microsatélites presentaron una mayor afinidad con las poblaciones
correspondientes a las razas del Complejo Andino que con las razas Pisingallo u Orgullo
Cuarentón (Tabla 8). La ausencia de relación con la raza Orgullo Cuarentón resulta
esperable ya que, como se indicara previamente. esta entidad es de origen reciente. La
ausencia de relación con la raza Pisingallo es, en cambio, más intrigante, especialmente,
teniendo en cuenta que el ejemplar 20 del sitio Lorohuasi perteneceria a la raza Pisingallo
según sus caracteristicas morfológicas (Tabla 6).
Algunos autores han considerado que los métodos de asignación son en realidad
más útiles para refutar la pertenencia de un determinado individuoa una población dada y
no asi para establecer inequivocamente su origen. ya que siempre existe la posibilidad de
no haber incluido la “verdadera” población de origen en el muestreo realizado (CORNUETet
al. 1999). En las poblaciones del NOA analizadas, la raza Pisingallo se encuentra
128
Discusión
representada por una única población, con lo cual no es posible descartar la existencia de
otras poblaciones de esta raza cuyas frecuencias alélicas en los Ioci considerados sean
distintas a Io obtenido para 6313. No obstante, la ya señalada similitud entre las
frecuencias de esta última población y las del grupo de malces reventadores de punta
aguzada descripto por Santacruz-Varela y col. (2004) (ver sección D4) sugiere que las
frecuencias halladas podrian considerarse representativas de dicho grupo. Cabe recordar
entonces al otro conjunto de malces reventadores que actualmente se encuentran en la
República Argentina: los de la llanura mesopotámico-chaqueña. Si bien la antigüedad de
estos últimosen la zona está sujeta a discusión, la presencia en los sitios de Catamarca de
materiales provenientes de otras áreas podria contribuir a explicar las discrepancias
observadas entre la morfología y composición genética del individuo20.
Por otro lado. uno de los supuestos subyacentes a las asignaciones propuestas es
la retención de señal filogenética en las frecuencias alélicas observadas en las poblaciones
actuales. Es decir. se asume que la distribución actual de frecuencias aún refleja la
pertenencia de las poblaciones a un determinado gano histórico, y que las diferencias
génicas observadas son, principalmente, consecuencia de las distintas relaciones de
ancestralidad y no de la acción independiente de fuerzas evolutivas, como migración,
selección y deriva. El patrón de asociación observado en los análisis de agrupamiento
(Figura 13), al igual que el análisis de la diferenciación genética entre poblaciones
presentado en la sección 03.2, apoyan la validez de este supuesto.
Los restos arqueológicos de cultivos y animales domesticados. o en vías de
domesticación, constituyen indicadores clave para el estudio del proceso de producción y
distribución de alimentos en las sociedades del pasado. Schlumbaum y col. (1998)
encontraron que el trigo tetraploide ya era cultivado en los Alpes Suizos en una etapa muy
anterior a lo previamente supuesto. demostrando asi la utilidad del ADNa para detectar la
introducciónde nuevos cultivos o variedades en las prácticas agricolas locales.
Los tres Ioci analizados en los ejemplares arqueológicos aqul estudiados -phi059.
phi127 y phi029- mostraron una única variante alélica que es. a su vez. la más frecuente
en poblaciones actuales correspondientes a las razas AmarilloChico (6476, 6484), Amarillo
Grande (6480), Blanco (6485) y Altiplano (6167. 6473) (Tabla 6, Tablas A5, A6 y A7).
La gran uniformidad observada resulta particularmente llamativa considerando que
los sitios arqueológicos estudiados corresponden a diversos contextos socio-históricos del
desarrollo cultural -agro-pastoril local (Punta Colorada), estatal (Lorohuasi) e hispano
indígena (Tebenquiche)- y que las muestras analizadas fueron recuperadas tanto en
entornos domésticos como funerarios, con los distintos usos y carga simbólica que ello
129
Discusión
implica (Tabla 2). Por otro lado. las caracteristicas climáticas de los sitios son también
diferentes. El valle de Abaucán (Lorohuasi, Punta Colorada) dispone de sectores en ladera,
aptos para el cultivoatemporal o con escasa necesidad de riego artificial,mientras que en
la Puna (Tebenquiche) estos recursos son inexistentes. La falta de diferenciación hallada
puede derivar de la ausencia total de variación entre y dentro de las poblaciones que
dieron origen a los ejemplares arqueológicos, o bien de una estructura genética similar a la
de las poblaciones actuales 6476, 6484, 6480, 6485, 6167 y 6473, en donde prevalecen
las variantes alélicas halladas en los ejemplares arqueológicos, sin observarse diferencias
significativas entre sus frecuencias. Así, la probabilidad de extraer el alelo más frecuente
tomando un alelo al azar de la población es elevada e igual en todas ellas. De aceptar Ia
segunda posibilidad, la homogeneidad genética evidenciada es consistente con la
existencia de un flujo génico significativo, posiblemente asociado a la actividad humana,
entre las diversas razas de maiz cultivadas en el pasado. Una suposición que encuentra
sustento en los altos niveles de intercambio intra e inter-regional descriptos para el NOA
desde etapas muy tempranas (CASTROR. & TARRAGÓ1992; ALBECK2000; HOCSMANet al.
2004)
En conclusión, los resultados obtenidos no sólo han demostrado la factibilidad de la
extracción y análisis de ácidos nucleicos provenientes de ejemplares arqueológicos del
Noroeste Argentino. sino que además ofrecen interesantes perspectivas para
investigaciones futuras acerca de los patrones de dispersión del maíz en América del Sur y
para el seguimiento temporal de la dinámica de intercambio entre los sistemas agrarios de
tierras bajas y altas. La utilización de las técnicas de ADN antiguo en investigaciones
multidisciplinarias permitirá incorporar una nueva dimensión a los estudios arqueológicos y
evolutivos, redundando en una mejor caracterización y conservación del patrimonio
arqueológico de la República Argentina.
DG. CROMOSOMAS SUPERNUMERARIOS Y GRADIENTES ALTITUDINALES
La presencia y significado del mantenimiento de los cromosomas B en poblaciones
naturales ha sido objeto de estudio en numerosos grupos de organismos desde hace más
de 50 años (BLACKWOOD1956; JONES & REES 1982; CARLSON 1986; PORTER & RAYBURN
1990; CARLSON& ROSEMAN1992; JONES 1995).
Las diferencias poblacionales en el número y frecuencia de cromosomas B pueden
derivar de factores selectivos (tolerancia ecológica de los portadores en relación con la
permisividad del ambiente), factores históricos, factores de transmisión (diferencias en la
130
intensidad de las fuerzas de acumulación) y factores aleatorios (deriva) (CAMACHOet al.
2000)
Como se mencionara previamente, las razas nativas de maiz del NOA presentan
polimorfismos para el número de cromosomas B. contenido de heterocromatina (número
de bandas knob) y contenido de ADN. La frecuencia poblacional de cromosomas B y el
número medio de cromosomas B por individuo (É ) muestran una correlación positiva con
Ia altura, mientras que el contenido de heterocromatina disminuye a medida que aumenta
la altitud (ROSATO1997; ROSAToet al. 1998). Los patrones de variación clinal observados
fueron interpretados por Rosato y col. (1998) como consecuencia de la acción de fuerzas
selectivas tendientes a mantener un nucleotipo óptimo.
El significado adaptativo de muchos de los gradientes latitudinales y altitudinales
descriptos en la literatura ha sido verificado tanto para caracteres morfológicos como
al. 2001; STORZ 2002; STORZ & DUBACH2004). Sin embargo, los gradientes también
pueden originarse como consecuencia de procesos demográficos. Esto es. gracias a la
interacción entre den'va y flujo génico restringido, o merced al contacto secundario entre
dos poblaciones históricamente aisladas y previamente diferenciadas con relación al
carácter en cuestión. Bajo la hipótesis adaptativa, sólo aquellos caracteres o locí bajo
selección mostrarán un patrón de variación clinal. sin modificar por ello las frecuencias de
otros Ioci polimórficos neutros, no ligados. Los procesos demográficos. en cambio,
afectarán a todos los Iocidel genoma de igual manera.
Una aproximación frecuentemente utilizada para discriminar entre escenarios
adaptativos y demográficos es la comparación entre los patrones de diferenciación
observados para el carácter supuestamente sujeto a selección y los correspondientes a
marcadores neutros. En el presente estudio, el análisis de la variabilidad microsatélite en 7
poblaciones pertenecientes al gradiente altitudinal de cromosomas B permite poner a
prueba el significado adaptativo de la variación citogenética observada.
Si el gradiente altitudinal descripto para las poblaciones del NOA fuera
consecuencia de procesos demográficos, el grado de diferenciación genética entre
poblaciones, estimado a partir de los marcadores neutros (F51)(Tabla 14), deberia mostrar
un patrón similar al exhibido por la variable inicialmente vinculada al gradiente, en este
caso, el número medio de cromosomas B por individuo. Es decir, a mayor distancia
altitudinal entre las poblaciones consideradas. mayor deberá ser la diferencia de É . y la
diferenciación genética entre ellas. Visto de otro modo. se espera que exista una
asociación positiva entre las diferencias de É y la distancia genética entre poblaciones.
como asl también entre distancias genéticas y distancias altitudinales. Sin embargo,
131
Discusión
ninguna de las dos asociaciones resultó significativa al ser evaluada mediante el test de
Mantel (ver Resultados, sección R4.2.). y, en concordancia con esto último, ninguna de las
variantes alélicas de los Ioci microsatélites mostró un patrón de variación clinal con la altura
(ver Resultados, sección R4.1.). Estos resultados permiten descartar las hipótesis
demográficas para explicar el mantenimiento del gradiente, apoyando asi su significado
adaptativo.
Las explicaciones adaptativas se toman más convincentes cuando: a) el patrón de
variación clinal se verifica en diferentes áreas de la distribución; b) otros rasgos
funcionalmente semejantes varían concomitantemente; c) los patrones intra e
interespecificos son similares (JONAS& GEBER1999). En las razas nativas de maíz, el
estudio de las asociaciones entre cromosomas B y altitud ha arrojado resultados
contradictorios. Mientras que Bretting y Goodman (1989) hallaron una correlación negativa
al examinar 300 poblaciones de América Central. las investigaciones de Porter y Raybum
(1990) en 12 poblaciones de Arizona no detectaron asociación alguna entre cromosomas B
y altitud. AI mismo tiempo, los ya citados resultados de Rosato (1997) demostraron la
existencia de una asociación positiva entre ambas variables en 16 poblaciones del NOA.A
pesar de estas inconsistencias, la recurrente correlación negativa entre altitud y presencia
de bandas heterocromáticas o knobs (MANGELSDORF& CAMERON1942; LONGLEY& KATO-Y
1965; BENNE'IT1976; BRETTINGet al. 1987b; ROSATOet al. 1998), una característica que
puede ser considerada “funcionalmentesemejante" a los cromosomas B desde el punto de
vista citológico. constituye un argumento a favor de la hipótesis selectiva para el
mantenimiento del gradiente altitudinal descripto en las poblaciones del NOA aqui
analizadas.
Un gran número de investigaciones han puesto de manifiesto la naturaleza
parasitica o “egoista” de la mayor parte de los cromosomas supemumerarios estudiados
hasta el momento en una amplia gama de organismos (ver referencias en JONES& HOUBEN
2003). A diferencia del modelo heterótico, en donde los cromosomas supemumerarios se
mantienen gracias a ser selectivamente beneficiosos para el portador, el modelo parasitico
asume que la presencia de los cromosomas B en las poblaciones naturales es promovida
únicamente a través de sus propios mecanismos de acumulación e impulso (CAMACHOet
al. 1997). La abundancia de las evidencias en favor del modelo parasitico parece ser dificil
de conciliar con los resultados del presente trabajo. Sin embargo, la mayor frecuencia de
los cromosomas B en las poblaciones de altura del NOA no necesariamente implica la
existencia de efectos ventajosos directamente relacionados con los cromosomas B, sino
que también puede ser interpretada como un producto indirecto de la selección sobre otros
132
rasgos. Las evidencias disponibles en relación con ambas posibilidades se discuten acontinuación.
Algunos de los efectos registrados corno consecuencia de la presencia de
cromosomas B han resultado directamente atribuibles a los genes contenidos en los
mismos. Tal es el caso de el gen de resistencia a la roya descripto en Avena sativa y de la
resistencia a antibióticos en el hongo Nectn'a haematococca (CAMACHOet al. 2000). Los
cromosomas B de maíz tienen una composición básicamente repetitiva y comparten la
mayor parte de su secuencia con los autosomas (PEACOCKet al. 1981; CHENG& LIN2003;
CHENG& LIN2004). Sólo tres secuencias específicas han sido identificadas hasta el
momento, siendo todas ellas de tipo repetitivo. La secuencia descripta por Alfenito y
Birchler (1993), conocida como pZmBs, se localiza cerca del centrómero del cromosoma B
y muestra cierta similitud con las regiones neocentroméricas de los cromosomas del
complemento regular. Por su parte, Stark y col. (1996) encontraron una región rica en
secuencias A-T que no muestra señal de hibridación al utilizar ADN genómico total de
individuos sin Bs en experimentos de hibridación ¡n situ, pero cuya ubicación no ha sido
determinada con precisión. Más recientemente, Cheng y Lin (2003) hallaron una unidad de
repetición de aproximadamente 350 pb que pudo ser localizada en el knob centromén'co
del cromosoma B y a lo largo de casi un tercio del brazo largo. Si bien la caracterización
de los cromosomas B de maiz es aún incompleta, su naturaleza fundamentalmente
repetitiva y Ia ausencia de regiones codificantes específicas hacen poco probable que la
aptitud de los individuos portadores de cromosomas supemumerarios pueda verse
incrementada a expensas de los genes contenidos en ellos.
La presencia fisica de los cromosomas B ha sido relacionada con diversos
fenómenos genéticos y cromosómicos. En el saltamontes Eyprepocnemis plorans, Riera y
col. (2004) observaron que la presencia de cromosomas B era acompañada de un
incremento en la frecuencia de quiasmas y en la tasa de recombinación de los
cromosomas autosómicos. Efectos similiares han sido registrados para los cromosomas B
de malz (HANSON1969). Según Rhoades y Dempsey (1972). la heterocromatina de los Bs
de maiz promueve la recombinación en los A, posiblemente debido a su replicación tardía
que alarga la profase meiótica y aumenta las posibilidades de recombinación.
Además del incremento en la recombinación, otras consecuencias citológicas
parecen derivar de la presencia de cromosomas B. Chiavarino y col. (2000) estudiaron la
no disyunción y formación de micronúcleos en la última división mitótica de las células del
tapete en individuos con 1B y OBs pertenecientes a lineas de maiz de alta y baja
transmisión femenina de cromosomas B y encontraron que la presencia de cromosomas B
133
Discusión
provoca inestabilidad en los autosomas de ambas lineas, aunque con mayor severidad en
las líneas de baja transmisión. Sorprendentemente, al estudiar Ia viabilidad del polen para
las mismas lineas, ésta fue reducida en las lineas de alta transmisión y no asl en las de
baja (GONZALEZ-SANCHEZet al. 2004).
Por otro lado. Rhoades y Dempsey (1972) demostraron que la presencia de dos, o
más, cromosomas B conduce a la eliminación de porciones heterocromáticas autosómicas
en las células de la aleurona de maiz. De acuerdo con el mecanismo propuesto por estos
autores, los Bs retrasarlan la replicación de la heterocromatina de los knobs durante la
segunda división mitótica del grano de polen, produciendo la ruptura de ciertas porciones
cromosómicas y dando lugar a la formación de células espennáticas con cromosomas
incompletos. Asimismo, Ia presencia de Bs y la presencia de knobs serian requisitos
necesarios pero no suficientes para que se produzca la perdida de heterocromatina. lo cual
coincide con las diferencias en la estabilidad autosómica de las líneas de alta y baja
transmisión femenina observadas por Chiavarino y col. (2000). En este contexto. la
correlación negativa entre altitud y contenido de heterocromatina observada en las
poblaciones del NOAestudiadas por Rosato (1997) adquiere nueva relevancia en relación
con el gradiente de cromosomas B aquí estudiado. Grandes proporciones de
heterocromatina tienden a incrementar la duración del ciclo celular y se ha propuesto que
su presencia estaría negativamente seleccionada en condiciones de altura, en donde la
época favorable para el desarrollo del cultivo es muy corta y se requiere de una rápida
proliferación celular (PRYORet al. 1980; REEVESet al. 1998; BUCKLERet al. 1999). Si bien la
existencia de una interacción entre contenido de heterocromatina y cromosomas B como
causa del mantenimiento del gradiente aquí estudiado es especulativa, ya que la
asociación entre heterocromatina y cromosomas B no ha podido ser establecida para el
conjunto de poblaciones incluidas en este trabajo, no es posible descartar que la presencia
de los cromosomas B en las poblaciones de altura esté siendo seleccionada a favor debidoa su efecto sobre la cantidad de heterocromatina.
Por último, como fue señalado anteriormente. el aumento del número medio de
cromosomas B por individuoen las poblaciones de altura también podría producirse como
consecuencia indirecta de la selección sobre otros rasgos. En el maiz. la tasa de
transmisión está controlada por genes ubicados en el complemento regular. La tasa
masculina es gobernada por un único gen pro-B con dos estados alélicos, mB-TRh (del
inglés male B Transmission Rate high) y mB-TR-l (del inglés male B Transmission Rate
low) (CHIAVARINOet al. 2001), mientras que la tasa femenina estaria determinada por al
menos un gen, cuya variante de baja transmisión es dominante y promueve Ia pérdida de
134
Discusión
los cromosomas B (genes anti-B) cuando éstos se encuentran en dosis única (GONZALEZ
SANCHEZet al. 2003). Una posible explicación para eI establecimiento del gradiente es que
alguno de los grupos de genes de transmisión. ya sea genes pro-B o anti-B, se encuentren
ligados a otros genes que estén siendo blanco de la selección, con lo cual sus frecuencias
en las poblaciones tienden a aumentar o disminuir con la altitud, respectivamente, llevando
a un incremento del número promedio de Bs por individuo en las poblaciones de mayoraltura.
Los ejemplos citados ponen de manifiesto la diversidad de factores potencialmente
involucrados con las ventajas selectivas de los cromosomas supemumerarios. No
obstante, las evidencias disponibles son aún insuficientes para determinar cuál de ellos es
responsable de la formación y mantenimiento del gradiente altitudinal analizado en el
presente trabajo.
Los resultados aqui obtenidos confirman la naturaleza adaptativa del gradiente
altitudinal de cromosomas B observado en las poblaciones del NOA. Sin embargo, esto no
implica que Ia evolución de los cromosomas B de maiz deba ser encuadrada bajo el
modelo heterótico. La relación entre Bs y autosomas puede ser considerada un caso
particular de co-evolución huésped-parásito (FRANK2000). El comportamiento parasltico de
los Bs es mediado por los mecanismos de acumulación y conducción meiótica. Si la
acumulación de cromosomas B produce efectos deletéreos, el genoma huésped tenderá a
desarrollar estrategias de defensa que le permitan neutralizar la acumulación de los
cromosomas supemumerarios. Como resultado, aquellos cromosomas B capaces de
generar nuevas annas para superar el "ataque" del huésped persistirán en las poblaciones.
En una concepción similar, el modelo no equilibrado de evolución a largo plazo de los
cromosomas B (CAMACHOet al. 1997; CAMACHOet al. 2000) propone que la existencia de
un conflicto permanente entre partes del genoma con intereses distintos lleva al
establecimiento de una relación fluctuante, en donde la naturaleza de los Bs puede
cambiar de parasítica a neutra. llegando a convertirse en ligeramente beneficiosa.
dependiendo de la etapa del proceso en la que se encuentre. Por lo tanto. la participación
de fuerzas selectivas en el mantenimiento del gradiente altitudinal de las poblaciones del
NOA no estaria indicando un significado adaptativo para los cromosomas B de maiz a Io
largo de todo el rango de distribución del cultivo, sino que más bien constituye una
manifestación local de Ia compleja interacción entre cromosomas B y autosomas.
135
Conclusiones
Conclusiones
l. La variabilidad de los Ioci microsatélites tiene origen en numerosos procesos cuya
dinámica debe ser evaluada antes de su incorporaciónen estudios poblacionales.
II. Las razas nativas del NOA constituyen una importante fuente de diversidad para
ampliarla base genética de los programas de mejoramiento.
lll. Distintos grupos raciales contribuyen a la riqueza del germoplasma de la región. La
constitución genética de las razas Altiplano, Amarillo chico, Amarillo grande y Blanco
permite asignarlas al Complejo Andino, mientras que las razas Pisingallo y Orgullo
Cuarentón pertenecen a los malces reventadores y a las razas incipientes.
respectivamente.
IV. Los ejemplares arqueológicos estudiados son más afines a las razas del Complejo
Andino que a las razas Pisingallo y Orgullo Cuarentón.
V. La gran homogeneidad genética observada en los ejemplares arqueológicos es
consistente con la existencia de un flujo génico significativo. posiblemente asociado a la
actividad humana, entre las diversas razas de malz cultivadas en el pasado.
VI. El gradiente altitudinal de cromosomas B descripto para las poblaciones del NOAes
mantenido gracias a la acción de fuerzas selectivas. Las evidencias disponibles son aún
insuficientes para determinar la generalidad de este fenómeno en relación con el valor
adaptativo de los cromosomas B de maiz a lo largo de toda la distribución del cultivo.
Los resultados del presente trabajo ponen de manifiesto la gran riqueza genética,
morfológica y cromosómica de las razas nativas de Ia República Argentina. La
caracterización de un mayor número de ejemplares arqueológicos y actuales,
especialmente en la región mesopotámico-chaqueña, región cuyo relevamiento es
prácticamente inexistente. será de fundamental importancia para la búsqueda de alelos
agronómicamente valiosos y para poner a prueba las hipótesis relacionadas con la
introducción y dispersión del maíz en América del Sur.
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150
PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓNDE ADN
Dellaporta y col. (1983) modificado
Pulven'zar 200 a 300 mg de maten'al vegetal fresco en aire liquido.
Transferir a tubo eppendorf conteniendo 500 pl de bufl'erde extracción (100 mMTn's, 50
mM EDTA, 500 m M CINa) y 35 pl de SDS 20% (p/v).
Incubar durante 10 min. a 65 °C con agitación.
Agregar 175 pl de Acetato de Potasio 5 M pH 5.2.
Precipitar en hielo durante 20 min.
Centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min.
Transferir el sobrenadante (fase acuosa) a un tubo limpio.Agregar 1 volumen de Fenol
CIorofonno-Isoamíllco (25:24z1). Mezclar suavemente por inversión.
Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min.
Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
Agregar 1/10 volumen de Acetato de Sodio pH 5.2 y 2 volúmenes de Etanol
Dejar precipitar a -20 °C durante 2-3 horas.
Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min.
Descartar el sobrenadante y agregar 1 ml de Etanol 70% para el lavado.
Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min. y repetir el lavado.
Descartar el sobrenadante y dejar secar.
Resuspender en 100 pl de HZOestéril o buffer TE (0,01M Tris, 1 mM EDTA pH 8).
Agregar 2 pl de RNAsa (10mg/ml) e incubar a 37 °C durante una hora.Conservar a -20 °C.
Yang y col. (1998) modificado
El protocolo descripto a continuación requiere del uso de los reactivos y columnas de
purificación provistas por el QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen).
Pulverizar 200 a 300 mg del material a estudiar de manera apropiada según suscaracterísticas.
151
Transferir a un tubo conteniendo 1 mL de buffer de extracción (0,5 M EDTA pH 8, 0,5%
SDS) previamente calentado a 55 °C.
lncubar con agitación a a 55 °C durante 4-6 horas.
Centrifugar a 2.000 g durante 5 min.
Tomar 500 ul de sobrenadante y transferir a un tubo conteniendo 5 volúmenes (2.5 ml)
de buffer QIAquick PB.
Mezclar suavemente con vortex. No invertir.
Agregar 500 ul de muestra a la columna y centrifugar a 12.800 g durante 1 min. No usar
volúmenes mayores de muestra para evitar derrames. Descartar el líquidoeluido .
Repetir hasta haber transferido todo el volumen (3 ml).
Lavar agregando 600 ul de buffer QIAquick PE y centrifugar por 1 min. Descartar el
llquido eluido.
Agregar a la columna 100 ul de buffer QIAquick EB y centrifugar a 12.800 g durante 1
min recogiendo en un tubo eppendorf limpio.
Conservar el extracto a -20 °C
SOLUCIONES
Electroforesis de geles de agarosa
Buffer TAE 50X
Tris 242 gEDTA pH 8 0.25 M 25 mIÁcido Acético Glacíal 57,1 mlHZOdestilada hasta 1000 ml
Bufferde siembra
Glicerol 3 mIH20 destilada 7 mlAzul de Bromofenol pta. de espátula
Electroforesls de geles de pollacrllamlda
Buffer TBE 10X
Tris 108 gÁcido Bórico 55 gEDTA 9.3 gH20 destilada hasta 1000 ml
152
Solución stock Acrilamida-Bisacrilamida 19:1 30%
Acrilamida 285 gBis-acrilamida 15 gHZOdestilada hasta 1000 ml
Filtrary conservar a 4 °C
Mezcla para geles desnaturalizantes 6%
TBE 10X 10 mlAcrilamida-Bisacrilamida 30% 20 mlUrea 48 gTEMED (diamina de N.N.N.N'-Tetrametiletileno) 80 ulPersulfato de Amonio 25% p/v 80 plHZObi-destilada hasta 100 ml
Mezcla para geles nativos 10%
TBE 10X 2,5 mlAcrilamida-Bisacn'lamida 30% 8,4 mlTEMED (diamina de N.N,N,N’-Tetrametiletileno) 30 ulPersulfato de Amonio 10% p/v 175 plH20 bi-destiiada hasta 25 mi
Bufferde siembra
Formamida 950 plAzul de Bromofenol 1 mgXylene Cyanol 1 mgEDTA 0,5 M pH 8 20 ulHZOdestilada hasta 1000 ul
SECUENCIACIÓN
Protocolo de precipitación con isopropanol
Sobre 5 pl de muestra proveniente dela reacción de secuenciación
Agregar 20 ul de Isopropanol 75%.
lncubar en oscuridad a temperatura ambiente durante 45-60 min.
Centn'fugar a 13.000 rpm durante 20 min.
153
Descartar el sobrenadante y agregar 250 ul de isopropanol 75%. Mezclar porinversión.
Centn'fugar a 13.000 rpm durante 10 min.
Descartar el sobrenadante. Asegurarse de que Ia remoción haya sido completa. De
ser necesario oentrifugarbrevemente y tornar con pipeta el volumen restante.
Secar al vacío durante 5 min o durante 30 min. bajo campana.
Conservar a —20°C.
FRECUENCIAS ALÉLICAS
A continuación se presentan las frecuencias alélicas correspondientes a los Ioci
microsatélites analizados en el presente estudio (Tablas A1-A18). Se incluyen, además, las
equivalencias alélicas con lo descripto por otros autores para lineas y razas nativas del
continente americano. Los datos de las lineas fueron compilados a partir de Liu y col.
(2003), Matsuoka y col. (2002a) o tomados de la Maize Data Base (MDB)de acuerdo con
la disponibilidadpara cada Iocus, según se indica en las tablas adjuntas.
La categoría Otras razas de América hace referencia a las razas nativas descriptas
por Matsuoka y col. (2002a; 2002b). En aquellos casos en donde fue posible, la
informaciónfue desglosada siguiendo el esquema de divisióngeográfica propuesto por losautores.
La nomenclatura de los alelos se mantuvo de acuerdo con los trabajos originales. El
tamaño de la muestra (N)corresponde al número de alelos estudiados.