DISTRIBUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR Streptococcus iniae EN DIFERENTES ÓRGANOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp) Y TILAPIA NILOTICA (Oreochromis niloticus) DIAGNOSTICADO POR PCR EN TIEMPO

DISTRIBUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR Streptococcus iniae EN

DIFERENTES ÓRGANOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp) Y TILAPIA

NILOTICA (Oreochromis niloticus) DIAGNOSTICADO POR PCR EN

TIEMPO REAL

FRANK BARREIRO SANCHEZ

CODIGO: 2005104481

DIRECTOR:

HENRY OSTOS ALFONSO, M.D. MSc. Genética

UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

PROGRAMA DE TECNOLOGIA EN ACUICULTURA CONTINENTAL

NEIVA – HUILA

2012

DISTRIBUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR Streptococcus iniae EN

DIFERENTES ÓRGANOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp) Y TILAPIA

NILOTICA (Oreochromis niloticus) DIAGNOSTICADO POR PCR EN

TIEMPO REAL

TRABAJO DE GRADO REALIZADO COMO REQUISITO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE TECNÓLOGO EN ACUICULTURA CONTINENTAL

FRANK BARREIRO SANCHEZ CODIGO: 2005104481

DIRECTOR:

HENRY OSTOS ALFONSO, M.D. M.Sc. Genética

UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

PROGRAMA DE TECNOLOGIA EN ACUICULTURA CONTINENTAL

NEIVA – HUILA

2012

NOTA DE ACEPTACIÓN

_______________________________________ 

_______________________________________

_______________________________________

________________________________________ 

JURADO 

________________________________________ 

JURADO 

________________________________________ 

DIRECTOR 

________________________________________ 

COORDINADOR 

DEDICATORIA

A:

Dios, por darme la oportunidad de vivir y por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi

camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el periodo de estudio

.

Mi madre María Gladys Sánchez, por darme la vida, quererme mucho, creer en mí y porque siempre me apoyaste. Mamá gracias por darme una carrera

para mi futuro, todo esto te lo debo a ti

.

Mi Padre Farith Barreiro, Por los ejemplos de perseverancia y constancia que lo caracterizan y que me ha infundado siempre, por el valor mostrado para

salir adelante y por su amor

.

Mis hermanos, Farith Alfredo y Albeiro, por estar conmigo y apoyarme siempre, los quiero mucho

.

Mi director de tesis, Henry Ostos Alfonso, por su gran apoyo, motivación y exigencia para la culminación de esta etapa de estudios.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Surcolombiana por haberme admitido como un hijo más de su alma mater.

Agradecimiento especial:

A James Betancur López, Zootecnista, por sus asesorías, recomendaciones durante el desarrollo del presente trabajo.

A Juan Carlos Quintero, Médico Veterinario y Zootecnista, por sus recomendaciones

A Dolly Lucia Salgado,por su colaboración,apoyo administrativo y por su amistad.

A Andrea Garrido, Auxiliar del Laboratorio de Medicina genómica, por su colaboración y disponibilidad con los materiales del laboratorio.

INDICE DE CONTENIDO

Introducción………………………………………………………..…...….…9

1. Marco Teórico…………………………………………………….….….…..13 1.1. La estreptococosis en peces……………………………………........13 1.2. Características de cultivo de la bacteria.………………………...….16 1.3. Diagnostico……………………………………………………………..18 1.4. Salud pública……………………………………………………….…..19 1.5. Reacción en cadena de la polimerasa

(PCR)………………………………………………………………....….20 1.6. PCR en tiempo real...…………………………………………….…….24

2. Formulación del Problema y Justificación………………………….……25 3. Objetivos……………………………………………………………….……..28

3.1. Objetivos general…………...………………………………….……….28 3.2. Objetivos específicos ……………………...…………………………...28

4. Metodología………………………………….…………………………….....29 4.1. Muestras y controles …..………………………………………..……...29 4.2. Extracción de DNA, a partir de tejidos…………………………….......29 4.3. Protocolo de PCR en tiempo real……………………………………...30 4.4. Examen de histopatología……...……………………………………....33 4.5. Análisis estadístico……………………………………………………...33

5. Resultados…………………………………………………………………....34 5.1. Extracción de DNA a partir de muestras congeladas ………….…...34 5.2. Resultados de la PCR en tiempo real…………………………...…....36 5.3. Sensibilidad de la PCR en tiempo real………………….…………....38 5.4. Especificidad de la PCR en tiempo real…………………………...…39 5.5. Histopatología…………………...……………………………………….40

6. Discusión …………………..…………………………………………………42

7. Conclusiones………………………………………………………………....43

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Pruebas de identificación de Streptococcus spp aislados en peces 18

Tabla 2. Primers utilizados para el diagnóstico de Streptococcus iniae por PCR en tiempo real 31

Tabla 3 Reactivos a utilizar y su cantidad de volumen para la PCR en tiempo real 31

Tabla 4. Cantidad de DNA obtenido a partir de la las muestras 34Tabla 5. Órganos positivos para la infección Streptococcus iniae 36Tabla 6. Hallazgos histopatológicos en diferentes órganos de

individuos diagnosticados positivos para Streptococcus iniae por PCR en tiempo real 40

Tabla 8. Cronograma 38

INDICE DE FIGURAS

Numeración Descripción de la figura Pagina Figura 1 Amplificación exponencial a partir de un fragmento

de ADN molde tras una serie de ciclos de PCR (Adaptado de Andy Vierstraete, 2001) 21

Figura 2 Esquema del procedimiento de la PCR 22Figura 3 Esquema de desarrollo PCR en tiempo real

(empleando sistema taqman). Tomado de: AbsoluteQuantificationstarted Guide. AplieddBiosystems. 25

Figura 4 Área de extracción de DNA 32Figura 5 Área de PCR 32Figura 6 NanoDrop 2000 35Figura 7 VortexMixer 36Figura 8 Resultado de la PCR tiempo real para el individuo

130 (izquierda), individuo 628 (derecha) 37Figura 9 Distribución de infección por órgano 37Figura 10 Sensibilidad de la PCR Tiempo Real. 38Figura 11 Especificidad de la PCR Tiempo Real. 39Figura 12 Moderados a severos focos de epicarditis

granulomatosa y leve presencia de bacterias tipo coco en miocardio y endocardio 2X (izquierda). Moderado foco de epicarditis necrótica 10X (derecha). 41

Figura 13 Severa acumulación de bacterias tipo coco focalizada en encéfalo y meningitis extensa multifocal. 40X (izquierda). Moderado a severo foco de meningitis fibrinohemorrágica con leve presencia de bacterias tipo coco en el citoplasma de macrófagos 10X (derecha). 41

Figura 14 Moderado foco de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Moderados focos de activación de CMM en hepatopáncreas 40X (izquierda). Severo foco de necrosis e inflamación en hepatopáncreas con presencia de bacterias tipo coco intra y extracitoplasmáticas en células tipo macrófagos, leve a moderados focos de infiltrado mononuclear perivascular, leve presencia de vacuolas que desplazan el núcleo de los hepatocitos 10X (derecha) 41

9  

INTRODUCCIÓN

La acuicultura sigue siendo un sector productivo de alimentos ricos en

proteínas creciente, vigoroso e importante, según la información

proporcionada por la FAO, la producción acuícola mundial de pescado

comestible, incluidos los peces de aleta, los crustáceos, los moluscos y otros

animales acuáticos destinados al consumo, alcanzó los 52,5 millones de

toneladas en el año 2008. (FAO 2010). La contribución de la acuicultura a la

producción total de la pesca de captura continuó aumentando y pasó del 34,5

% en 2006 al 36,9 % en 2008. En el período 1970-2008 la producción

acuícola de pescado comestible aumentó a un ritmo anual medio del 8,3 %,

mientras que la población mundial aumentó en promedio un 1,6 % anual.

(FAO 2010). El resultado combinado del desarrollo de la acuicultura en todo

el mundo y la expansión de la población mundial es que el suministro per

cápita medio anual de pescado comestible procedente de la acuicultura para

el consumo se multiplicó por diez y pasó de 0,7 kg en 1970 a 7,8 kg en 2008,

lo que supone un incremento medio del 6,6 % anual. (FAO, 2010)

La producción acuícola se destina principalmente al consumo. En 2008 la

acuicultura generó el 45,7 % de la producción mundial de pescado

comestible destinado al consumo, cifra superior al 42,6 % correspondiente a

2006. (FAO, 2010). En China, el mayor productor acuícola del mundo, el 80,2

% del pescado comestible consumido en 2008 procedió de la acuicultura,

cifra superior al 23,6 % correspondiente a 1970. La producción acuícola

suministró al resto del mundo el 26,7 % de su pescado comestible, cifra

superior al 4,8 % correspondiente a 1970. (FAO, 2010)

10  

La acuicultura Colombiana en mayor parte es la piscicultura; lo primero que

hay que resaltar sobre el desarrollo de la piscicultura nacional es que, si bien

es cierto que se trabaja con varias especies nativas, la mayor parte de su

producción está concentrada en dos especies exóticas que son la tilapia y la

trucha, siendo la primera la que muestra una mayor dinámica en producción

y participación en el mercado. La especie nativa con mayor participación es

la cachama, seguida muy de lejos por el bocachico. (FAO – INCODER,

2011).

En primer lugar, a pesar de la gran participación del sistema productivo de

estanques en la superficie total, sólo genera el 65.48 % en el volumen total

de producción, mientras que el sistema de jaulas, con menos del 2 % del

espejo de agua genera el 34.52 % de la producción, en segundo lugar, la

tilapia representa el 73.72 % del total de la producción, mientras que la

cachama, que es el segundo nivel llega al 11.5 %, la trucha el 2.86 % y las

otras especies sólo el 3.4 %. La participación del Huila en el total de la

producción es del 44.47 %, seguido por el Meta con el 15.11 %; todos los

demás departamentos tienen producciones muy inferiores al Huila y Meta.

(FAO – INCODER, 2011).

La estreptococosis es una enfermedad originada por un grupo de cocos

Gram (+) que inducen una signología clínica bastante característica que

involucra muchos órganos del pez. Hasta el momento los cocos Gram (+)

que se han publicado como agentes patógenos para los peces incluyen:

Streptococcus sp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus iniae,

Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus milleri, Streptococcus ictaluri,

Streptococcus parauberis, Enterococcus sp., Enterococcus seriolicida,

Lactococcus sp., Lactococcus garviae, Lactococcus piscium, Vagococcus

sp., Vagococcus salmoninarum, Carnobacterium piscícola. (Prieta et al.,

11  

1993; Eldar et al., 1994; Toranzo et al., 1994; Domenech., 1996; Michel et al.,

1997, Mata et al., 2004, Yang and Li, 2009, Jimenez A. P. 2010).

Streptococcus iniae y otras especies de estreptococos se han descrito en

numerosos brotes de la enfermedad en varias especies de peces como la

tilapia. (Hernández E, Figueroa J, and Iregui C. 2009.) Streptococcus iniae es

el principal agente causal de la estreptococosis en todo el mundo de peces

silvestres y de granja. Originalmente aislado de abscesos subcutáneos sobre

delfines de agua dulce del Amazonas (Pier y Madin, 1976), este patógeno se

ha asociado a brotes de enfermedades en diferentes especies de peces de

agua dulce y salada comerciales, tales como la trucha arco iris, la tilapia, el

bagre rayado, la dorada o la lubina (Zlotkin et al., 1998; Shoemaker et al.,

2001; Colorni et al., 2002), con tasas de mortalidad entre el 30 y el 50% de

los peces afectados (Eldar et al, 1995b).

Las técnicas de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR), son más precisas y exactas para la identificación de

bacterias a nivel de especie. Estas técnicas se han utilizado cada vez más

para detectar e identificar muchos patógenos bacterianos. Varias técnicas

moleculares han sido desarrollados para complementar los protocolos de

diagnóstico y taxonómicos del Streptococcusiniae, haciéndolo más rápido,

sensible, exacto y específico. Los ensayos de PCR se han utilizado con éxito

para identificar Streptococcus iniae por la amplificación de los genes 16S

rRNA (Zlotkin et al., 1998), la chaperonina HSP60 (Goh et al., 1998), el 16S-

23S rRNA gen de la región espaciadora intergénica (Berridge et al., 1998), y

el gen de la lactato oxidasa (LCTO) (Mata et al., 2004).

12  

En la realización de este trabajo se empleó la PCR en tiempo real, para

identificar la distribución de la infección por Streptococcus iniae en cerebro,

corazón e hígado de tilapia roja (Oreochromissp) y tilapia nilotica

(Oreochromisniloticus) además se observó el daño histopatológico por

órgano.

13  

1. MARCO TEÓRICO

1.1. LA ESTREPTOCOCOSIS EN PECES

El patógeno Streptococcusi niae en peces (Pier, G.B., Madin, S.H., 1976) es

endémica en varias partes del mundo, incluido Israel (Eldar, A., S. Lawhon,

P. F. Frelier, L. Assenta, B. R. Simpson, P. W. Varner, and H. Bercovier.

1997.) y América del Norte (Perera, R. P., S. K. Johnson, M. D. Collins, and

D. H. Lewis. 1995.) la infección por Streptococcus iniae en la trucha arco iris

(Oncorhynchusmykiss) produce una enfermedad que afecta sustancialmente

el cerebro, con sólo pequeñas alteraciones patológicas en otros órganos

(Eldar A y Ghittino C. 1999). Recientemente el Streptococcus iniae se ha

aislado de los seres humanos enfermos que sufren de celulitis, meningitis o

bacteriemia lo que indica una amenaza para la salud pública.

(GiladBachrach, Amir Zlotkin, AvshalomHurvitz, Donald L.Evans and

AviEldar. 2001).

El Streptococcusiniae fue inicialmente aislado en 1976 en delfines

amazónicos de agua dulce (Iniaegeoffrensis) que habitaban en el acuario de

San Francisco y Nueva York (Pier y Madin, 1976 y 1978). Estos animales

presentaban lesiones cutáneas superficiales. En los años ochenta, se aisló

una nueva especie del estreptococo, considerado el agente etiológico de

meningoencefalitis agudas que afectaban a tilapias de cultivo en Israel,

Taiwán y los Estados Unidos (Eldaret al, 1994 y 1995a), causando una alta

tasa de mortalidad entre los animales. (Romano. LA., Mejía J. 2003.).

14  

En principio a este patógeno se lo denominó Streptococcus shiloi,

posteriormente, las características fenotípicas y genotípicas demostraron que

se trataba del Streptococcus iniae (Eldar y et al, 1995b).

La primera infección por Streptococcus en el híbrido de tilapia

(Oreochromisniloticus x O. aureus) fue en Arabia Saudita y se reporta en

1994 (Al-Harbi, 1994). Desde entonces, la infección se ha propagado

rápidamente por todo el país, causando una mortalidad considerable en las

poblaciones de tilapia, con efecto económico significativo. (Al-Harbi, Ahmed

H., 2010).

Un estudio demuestra que la prevalencia de Streptococcus iniae en

establecimientos productores de tilapias en Estados Unidos de Norteamérica

es realmente preocupante. El Streptococcus iniae se aisló en 3,81 % de las

tilapias nilóticas estudiadas y en el 7,23 % de su híbrido denominado

vulgarmente tilapia roja. En cuanto a los establecimientos evaluados entre el

21,6 % y el 27,4 % presentaban algún animal infectado por Streptococcus

iniae. Se observaron variaciones entre animales de diferentes edades tanto

en tilapia nilótica como en tilapia roja. En tilapia nilótica se halló una menor

prevalencia bacteriana en animales de peso comercial y alevinos con el 1,67

% y 0,88 % respectivamente y la mayor incidencia se observó en peces en

fase de engorde (7,96 %). Algo similar sucedió con la tilapia roja, donde se

encontró una menor prevalencia bacteriana en animales de peso comercial y

alevinos con el 3,12 % y 2,12 % respectivamente y la mayor incidencia se

observó también en peces en fase de engorde (9,56 %) (Shoemaker y cols,

2001).

Clínicamente se evidencia que los animales infectados dejan de alimentarse,

se observan letárgicos y adelgazados. Macroscópicamente se encuentran

frecuentemente con endoftalmos, aunque ocasionalmente, puede observarse

15  

exoftalmos cuando la septicemia genera una panoftalmitis aguda. (Romano.

LA., Mejía J. 2003.). Las hemorragias cutáneas difusas o petequiales son

frecuentes y si bien se observan en todo el cuerpo, prevalecen en la región

cefálica y caudal. En el abdomen se suele observar una ascitis con líquido

que varía entre cetrino y hemorrágico. Con cierta frecuencia se observa una

esplenomegalia y el hígado se observa friable. En la cavidad craneal se

puede ver la congestión difusa cerebral con líquido cefalorraquídeo

hemorrágico (Romano. LA., Mejía J. 2003).

El análisis histológico muestra un característico cuadro septicémico con una

marcada infiltración celular inflamatoria y numerosos cocos en la mayoría de

los tejidos examinados. Predomina un cuadro menigoencefálico con

dilatación de capilares meníngeos, extravasación de eritrocitos y densos

infiltrados inflamatorios con predominio de granulocitos y macrófagos aunque

también se observan linfocitos. Con técnicas de impregnación argéntica se

pueden ver abundantes cocos en el parénquima encefálico. En el hígado se

observa una hepatitis focal intraséptica con focos de necrosis hepatocelular e

infiltrados inflamatorios. En algunos casos se puede observar una periarteritis

hepática. En el bazo se observa disgregación de melanomacrófagos y

presencia de cocos en los sinusoides esplénicos. La miocarditis y la

pericarditis suele ser un hallazgo frecuente. Algunos autores describen

oftalmitis, presencia de granulomas meníngeos y focos inflamatorios renales

(Perera et al, 1998).

El Streptococcus iniae en pez oscar (Astronotusocellatus), seriola

(Seriolaquinqueradiata), anguila (Anguilla japonica) y corvinón ocelado

(Sciaenopsocellatus) provoca septicemia hemorrágica, con ascitis y

trombosis difusa en vasos sanguíneos (Kusuda y cols., 1993; Eldar y cols.,

1999; Tukmechi y cols., 2009). En tilapia provoca un cuadro septicémico con

una marcada infiltración celular inflamatoria, de predominio

meningoencefálico con dilatación de capilares meníngeos, extravasación de

16  

eritrocitos y densos infiltrados inflamatorios con predominio de granulocitos,

macrófagos y linfocitos (Romano y Mejía, 2003). En la trucha arcoíris

(Oncorhynchusmykiss), el Streptococcus iniae provoca formación de

abscesos en el interior de los músculos abdominales con necrosis por

coagulación, así como proliferación de células mucosas y espongiosis en

piel, tejido ocular con hiperemia, hemorragias retinianas, inflamación en el

vítreo y hemorragias en la cámara posterior del ojo, así como

glomerulonefritis, edema y descamación de la mucosa intestinal, y necrosis

focal hepática con hiperemia e infiltración linfocitaria (Akhlaghil y Mahjor,

2004).

En otro estudio con trucha arcoíris, Eldar y Ghittino (1999) describen

meningitis aguda, panoftalmitis con destrucción de la cámara anterior del

globo ocular y afectación del nervio óptico, pero en cambio, describen un

tejido renal sin lesiones, que sí se describe en el estudio de Akhlaghil y

Mahjor (2004) también con trucha arcoíris. (Aamri F. 2010.)

1.2. CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO DE LA BACTERIA

Los medios de cultivo usualmente empleados para el aislamiento de estas

bacterias deben ser suplementados con sangre ovina desfibrinada al 5%;

dentro de estos se pueden mencionar: agar tripticasa soya (TSA) (Perera et

al., 1995; Baya et al., 1996; Cheng and Chen, 1998), agar triptona sangre

(BTA) (Bragg and Broere, 1986; Ceschia et al., 1992), y agar infusión cerebro

corazón (BHI) (Prieta et al., 1993; Nieto et al., 1995; Yuasa et al., 1999).

En general, se obtiene el crecimiento de colonias pequeñas (0.5-1.5 mm),

blancas opacas, viscosas, redondeadas y con un borde liso (Plumb et al.,

17  

1974; Boomker et al., 1979; Bragg and Broere, 1986; Ceschia et al., 1992;

Prieta et al., 1993; Perera et al., 1995; Yuasa et al., 1999). La alta viscosidad

comúnmente observada de estas colonias ha sido asociada a la presencia de

una cápsula muy prominente (Yoshida et al., 1996).

Adicionalmente, se han desarrollado medios de cultivo selectivos para estas

bacterias. (Kitao et al., 1993) usaron caldo tioglicolato suplementado con

azida de sodio (0.025%) para el aislamiento de Enterococcus seriolicida de

agua marina y fangos alrededor de las explotaciones de ¨yellowtail¨. (Jimenez

A. P. 2010).

Por medio de la coloración de Gram suelen observarse como cocos de 0.6-

0.8 μm solos o en cadenas cortas como en el caso de los Streptococcus iniae

y Streptococcus agalactiae (Kitao, 1993; Perera et al., 1994), como

cocobacilos, especialmente el L. garviae y S. parauberis (Boomker et al.,

1979; Bragg and Breore, 1986; Prieta et al., 1993; Doménech et al., 1996) o

como células ovoides (1.4 x 0.7μm) en el caso de los Enterococcus sp. Y

Vagococcus sp. (Carson et al., 1993; Michel et al., 1997).

En general no son motiles, no esporulados, anaerobios facultativos, no

producen catalasa, ácido sulfhídrico, indol, ornitina ni oxidasa, producen

ácido láctico a partir de carbohidratos y no suelen reaccionar con los grupos

de antígenos Lancefield (Austin and Austin, 1985; Hardie, 1986).

La tabla 1 muestra las principales características de identificación de algunas

de las especies de estreptococos aislados de peces.

18  

1.3. DIAGNOSTICO

El diagnóstico presuntivo de la estreptococosis se basa

fundamentalmente en la presencia de los signos clínicos y el aislamiento

de cocos Gram(+) de órganos internos. Una vez se obtiene el crecimiento

de colonias puras en los diferentes medios de cultivo, es necesaria una

confirmación más precisa mediante pruebas fisiológicas y bioquímicas

(Kitao, 1993; Shoemaker and Klesius, 1997).

Técnicas de inmunohistoquímica han sido utilizadas exitosamente para la

identificación de Streptococcus sp. en trucha arco iris, Tilapia y Yellowtail

es una especie de pez de agua salada, la inmunohistoquímica como la

inmunoperoxidasa indirecta ha mostrado una mayor sensibilidad en

19  

comparación con el aislamiento microbiológico (Bragg, 1988; Hernández,

2009). Recientemente, se ha empleado inmunofluorescencia para la

detección de Streptococcus iniae en tilapia (Klesius et al., 2006).

En Colombia, el diagnóstico de la estreptococcosis se viene realizando

mediante el uso simultáneo de la histopatología, inmunoperoxidasa

indirecta (IPI), microbiología y PCR (a partir de colonias bacterianas); bien

sea en casos de mortalidad o en programas de monitoreo sanitario que se

han realizado periódicamente con propósitos preventivos (Iregui et al.,

2004).

1.4. SALUD PÚBLICA

El primer caso de enfermedad humana fue reportado en Texas en 1991,

un segundo caso apareció en Ottawa en 1994, y nueve casos más entre

1995 y 1996 (Weinstein et al., 1997). Todos los pacientes tuvieron historia

de manipulación de tilapias vivas o sus filetes y desarrollaron celulitis

aguda, osteomielitis o endocarditis. Por el momento solo se ha implicado

el Streptococcus iniae, pero se sospecha que otras bacterias relacionadas

con la entidad en peces, puedan como esta, causar infección y

enfermedad en humanos (Weinstein et al., 1997; Lau et al., 2003).

20  

1.5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Es una técnica para la síntesis “in vitro” de secuencias específicas de

ADN. Las siglas PCR significan “Polimerase Chain Reaction”: reacción en

cadena de la polimerasa. Desarrollada originalmente por Kary Mullis en la

década de los 80, por lo cual se le adjudicó el Premio Nobel de Química

en 1993, ha sido ampliamente utilizada en el campo de la biología

molecular como PCR simple y en sus diferentes variedades (PCR

multiplex, PCR anidado, RT-PCR, PCR-RFLP, etc.) (Hoorfar et al., 2004,

Hoffmann et al., 2009).

La técnica de PCR permite amplificar de manera selectiva fragmentos del

ADN, situados entre dos regiones cuyas secuencias son conocidas. Estas

dos regiones se utilizan como iniciadores en la reacción de síntesis del

ADN, que está catalizada por la enzima ADN polimerasa (Gibello et al.,

2001).

Brevemente, la reacción se basa en la repetición sucesiva de 30 a 40

ciclos, conformado cada uno por tres etapas o fases principales: Una

primera fase de desnaturalización, donde la doble hélice de ADN se

separa en sus dos hebras, una segunda etapa de hibridación, donde los

iniciadores específicos se unen a las zonas 3’ complementarias que

flanquean el fragmento que queremos amplificar, y un paso final de

elongación, donde se produce la síntesis de una cadena sencilla

complementaria a la original mediante la enzima ADN polimerasa, la cual

incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio,

complementarios a la cadena molde. Este ciclo se repite de tal manera

que se da una amplificación exponencial de la secuencia de interés,

21  

generando al final del proceso billones de copias de ella (Figuras. 1 y 2).

Todo el proceso se lleva a cabo en un equipo, denominado termociclador,

que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de

forma exacta. Los productos obtenidos se visualizan normalmente por

medio de electroforesis en gel de agarosa. La amplificación de un gen

específico del patógeno puede de este modo aumentar significativamente

la sensibilidad de la detección (Gibello et al., 2001, Cunningham, 2002,

Yang and Rothman, 2004).

Figura 1. Amplificación exponencial a partir de un fragmento de ADN molde tras una serie de ciclos de PCR (Adaptado de Andy Vierstraete, 2001).

Las ventajas de la PCR sobre otros métodos de diagnóstico genético

radican en su simplicidad y rapidez, especificidad y sensibilidad (Johnson,

2000; Gibello et al., 2001).

Las diferentes clases de PCR han sido empleadas ampliamente para el

diagnóstico e investigación de infecciones causadas por microorganismos

(bacterias, hongos, protozooarios) así como para el estudio de

22  

enfermedades de tipo genético, análisis forenses, relaciones filogenéticas

entre especies, detección de cepas resistentes a antibióticos etc. a partir

de diferentes muestras como sangre, semen, cultivos bacterianos,

cultivos celulares, tejidos frescos, congelados o embebidos en parafina,

tanto en medicina humana como Veterinaria (Figura 2.) (Yang and

Rothman, 2004).

Figura 2. Esquema del procedimiento de la PCR

En las últimas dos décadas la PCR ha sido extensivamente modificada

para expandir su utilidad y versatilidad. Por ejemplo, el PCR múltiple

permite la detección simultánea de diferentes secuencias de ADN, por la

incorporación de diferentes grupos de iniciadores. El PCR anidado,

incrementa la sensibilidad y especificidad por medio de dos

amplificaciones sucesivas, el PCR-RFLP (Poliformismos en el tamaño de

los fragmentos de restricción) permite la amplificación de genes de interés

23  

y la posterior digestión con enzimas de restricción permitiendo generar

fragmentos de ADN de distintos pesos moleculares, esta técnica es de

gran utilidad para la genotipificación de microorganismos y el RT-PCR,

permite la detección de RNA por la conversión de RNA en una copia

complementaria de ADNc por medio de la enzima transcriptasa reversa,

muy útil en la identificación de virus RNA como VIH y hepatitis C (Hoorfar

et al., 2004, Hoffmann et al., 2009)

Un avance significativo, fue el desarrollo de la PCR en tiempo real, la cual

permite la amplificación y detección de los productos en una única

reacción, eliminando la necesidad de electroforesis para la visualización

de los amplificados. El PCR en tiempo real permite la amplificación

simultánea y la cuantificación en tiempo real (al final de cada ciclo) de

secuencias específicas de ácidos nucléicos, además de aumentar la

sensibilidad, permite reducir el riesgo de contaminación cruzada

(Houghton and Cockerill, 1996; Hoffmann et al., 2009).

El diagnóstico de infecciones basado en PCR ha sido desarrollado

efectivamente para un gran rango de microorganismos, debido a la alta

sensibilidad y especificidad y el bajo consumo de tiempo. En el mundo ha

sido aplicada a la identificación por género y especie de microorganismos

que no crecen in vitro o que requieren un largo tiempo para crecer (Yang

and Rothman, 2004). Sin embargo, un limitado número de ensayos ha

sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) y aceptados en

la práctica clínica (Yang and Rothman, 2004).

En medicina humana es un método de rutina para el diagnóstico y

clasificación de enfermedades hematolinfoides, bacterianas

24  

(Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus, Neisseriagonorrhoeae),

fúngicas (Chlamydia spp, Aspergillus, Candida), parasitarias

(Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, Giardia, Entamoeba histolytica

etc), virales (Herpes, cytomegalovirus, Poxvirus, adenovirus, influenza

etc) y de enfermedades neoplásicas (Weiss, 1995,Espy et al., 2006;

Hutchins and Grabsch; 2009, Mengoli et al., 2009; Olson et al., 2010).

En Medicina Veterinaria, se emplea en el diagnóstico de infecciones

virales, bacterianas y parasitarias, principalmente en aves (New castle,

Influenza aviar) Bovinos (Diarrea viral Bovina, Leucosis bovina) y Cerdos

(Síndrome Respiratorio Porcino-PRRS, Haemophilus parasuis,

Streptococcus suis, Influenza porcina, Circovirus porcino, Peste porcina

clásica, Neumonía enzoótica porcina) (Pulido et al., 2006; Hoffmann et al.,

2009).

1.6. PCR EN TIEMPO REAL

La PCR cuantitativa detecta en tiempo real la amplificación del genoma

de interés. Para llevar a cabo esta detección existen varios métodos,

pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN

(sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos

amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra

molécula que inhibe esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma que sólo

cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN

polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del "quencher"

y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser (figura 3). La

cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR

será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En

2

q

c

d

general

curva p

ADN qu

Figura 3Tomado d

2. FORMU

La acuicult

que tiene u

con la pro

desarrollo d

para que s

atrón en la

ue se está a

3. Esquema dde: AbsoluteQ

ULACIÓN D

tura de pec

un crecimie

ducción ga

de la acuic

sea válida e

s mismas c

amplificand

de desarrolloQuantification

DEL PROB

ces es uno

ento anual d

anadera (3

cultura ha l

25 

esta técnica

condiciones

o.(M. Tevfi

o PCR en tienstarted Guide

LEMA Y JU

de los sec

de casi el 1

3%) y la pe

levado a la

a requiere

s para cono

kDorak (Ed

empo real (ee. AplieddBio

USTIFICAC

ctores de p

10% desde

esca extra

a aparición

realizar en

ocer la can

d.) 2007).

mpleando sisosystems.

CIÓN

producción

e 1984, en

activa (1,6%

de un gra

paralelo u

tidad total

stema taqma

de aliment

comparaci

%). El rápi

n número

na

de

an).

tos

ón

do

de

26  

enfermedades infectocontagiosas de muy diverso origen, ya que el régimen

intensivo del cultivo, unido en muchas ocasiones a unas condiciones

higiénico-sanitarias deficitarias, junto al estrés de los animales, favorece la

penetración y desarrollo de agentes patógenos, y como secuencia, la

aparición de enfermedades infectocontagiosas, que son un freno muy

significativo en la producción acuícola, afectando en muchos países al

desarrollo económico del sector.(Aamri F. 2010).

Streptococcus iniae es un importante patógeno de peces en muchas

regiones del mundo. Esta bacteria es también zoonótica con infecciones en

humanos asociados con la manipulación y preparación de los peces

infectados. El Streptococcus iniae se fue señalado como una enfermedad

emergente zoonótica transmitida por animales destinados al consumo en la

Conferencia Internacional sobre Enfermedades Infecciosas Emergentes en

2000 (Hansen et al 2001, Justice et al 2009)

En cuanto a la clínica producida en la infección por Streptococcus iniae, los

peces afectados pueden presentar uno o más de los siguientes signos

clínicos, dependiendo de la especie afectada: natación errática, pérdida de

orientación, letargia, pérdida de control de la flotabilidad, melanosis,

exoftalmia unilateral o bilateral, opacidad de la córnea, hemorragias en o

alrededor de los ojos, base de las aletas, ano, o en cualquier otro lugar en el

cuerpo, fluido ascítico en la cavidad abdominal y ulceraciones (Eldaret al.,

1994 y 1995-a). Esta sintomatología es muy similar a la producida por las

bacterias Streptococcus parauberis, Streptococcus agalactiae o Lactococcus

garvieae (Doménechet al., 1993 y 1996; Eldaret al., 1994 y 1995-a y b;

Bercovieret al., 1997; Eldar y Ghittino, 1999). En algunos casos, los peces no

muestran signos evidentes antes de la muerte. La necropsia puede

evidenciar la presencia de líquido hemorrágico en cavidad abdominal,

27  

esplenomegalia, palidez hepática, así como la inflamación alrededor del

corazón y el riñón. Muchos estreptococos infectan el sistema nervioso de los

peces, lo que explica la natación errática frecuentemente observada en

peces infectados (Yanong y Francis-Floyd, 2006).

Su diagnóstico se basa en los signos clínicos, las lesiones histopatológicas y

el aislamiento microbiológico; sin embargo, se requiere de técnicas más

sensibles que confirmen o descarten la presencia de la bacteria en animales.

La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real

permite identificar con una alta sensibilidad y especificidad un gen de interés

de un microorganismo que posiblemente se encuentre en bajas

concentraciones en una muestra. (Jiménez A. P. 2010).

Además de su importancia en la acuicultura, Streptococcus iniae ha surgido

recientemente como una amenaza para la salud pública debido a su agente

zoonótico, al haber sido aislado de humanos infectados como consecuencia

de lesiones accidentales durante la manipulación de pescado fresco

infectado (Weinstein et al, 1997;.Lau .et al, 2003;. Facklam et al, 2005).

28  

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVOS GENERAL

Identificar la distribución de la infección por Streptococcus iniae en

diferentes órganos de tilapia roja (Oreochromis sp) y tilapia nilotica

(Oreochromis niloticus) diagnosticado por PCR en tiempo real.

3.2. OBJETIVO ESPECÍFICOS

Determinar e identificar la distribución de la infección en Cerebro,

Hígado y Corazón.

Describir hallazgos histopatológicos en cerebro, hígado y corazón

de individuos infectados con Streptococcus iniae

29  

4. METODOLOGÍA

4.1. MUESTRAS Y CONTROLES

El grupo de investigación del Laboratorio de Medicina Genómica en un

estudio realizado en el 2011, identificó 10 individuos positivos a la

enfermedad Streptococcus iniae, el análisis se realizó en una mezcla de

cerebro, corazón e hígado con la técnica de PCR en tiempo real, las

muestras están congeladas a -20° C y se emplearon en el presente estudio.

Para los controles se realizó la extracción de ADN de los cultivos puros de la

cepa de Streptococcus iniae, la cual fue adquirida de ATTC (No. 29178) con

el Kit comercial QIAamp ADN Mini Kit, QIAGEN, siguiendo las

recomendaciones del fabricante.

4.2. EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE TEJIDOS

La extracción de ADN se realizó con el kit comercial de Quigen según el

protocolo para bacterias de la misma marca comercial, las muestras de

cerebro, hígado, corazón que estaban a -20 °C se descongelaron. Estas

muestras de tejido se pesaron (10-20mg), se suspendieron en 180 µl de una

solución de enzimas (20 mg/ml lysozyme; 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM

EDTA; 1,2% Triton) este paso es para bacterias Gram-positivas y se

maceraron utilizando el mortero con Biovortex marca VortexMixer, (figura 7)

30  

siempre dentro del tubo vial (eppendorf). Se incubaron por 30 minutos a

37°C. después se añadió 20µl de proteinasa K y 200 µl del Buffer AL. y se

mezclaron con VortexMixer e incubaron a 56°C por 30 minutos. Luego se

centrifugaron brevemente el tubo para precipitar las gotas que puedan estar

adheridas a la tapa del vial (eppendorf), después se añadieron 200µl de

etanol (96-100%) se centrifugo brevemente el tubo para precipitar las gotas

que puedan estar adheridas a la tapa del vial (eppendorf), luego se adiciono

el lisado en una columna purelink spin column y se centrifugó a 10000 rpm

por un minuto a temperatura ambiente. Se descartó todo lo que quedo en el

tubo colector, luego se adiciono 500µl del Buffer AW1, se centrifugó a 10000

rpm por un minuto, se descartó todo lo que quedo en el tubo colector, se

adiciono 500µl del buffer AW2 se centrifugo a 14000 rpm por tres minutos, se

descartó todo lo que quedo en el tubo colector, luego se introdujo el tubo en

un vial nuevo de 1,5 ml en la columna, a continuación se adiciono 200 µl del

Buffer AE y se incubo por 1 minuto temperatura ambiente y luego se

centrifugo a 14000 rpm por un minuto y se descartó la columna y se guardó

lo que queda en el vial de 1,5 ml.

4.3. PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL

La estandarización de la prueba diagnóstica molecular por PCR en tiempo

real para las especies Streptococcus iniae, la realizó el grupo Laboratorio de

Medicina Genómica de la Universidad Surcolombiana, Se diseñaron los

primers para generar las secuencias de la accesión No. Y07622.1 proteína

Lactato oxigenasa (lctO) (S. iniae). En esta región se diseñaron los primers

específicos de especie, utilizando el Software Primer Express 3.0 Applied

Byosistems, para el equipo utilizado Applied Biosystems 7300 Real-Time

PCR System.

31  

Tabla 2. Primers utilizados para el diagnóstico de Streptococcusiniae por PCR en tiempo real

Forward GTT TTC TTG AAG CTA TTG CAG GTT T Reversed CGC GCA AGG GTT TCA TG Sonda VIC-CTGCGGTTGCCATACCAGCAAGTATTCTA- TAMRA

Tabla 3. Reactivos a utilizar y su cantidad de volumen para la PCR en tiempo real.

Reactivo Cantidad

Taqman Universal PCR master mix (2X) 12.5 ul

Taqman (sonda) 0.5 ul

Primer F (10 uM) 1.25 ul

Primer R (10 um) 1.25 ul

DNA 1 ul

Agua 8.5 ul

TOTAL 25 ul

Protocolo de perfiles de temperatura para PCR en tiempo real.

50 ºC por 2 minutos 95 ºC por 10 minutos 40 ciclos 95ºC por 15 segundos 60 ºC por 1 minutos

Figura 4. Á

Figura 5. Á

Área de extr

Área de PC

racción de

R

32 

DNA

33  

4.4. EXAMEN DE HISTOPATOLOGÍA

Se tomaron muestras de 10 animales del cerebro, hígado y corazón, estos

fueron retirados del animal durante la necropsia y una parte esta conservada

en formol tamponado al 4% en PBS (phosphate buffer saline) como método

de rutina para fijar y conservar los tejidos sin afectar la citoarquitectura.

Luego en el laboratorio de Histopatología animal de la Universidad Nacional

de Colombia, se tomó una pequeña porción representativa de la muestra y se

llevó al procesador automático de tejidos, en esta fase se dio la inclusión del

tejido con parafina que consiste en: deshidratación, aclaración, infiltración y

colado de bloques donde el tejido queda incluido, se seccionaron los bloques

con ayuda de un micrótomo (6 - 8μ espesor) y se colocaron en baño de

flotación para la selección de las muestras, se montaron en placas de vidrio

para coloración general de rutina con hematoxilina- eosina (H&E) o tinción de

gram, para el análisis de las secciones histológicas. Posteriormente, se

llevaron las muestras para observación en microscopía (10x y 40x).

4.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados se analizaron con estadística descriptiva y análisis de

frecuencias con el paquete estadístico INFOSTAT

34  

5. RESULTADOS

5.1. EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DE MUESTRAS CONGELADAS

La cantidad de DNA obtenido con el kit comercial de Quigen según el

protocolo para bacterias de la misma marca comercial se encuentra en la

tabla 4, la medición se realizó con el equipo NanoDrop 2000 (figura 6.)

Tabla 4. Cantidad de DNA obtenido a partir de la las muestras

Muestra

Cantidad (ng/µl) Identificación del

Individuo

Órgano

1

Corazón 46,3

Hígado 402

Cerebro 54,8

2

Corazón 32,4

Hígado 23,6

Cerebro 133,8

3

Corazón 36,2

Hígado 10,7

Cerebro 25

4

Corazón 29,8

Hígado 13,1

Cerebro 3,7

5

Corazón 37,5

Hígado 43,2

Cerebro 28,6

6

Corazón 34,6

Hígado 79,2

Cerebro 39,8

7 Corazón 22,3

Control p

8

9

10

ositivo de Str

Híga

Cere

Cora

Híga

Cere

Cora

Híga

Cere

Cora

Híga

Cere

reptococcusin

Fig

35 

ado

ebro

azón

ado

ebro

azón

ado

ebro

azón

ado

ebro

niae

ura 6. NanoDDrop 2000.

33

10,4

16,7

21,5

20,2

24,6

34

14,2

23

11,7

12,5

8,7

l

T

23456789

5.2. RES

Los resulta

la tabla 5.

Tabla 5. Ór

Individuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

SULTADOS

ados positiv

rganos pos

F

S DE LA P

vos para inf

sitivos para

36 

Figura 7.Vorte

CR EN TIE

fección Str

la infección

ÓrganCorazCerebCorazCorazCorazHígadCorazHígadHígadHígad

exMixer

EMPO REA

reptococcus

n por Strep

nos infectazón - Hígadbro zón zón zón do zón - Cerebdo - Cerebrdo do - Cerebr

AL

s iniae se r

ptococcus in

dos do

bro ro

ro

relacionan

niae.

en

37  

Ningún individuo presento infección en los tres órganos al mismo tiempo, el

40% presento infección en dos órganos, el 30% de la infección se presentó

en corazón, el 20% se presentó en Hígado y cerebro al mismo tiempo, 20%

en hígado, el 10% se presentó en cerebro igualmente en corazón - hígado y

corazón – cerebro

Figura 8. Resultado de la PCR tiempo real para el individuo 1 (izquierda), individuo 8 (derecha)

Figura 9. Distribución de infección por órgano.

F

A

y

u

d

5.3. SEN

Figura 10. Se

El limite má

ADN en ag

y 1:10000.

una dilució

diagnóstico

NSIBILIDA

ensibilidad de

ás bajo de

ua destilad

En la figura

ón tan alta

o positivo de

AD DE LA P

e la PCR Tiem

detección d

da estéril en

a 10 se mu

se eviden

e la infecció

38 

PCR TIEMP

mpo Real.

del Streptoc

n concentra

uestra la alt

cia claram

ón.

PO REAL

coccus inia

aciones de

ta sensibilid

mente la pe

ae se probó

1:1, 1:10, 1

dad del diag

endiente qu

ó diluyendo

1:100, 1:10

gnóstico, c

ue permite

el

00

on

el

39  

5.4. ESPECIFICIDAD DE LA PCR TIEMPO REAL

Figura 11. Especificidad de la PCR Tiempo Real.

La especificidad del ensayo de PCR Tiempo Real se probó utilizando ADN

extraído de las cepas de tres especies de Streptococcus; S. pyogenes, S.

pneumoniae y S. agalactiae, en la figura 10 se muestra la alta especificidad

que tiene la prueba para la familias S. iniae.

40  

5.5. HISTOPATOLOGÍA

A nivel microscópico se hallaron diferentes daños o injurias en los tejidos

colectados (corazón, hígado, cerebro), en la Tabla 7 se muestran las

principales lesiones histopatológicas halladas en los diferentes órganos

analizados y que se relacionan con infecciones por streptococcocis.

Tabla 6. Hallazgos histopatológicos en diferentes órganos de individuos diagnosticados positivos para Streptococcus iniae por PCR en tiempo real

Corazón

Epicarditis multifocal con formación de granulomas o granulomatoso con presencia de bacterias tipo cocos.

Moderada miocarditis generalizada. Bacterias tipo coco en miocardio y endocardio. Granuloma en miocardio. Miocarditis generalizada.

Cerebro

Meningitis multifocal Hemorragias e inflamación granulomatosa en meninges. Leve a moderado foco de meningoencefalitis necrótica con presencia de

bacterias tipo cocos Congestión en encéfalo y meninges generalizada Granuloma de meninges Meningitis Fibrinohemorrágica con presencia de bacterias tipo cocos en

el citoplasma de macrófagos

Hígado

Focos de congestión hepática. Hepatopáncreas con presencia de bacterias tipo coco intra y

extracitoplasmaticas en celulas tipo macrófagos. Focos de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Activación de centros melanomacrófagos en hepatopáncreas. Granuloma en hígado. Vacuolización hepática.

41  

Figura 12.Moderados a severos focos de epicarditis granulomatosa y leve presencia de bacterias tipo coco en miocardio y endocardio 2X (izquierda). Moderado foco de epicarditis necrótica 10X (derecha).

Figura 13.Severa acumulación de bacterias tipo coco focalizada en encéfalo y meningitis extensa multifocal. 40X (izquierda). Moderado a severo foco de meningitis fibrinohemorrágica con leve presencia de bacterias tipo coco en el citoplasma de macrófagos 10X (derecha).

Figura 14. Moderado foco de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Moderados focos de activación de CMM en hepatopáncreas 40X (izquierda). Severo foco de necrosis e inflamación en hepatopáncreas con presencia de bacterias tipo coco intra y extracitoplasmáticas en células tipo macrófagos, leve a moderados focos de infiltrado mononuclear perivascular, leve presencia de vacuolas que desplazan el núcleo de los hepatocitos 10X (derecha) . 

42  

6. DISCUSIÓN

Este trabajo corrobora los estudios previos de nuestro grupo de investigación

respecto que todos los casos positivos obtuvieron por los menos un órgano

infectado, el 40% reporto coinfección. La técnica de PCR Tiempo Real,

como una herramienta de diagnóstico molecular, ha facilitado la detección y

la identificación de un número creciente de bacterias de importancia clínica

en medicina veterinaria y humana. A veces, entre los microorganismos

filogenéticamente relacionadas, es difícil diseñar un conjunto específico de

cebadores para la identificación de especies bacterianas.

El examen histopatológico reveló agudo a subagudo meningoencefalitis que

consiste de un exudado que cubre la superficie del cerebro que contiene

colonias de bacterias y la infiltración multifocal de células de macrófagos en

el hígado y corazón como las lesiones principales, Estos resultados se

pueden correlacionar con los hallazgos clínicos de letargo y pérdida de la

orientación, (Eldar&Ghittino 1999) que pueden ser confundidos con otras

clases de infección.

La infección por Streptococcus iniae se presenta con morbilidades agudas y

crónicas en muchas especies de peces, tanto de pesca extractiva como de

acuicultura, y así, al menos, 27 especies de peces han sido descritas como

sensibles a la infección (Agnew y cols., 2007). Sin embargo, es la primera

vez que se realizan estudios sobre este tipo de patología en Colombia, las

investigaciones se han realizado en el laboratorio de medicina genómica de

la Universidad Surcolombia desde el año 2011.

43  

7. CONCLUSIONES

La PCR en tiempo real es un método rápido, sensible y específico

para la detección de Streptococcus iniae en peces comerciales, útil en

investigación, estudios epidemiológicos y diagnóstico.

El Streptococcus iniae causa una infección muy grave y puede

generar graves problemas sobre la actividad acuícola del Huila y sobre

los recursos icticos nativos.

La importancia de seguir con monitoreos continuos, por las

implicaciones que tiene el Streptococcus iniae en la salud de los peces

y como agente zoonótico.

Se necesita más investigación para entender completamente este

patógeno, en particular, su diversidad serológica y epidemiológica,

antes de que los programas de vacunación puedan tener éxito a

escala mundial.

44  

8. BIBLIOGRAFIA

Aamri F. 2010. Patogenicidad de streptococcusiniae en acuicultura.

Presentado como requisito parcial para la obtención del Título oficial de

Máster Universitario en Cultivos Marinos otorgado por la Universidad de Las

Palmas de Gran Canaria y del Diploma de Master of Science en Acuicultura

otorgado por el Centro Internacional de Altos Estudios Agronómicos

Mediterráneos (CIHEAM).

Al-Harbi, A.H., 1994.First Isolation of Streptococcus sp. from hybrid tilapia

(Oreochromisniloticus x O. aureus) in Saudi Arabia. Aquaculture 128, 195-

201.

Al-Harbi, Ahmed H., (2010). Molecular characterization of Streptococcus iniae

isolated from hybrid tilapia (Oreochromisniloticus x O. aureus), Aquaculture,

doi: 10.1016/j.aquaculture.2010.12.014

Akhlaghil M y Mahjor AA. (2004). Some histopathological aspects of

streptococcosis in cultured rainbow trout (Oncorhynchusmykiss).Bulletin of

European Association of Fish Pathologists.24: 132.

Baya, A.; Navarro, R., and Kotopoulis, E. 1996. Streptococcal infections of

hybrid striped bass and tilapia. In: Proc. The Successes and Failures in

Commercial Recirculating Aquaculture Conference. Roanoke, Virginia, Jul.

1996, p 32-40.

Bercovier H, Ghittino C, y Eldar A. (1997). Immunization with bacterial

antigens: Infections with streptococci and related organisms. En: Fish

Vaccinology. Gudding, Lillehaug, Midtlyng, y Brown. (eds). Developments in

Biologicals, Vol. 90.Karger, Basel, Switzerland.

45  

Berridge, B.R., Fuller, J.D., de Azavedo, J., Low, D.E., Bercovier, H., Frelier,

P.F., 1998. Development of specific nested oligonucleotide PCR primers for

the Streptococcus iniae16S-23S ribosomal DNA intergenic spacer. J. Clin.

Microbiol. 36, 2778-2781.

Boomker, J.; Imes, G.D.Jr.; Cameron, C. M.; Naude, T.W., and Schoonbee,

H.J. 1979.Trout mortalities as a result of Streptococcus

infection.Onderstepoort J. Vet. Res, 46: 71-77.

Bragg, R. 1988. The indirect fluorescent antibody technique for the rapid

identification of streptococcosis of rainbow trout

(Salmogairdneri).Onderstepoort J. Vet. Res., 55: 59-61.

Bragg, R., and Broere, J. 1986. Streptococcosis in rainbow trout in South

Africa. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 3: 89-91.

Carson, J.; Gudkovs, N., and Austin, B. 1993.Characteristic of an

Enterococcus-like bacterium from Australia and South Africa, pathogenic for

rainbow trout, Oncorhynchusmykiss (Walbaum). J. Fish Dis., 16: 381-388.

Ceschia, G.; Giorgetti, G.; Giavenni, R., and Sarti, M. 1992. A new problem

for italian trout farms: Streptococcosis in rainbow trout (Oncorhynchusmykiis).

Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 2: 71-72.

Cheng, W., and Chen, J. 1998. Enterococcus-like infections in

Macrobrachiumrosembergii are exacerbated by high pH and temperature but

reduced by low salinity. Dis. Aquat. Org., 34: 103-108.

46  

Colorni, A., Diamant, A., Eldar, A., Kvitt, H., Zlotkin, A., 2002. Streptococcus

iniae infections in red sea cage-cultured and wild fishes. Dis. Aquat. Org. 49,

165–170.

Cunningham CO. 2002. Molecular diagnosis of fish and shellfish diseases:

present status and potential use in disease control. Aquaculture 206: 19-55.

Doménech A, Prieta J, Fernández-Garayzabal J.F, Collins MD, Jones D,

Domínguez L. (1993). Phenotypic and phylogenetic evidence for a close

relationship between Lactococcusgarvieae and Enterococcus

seriolocida.Microbiología SEM. 9: 63-68.

Doménech A, Fernández-Garayzabal JF, Pasqual C, Garcia JA, Cutuli MT,

Moreno MA, Collins MD y Domínguez L. (1996). Streptococcosis in cultured

turbot, Scophtalmusmaximus (L.), associated with Streptococcus parauberis.

Journal of Fish Diseases. 19: 33-38.

Eldar A, Bejerano Y yBercovier H. (1994). Streptococcus shiloi and

Streptococcus difficile: two new streptococcal species causing

meningoencephalitis in fish. Current Microbiology. 28: 139-143.

Eldar A, Bejerano Y, Livoff A, Horovitcz A y Bercovier H. (1995-a).

Experimental streptococcal meningo-encephalitis in cultured fish.Veterinary

Microbiology.43: 33- 40.

Eldar A, Frelier PF, Assenta L, Varner PW, Lawhon S y Bercovier H. (1995-

b). Streptococcus shiloi, the name of an agent causing septicemic infection in

fish, is a junior synonym of Streptococcus iniae. International Journal of

Systematic Bacteriology. 45: 840-842.

47  

Eldar A y Ghittino C. (1999). Lactococcusgarvieae and Streptococcus iniae

infections in rainbow trout Oncorhynchusmykiss: similar, but different

diseases. Diseases of Aquatic Organisms. 36: 227-231.

Eldar, A., S. Lawhon, P. F. Frelier, L. Assenta, B. R. Simpson, P. W. Varner,

and H. Bercovier. 1997. Restriction fragment length polymorphisms of 16S

rDNA and of whole rRNA genes (ribotyping) of Streptococcus iniae strains

from the United States and Israel. FEMS Microbiol.Lett. 151:155–162.

Espy M.J., Uhl J.R., Sloan L.M., Buckwalter S.P. , Jones M. F., Vetter E. A.,

Yao J. D.,Wengenack N. L., Rosenblatt J. E. 2006. Real-Time PCR in Clinical

Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing. Clin.Microbiol Rev.

19: 165–256.

Facklam R., Elliott J., Shewmaker L. &Reingold A. (2005) Identification and

characterization of sporadic isolates of Streptococcus iniae isolated from

humans. Journal of ClinicalMicrobiology 43, 933–937.

FAO. 2010. FisheriesTopics: Research. El estado mundial de la pesca y la

acuicultura. TopicsFactSheets. Texto de Jean- FrancoisPulvenis. In:

Departamento de Pesca y Acuicultura de la FAO

FAO – INCODER. 2011. Diagnóstico del Estado de la Acuicultura en

Colombia. Plan Nacional de Desarrollo de la Acuicultura Sostenible en

Colombia FAO - INCODER

Gibello A, Blanco M, Domínguez L y Fernández-Garayzábal J. 2001.

Utilización de la PCR para el diagnóstico en ictiopatología. Revista AquaTIC.

Nro.15, Noviembre.

48  

GiladBachrach, Amir Zlotkin, AvshalomHurvitz, Donald L.Evans and AviEldar.

2001. Recovery of Streptococcus iniae from Diseased Fish Previously

Vaccinated with a Streptococcus Vaccine. Appl. Environ. Microbiol.

67(8):3756.

Goh, S.H., Driedge,r D., Gillett, S., Low, D.E., Hemmingsen, S.M., Amos, M.,

Chan, D., Lovgren, M., Willey, B.M., Shaw, C., Smith, J.A., 1998.

Streptococcus iniae, a human and animal pathogen: specific identification by

the chaperonin 60 gene identification method. J. Clin. Microbiol. 36, 2164-

2166.

Hansen GR, Woodall J, Brown C, Jaax N, McNamara T, Ruiz A. . 2001.

Emerging zoonotic diseases. Panel summary from the International

Conference on Emerging Infectious Diseases Conference, Atlanta, Georgia,

2000.Emerg Infect Dis. 2001;7:537. DOI: 10.3201/ eid0703.010316

Hernández E, Figueroa J, and Iregui C. 2009.Streptococcosis on a red tilapia,

Oreochromis sp., farm: a case study. J. Fish Dis., 32: 247-252.

Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. 1993. Kinetic PCR analysis:

real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y);

11(9): 1026-30.

Hoffmann B., Beer M., Reid S.M., Mertens P. Oura C., Van Rijn, Slomka M.J.

2009. A review of RT-PCR technologies used in veterinary virology and

disease control: Sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases

notifiable to the World Organisation for Animal Health. Vet. Microbiol. 139: 1–

23

49  

Hoorfar J., MalornyB.,Cook A., Wagner M., Fach P. 2004. Practical

Considerations in Design of Internal Amplification Controls for Diagnostic

PCR Assays. J. Clinical .Microbiol. 42: 1863–1868.

Houghton S. and Cockerill F. 2006. Real-time PCR: Overview and

applications. Surgical research review. 139: 1-5.

Hutchins G.G.A., Grabsch H.I. 2009. Molecular Pathology the

future?Review.The royal colleges of surgeons of Edinburgh and Ireland.

Surgeon 7, 6: 366-77.

Iregui C., Hernández E., Jiménez A., Pulido A., Rey A. L. 2004. Primer mapa

epidemiológico de las lesiones y enfermedades de los peces de Colombia.

Universidad Nacional de Colombia. Ministerio de Agricultura y Desarrollo

Rural .38, 39 y 70 pág.

Jimenez A. P. 2010. Detección de Streptococcusagalactiae por PCR en

Tejidos de Tilapias rojas (Oreochromisspp.) menores de 20g. Tesis de grado

como requisito para optar al título de MsC en Microbiología.

Johnson J.R. 2000. Development of polymerase chain reaction-based assays

for bacterial gene detection.J.ofMicrobiol. Methods 41: 201–209.

Justice C.F. Baiano and Andrew C. Barnes. 2009. Towards Control of

Streptococcus iniae. Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol.

15, No. 12, December 2009

50  

Kitao, T. 1993. Streptococcal infections. In: Inglis, V.; Roberts, R., and

Bromage, N. (eds) Bacterial diseases of fish. Blackwell, Oxford, p 196-210.

KlesiusP.,EvansJ.,Shoemaker C., and Yeh H. 2006. Rapid detection and

identification of Streptococcus iniae using a monoclonal antibody-based

indirect fluorescent antibody technique.Aquaculture 258: 180– 186.

Kusuda R y Salati F. (1993). Major bacterial diseases affecting mariculture in

Japan.Annual Review of FishDiseases. 3: 69-85.

Lau S.K.P., Woo P.C.Y., Tse H., Leung K.W., Wong S.S.Y. & Yuen K.Y.

(2003) Invasive Streptococcus iniae infections outside North America. Journal

of Clinical Microbiology 41, 1004–1009.

Lee,M.A., Squirrell,D.J., Leslie,D.L. &Brown,T. 2004. Homogeneous

Fluorescent Chemistries. In: Real-Time PCR; An Essential Guide.

Mata A.I., Gibello A., Casamayor A., Blanco M., Domínguez L. and

Garayzábal F. 2004. Multiplex PCR assay for detection of bacterial pathogens

associated with warm-water streptococcosis in fish. App. Environ. Microbiol.

70: 3183-3187.

Mengoli C., Cruciani M., Barnes R.A., Loeffler J., Donnelly J.P. 2009. Use of

PCR for diagnosis of invasive aspergillosis: systematic review and meta-

analysis. Lancet Infect Dis. 9: 89–96

Michel, C.; Nougayrède, P.; Eldar, A.; Sochon, E., and Kinkelin, de P.

1997.Vagococcussalmoninarum, a bacterium of pathological significance in

rainbow trout Oncrhynchusmykiss farming. Dis. Aquat. Org., 30: 199-208.

51  

M. TevfikDorak (Ed.) 2007. Real-time PCR. This edition published in the

Taylor & Francis e-Library. ISBN: 0-4153-7734-X (Print Edition)

Nieto, J.M.; Devesa, S.; Quiroga, I., and Toranzo, A.E. 1995. Pathology of

Enterococcus sp. infection in farmed turbot, Scophthalmusmaximus L. J. Fish

Dis., 18: 21-30.

Olson A.B., Sibley C. D., Schmidt L.,.Wilcox M. A., Surette M. G., Corbett

C.R. 2010. Development of real-time PCR assays for detection of the

Streptococcus milleri Group from Cystic fibrosis clinical specimens using

targets for cpn60 and 16s rRNA genes. J. Clin. Microbiol. JCM Accepts,

published online ahead of print on 17 February 2010.

Perera, R. P., S. K. Johnson, M. D. Collins, and D. H. Lewis. 1995.

Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica 3 T. aurea

hybrids. J. Aquat. Anim. Health 6:335–340.

Perera, R.P., R.A. Fiske, K. Johnson (1998). Histopathology of Hybrid

Tilapias Infected with a Biotype of Streptococcus iniae.Journal of

AquaticAnimal Health. 10(3):294-299

Pier, G.B., Madin, S.H., 1976. Streptococcus iniae sp. nov., a betahemolytic

Streptococcus isolated from Amazon Freshwater Dolphin, Inia. Int. J. Syst.

Bacteriol. 26, 545–553.

Pier G.B, S.H. Madin, S. Al-Nakeeb (1978). Isolation and characterization of a

second isolate of Streptococcus iniae. Int J SystBacteriol. 28:311-314

Plumb, J.; Schachte, J.; Gaines, J.; Peltier, W., and Carroll, B. 1974.

Streptococcus sp. from marine fishes along the Alabama and northwest

Florida coast of the gulf of Mexico. Trans. Amer. Fish Soc., 2: 358-361

52  

Prieta, J.; Doménech, A.M.; Fernández-Garayzábal, J.F.; Collins, M.D.;

Rodrigues, U.M.; Jones, D.; Rodríguez, A. y Domínguez, L. 1993.

Lactococosis de la trucha arco iris (Oncorhynchusmykiis). Med. Vet., 6: 367-

373.

Pulido A., Mogollón JD., Morales H., Rincón M.A. 2006. Estandarización y

aplicación de la técnica PCR anidado para la detección de

Mycoplasmahyopneumoniae. Rev. Med. Vet. Zoot. 53: 22-32.

Romano. LA., Mejía J. 2003. Infección por Streptococcusiniae: Una

enfermedad emergente que afecta a peces de cultivo y a humanos.

RevistaAquaTIC, nº 18, pp. 25-32.

Toranzo, A.E.; Devesa, S.; Heinen, P.; Riaza, A.; Nuñéz, S., and Barja, J.L.

1994. Streptococcosis in cultured turbot caused by an Enterococcus-like

bacterium. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 1: 19-23.

Tukmechi A, Hobbenaghi R, Rahmati HH y Morvaridi A. (2009).

Streptococcosis in a Pet Fish, AstronotusOcellatus: A Case Study.

Proceedings of world academy of science, engineering and technology. 37:

14-15.

Shoemaker C and Klesius P. 1997. Streptococcal diseases problems and

control: a review. In: Fitzsimmons K. Tilapia Aquaculture. Proc. Fourth

international symposium on tilapia in aquaculture. Florida. USA. 2: 671-680.

Shoemaker C., Klesius, P.H., Evans, J.J., 2001. Prevalence of Streptococcus

iniae in tilapia, hybrid striped bass, and channel catfish on commercial fish

farms in the United States.AJVR 62, 174–177.

53  

Vinueza, B.C., 2009. PCR en Tiempo Real: la nueva era de la información

genética celular (Real Time PCR: the new age of celular geneticinformation).

REDVET Rev. electrón. Vet. Vol. 10, Nº 2

Wang C., Kaltenboeck B., Freeman M. 2012. Veterinary PCR

Diagnostics.Bentham e books. ISBN: 978-1-60805-348-3

Weinstein MR, Litt M, Kertesz DA, Wyper P, Rose D, Coulter M, Facklam AR,

Ostach C, Willey BM, Borczyk A y Low DE. (1997). Invasive infections due to

a fish pathogen, Streptococcus iniae.S. iniae study group.The New England

Journal of Medicine. 337: 589-594.

Weiss J.B. 1995. DNA Probes and PCR for Diagnosis of Parasitic

InfectionsCLINICALMicrobiol.Rev. 8: 113–130.

Yang W. and Li A. 2009.Isolation and characterization of Streptococcus

dysgalactiae from diseased Acipenserschrenckii. Aquaculture 294: 14–17.

Yang S and Rothman R.E. 2004. Review: PCR-based diagnostics for

infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care

settings. Lancet Infect Dis 4: 337–48.

Yanong Roy PE y Francis-Floyd R. (2006). Streptococcal Infections of

Fish.University of Florida IFAS Extension.Circular. 57: 1-6.

Yoshida, T.; Yamada, Y.; Sakai, M.; Inglis, V.; Xie, X.J.; Chen, S.-C., and

Kruger, R. 1996. Association of the cell capsule with anti-opsonophagocytosis

in β-hemolytic Streptococcus spp. isolated from rainbow trout. J. Aquat. Anim.

Health, 8: 223-228.

54  

Yuasa, K.; Kitancharoen, N.; Kataoka, Y., and Al-Murbaty, F.

1999.Streptococcus iniae, the causative agent of mass mortality in

rabbitfishSiganuscanaliculatus in Bahrain. J. Aquat. Anim. Health, 87-93.

Zlotkin, A., Hershko, H., Eldar, A., 1998. Possible transmission of

Streptococcus iniae from wild fish to cultured marine fish. Appl. Environ.

Microbiol. 64, 4065–4067.